CN109646443A - 溶血磷脂酸的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药和生物技术领域，公开了溶血磷脂酸的应用。溶血磷脂酸可用于调控炎症因子例如IL‑1和/或IL‑6的表达，减轻炎症反应；并可以促进成纤维细胞分泌胶原、促进表皮增殖和再生。因此，溶血磷脂酸可修复创伤，促进创伤愈合，具有良好的应用前景。

Description

溶血磷脂酸的应用
技术领域
本发明属于医药和生物技术领域，涉及溶血磷脂酸在调控炎症因子表达方面的应用。
背景技术
人皮肤创伤后伤口愈合是创伤愈合领域的一个重大难题，缺乏特效的治疗方案。临床资料显示，某些因素导致的伤口经久不愈，属于临床治疗中的棘手问题。伤口愈合机制是一个极其复杂的过程，受到炎症反应、血管通透性、各种细胞因子等多因素综合的影响。伤口愈合是机体组织对损伤刺激的生理反应，包括四个阶段：止血、炎症、增殖与重新塑形。此过程需要各种生长因子和细胞因子的综合调控，使伤口在一定时间内得以愈合。伤口的愈合是复杂的动态的过程，很多生长因子调控伤口愈合过程，但是由于易被蛋白酶降解或不能到达创面，临床应用很少。因此，如果能够上调创伤的炎症因子表达，可以减轻炎症反应，促进伤口愈合。
溶血磷脂酸(Lysophosphatidic Acid,LPA)的结构如下所示，是一种十分活跃的磷脂信号分子，是内源性、结构简单的小分子。
LPA的特点：易溶于水，不易降解，在体内很稳定。它是真核细胞磷脂生物合成早期的关键前体，甘油磷脂代谢的中间产物。LPA通过受体信号跨膜转导发挥作用，LPA的受体有多个亚型，目前发现在哺乳动物中确定存在6种LPA受体，即LPA1-LPA6，通过G蛋白偶联受体作用于靶细胞，可激活G蛋白偶联受体，引起生长激素样作用。目前，对LPA的研究主要集中在作为诊断分子标记物的应用。
发明内容
本发明旨在提供溶血磷脂酸的应用。
本发明技术方案为：
溶血磷脂酸(LPA)用于调控炎症因子的表达。所述的炎症因子为IL-1和/或IL-6。
进一步，溶血磷脂酸用于调控皮肤细胞中IL-1和/或IL-6的表达。尤其是表皮细胞中IL-1和/或IL-6的表达。
溶血磷脂酸用于制备调控炎症因子表达或降低炎症反应的药物。或者，溶血磷脂酸用于制备调控炎症因子表达或降低炎症反应的皮肤外用剂。所述的炎症因子为IL-1和/或IL-6。
一种用于调控IL-1和/或IL-6表达或降低炎症反应的药物或者皮肤外用剂，含有溶血磷脂酸。
生理浓度(2-20μM)下，LPA能够调控(上调)IL-1和IL-6表达，促进成纤维细胞分泌胶原、促进表皮增殖和再生，可以修复创伤，促进创伤愈合。
通过采用皮肤损伤动物模型，观察LPA对小鼠皮肤割伤创面作用，显示LPA有促进愈合的作用、能够缩短伤口愈合时间、减轻炎症反应。
通过创伤模型，显示LPA可干预创伤模型中炎症因子的变化。
溶血磷脂酸还可以用于制备促进成纤维细胞分泌胶原、促进表皮增殖和再生或者修复创伤的药物。
经过LPA处理，小鼠、裸鼠皮肤割伤创面表皮增厚，皮下胶原增多。表皮增厚提示LPA在体内有促进表皮增殖，调控表皮再生的作用，有利于创伤修复；皮下胶原增多提示LPA调控真皮成纤维细胞分泌胶原，显著提升真皮成纤维细胞分泌功能，有利于创伤修复。
本发明的有益效果在于，提供了溶血磷脂酸的新用途和基于LPA治疗皮肤创伤的新策略，公开了溶血磷脂酸调控炎症因子IL-1和IL-6的水平、表皮细胞的增殖以及真皮成纤维细胞分泌胶原，有利于促进皮肤创伤修复。本发明所使用的溶血磷脂酸是结构简单易溶于水的小分子，优于皮肤创伤药物难溶性药物的生物利用度，具有良好的应用前景。本发明利用LPA调控炎症因子的水平、具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1用LPA和生理盐水(对照组)处理小鼠皮肤割伤创面第0、3、6、9、12天的结果。同一只小鼠背部2个割伤创面，上边是LPA处理组，下边是生理盐水对照组。LPA处理组第6天、9天、12天时明显观察到小鼠背部皮肤创伤创面变小，愈合时间缩短，显示LPA对小鼠皮肤割伤创面有促进愈合的作用。
图2为实施例1用LPA和生理盐水(对照组)处理裸鼠皮肤割伤创面12天的HE染色结果，放大倍数分别为40倍和100倍，LPA组比生理盐水组(saline)裸鼠表皮明显增厚，皮下胶原增多。
图3为实施例1用LPA和生理盐水(对照组)处理裸鼠皮肤割伤创面3天的masson染色结果，放大倍数为100倍，表明LPA组比生理盐水组(saline)裸鼠皮下胶原增多。
图4为实施例1用LPA和生理盐水(对照组)处理小鼠皮肤割伤创面15天的HE染色结果，放大倍数为40倍，表明LPA组比生理盐水组(saline)小鼠表皮明显增厚，皮下胶原增多。
图5为实施例1用LPA和生理盐水(对照组)处理小鼠皮肤割伤创面15天的masson染色结果，放大倍数为40倍，表明LPA组比生理盐水组(saline)小鼠皮下胶原增多。
图6为LPA处理Hacat细胞6、12、24小时后QPCR检测IL-1的表达量。
图7为LPA处理Hacat细胞6、12、24小时后QPCR检测IL-6的表达量。
具体实施方式
以下结合具体的实施例来对本发明的技术方案加以说明。
实施例1
采用皮肤损伤动物模型，观察LPA对小鼠皮肤割伤创面的作用，同一只小鼠背部2个割伤创面，分别用生理浓度(20μM)的LPA(用药组)和生理盐水(对照组，Untreated)处理，涂敷于创面上，每天换药。第0、3、6、9和12天的结果如图1所示，上面是LPA处理组，下面是生理盐水对照组。第6、9、12天时，可以明显观察到小鼠背部皮肤创伤创面变小，愈合时间缩短。因此，LPA对小鼠皮肤割伤创面有促进愈合的作用、能够缩短伤口愈合时间、减轻炎症反应。
以裸鼠为实验动物，取处理12天的用药组及对照组的裸鼠创口皮肤，用HE染色处理，结果如图2；以小鼠为实验动物，取处理15天的用药组及对照组的小鼠创口皮肤，用HE染色处理，结果如图4所示。
如图2所示(A、C放大倍数为40倍，B、D放大倍数为100倍)，LPA处理12天时，HE染色显示，LPA组(C、D)比用生理盐水处理的对照组(A、B)裸鼠表皮明显增厚，皮下胶原增多。如图4所示(放大倍数为40倍)，与对照组(A)相比，LPA组处理的小鼠表皮明显增厚，皮下胶原增多。HE染色结果提示，LPA在体内有促进表皮增殖、调控表皮再生的作用，有利于创伤修复。皮下胶原增多提示LPA调控真皮成纤维细胞分泌胶原。研究结果表明LPA可以显著提升表皮细胞增殖水平和真皮成纤维细胞分泌功能，有利于创伤修复。
取处理3天的用药组及对照组的裸鼠创口皮肤，用massion染色处理。结果如图3所示；取处理15天的用药组及对照组的小鼠创口皮肤，用massion染色处理，结果如图5所示。
如图3所示(放大倍数为100倍)，与生理盐水对照组(A)相比，用LPA(B)处理3天的裸鼠皮下胶原增多；如图5所示(放大倍数为40倍)，与生理盐水对照组(A)相比，用LPA(B)处理15天的小鼠皮下胶原增多。manssion染色结果提示，LPA能够显著提升真皮成纤维细胞分泌功能，有利于创伤修复。
小鼠与裸鼠的实验结果一致，提示LPA可以显著提升表皮增殖水平和成纤维细胞分泌功能，调控真皮成纤维细胞分泌胶原，使创伤面表皮增厚，皮下胶原增多，可促进表皮增殖和再生，有促进创伤愈合的作用。
实施例2
LPA可以干预创伤模型中炎症因子的变化，以Hacat表皮细胞为模型，分别检测不同浓度LPA处理6、12、24小时后IL-1和IL-6的表达量。实验方法如下：
一、Hacat(人永生化表皮)细胞培养
(1)用PBS清洗细胞，胰酶消化后离心；用完全培养基重悬细胞；
完全培养基为：MEM培养基+10％胎牛血清+1％双抗+1mM丙酮酸钠+0.1mM非必需氨基酸；
(2)吹打混匀后均匀种到培养板内，置于37℃、5％CO2培养箱内培养。
二、加药
(1)观察培养板(六孔板)中每孔细胞长至70％-80％时，吸出培养基，PBS清洗后吸出PBS；
(2)各孔分别加入1mL LPA浓度为0、5μM、10μM、20μM的无血清MEM培养基处理，将培养板放入培养箱继续培养。培养时间即LPA处理时间分别为6、12、24h，进行PCR定量测定。
三、PCR定量检测：
(一)提取RNA、RNA变性和逆转录，得到cDNA，于-20℃保存。
(二)实时荧光定量PCR(QPCR)
以cDNA为模板进行扩增，以管家基因(GAPDH)为内参，分别检测炎症因子IL-6和IL-1β的表达量。
PCR方法参数和扩增引物序列如下：
表1.PCR条件
表2.扩增引物序列
扩增体系放入PCR仪检测。测定完毕后，记录cp值，计算炎症因子表达量，查看溶解曲线，结果如图6、7所示。
图6的A、B、C分别为加药培养6h、12h和24小时后IL-1的表达量。
图7的A、B、C分别为加药培养6h、12h和24小时后IL-6的表达量。
结果显示，LPA浓度为10μmol/L、20μmol/L时，在24h内均可以提高IL-1表达，浓度20μmol/L时效果最为显著；LPA浓度为5μmol/L，在6h内可以提高IL-1表达。
加药12h时，生理浓度的LPA均可显著提高IL-6的表达量，并且与加药量正相关；LPA浓度为5μmol/L、10μmol/L时，IL-6的表达量在加药24h时仍可提高。

Claims (10)

1.溶血磷脂酸在调控炎症因子表达方面的应用。
2.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的炎症因子为IL-1和/或IL-6。
3.权利要求1或2所述的应用，其特征在于，溶血磷脂酸用于调控皮肤细胞中IL-1和/或IL-6表达。
4.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的皮肤细胞为表皮细胞。
5.溶血磷脂酸在制备调控炎症因子表达或降低炎症反应的药物方面的应用。
6.溶血磷脂酸在制备调控炎症因子表达或降低炎症反应的皮肤外用剂方面的应用。
7.权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述的炎症因子为IL-1和/或IL-6。
8.一种用于调控IL-1和/或IL-6表达、或降低炎症反应的药物，其特征在于，含有溶血磷脂酸。
9.一种用于调控IL-1和/或IL-6表达、或降低炎症反应的皮肤外用剂，其特征在于，含有溶血磷脂酸。
10.溶血磷脂酸在制备促进成纤维细胞分泌胶原、促进表皮增殖和再生或者修复创伤的药物方面的应用。
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