CN107929323B

CN107929323B - 治疗糖尿病创面注射剂的制备方法及其产品

Info

Publication number: CN107929323B
Application number: CN201711259270.4A
Authority: CN
Inventors: 莫朝晖; 汪凌昊; 何红晖; 赵立玲; 陈科; 万新星
Original assignee: Third Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Third Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2017-12-04
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2020-01-21
Anticipated expiration: 2037-12-04
Also published as: CN107929323A

Abstract

本发明公开了一种治疗糖尿病创面注射剂的制备方法及其产品，其包括以下步骤：1)含有间充质干细胞的溶液；2)制备I型胶原蛋白溶液和层粘连蛋白的混合溶液；3)混合溶液与含有间充质干细胞的溶液进行混合，并充分分散均匀，即得治疗糖尿病创面注射剂。本发明其主要是通过I型胶原蛋白和层粘连蛋白对间充质干细胞的包覆，保护间充质干细胞的活性，从而避免在治疗过程中随着时间推移，治疗效果减弱的问题，而且I型胶原蛋白和层粘连蛋白可以与间充质干细胞起到协同作用，进一步增强其治疗效果。

Description

治疗糖尿病创面注射剂的制备方法及其产品

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种治疗糖尿病创面注射剂的制备方法及其产品。

背景技术

创面愈合是一个复杂的生物学过程，是炎性细胞、修复细胞、细胞外基质及细胞因子等多因素共同参与并高度协调、相互调控的复杂过程。糖尿病患者皮肤易受损伤，损伤后往往反复发作，迁延不愈，形成顽固难愈性溃疡，这主要是因为糖尿病患者机体的组织细胞长时间处于高糖环境，使局部皮肤组织细胞、蛋白质等被糖基化，引起血管内皮功能异常，反应受损；巨噬细胞的功能异常，炎症反应延长失衡；生长因子缺乏或者受损，明胶组织的减少、表皮屏障功能的失调，以及肉芽组织的减少等，导致溃疡难以修复。随着居民生活水平的提高，饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏以及少动多坐的生活方式等诸多因素，糖尿病发病率及患病率增长迅速，因此，糖尿病难愈性溃疡的治疗是临床急需解决的重要课题之一。

目前治疗糖尿溃疡的方法有传统外科清创、高压氧治疗、植皮治疗法、生长因子治疗等。近年来，随着组织工程学研究的不断深入，采用干细胞治疗糖尿病溃疡取得了一定的效果。目前干细胞治疗方法主要有动脉、静脉或局部注射细胞，在细胞迁移过程中，存在着细胞存活率低、细胞凋亡、功能障碍的问题。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)，因其来源广泛、取材容易、免疫原性小等特点，是目前治疗糖尿病难愈性创面最常用的细胞。MSCs具有向各种组织相比分化的巨大潜能，可通过免疫调节及其旁分泌能力，促进血管生成、改善糖尿病创面糖脂代谢，具有改变糖尿病局部的微环境能力，为糖尿病难愈性创面的治疗提供了有力的手段。虽然间充质干细胞治疗糖尿病难愈性创面虽然取得了一些疗效，但单一MSCs细胞进行静脉或局部注射后，细胞在迁移过程中，会存在细胞存活率下降，活性减弱，因而随着时间的推移其治疗效果会减弱，导致糖尿病难愈性创面后期愈合效果较差。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗效果好的治疗糖尿病创面注射剂的制备方法及其产品。

本发明提供的治疗糖尿病创面注射剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将脐带间充质干细胞在培养皿中培养，用胰蛋白酶进行消化，消化完后添加血清去除胰蛋白酶的活性，接着进行第一次离心，离心完毕后倒掉上清液，然后用PBS溶液重悬细胞，进行第二次离心，离心完毕后倒掉上清液，再添加PBS溶液重悬细胞，得到含有间充质干细胞的溶液；

2)取I型胶原蛋白溶解于醋酸水溶液，得到I型胶原蛋白溶液；取层粘连蛋白溶解于PBS溶液溶解，得到层粘连蛋白溶液；将I型胶原蛋白溶液和层粘连蛋白溶液进行混合，得到混合溶液；

3)在步骤2)的混合溶液中加入步骤1)制备的含有间充质干细胞的溶液，并用微量移液器轻轻反复吹打，至间充质干细胞充分分散均匀，即得治疗糖尿病创面注射剂。

所述步骤1)中，细胞培养至6-8代；消化时间为1-3min，胰蛋白酶的质量分数为0.1％-0.5％；含有间充质干细胞的溶液浓度为5×10⁶-2×10⁷个/ml；

所述步骤2)中，醋酸水溶液的质量体积比为0.1-1.0％；I型胶原蛋白溶液的浓度为50-200ug/ml；层粘连蛋白溶液的浓度为25-100ug/ml；I型胶原蛋白溶液与层粘连蛋白溶液的混合体积比为1:(1-2)。

所述步骤3)中，混合溶液与间充质干细胞的溶液的混合体积比为1:(1-4)。

所述的一种治疗糖尿病创面的注射剂的制备方法制备得到糖尿病创面注射剂。

所述的糖尿病创面注射剂在治疗糖尿病创面中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明利用I型胶原蛋白和层粘连蛋白对间充质干细胞进行包覆，可以保护注射后细胞迁移过程中MSCs的活性，避免在治疗过程中随着时间推移，治疗效果减弱的问题；

2、I型胶原蛋白和层粘连蛋白可以与间充质干细胞可以起到协同治疗的作用，增强治疗糖尿病创面的效果。

附图说明

图1实施例2中大鼠糖尿病创面愈合图；

图2实施例2中大鼠糖尿病创面面积的曲线图；

图3实施例2中12天后糖尿病创面的HE染色的组织形貌观察图；

图4实施例2中12天后糖尿病创面的CD31免疫组织化学染色图；

图5实施例2中Western blotting检测VEGF-α的结果图；

图6实施例2中Western blotting检测PDGF的结果图；

图7实施例2中Western blotting检测EGF的结果图。

说明：图中*号：与PBS组相比，p值<0.05；#号：与MSCs组相比，p值<0.05。

具体实施方式

本发明中的PBS溶液为pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液。

实施例1

1)将脐带间充质干细胞在培养皿中培养至6代，接着加入1ml质量分数为0.25％的胰蛋白酶进行消化1min，消化完毕后添加等体积的血清去除胰蛋白酶的活性，接着进行第一次离心，离心力为800g，时间为5min，离心完毕后倒掉上清液后，然后用10ml PBS溶液重悬细胞，进行第二次离心，离心力为800g，时间为5min，离心完毕后倒掉上清液，再添加的3ml PBS溶液重悬细胞，得到浓度为5×10⁶个/ml含有间充质干细胞的溶液(MSCs)。

2)取200ugI型胶原蛋白溶解于1ml质量体积比0.5％的醋酸水溶液溶解，得到I型胶原蛋白溶液；取100ug层粘连蛋白溶解于1ml PBS溶液溶解，得到层粘连蛋白溶液；将I型胶原蛋白溶液和层粘连蛋白溶液按照体积比为1:1进行混合，得到混合溶液(ECM)；

3)步骤2)的混合溶液加入2ml步骤1)制备的含有间充质干细胞的溶液，并将间充质干细胞在混合溶液中充分分散均匀，即得治疗糖尿病创面的注射剂(ECM-MSCs)。

实施例2治疗糖尿病创面的注射剂在治疗大鼠糖尿病创面中的应用

采取高糖高脂饲养的大鼠，并腹腔注射35mg/kg链脲佐菌素(STZ)腹腔建立糖尿病大鼠模型，成模的糖尿病大鼠随机分为三组，在大鼠后背正中偏上处创建直径1cm大小全层皮肤缺损创面，每组分别在创面周边进行局部皮下注射，对照组注射1ml PBS溶液、MSCs治疗组注射1ml实施例1制备的MSCs溶液、ECM-MSCs治疗组注射1ml实施例1制备的ECM-MSCs注射剂。

分别在注射后的2、4、6、8、10、12天测定创面大小观察愈合情况；将愈合后的糖尿病创面进行HE及免疫组化染色观察创面修复及新生血管生成状况，荧光定量RT-PCR、Western-blotting检测创面组织血管形成因子、组织修复相关生长因子的表达情况。

从图1大鼠糖尿病创面愈合图可以看出，MSCs治疗组与ECM-MSCs治疗组相较于PBS对照组，创面愈合速度均明显增快；而ECM-MSCs治疗组相较于MSCs治疗组，创面愈合速度也相对较快，说明MSCs有加速糖尿病创面愈合的作用，而且EMC可以与MSCs起到协同作用，进一步加速糖尿病创面的愈合。

从图2大鼠糖尿病创面面积的曲线图，从图2可知，创面面积愈合速度ECM-MSCs治疗组>MSCs治疗组>PBS对照组，说明ECM-MSCs治疗组的治疗效果优于MSCs治疗组和PBS对照组。

从图3愈合创面组织的HE染色图可以看出，注射12天之后，PBS对照组创面可观察到呈圆形和类圆形的炎症细胞，上皮未完全覆盖创面；MSCs治疗组的创面可观察到梭形的成纤维细胞，上皮完全覆盖创面；ECM-MSCs治疗组的上皮已完全覆盖创面，并且无炎症细胞和成纤维细胞，说明创面基本完全治愈。因此，ECM-MSCs治疗组创面愈合的速度较MSCs治疗组和PBS对照组要明显加快。

从图4CD31免疫组织化学染色图可以看出，ECM-MSCs治疗组创面愈合组织新生血管密度较MSCs治疗组明显增高，而且其染色的阳性细胞数明显高于MSCs治疗组，说明ECM-MSCs治疗组治疗效果优于单一的MSCs治疗组。

由图5-7可知，ECM-MSCs治疗组创面组织的VEGF-α、PDGF，EGF的mRNA及蛋白质水平较蛋白表达、水平明显高于MSCs治疗组和对照组。

由以上结果可知：由于本发明的ECM-MSCs利用了I型胶原蛋白溶液和层粘连蛋白对MSCs进行了包覆，其MSCs的活性高于其他组，因而其VEGF-α、PDGF，EGF蛋白的表达水平较高，所以ECM-MSCs治疗组的治疗效果明显优于PBS对照组和MSCs治疗组。

实施例3

1)将脐带间充质干细胞在培养皿中培养至7代，接着加入1ml质量分数为0.1％的胰蛋白酶进行消化2min，消化完毕后添加等体积的血清去除胰蛋白酶的活性，接着进行第一次离心，离心力为800g，时间为5min，离心完毕后倒掉上清液后，然后用10ml PBS溶液重悬细胞，进行第二次离心，离心力为800g，时间为5min，离心完毕后倒掉上清液，再添加的5ml PBS溶液重悬细胞，得到浓度为8×10⁶个/ml含有间充质干细胞的溶液(MSCs)。

2)取100ugI型胶原蛋白溶解于1ml质量体积比1.0％的醋酸水溶液溶解，得到I型胶原蛋白溶液；取38ug层粘连蛋白溶解于1.5ml PBS缓冲溶液溶解，得到层粘连蛋白溶液；将I型胶原蛋白溶液和层粘连蛋白溶液按照体积比为1:1.5进行混合，得到混合溶液(ECM)；

3)步骤2)的混合溶液加入5ml步骤1)制备的含有间充质干细胞的溶液，并将间充质干细胞在混合溶液中充分分散均匀，即得治疗糖尿病创面的注射剂(ECM-MSCs)。

实施例4

1)将脐带间充质干细胞在培养皿中培养至8代，接着加入1ml质量分数为0.5％的胰蛋白酶进行消化3min，消化完毕后添加等体积的血清去除胰蛋白酶的活性，接着进行第一次离心，离心力为800g，时间为5min，离心完毕后倒掉上清液后，然后用10ml PBS溶液重悬细胞，进行第二次离心，离心力为800g，时间为5min，离心完毕后倒掉上清液，再添加的5ml PBS溶液重悬细胞，得到浓度为2×10⁷个/ml含有间充质干细胞的溶液(MSCs)。

2)取25ugI型胶原蛋白溶解于0.5ml质量体积比0.1％的醋酸水溶液溶解，得到I型胶原蛋白溶液；取75ug层粘连蛋白溶解于1ml PBS缓冲溶液溶解，得到层粘连蛋白溶液；将I型胶原蛋白溶液和层粘连蛋白溶液按照体积比为1:2进行混合，得到混合溶液(ECM)；

Claims

1.一种治疗糖尿病创面注射剂的制备方法，包括以下步骤：

1）将脐带间充质干细胞在培养皿中培养，用胰蛋白酶进行消化，消化完后添加血清去除胰蛋白酶的活性，接着进行第一次离心，离心完毕后倒掉上清液，然后用PBS溶液重悬细胞，进行第二次离心，离心完毕后倒掉上清液，再添加PBS溶液重悬细胞，得到含有间充质干细胞的溶液；

2）取І型胶原蛋白溶解于醋酸水溶液，得到І型胶原蛋白溶液；取层粘连蛋白溶解于PBS溶液溶解，得到层粘连蛋白溶液；将І型胶原蛋白溶液和层粘连蛋白溶液进行混合，得到混合溶液；

3）在步骤2）的混合溶液中加入步骤1）制备的含有间充质干细胞的溶液，并用微量移液器轻轻反复吹打，至间充质干细胞充分分散均匀，即得治疗糖尿病创面的注射剂。

2.根据权利要求1所述的治疗糖尿病创面注射剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，细胞培养至6-8代。

3.根据权利要求1或2所述的治疗糖尿病创面注射剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，消化时间为1-3min，胰蛋白酶的质量分数为0.1%-0.5%。

4.根据权利要求1或2所述的治疗糖尿病创面注射剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，含有间充质干细胞的溶液浓度为5×10⁶-2×10⁷个/ml。

5.根据权利要求1所述的一种治疗糖尿病创面的注射剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中，醋酸水溶液的质量体积比为0.1-1.0%。

6.根据权利要求1或5所述的治疗糖尿病创面注射剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中，І型胶原蛋白溶液的浓度为50-200ug/ml；层粘连蛋白溶液的浓度为25-100ug/ml。

7.根据权利要求6所述的治疗糖尿病创面注射剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中，І型胶原蛋白溶液与层粘连蛋白溶液的体积比为1:(1-2)。

8.根据权利要求1所述的治疗糖尿病创面注射剂的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中，混合溶液与间充质干细胞的溶液的体积比为1:(1-4）。

9.根据权利要求1所述的治疗糖尿病创面注射剂的制备方法制备得到糖尿病创面注射剂。