CN104611366A - 鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗及其引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗及其引物和应用。鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗，其序列如序列表Seq No.1所示。用于构建鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗的引物对，上引物P1：如序列表Seq No.2所示；下引物P2：如序列表Seq No.3所示。构建方法，包括如下步骤：根据现有质粒pMD18-T-Hsp90的核苷酸序列设计引物对；进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp90基因；构建重组质粒pVAX1-Hsp90。最后进行雏鸡免疫实验，证明重组基因疫苗具有较好的保护雏鸡免受球虫侵害的效果。该核酸疫苗制备简单，省时省力，成本低，稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及动物疫苗制造技术领域，具体涉及一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)及其引物和应用。
背景技术
核酸疫苗具有安全性高、在机体内维持时间长、制备简单等优点，已引起广泛关注。核酸疫苗，就是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。
目前国内外有多个学者利用鸡球虫抗原基因构建的核酸疫苗进行免疫，均证明其可产生保护作用。Kopko等将E.tenella折光体蛋白基因插入pcDNA3.1载体中获得表达质粒pcDNA3-SO7，免疫后观察到了明显的保护作用。说明球虫保护性抗原的真核表达质粒免疫可产生保护作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)及其引物和应用，用于保护鸡群。本发明首次将Hsp90基因插入真核载体中构建质粒并将其作为预防鸡堆型艾美耳球虫的核酸疫苗，该核酸疫苗制备简单，省时省力，成本低，稳定性好。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
1、一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)，序列如序列表Seq No.1所示。
本发明还具有如下技术特征：
1、一种用于构建鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)的引物对，上引物P1：如序列表Seq No.2所示，下引物P2：如序列表Seq No.3所示。
2、如上所述的一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)在治疗和/或预防鸡球虫的药物中的应用。
3、一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)的构建方法，包括如下步骤：
(1)根据现有质粒pMD18-T-Hsp90的核苷酸序列设计引物对，上引物，序列如序列表Seq No.2所示，下引物如序列表Seq No.3所示；
(2)进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp90基因；
(3)构建重组质粒pVAX1-Hsp90。
4、如上所述的构建方法，步骤(2)采用常规链式聚合酶反应的具体步骤如下：将混合液在94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃、30s，59.2℃、30s，72℃、2min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min，扩增完毕后置4℃终止反应；
所述混合液组成如下所示：
5、如上所述的构建方法，步骤(3)质粒pVAX1-Hsp90的重组构建方法具体步骤如下：用限制性内切酶BamH I和Pst I酶切消化PCR所得Hsp90基因产物和pVAX1载体，分别获得Hsp90基因片段和线性载体pVAX1，将所得片段胶回收后进行体外连接，构建重组质粒pVAX1-Hsp90，将疑似阳性的质粒送华大基因测序，将测序鉴定为阳性的重组质粒命名为pVAX1-Hsp90。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：(1)本试验首次将Hsp90基因插入真核载体中构建质粒并将其作为预防鸡堆型艾美耳球虫的核酸疫苗。(2)该核酸疫苗制备简单，省时省力，成本低，稳定性好。(3)研究表明，核酸疫苗在疾病的防治中具有其他疫苗不可比拟的优点，因此该核酸疫苗有望在鸡堆型艾美耳球虫的防治中发挥重要作用。
附图说明
图1是Hsp90基因PCR图；
其中，M：DNAmarker；1：Hsp90基因扩增结果；
图2是重组质粒pVAX1-Hsp90的构建示意图；
图3是重组质粒pVAX1-Hsp90的BamH I单酶切及BamH I和Pst I双酶切鉴定图；
其中，M：DNA marker；1：重组质粒BamH I单酶切鉴定2：重组质粒BamH I和Pst I双酶切鉴定；
图4是免疫雏鸡胸腺T细胞数量变化图；
图5是免疫雏鸡脾脏T细胞数量变化图；
图6是免疫雏鸡外周血T细胞数量变化图；
图7是免疫雏鸡外周血Hsp90 IgG抗体含量动态变化图；
图8是免疫雏鸡增重情况；
图9是免疫雏鸡攻虫后第6天克粪便卵囊数；
图10是免疫雏鸡攻虫后第6天十二指肠病变计分。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述：
实施例1
Hsp90基因的PCR扩增
1根据质粒pMD18-T-Hsp90的核苷酸序列，设计引物P1和P2，
P1：5’-CGCGGATCCGCCACCATGGAGAACAAGGAGACC-3’(下划线表示引入的酶切位点为BamH I)
P2：5’-AACTGCAGTTAGTCTACCTCCTCCATCT-3’(下划线表示引入的酶切位点为Pst I)
2进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp90基因。
以质粒pMD18-T-Hsp90为模板，P1和P2为引物，以高保真DNA聚合酶进行PCR，反应条件为：将混合液在94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃、30s，59.2℃、30s，72℃、2min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min，扩增完毕后置4℃终止反应。
所述混合液组成如下所示：
将PCR产物用质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳进行分析，在2 139 bp附近存在单一的目标条带，结果如图1所示，表明实验获得了与预期相符的特异DNA片段即Hsp90基因片段。
实施例2
重组质粒pVAX1-Hsp90的构建及鉴定
1、将胶纯化回收后Hsp90PCR产物进行BamH I和Pst I双酶切，胶纯化回收后，与经同样酶切回收的pVAX1质粒连接，构建重组质粒pVAX1-Hsp90。重组质粒构建过程如图2所示。转化大肠杆菌感受态，Kan+筛选阳性克隆子。
2、根据质粒小提试剂盒说明书对菌液PCR鉴定正确的菌液进行提取质粒，具体步骤如下：
(1)取1-5mL细菌培养物，12 000r/min离心10min，尽量吸除上清；
(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液I，使用移液器彻底悬浮细菌沉淀；
(3)向离心管加入250μL溶液II，温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，此步骤不宜超过5min；
(4)向离心管中加入350μL溶液III，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，12 000r/min离心10min；
(5)将上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱加入收集管中)，室温放置2min，12 000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(6)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12 000r/min离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；
(7)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12 000r/min离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；
(8)12 000r/min离心2min，将吸附柱敞口置于室温放置数分钟；
(9)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬滴加50-200μL经65℃水浴加热的洗脱液，室温放置1min，12 000r/min离心1min；
(10)将洗脱下的载体质粒收集到离心管中，置于-20℃保存备用。
3、重组质粒pVAX1-Hsp90的酶切鉴定
将-20℃保存的质粒BamH I和Pst I双酶切，酶切反应体系共10μL。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，出现两条DNA带，位置与预测一致，结果如图3所示。
酶切反应体系如下：
4、重组质粒的测序鉴定
将疑似阳性的质粒送华大基因测序，测序鉴定为阳性。重组质粒命名为pVAX1-Hsp90。
实施例3
免疫雏鸡
1、根据《分子克隆试验指南》，用碱裂解法大量制备并纯化重组质粒，用紫外分光光度计进行质粒浓度及纯度测定，用适量的灭菌PBS将终浓度调整到1μg/μL。
2、一日龄雏鸡随机分为4组，每组15只，即未免疫未攻虫组(None)、PBS对照组(PBS)、pVAX免疫组(pVAX)、pVAX-Hsp9免疫组(pVAX-Hsp90)。14、21日龄每只鸡胸部肌肉注射100μg真核质粒或100μL PBS，28日龄除None组外均口服接种1×105个孢子化卵囊进行攻虫，在免疫前15min，每只鸡提前100μL25％葡萄糖溶液。14d、28d和35d逐羽称重，计算平均增重及相对增重率、攻虫后第6d进行十二指肠病变计分、OPG值计算及抗球虫指数(Anticoccidial index，ACI)计算，并分别于7d、21d、28d、35d和42d无菌采取胸腺、脾脏、抗凝血检测T淋巴细胞数量，同时分离血清测定血清抗体效价，用以上指标评价免疫保护效果。
实施例4T
淋巴细胞数量的检测
1、胸腺、脾脏淋巴细胞悬液制备
在酒精灯旁无菌采取试验鸡脾脏、胸腺于灭菌平皿中，拿入超净台中，用不完全1640培养液(含双抗200IU/mL青霉素，200μg/mL链霉素)清洗，去除多余脂肪及筋膜，再清洗一次，放入另一心的平皿中，加入1mL 1640培养液用铜网(200目)研磨挤压制备单细胞悬液；移入10mL离心管中，并用少量1640清洗平皿，同时移入10mL离心管中，1 000r/min离心10min清洗一次，沉淀用2mL不完全1640悬起，轻轻加入到2mL淋巴细胞分离液的10mL离心管中，用水平台式离心机1 000r/min离心10min，小心收集中间淋巴细胞层(淡黄色)于10mL离心管中，加入不完全1640培养液1 000r/min离心10min洗涤细胞两次，最后用2mL完全1640培养液悬起细胞，用台盼蓝染色法检测细胞活力＞95％，同时进行细胞计数，调细胞浓度至1×107个/mL。
2、免疫器官T淋巴细胞增殖功能变化检测
96孔微量培养板，每孔加入50μL含10μg/mL ConA(胸腺)或20μg/mLConA(脾脏)的1640培养液，将细胞浓度为1×107个/mL的淋巴细胞悬液加入96孔微量培养板，每孔50μL，对照孔只加1640培养液，设三复孔。至每孔中培养物总体积为100μL，ConA终浓度分别为5μg/mL(胸腺)，10μg/mL(脾脏)，细胞终浓度为5×106个/mL。置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下分别培养45h(胸腺)、21h(脾脏)后每孔加入5mg/mL MTT溶液10μL，继续培养3h，然后每孔加入100μL DMSO溶液，置于恒温培养箱反应15min，以空白对照孔调零，在酶标仪上测定OD490nm值，结果以三重复孔平均值表示。如图4、图5所示。
3、血液淋巴细胞悬液制备
5mL注射器抽取0.6mL抗凝剂，心脏采2.4mL血液，(柠檬酸钠∶血液＝1∶4)混匀，共3mL。10mL离心管中加入3mL淋巴细胞分离液，缓慢轻轻加入抗凝血3mL。用水平台式离心机1 000r/min离心10min，小心收集中间淋巴细胞层(淡黄色)，加入不完全1640培养液1000r/min离心10min洗涤细胞两次，加入2mL完全1640培养液悬起细胞，计数，按1×107个/mL的单细胞悬液。
4、雏鸡血液T淋巴细胞增殖试验
将细胞浓度为1×107个/mL的外周血淋巴细胞悬液加入96孔微量培养板，每孔50μL，同时每孔加入50μL含20μg/mL ConA的1640培养液，设立对照孔只加1640培养液，设三复孔。至每孔中培养物总体积为100μL，ConA终浓度10μg/mL，细胞终浓度为5×106个/mL。置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养21h后每孔加入5mg/mL MTT溶液10μL，继续培养3h，然后每孔加入100μL DMSO溶液，置于恒温培养箱反应15min，以空白对照孔调零，在酶标仪上测定OD490nm值，结果以三重复孔平均值表示。结果如图6所示。
实施例5
血液中抗体的检测
1、包被：每孔包被用包被液(pH＝9.6 0.05mol/L碳酸盐缓冲液)稀释后的1μg重组Hsp90蛋白，每孔100μL，4℃过夜。
2、洗涤：弃去包被液，每孔加入洗液(含0.5％Tween20 0.01mol/L pH 7.4PBS，PBST)200μL，每次震荡5min，洗涤3次，甩干。
3、封闭：每孔加入封闭液(含5％脱脂奶粉的PBS)200μL，37℃孵育2h，甩干，洗板同前。
4、加样：将1∶20稀释的待检样品按100μL每孔的量加入，同时设置阳性对照，37℃孵育1h，洗涤同前。
5、加入酶标抗体：1∶5000稀释的抗鸡二抗，每孔100μL，37℃孵育1h，洗涤同上。
6、显色：加底物液100μL显色10min。
7、终止：每孔加2mol/L的浓硫酸作用5min终止反应。
8、检测：使用酶标仪在490nm下测定光吸光度值。
抗体检测结果如图7所示。
实施例6
抗球虫指数
1、攻虫后增重水平
增重＝35d体重-28d体重，结果如图8所示。
2、克粪便卵囊排出数(OPG)
攻虫后第6d收集称取2g粪便加人少量蒸馏水搅拌均匀，2 000r/min，离心10min，沉淀加入5mL蒸馏水，充分混匀，加饱和盐水至60mL，混匀后用60目铜网过滤，吸取一滴混悬液于麦克马斯特计数板计数室内，静置5min，记录两个计数室的卵囊数。OPG计算公式如下：OPG＝(n1+n2)/2÷0.15×60÷2＝A×200，结果如图9所示
3、十二指肠病变计分
35d时每组断颈处死3只雏鸡，逐羽观察十二指肠病变，并按Johnson设计的病变记分方法逐羽进行十二指肠病变计分，三个人分别记录，取平均值，即将病变分为0-+4五个等级。
0：表示形态正常，无肉眼可见病变；
+1：十二指肠浆膜面存在分散的白色病灶，每cm2不超过5处。
+2：肠壁不增厚，内容物正常，白色病灶数量增多但未融合，形成白色条纹状梯形外观，3周龄以上的鸡病变可扩展至十二指肠下20cm处。
+3：小肠壁增厚，内容物呈水样，白色病灶增多且融合成片，病变蔓延到卵黄囊憩室之后。
+4：肠壁高度肥厚，肠内容物呈奶油状，被感染的肠绒毛缩短融合使十二指肠和小肠粘膜呈灰白色。死亡鸡只也计为+4分。结果如图10所示。
4、抗球虫指数ACI
ACI＝(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)
其中，存活率＝(实验结束时存活鸡数/实验鸡数)×100％
相对增重率＝(各实验组最后剖杀时增重率/非感染非免疫组增重率)×100％
病变值(0-4)＝各实验组的平均病变计分(0～4)×10
卵囊值(0～40)按表1计算：
表1卵囊值计算方法
抗球虫指数ACI结果如表2所示，以ACI大于或等于180为保护效果明显，A160-179一般，小于160无保护效果。
表2抗球虫指数
Claims (6)
1.一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)，其特征在于，序列如序列表Seq No.1所示。
2.一种用于构建鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)的引物对，其特征在于，上引物P1：如序列表Seq No.2所示，下引物P2：如序列表Seq No.3所示。
3.根据权利要求1所述的一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)在治疗和/或预防鸡球虫的药物中的应用。
4.一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据现有质粒pMD18-T-Hsp90的核苷酸序列设计引物对，上引物，序列如序列表Seq No.2所示，下引物如序列表Seq No.3所示；
(2)进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp90基因；
(3)构建重组质粒pVAX1-Hsp90。
5.根据权利要求4所述的一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)的构建方法，其特征在于，所述的步骤(2)采用常规链式聚合酶反应的具体步骤如下：将混合液在94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃、30s，59.2℃、30s，72℃、2min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min，扩增完毕后置4℃终止反应；
所述混合液组成如下所示：
6.根据权利要求4所述的一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)的构建方法，其特征在于，所述的步骤(3)质粒pVAX1-Hsp90的重组构建方法具体步骤如下：用限制性内切酶BamH I和Pst I酶切消化PCR所得Hsp90基因产物和pVAX1载体，分别获得Hsp90基因片段和线性载体pVAX1，将所得片段胶回收后进行体外连接，构建重组质粒pVAX1-Hsp90，将疑似阳性的质粒送华大基因测序，将测序鉴定为阳性的重组质粒命名为pVAX1-Hsp90。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150513 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |