CN113025738A - 一种艾美耳球虫常山酮耐药性相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
一种艾美耳球虫常山酮耐药性相关的snp分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于球虫耐药性检测技术领域，具体涉及一种与鸡艾美耳球虫常山酮耐药性相关的SNP分子标记，进一步公开一种鸡艾美耳球虫常山酮耐药性的位点突变检测试剂盒及检测方法。本发明方案通过将鸡球虫常山酮耐药株与敏感株基因组序列进行比对，发现位于球虫PRS基因第1852位的SNP位点，该SNP位点A对应于常山酮敏感，该SNP位点G对应常山酮耐药。经鸡球虫不同临床耐药虫株的验证，该SNP位点可用于区分鉴别常山酮耐药的鸡球虫和敏感的鸡球虫，具有较高的常山酮耐药性检测准确性，其鉴定结果与笼饲实验的鉴定结果一致，可作为常山酮耐药虫株筛选及检测的依据。
Description
技术领域
本发明属于球虫耐药性检测技术领域，具体涉及一种与鸡艾美耳球虫常山酮耐药性相关的SNP分子标记，进一步公开一种鸡艾美耳球虫常山酮耐药性的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种常见的寄生虫病，该病危害极为严重，每年全球因球虫病的感染造成大约30亿美元的损失，是鸡病中引起经济损失最为严重的疾病之一。艾美耳属(Eimeria)球虫隶属顶复门，目前已报道1800余种，现已发现并公认能够引起感染的艾美耳球虫有7种，即柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫。球虫能够破坏鸡肠上皮细胞，在规模化养殖中，以死亡率高为特征的球虫病爆发不常见，临床多见鸡食欲不振、精神萎靡、生产性能下降等症状，感染时常表现两种或两种以上的混合感染。除此之外，艾美耳球虫还是一种理想的模式生物，可以用于研究原虫的裂殖生殖发育，近期的研究还表明，艾美耳球虫能够作为病原载体用于疫苗研发。
现阶段，养殖业对鸡球虫病的防控，多以药物防控为主，疫苗为辅。抗球虫药物仍是现阶段主要的防治手段，目前仍在应用的药物主要包括化学合成类，即磺胺类(磺胺喹恶啉、磺胺氯吡嗪等)、三嗪类(地克珠利、妥曲珠利)、喹啉类(丁氧喹甲酯、苄氧喹甲酯)、吡啶类(氯羟吡啶)、植物碱类(常山酮)以及聚醚离子载体类(莫能霉素、盐霉素、马杜霉素)等。抗球虫药的使用能够在一定程度上降低养殖业中球虫病造成的经济损失，在规模化养殖的发展中发挥重要的作用。但是随着药物的广泛使用，耐药株相继被报道，目前对于球虫病耐药性的研究多局限于各地区耐药株流行情况以及转录组学分析耐药株与敏感株的差异。
常山酮(Halofuginone)作为一类植物碱类药物，能够对球虫早期子孢子、第一代裂殖体以及第二代裂殖体发育有明显的抑杀作用。然而，该药在使用一段时间后就会出现耐药株的相继报道，在同属顶复门原虫--疟原虫上已有常山酮耐药虫株出现的相关报道。对具有常山酮抗药性的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)虫株测其突变位点定位于cPRS基因，主要影响脯氨酸tRNA合成酶的功能。但在艾美耳球虫研究领域，目前还没有常山酮耐药分子机制的相关报道。
目前，对常山酮耐药性的检测方法仍停留在笼饲实验，虽然这种方法的检测结果较为可靠，但是其过程较为复杂且耗时长，需要大量具有活力的卵囊以及实验动物。所以，亟待开发一种能够快速检测鸡球虫常山酮耐药的方法，以便指导临床球虫病用药，降低养殖业损失。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种艾美耳球虫中与鸡球虫常山酮耐药性相关的SNP分子标记；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种利用该SNP分子标记检测鸡球虫常山酮耐药性的试剂盒以及检测方法。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种艾美耳球虫常山酮耐药性相关的SNP分子标记，其包括如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的DNA片段，SNP位点位于该DNA片段的第1852位，其多态性为A/G；
其中，对于常山酮耐药株，该位点所述SNP分子标记的多态性位点为G，对于常山酮敏感株，该位点多态性位点为A。
本发明还公开了一种用于扩增权利要求1所述艾美耳球虫常山酮耐药性相关的SNP分子标记的引物对，包括：
适宜于检测堆型艾美耳球虫的Ac引物对，具体包括：
Ac-F：ATGACCGGCCAGGAAGGTCC；
Ac-R：CTACCAAGACTTCCCTTCCT；和/或，
适宜于检测柔嫩艾美耳球虫的Tn引物对，具体包括：
Tn-F：ATGGGCTCGACGGTGACACC；
Tn-R：CTAGTAGCTCCGGCCAAACA；和/或，
适宜于检测巨型艾美耳球虫的Mx引物对，具体包括：
Mx-F：ATGACAGCCCAAGAAGGTCC；
Mx-R：CTACGCGCAGGCCCTGTCGC；和/或，
适宜于检测和缓艾美耳球虫的Mt引物对，具体包括：
Mt-F：ATGTGGGAGACAGTGCAGCG；
Mt-R：TTATGTATGTATAATCACCT；和/或，
适宜于检测毒害艾美耳球虫的Ne引物对，具体包括：
Ne-F：ATGATTAAAGAGGCTGGTAG；
Ne-R：CTAGTAGCTCCGGCCAAACA；和/或，
适宜于检测布氏艾美耳球虫的Br引物对，具体包括：
Br-F：ATGGCGGCCCAGGAAGGTCC；
Br-R：TTAACGGTTGTTTTGCACCG；和/或，
适宜于检测早熟艾美耳球虫的Pr引物对，具体包括：
Pr-F：ATGTGTCTCATGTGTTTGCTG；
Pr-R：TCACTCTAGGGGGGGGGAGG。
本发明还公开了一种用于检测艾美耳球虫常山酮耐药性的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。
具体的，所述试剂盒可以根据待检测球虫类别选择适宜的引物对，也可以同时含有多种引物对，其余成分如DNA聚合酶以及Marker为实验室常见的试剂，且可以无RNA酶水以及相应的PCR管。。
本发明还公开了所述用于检测艾美耳球虫常山酮耐药性的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以常规方法提取待测虫株样品DNA模板的步骤，以及，以提取的DNA为模板，利用所述试剂盒进行PCR扩增的步骤，并根据PCR扩增结果进行虫株常山酮耐药性的判断。
本发明还公开了所述艾美耳球虫常山酮耐药性相关的SNP分子标记在艾美耳球虫常山酮耐药性检测领域、或艾美耳球虫常山酮耐药虫株筛选领域、或指导鸡抗球虫药物使用领域中的应用。
本发明还公开了所述用于扩增所述艾美耳球虫常山酮耐药性相关的SNP分子标记的引物对在艾美耳球虫常山酮耐药性检测领域、或艾美耳球虫常山酮耐药虫株筛选领域、或指导鸡抗球虫药物使用领域中的应用。
本发明还公开了所述用于检测艾美耳球虫常山酮耐药性的试剂盒在艾美耳球虫常山酮耐药性检测领域、或艾美耳球虫常山酮耐药虫株筛选领域、或指导鸡抗球虫药物使用领域中的应用。
本发明还公开了一种艾美耳球虫常山酮耐药性的检测方法，包括提取待测虫株DNA模板的步骤，以及，以所述引物对或所述试剂盒对所述待测虫株的DNA模板进行PCR扩增的步骤，并根据PCR扩增结果进行虫株常山酮耐药性的判断。
具体的，所述检测方法中，所述PCR扩增的反应程序包括：98℃，30-60s；98℃，15-30s；65℃，20-30s；72℃，25-35s，30-40个循环；72℃，5-10min；优选的，采用的PCR扩增的反应程序为：98℃，30s；98℃，15s；60℃，30s；72℃，30s，35个循环；72℃，10min。
具体的，根据PCR扩增产物的序列判断鸡球虫是否具有常山酮耐药性的方法为：若PCR扩增产物中对应于SEQ ID NO.1所示序列第1852位的核苷酸序列为A，则待测鸡球虫为常山酮敏感虫株，若PCR扩增产物中对应于SEQ ID NO.1所示序列第1852位的核苷酸序列为G，则待测鸡球虫为常山酮耐药虫株。
具体的，所述的艾美耳球虫常山酮耐药性的检测方法，所述艾美耳球虫包括柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫。
本发明方案通过将鸡球虫常山酮耐药株与敏感株基因组序列进行比对，发现位于球虫PRS基因第1852位的SNP位点，该SNP位点A对应于常山酮敏感，该SNP位点G对应常山酮耐药。经鸡球虫不同临床耐药虫株的验证，该SNP位点可用于区分鉴别常山酮耐药的鸡球虫和敏感的鸡球虫，具有较高的常山酮耐药性检测准确性，其鉴定结果与笼饲实验的鉴定结果一致，可作为常山酮耐药虫株筛选及检测的依据。
本发明进一步设计得到可用于特异性扩增所述常山酮耐药性相关的SNP分子标记的引物对，利用该引物对结合PCR技术可实现基于分子水平对鸡球虫常山酮耐药性的检测。该方法具有检测耗时短、操作简单，检测成本低的优势，可广泛应用于鸡球虫常山酮耐药性的临床检测。
本发明进一步公开了一种对鸡球虫常山酮耐药性的检测方法，所述方法利用设计的不同种类虫株的引物对，对所述鸡球虫基因组进行特异性扩增，通过检测SNP位点的基因型即可对鸡球虫是否具有常山酮耐药性进行快速准确的检测。该方法具有的优势在于其不需要大量的新鲜球虫卵囊以及实验动物，且整个实验不受场地等因素限制，与传统的笼饲实验相比，具有耗时短，特异性强以及操作简单，成本低等优势，可广泛用于常山酮耐药性临床检测。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为本发明实施例1中PCR扩增产物的凝胶电泳结果，其中，M为DNA marker，AL5000；泳道2为以检测柔嫩艾美耳球虫的Tn引物对为引物，以柔嫩艾美耳球虫基因组为模板的扩增产物；泳道3为以检测堆型艾美耳球虫的Ac引物对为引物，以堆型艾美耳球虫基因组为模板的扩增产物。
具体实施方式
本发明下述实施例中，涉及的设备及试剂包括：
pEASY-Blunt Simple Cloning Vector和感受态细胞Trans1-T1购自北京全式金生物有限公司；
DNA分子标准量Marker购自北京艾德莱生物科技有限公司；
Q5高保真DNA聚合酶购自NEB公司；
TRIZOL购自赛默飞公司；
Percoll购自cytiva公司；
玻璃珠购自Sigma公司；
反转录试剂盒购自北京全式金有限公司；
TAE缓冲液为按照常规配方配置；
PCR仪、37℃恒温摇床、37℃培养箱、凝胶成像仪、凝胶电泳仪为常规设备。
实施例1与鸡球虫常山酮耐药性相关的SNP分子标记的获得
采集来自不同地区的鸡球虫虫株，经过笼饲试验获得4株常山酮耐药虫株。但考虑这几株虫株属于混合虫株，为保证后续重测序分析的SNP准确性以及降低二代测序产生的随机误差，采取肠道内容物分离以及分离单孢子囊的技术将常山酮耐药株中的柔嫩艾美耳球虫分离出来，从而获得4株具有常山酮耐药性状分离虫株。
将获得的4株样品提取基因组后做高通量测序，100×测序深度，将重测序的数据比对到参考基因组上，之后结合Freebayes call SNP以及基因注释等策略，注释突变基因。之后结合疟原虫上已有的常山酮耐药性突变基因的相关报道，将突变基因锚定在PRS基因上。为了避免高通量测序产生的错误，利用高保真DNA聚合酶扩增的方法进一步验证PRS基因扩增产物测序，发现球虫PRS基因第1852位的SNP位点，该SNP位点A对应于常山酮敏感，该SNP位点G对应常山酮耐药。
实施例2与鸡球虫常山酮耐药性相关的SNP分子标记的检测引物设计
本实施例针对上述实施例1中发现的SNP位点设计扩增引物。
以柔嫩艾美耳球虫为例，本发明在引物设计和筛选过程中发现，由于柔嫩艾美耳球虫PRS基因存在多段内含子序列，为了获得能够高效特异性扩增含有上述SNP位点的DNA片段，该模板应该为反转录的cDNA样品。针对这样的序列，引物设计也应针对cDNA。
比对7种常见的鸡球虫PRS基因组发现，它们的PRS基因保守性很高，本实施例设计包括柔嫩艾美耳球虫的PRS基因扩增引物在内的7种常见鸡球虫PRS基因的扩增引物，委托北京瑞博兴科生物技术有限公司合成引物，具体的引物序列见下表1。
表1常见7种鸡球虫PRS基因PCR扩增引物
分别按照常规方法提取堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫和早熟艾美耳球虫的基因组DNA为模板，利用上表1中的各个扩增引物对进行PCR扩增，具体PCR反应体系及程序如下：
PCR反应体系：上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，dNTP溶液1μL，5×Reactionbuffer溶液10μL，Q5酶0.5μL，用去离子水补足50μL；
PCR反应程序：预变性98℃，时间30s；变性98℃，时间15s；退火温度65℃，时间30s；延伸温度72℃，时间30s；循环35次；最后72℃延伸10min。
经PCR扩增可得到表1所示长度的目标片段，其中，部分扩增片段的电泳检测结果如图1所示。
实施例3利用肠道分离以及单孢子囊接种技术获得遗传背景单克隆后代
由于田间分离的样品多为混种，且遗传背景较为复杂，不利于后期的重测序分析以及PCR的特异性扩增，为获得遗传背景清晰且单一的后代，我们采用肠道分离以及单孢子囊接种的技术，具体方法如下：
1、肠道内容物分离获得耐药虫株
取1-2×104孢子化卵囊接种7-14日龄无球虫感染的AA肉鸡，在排卵囊高峰第7天杀鸡取盲肠内容物，向离心管种加入5倍体积的高温杀死球虫的饱和盐水，3600rpm离心5min，取上清；转移上清至新的离心管内，向其中加入5倍体积的清水，3600rpm离心5min，迅速弃去上清；用4％重铬酸钾转移沉淀至锥形瓶内，孢子化后收集卵囊。
2、提取孢子囊
用高压后的PBS洗去重铬酸钾，向纯化后的卵囊悬液中加入2mm的玻璃珠，涡旋剧烈震荡。镜检观察孢子囊逸出情况，若视野中绝大部分是孢子囊，3000rpm离心5min；弃上清，向沉淀中加入50％percoll，10000rpm离心1min；吸弃上清后，保留沉淀，加入1mL PBS，3000rpm离心5min，重复该步骤3次。
3、单孢子囊分离获得遗传背景单一的耐药虫株
将上述提取的孢子囊利用血细胞计数板计数，之后利用PBS稀释至0.15μL有1个孢子囊；准备烤箱烘烤好的1cm×1cm塑料片、载玻片、剪刀镊子、报纸以及50％甘油水等材料。
将塑料小纸片用镊子夹起贴在载玻片上，每张玻片可以贴若干，塑料纸之间不要太靠近即可。在显微镜下，将光束对准某一塑料纸片的中央，然后用2.5μl的移液器从孢子囊悬液中取0.25μl小心滴在纸片中央，立即镜检，镜检中要确保此液滴中没有卵囊及超过1个的孢子囊，若发现符合此条件的液滴，需进行双人镜检，同时确认方可；不然，则在下一个塑料纸片上重复上述操作。经两人同时确认后，立即用10μl移液器吸取3μl甘油水，悬空垂直滴到塑料纸中央，完全覆盖此小液滴；此时助手取出一只小鸡并保定好，操作者小心夹取此小塑料纸片边缘，另一只手打开小鸡的喙，将塑料纸小心送入口腔深部(可以将有液滴的一面贴在鸡舌头根部)，然后迅速用200μl移液器吸取200μl PBS，缓慢冲洗鸡的口腔；此过程要做好保定，使鸡不得摆动头部，以确保接种成功；重复上述操作，直到所有小鸡均被接种单孢子囊；将小鸡转移到鸡笼或隔离器中，保证饮水和饲料，并做好保温工作。
4、卵囊收集及扩繁
在接种后的第7天杀鸡取盲肠，每收取一只，更换手套一次；在报纸上铺手套一只，取一对盲肠开始操作，沿纵向剪开盲肠，如内有大量的盲肠内容物或粘液，需在自来水下进行冲洗去除；然后用一张玻片固定盲肠，另一张玻片从盲肠的一端刮至另一端，应刮至肌层(刮取后盲肠呈透明的薄膜样)，小心转移刮取物至一个离心管；用5ml PBS将挂在壁上的内容物冲洗到管底；丢弃刮取后的盲肠和手套，剪刀放入装有开水的烧杯浸泡消毒(或者用电磁炉烧水消毒)，用过的玻片另置；更换所戴手套，铺垫新的手套，用未使用的玻片和消毒过的剪刀进行下一对盲肠的操作。
上述操作完毕后，称取胰酶，每管加入0.075g(终浓度约为1.5％，m/v)，混匀后将离心管置于41℃水浴温浴1h，其间每5-10min摇动离心管一次；胰酶消化结束后，将塑料平皿置于操作台上(铺报纸)，将每个离心管中的消化物用纱布直接过滤至平皿中，可再用1mlPBS冲洗纱布；每过滤一个样品需更换纱布；在每个平皿中添加0.5ml重铬酸钾溶液，混匀后于28℃摇床中孢子化；24h时需往每个平皿添加蒸馏水1ml左右，以弥补蒸发损失。
48h左右结束孢子化并在显微镜下检查每个平皿，若有平皿中存在卵囊，且所有卵囊形态均为柔嫩，则此可能是单孢子囊分离成功的样品；对此样品进行卵囊计数(单孢子囊接种产生的卵囊一般只有几百个或更少)；离心收集卵囊(3600rpm，5min)，用以后期传代。
于接种后第5天清粪并倒入4％重铬酸钾，在第10天收集粪便中的卵囊，孢子化后镜检，计数；并且取出一部分卵囊提取子孢子，按照CTAB法提取子孢子，PCR验证卵囊是否为纯种。
实施例4SNP分子标记用于检测实验进化体系产生的常山酮耐药性虫株与其母源虫株差异
利用实施例1获得的SNP分子标记及其扩增引物对实验进化条件下产生的1株(柔嫩株)柔嫩艾美耳球虫常山酮耐药虫株的常山酮耐药性进行检测，具体方法如下：
1、实验进化体系诱导产生常山酮耐药虫株
本实施例模拟田间快速诱导耐药株的试验方案诱导产生常山酮耐药虫株，即以药物工作浓度的剂量对大规模的卵囊群体进行连续筛选，之后逐渐提高药物剂量，经过多代筛选获得耐药虫株。
之后，再按照药物浓度递增的策略诱导产生常山酮耐药虫株，即先以低于推荐药物剂量开始诱导，之后逐渐提高药物剂量，经过多次传代获得常山酮耐药虫株。
选取不同遗传背景且对常山酮敏感的2株艾美耳球虫作为母源虫株，选用7-14日龄无球虫感染的AA肉鸡传代鸡球虫，每只无球虫鸡按照1×104个孢子化卵囊感染，接种前48小时在饲料中添加常山酮，收取接种后5-10天排出粪便中的卵囊。根据相对卵囊产量逐渐提高药物浓度，直至诱导出常山酮耐药虫株。当药物浓度提高时，若收集不到足以传代的卵囊，则将这些卵囊在无药物选择压力的条件下传代一次。本实施例中，传代药物浓度依次为1mg/kg饲料、1.5mg/kg饲料、2mg/kg饲料、3mg/kg饲料、6mg/kg饲料和30mg/kg饲料，且均在不同药物浓度下扩繁3代，以确保获得对该浓度具有抗性的虫株。
2、DNA模板的制备
将诱导的中间代次以及最终浓度诱导的卵囊纯化后，取适量卵囊接种鸡，在第5天取鸡盲肠，提取二代裂殖子。具体方法如下：
向二代裂殖子悬液中加入500μL CTAB缓冲液40μL蛋白酶K，55℃金属浴消化2-3小时，期间数次颠倒混匀。加入40μL的RNA酶，37℃金属浴消化30min，期间颠倒混匀数次。加入等体积的CTAB溶液，剧烈震荡数次，1×104rpm，离心10min。转移上清至新的1.5mL离心管中，每管加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃冰箱静置30min以上。
于4℃，1×104rpm，离心15min，弃上清，保留沉淀，加入1mL 75％乙醇，4℃，1×104rpm，离心5min，弃上清，待乙醇挥发完全后，加入100μL ddH2O溶解，放入-20℃备用。
3、RNA模板制备
考虑到该基因存在多个内含子序列，制备RNA模板，向二代裂殖子加1mL TRIZOL，用移液枪反复吹打，直至裂殖子完全裂解，室温作用5min。
加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，静置3min，4℃、12000rpm离心5min，取上层水相转至预冷的500μL异丙醇，沉淀水相中的RNA，静置10min；4℃、12000rpm离心15min，弃去上清，用75％乙醇洗涤沉淀，4℃、12000rpm离心15min，弃上清。
挥发干净乙醇，按照沉淀量加入无酶无菌双蒸水，利用分光光度计测RNA浓度，-80℃冰箱保存RNA样品。
按照全式金试剂盒要求对RNA样品反转录，反转录体系如下：
表2全式金反转录体系
| 试剂 | 体积 |
| F-Primer | 1 |
| 2×R-Primer | 10 |
| DNA Remover | 1 |
| Random Primer | 1 |
| Oligo | 1 |
| RNase free water | 依据样品浓度 |
| RNA | 补足至20μL |
4、PCR扩增
以步骤3反转录得到的cDNA为模板，采取如下所示的适宜于检测柔嫩艾美耳球虫的Tn引物对进行PCR扩增：
Tn-F：ATGGGCTCGACGGTGACACC；
Tn-R：CTAGTAGCTCCGGCCAAACA；
具体PCR反应体系及程序如下：
PCR反应体系：上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，dNTP溶液1μL，5×Reactionbuffer溶液10μL，Q5酶0.5μL，用去离子水补足50μL；
PCR反应程序：预变性98℃，时间30s；变性98℃，时间15s；退火温度65℃，时间30s；延伸温度72℃，时间30s；循环35次；最后72℃延伸10min。
5、PCR产物检测及连接转化后测序
PCR产物凝胶电泳检测：配置1.5％凝胶块，130V电压，电泳10min，凝胶成像，PCR条带大小为2244bp。
切取条带后，回收并连接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(购自北京全式金生物有限公司)，而后转化到感受态细胞Trans5α(购自北京全式金生物有限公司)中，涂布到含有20μg/ml的氨苄霉素的培养板中，于37℃培养箱中孵育过夜。挑取单克隆后，进行PCR鉴定，并选取阳性克隆委托北京瑞博兴科生物技术有限公司进行测序。
5、检测结果分析
将步骤3获得的敏感虫株对照与纯种耐药虫株的PCR产物进行序列比对，结果如下表3所示。结果显示，敏感虫株的PRS基因第1852位为A，而耐药虫株则为G。将测序后的碱基序列通过软件翻译为氨基酸序列，结果显示，PRS基因的第1852位的A突变为G导致氨基酸发生突变，敏感株的氨基酸有苏氨酸(Thr)突变为丙氨酸(Ala)。
表3敏感虫株和耐药虫株的序列比对结果
| 虫株类型 | 第1852位碱基 | 氨基酸 |
| 敏感虫株 | A | 苏氨酸 |
| 耐药虫株 | G | 丙氨酸 |
实施例5基于SNP分子标记用于检测田间采集的混合鸡球虫样本的常山酮耐药性
利用实施例1获得的SNP分子标记及其针对7种鸡球虫的扩增引物(详见表1)对采集自不同地区的7株分离虫株的常山酮耐药性进行检测，具体方法如下：
1、DNA模板的制备
将孢子化后的4株田间混合鸡球虫样品接种于适龄(7-14日龄)的无球虫鸡，接种剂量5×103-2×104卵囊。收取接种后5-10天粪便中的卵囊。
卵囊孢子化48小时后，进行纯化。将含有卵囊的重铬酸钾倒入干净的离心管中，3600rpm，离心5min，倒出上层液体，用PBS重悬沉淀，重复2-3次；用饱和食盐水重悬沉淀，3600rpm离心5min，将上层含有卵囊的液体导入另一个干净的离心管中，加入5倍体积的PBS，3600rpm离心5min；倒出上清，然后用次氯酸钠溶液重悬沉淀，置于冰上，时间不超过5min为宜，3600rpm离心5min后，吸取上层含有卵囊的液体到另一干净的离心管中，加入5倍体积的PBS离心，重复3-5次，直至无次氯酸钠残留的气味，沉淀即是纯化后的卵囊。
将2mm的玻璃珠用(总体积约为3ml)PBS冲洗2-3遍，并倒入上述卵囊中，在旋涡振荡器上作用5-10min；吸取上层液体并转入干净的EP管中，4℃、12000rpm离心5-10min；弃去上清，加入500ml CTAB溶液和40μL蛋白酶K，55℃作用2小时；待温度降至37℃后，再加入20μL的RNA酶，并于37℃作用30min；待温度降至室温后，加入DNA提取液(酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1)，剧烈震荡30s，然后1000rpm离心5min；弃去上清，加入等体积的异丙醇，-20℃静止30min，然后4℃、12000rpm离心15min；弃去上清，加入1ml浓度为75％的乙醇溶液，离心30s，待乙醇挥发完全后，加入200μL ddH2O溶解，放入-20℃备用。
2、PCR扩增反应条件及反应体系
PCR扩增引物详见表1所示，反应体系及程序同实施例3。
3、PCR产物检测及连接转化后测序
PCR产物检测及连接转化后测序方法同实施例3。
4、检测结果分析
将步骤3获得混合虫株的PCR产物进行序列比对，结果如下表4所示。结果显示，7株田间分离混合虫株中有3株的PRS基因存在第1852的A到G的突变。
将以上鉴定得到的3株突变型混合虫株和4株野生型混合虫株进行笼饲实验，结果显示，突变型混合虫株具有常山酮耐药性而野生型混合虫株不具有耐药性，可见SNP分子标记的检测结果与笼饲实验结果一致。由此可见，本发明基于SNP分子标记的PCR检测方法不仅可以用于纯种柔嫩艾美耳球虫的常山酮耐药性检测，也可以很好地应用于临床样品(混合虫株)的检测。
表4敏感虫株、耐药虫株和混合群体的序列比对结果
| 虫株类型 | 第1852位碱基 | 氨基酸 |
| 敏感虫株 | A | 苏氨酸 |
| 耐药虫株 | G | 丙氨酸 |
| 混合群体 | G | 丙氨酸 |
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种艾美耳球虫常山酮耐药性相关的SNP分子标记，其特征在于，其包括如SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的DNA片段，SNP位点位于该DNA片段的第1852位，其多态性为A/G；
其中，对于常山酮耐药株，该位点所述SNP分子标记的多态性位点为G，对于常山酮敏感株，该位点多态性位点为A。
2.一种用于扩增权利要求1所述艾美耳球虫常山酮耐药性相关的SNP分子标记的引物对，其特征在于，包括：
适宜于检测堆型艾美耳球虫的Ac引物对，具体包括：
Ac-F：ATGACCGGCCAGGAAGGTCC；
Ac-R：CTACCAAGACTTCCCTTCCT；和/或，
适宜于检测柔嫩艾美耳球虫的Tn引物对，具体包括：
Tn-F：ATGGGCTCGACGGTGACACC；
Tn-R：CTAGTAGCTCCGGCCAAACA；和/或，
适宜于检测巨型艾美耳球虫的Mx引物对，具体包括：
Mx-F：ATGACAGCCCAAGAAGGTCC；
Mx-R：CTACGCGCAGGCCCTGTCGC；和/或，
适宜于检测和缓艾美耳球虫的Mt引物对，具体包括：
Mt-F：ATGTGGGAGACAGTGCAGCG；
Mt-R：TTATGTATGTATAATCACCT；和/或，
适宜于检测毒害艾美耳球虫的Ne引物对，具体包括：
Ne-F：ATGATTAAAGAGGCTGGTAG；
Ne-R：CTAGTAGCTCCGGCCAAACA；和/或，
适宜于检测布氏艾美耳球虫的Br引物对，具体包括：
Br-F：ATGGCGGCCCAGGAAGGTCC；
Br-R：TTAACGGTTGTTTTGCACCG；和/或，
适宜于检测早熟艾美耳球虫的Pr引物对，具体包括：
Pr-F：ATGTGTCTCATGTGTTTGCTG；
Pr-R：TCACTCTAGGGGGGGGGAGG。
3.一种可用于检测艾美耳球虫常山酮耐药性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物对。
4.一种权利要求3所述用于检测艾美耳球虫常山酮耐药性的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以常规方法提取待测虫株样品DNA模板的步骤，以及，以提取的DNA为模板，利用所述试剂盒进行PCR扩增的步骤，并根据PCR扩增结果进行虫株常山酮耐药性的判断。
5.权利要求1所述艾美耳球虫常山酮耐药性相关的SNP分子标记在艾美耳球虫常山酮耐药性检测领域、或艾美耳球虫常山酮耐药虫株筛选领域、或指导鸡抗球虫药物使用领域中的应用。
6.权利要求2所述用于扩增权利要求1所述艾美耳球虫常山酮耐药性相关的SNP分子标记的引物对在艾美耳球虫常山酮耐药性检测领域、或艾美耳球虫常山酮耐药虫株筛选领域、或指导鸡抗球虫药物使用领域中的应用。
7.权利要求3所述用于检测艾美耳球虫常山酮耐药性的试剂盒在艾美耳球虫常山酮耐药性检测领域、或艾美耳球虫常山酮耐药虫株筛选领域、或指导鸡抗球虫药物使用领域中的应用。
8.一种艾美耳球虫常山酮耐药性的检测方法，其特征在于，包括提取待测虫株DNA模板的步骤，以及，以权利要求2所述引物对或权利要求3所述试剂盒对所述待测虫株的DNA模板进行PCR扩增的步骤，并根据PCR扩增结果进行虫株常山酮耐药性的判断。
9.根据权利要求8所述的艾美耳球虫常山酮耐药性的检测方法，其特征在于，所述艾美耳球虫包括柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫。
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