CN107823640A

CN107823640A - 一种草鱼呼肠孤病毒类纤突vp56蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107823640A
Application number: CN201711023099.7A
Authority: CN
Inventors: 裴超; 高岩; 孔祥会; 孙效迎
Original assignee: Henan Normal University
Current assignee: Henan Normal University
Priority date: 2017-10-27
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2018-03-23
Anticipated expiration: 2037-10-27
Also published as: CN107823640B

Abstract

本发明公开了一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于基因工程及分子免疫学技术领域。本发明的技术方案要点为：一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗，该亚单位疫苗蛋白由草鱼呼肠孤病毒S7基因节段编码，该草鱼呼肠孤病毒S7基因节段的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白即为草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗蛋白，该亚单位疫苗蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。本发明的亚单位疫苗蛋白注射草鱼鱼体后能够显著刺激鱼体免疫细胞增殖、抗病毒相关基因上调表达以及特异性抗体大量产生，有效提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力，进而用于预防水产养殖中因病毒引起的草鱼出血病。

Description

一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程及分子免疫学技术领域，具体涉及一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）主要感染一龄以内草鱼鱼苗，引起草鱼出血病，主要发病症状为体表及鳍条末端发黑，腹部肿大，突眼，下颌、鳍基充血，口腔、肌肉、内脏有明显出血。草鱼出血病发病季节长，每年6月下旬至9月底是主要的流行季节，8、9月为发病高峰季节，在水温25-30℃最为流行。我国草鱼养殖主要病害有草鱼出血病、肠炎病、赤皮病、烂鳃病和“肝胆综合症”等，其中以草鱼出血病危害最为严重，其发病快、流行广、死亡率高，一旦爆发流行，苗种最高死亡率可达90%，给我国草鱼养殖产业造成重大损害。

通过疫苗免疫草鱼一直以来是预防和控制草鱼出血病的重要方法，研究人员起初采用病鱼的内脏组织研磨成匀浆，然后灭活用来作为疫苗免疫健康草鱼，但是这种方式免疫效果差，而且容易引起鱼体局部或全身反应。随后用细胞培养的病毒，灭活后接种鱼体获得了较好的免疫效果。草鱼呼肠孤病毒在细胞中连续传代后，其毒力会减弱，利用这一原理制备的减毒活疫苗，免疫保护效果良好，但是这种疫苗存在病毒复壮的风险。

近些年来，对于草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗的研究也有所开展，将病毒的外衣壳蛋白基因VP5插入到表达载体中，构建的原核表达亚单位疫苗可以达到50%以上的免疫保护率；将病毒的VP6基因插入到昆虫杆状病毒中构建的病毒载体疫苗可以刺激鱼体产生抗病毒免疫。但是现有的亚单位疫苗种类仍然较少，不足以应对病毒变异导致的疫苗失效的风险，而且越来越多的新型草鱼呼肠孤病毒株被发现和分离，这些新型的草鱼呼肠孤病毒称为II型草鱼呼肠孤病毒，以区别于最早发现的I型草鱼呼肠孤病毒。新型病毒株致病性更强，流行范围更广，而目前针对II型草鱼呼肠孤病毒的疫苗种类数量极少。因此针对新型病毒，寻找草鱼呼肠孤病毒新的抗原位点，应用新的靶标蛋白来制备亚单位疫苗就尤为重要。采用生物信息学的方法分析发现，新型草鱼呼肠孤病毒S7基因节段编码的VP56蛋白结构非常特殊，具有和腺病毒的纤维突起蛋白（fiber protein）相似的结构，因此称之为类纤突蛋白，已知腺病毒是依靠其衣壳上的纤突蛋白首先与细胞接触，然后入侵细胞，在病毒入侵的过程中起至关重要的作用，并且纤突蛋白具有良好的免疫原性，利用纤突蛋白制备的抗体能够中和腺病毒，使其失去感染能力。基于以上研究，本发明将草鱼呼肠孤病毒的类纤突蛋白VP56制备成了亚单位疫苗并免疫注射鱼体，显示该亚单位疫苗能够有效刺激鱼体产生抗病毒抗体，进而提高鱼体的免疫力和抗病毒感染的能力。

目前，未见利用草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白制备亚单位疫苗的相关报道。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗及其制备方法，该亚单位疫苗通过诱导鱼体产生特异性抗体有效提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力，进而用于预防水产养殖中因草鱼呼肠孤病毒感染而引起的草鱼出血病。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗蛋白由草鱼呼肠孤病毒S7基因节段编码，该草鱼呼肠孤病毒S7基因节段的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白即为草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗蛋白，该亚单位疫苗蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。

本发明所述的草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于具体步骤为：

（1）质粒pET32a-VP56的构建，以分离的草鱼呼肠孤病毒的基因组为模板，反转录后用引物S7F1/S7R1进行PCR扩增，产物纯化后用KpnI和Xho I双酶切，回收1kb片段，同时将质粒pET32a(+)用Kpn I和Xho I双酶切，回收5.8kb片段，将上述回收的两个DNA片段用T₄ DNA连接酶连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）后在含氨苄的LB固体培养基上培养，筛选含有质粒pET32a-VP56的阳性重组菌；

（2）疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将含有质粒pET32a-VP56的阳性重组菌在含氨苄的LB液体培养基中于37℃培养过夜，按体积比1:100将培养液转接到新鲜的含氨苄LB培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养6小时，离心收集菌体并用结合缓冲液悬浮，超声波破碎1小时，离心收集沉淀并溶解在含6M尿素的结合缓冲液中，冰上过夜，将溶解上清用Ni-IDA琼脂糖凝胶柱收集回收并透析复性即可获得由序列表SEQ IDNo.1所示碱基序列编码的亚单位疫苗蛋白。

本发明所述的草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗的应用，其特征在于：将该亚单位疫苗按照2µg疫苗蛋白/g鱼体重量注射草鱼腹腔后，通过激发草鱼免疫细胞的增殖提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力。

进一步优选，所述草鱼免疫细胞为淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞。

本发明所述的草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗的应用，其特征在于：将该亚单位疫苗按照2µg疫苗蛋白/g鱼体重量注射草鱼腹腔后，通过诱导草鱼抗病毒基因的表达有效提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力。

进一步优选，所述草鱼抗病毒基因为IgM、IFN I、MHC I和TLR22。

本发明所述的草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗的应用，其特征在于：将该亚单位疫苗按照2µg疫苗蛋白/g鱼体重量注射草鱼腹腔后，通过诱导鱼体产生特异性抗体有效提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力，进而用于预防水产养殖中因草鱼呼肠孤病毒感染而引起的草鱼出血病。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、本发明的亚单位疫苗所使用的草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白位于病毒衣壳结构的表面，具有良好的免疫原性，可诱导草鱼鱼体的特异性和非特异性免疫应答；

2、本发明的亚单位疫苗可诱导草鱼鱼体产生特异性抗体，有效对抗草鱼呼肠孤病毒的感染，免疫保护效率达到78%；

3、本发明的亚单位疫苗制备方法简单，使用时无需添加佐剂，可实现规模化生产。

附图说明

图1为草鱼呼肠孤病毒S7基因扩增图；

图2为在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达重组VP56蛋白，其中泳道1、2、3分别是IPTG诱导菌，4是未诱导菌，5是纯化的重组疫苗蛋白；

图3为亚单位疫苗注射草鱼鱼体后鱼体血液内总的免疫细胞数量变化，注射PBS的草鱼鱼体作为对照组；

图4为亚单位疫苗注射草鱼鱼体后不同时间段内鱼体淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞的百分比变化；

图5为亚单位疫苗注射草鱼鱼体后免疫器官头肾和脾脏中的抗病毒基因IFN I、MHC I、IgM和TLR22的相对表达量变化；

图6为免疫保护草鱼鱼体后鱼体血清中特异性抗病毒抗体含量的变化；

图7为攻毒实验结果，使用亚单位疫苗的实验组和未使用亚单位疫苗的对照组草鱼鱼体存活率的对比图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗的制备

1、质粒pET32a-VP56的构建

草鱼呼肠孤病毒分离自河南新乡市一个养殖池塘，取患草鱼出血病的草鱼内脏，加PBS混合研磨匀浆后，取匀浆液8000g离心，取上清用0.22µm孔径的滤器过滤，过滤液接种到体外培养的草鱼肾细胞（CIK）中，培养一周后收集细胞，细胞中含有增殖的草鱼呼肠孤病毒。RT-PCR检测显示该草鱼呼肠孤病毒为II型草鱼呼肠孤病毒。以该草鱼呼肠孤病毒基因组RNA为模板，用引物S7F1：5’-TTCGGTACCAGTGGAAAATTAGACA-3’和S7R1：5’-GCACTCGAGGTACTTACAGCAAACTACC-3’进行逆转录PCR，逆转录过程为：取基因组RNA模板8µL，引物各1µL，94℃ 5min，立即放入冰上，之后RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5µL，dNTPMixture（10mM each）1µL，5×RT Buffer 3.5µL，AMV Reverse Transcriptase 1µL，RNasefree dH₂O 3.5µL，反应条件为37℃ 1h，75℃ 10min，获得目的基因cDNA。然后取1µL目的基因cDNA为模板进行PCR扩增：95℃预变性5min；95℃ 30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；72℃终延伸10min。PCR产物纯化后用Kpn I和Xho I双酶切，回收1kb的片段。同时将pET32a质粒用相同的酶双酶切，回收5.8kb的片段，将上述回收的两个DNA片段用T₄ DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h，挑取培养基上长出的单克隆菌落，接种含氨苄的液体LB培养基中扩大培养，PCR检测各扩大培养的菌落，选取其中的阳性菌送样检测其中的质粒DNA序列，以验证目的基因片段扩增是否正确以及与质粒是否正确连接。测序验证正确的阳性菌扩大培养后，提取其中的质粒，即pET32a-VP56质粒。

2、亚单位疫苗蛋白的诱导与纯化

将构建好的pET32a-VP56质粒转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），将含有pET32a-VP56质粒的BL21涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上于37℃培养12h，挑取单克隆菌落扩大培养，PCR检测为阳性后，将阳性菌培养液1mL加入到100mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于恒温摇床中于37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6，然后加入1mM的IPTG诱导蛋白表达6h。取1mL菌液来检测蛋白诱导表达情况，显示目的蛋白有明显的表达，分子量大小与VP56蛋白分子量一致（图2）。取8000g离心10min沉淀菌体，培养上清弃掉后用PBS冲洗两次，然后将菌体用20mL的结合缓冲液（2.4g Tris、29.2g NaCl和0.34g咪唑溶解于蒸馏水至1000mL，调pH=7.9）重悬，置于冰上超声波破碎1h。取10000g离心10min，收集沉淀。用含1M尿素的结合缓冲液振荡溶解2h，取10000g离心10min，收集沉淀，以除去部分杂蛋白。用10mL含6M尿素的结合缓冲液溶解沉淀，于4℃过夜溶解。取10000g离心10min，收集上清。将上清加入到Ni-IDA琼脂糖凝胶柱中，凝胶柱中的Ni可以结合其中的VP56蛋白。待上清流完后用10倍柱体积的含6M尿素的结合缓冲液洗脱未结合在柱上的VP56蛋白。用含不同浓度咪唑的洗脱缓冲液（2.4g Tris、29.2g NaCl和360g尿素溶解于蒸馏水至1000mL，其中咪唑浓度分别为20mM、40mM、60mM、100mM和500mM）。将结合在柱上的VP56蛋白洗脱下来，SDS-PAGE检测各洗脱液中重组蛋白的纯度，将含有高纯度重组蛋白的洗脱液放入透析袋中进行透析以除去洗脱液中含有的尿素，透析后得到含有由序列表SEQ ID No.1碱基序列编码的亚单位疫苗蛋白的溶液。

实施例2

草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗的应用

1、亚单位疫苗能够明显增加鱼体免疫细胞的数量

将健康草鱼鱼苗（每尾约20g）60条随机分为两组，每组30条，分别作为实验组和对照组，实验组每尾腹腔注射亚单位疫苗蛋白2µg/g鱼体重量，对照组注射等体积的PBS，25℃饲养。注射后的第1、3、5、7、14、21、28、35天，每天在两组鱼体中各取3条，尾静脉取血，按体积比1:200稀释后利用Neubauer计数板统计免疫细胞数目，并用吉姆萨染色观察，统计一百个免疫细胞中单核细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞各占比例。结果显示，实验组免疫细胞数量在免疫第5天显著升高，第7天达到峰值(8.42±1.9)×10⁷/mL（P<0.05），第14天仍较显著高于对照组（P<0.01）（图3）；实验组中性粒细胞比例在第5天显著增加并达到峰值(25.93±5.60)%，在第7天仍显著高于对照组（P<0.05）；淋巴细胞比例在免疫保护后14天显著增加并达到峰值(85.81±0.73)%（P<0.01），第21天仍显著高于对照组（P<0.05）（图4）。

2、亚单位疫苗能够明显提高鱼体抗病毒基因的表达

注射后第1、3、5、7、14、21、28、35天的草鱼鱼体，各取3条，取头肾和脾脏组织，提取RNA，用荧光定量RT-PCR的方法，检测其中抗病毒基因IFN I、MHC I、IgM和TLR22的表达，结果显示，相对于对照组，免疫组IFN I、MHC I和TLR22这3个免疫基因的表达量在免疫保护一周内都显著增高达到峰值（P< 0.05）。头肾和脾脏中IFN I在免疫保护第5天达到极值分别上调20倍和7.5倍（P < 0.01）；头肾和脾脏中MHC I在免疫保护第5天达到极值分别上调40倍和7.5倍（P < 0.05）；TLR22在头肾中免疫保护第5天上调3.2倍（P< 0.05），在脾脏中免疫保护第3天上调10倍（P < 0.01）。IgM在头肾和脾脏中免疫保护后期第21天达到极值，分别上调48倍（P < 0.01）和10倍（P< 0.05）（图5）。

3、亚单位疫苗能够明显刺激鱼体产生保护性的抗体

将1中采取的实验组和对照组的草鱼鱼体血液凝固分层后，取上层的血清，用ELISA的方法检测其中抗病毒抗体的含量，结果显示，注射疫苗组的鱼体中特异性抗体含量在14天后开始显著增加并持续增加，在第5周仍显著高于对照组，在第28天抗体含量达到最高最高，约为10³（P<0.05）（图6）。

4、亚单位疫苗针对草鱼呼肠孤病毒引起的出血病具有显著的保护效应

同样的将健康草鱼60条分为两组，每组30条，分别作为实验组和对照组，实验组注射重组亚单位疫苗蛋白，对照组注射PBS。注射21天后，给实验组和对照组的每尾鱼注射10个LD₅₀的草鱼呼肠孤病毒进行感染，感染14天后统计两组鱼的死亡数和存活数，计算亚单位疫苗的免疫保护率RPS，RPS=（1-免疫组死亡率/对照组死亡率）×100%。根据实验结果得出的亚单位疫苗针对草鱼呼肠孤病毒的免疫保护率为78%（图7），进而表明该亚单位疫苗能够显著提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

序列表

<110> 河南师范大学

<120> 一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用

<130> 2017

<141> 2017-10-27

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 5

<211> 993

<212> DNA

<213> 草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus)

<400> 5

agtggaaaat tagacactaa ttcgtatacc ggttcatcga gtgtggacat atctggagcg 60

gcggcagaaa agacggtgag cgttagaacg attaacccca tcattgcagg tcaggatggc 120

ttgtccctat cactaagcgg tgtcctagag gttggcgctg gcttattact atcaggtagg 180

tcttggcccc ttacattgga tctacgtgtg agtaccccat tagcatatga ccataccgga 240

gtactatccg ttgtaacacg gtatccctta gatgtgacgt ctgctggcat gggtgtcaac 300

atgcaggtgc ccctacggtt aaacggtgtc gacttaggat tggcatacaa tacgcaggat 360

ttttcgatag ttgacggata tttgactttg aacaagtccc aaggaaaatt ggaggaactc 420

ggtgaggtgg tcaacatgaa cgctactcta gtcgacttaa atgacagtgg attgcaggct 480

ctagagacag atttaagctt ggagaagcct ctcaacgcta tgcaatgcct atttgagcat 540

gagggtacat ggcgttggaa gtttggtgtg cgaatgtcca cggaaccgac gattacaact 600

gtccgtgtta atgttcacag cacttggtct gtcgctgtcc aggaatcaat agcaatttgc 660

gcgataacca ccactacggc tggagctggt aaaggacaag ggccccgggt gactattcct 720

ttcagaagag ctgatctcac cgatgatatg atgcgtgcag gcttcgatgt gtggaagagc 780

gattatatca gggaggaagc atttgtaggt acgttacgtg gcctctaccg acgctggtcc 840

gacaagcatc tacttacgga attctacgca cacggccgtc tctatccaac tgaggatggc 900

atcgagttga ttttaacacc taggtctacg gatgacgagt atgagtgggc tggtttgcgt 960

aatgtgcatt ggacggtagt ttgctgtaag taa 993

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 5

ttcggtacca gtggaaaatt agaca 25

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 5

gcactcgagg tacttacagc aaactacc 28

<210> 5

<211> 330

<212> PRT

<213> 草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus)

<400> 5

Ser Gly Lys Leu Asp Thr Asn Ser Tyr Thr Gly Ser Ser Ser Val Asp

1 5 10 15

Ile Ser Gly Ala Ala Ala Glu Lys Thr Val Ser Val Arg Thr Ile Asn

20 25 30

Pro Ile Ile Ala Gly Gln Asp Gly Leu Ser Leu Ser Leu Ser Gly Val

35 40 45

Leu Glu Val Gly Ala Gly Leu Leu Leu Ser Gly Arg Ser Trp Pro Leu

50 55 60

Thr Leu Asp Leu Arg Val Ser Thr Pro Leu Ala Tyr Asp His Thr Gly

65 70 75 80

Val Leu Ser Val Val Thr Arg Tyr Pro Leu Asp Val Thr Ser Ala Gly

85 90 95

Met Gly Val Asn Met Gln Val Pro Leu Arg Leu Asn Gly Val Asp Leu

100 105 110

Gly Leu Ala Tyr Asn Thr Gln Asp Phe Ser Ile Val Asp Gly Tyr Leu

115 120 125

Thr Leu Asn Lys Ser Gln Gly Lys Leu Glu Glu Leu Gly Glu Val Val

130 135 140

Asn Met Asn Ala Thr Leu Val Asp Leu Asn Asp Ser Gly Leu Gln Ala

145 150 155 160

Leu Glu Thr Asp Leu Ser Leu Glu Lys Pro Leu Asn Ala Met Gln Cys

165 170 175

Leu Phe Glu His Glu Gly Thr Trp Arg Trp Lys Phe Gly Val Arg Met

180 185 190

Ser Thr Glu Pro Thr Ile Thr Thr Val Arg Val Asn Val His Ser Thr

195 200 205

Trp Ser Val Ala Val Gln Glu Ser Ile Ala Ile Cys Ala Ile Thr Thr

210 215 220

Thr Thr Ala Gly Ala Gly Lys Gly Gln Gly Pro Arg Val Thr Ile Pro

225 230 235 240

Phe Arg Arg Ala Asp Leu Thr Asp Asp Met Met Arg Ala Gly Phe Asp

245 250 255

Val Trp Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Glu Glu Ala Phe Val Gly Thr Leu

260 265 270

Arg Gly Leu Tyr Arg Arg Trp Ser Asp Lys His Leu Leu Thr Glu Phe

275 280 285

Tyr Ala His Gly Arg Leu Tyr Pro Thr Glu Asp Gly Ile Glu Leu Ile

290 295 300

Leu Thr Pro Arg Ser Thr Asp Asp Glu Tyr Glu Trp Ala Gly Leu Arg

305 310 315 320

Asn Val His Trp Thr Val Val Cys Cys Lys

325 330

Claims

1.一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗蛋白由草鱼呼肠孤病毒S7基因节段编码，该草鱼呼肠孤病毒S7基因节段的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白即为草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗蛋白，该亚单位疫苗蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。

2.一种权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于具体步骤为：

（1）质粒pET32a-VP56的构建，以分离的草鱼呼肠孤病毒的基因组为模板，反转录后用引物S7F1/S7R1进行PCR扩增，产物纯化后用Kpn I和Xho I双酶切，回收1kb片段，同时将质粒pET32a(+)用Kpn I和Xho I双酶切，回收5.8kb片段，将上述回收的两个DNA片段用T₄ DNA连接酶连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）后在含氨苄的LB固体培养基上培养，筛选含有质粒pET32a-VP56的阳性重组菌；

3.权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗的应用，其特征在于：将该亚单位疫苗按照2µg疫苗蛋白/g鱼体重量注射草鱼腹腔后，通过激发草鱼免疫细胞的增殖提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力。

4.根据权利要求3所述的草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗的应用，其特征在于：所述草鱼免疫细胞为淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞。

5.权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗的应用，其特征在于：将该亚单位疫苗按照2µg疫苗蛋白/g鱼体重量注射草鱼腹腔后，通过诱导草鱼抗病毒基因的表达有效提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力。

6. 根据权利要求5所述的草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗的应用，其特征在于：所述草鱼抗病毒基因为IgM、IFN I、MHC I和TLR22。

7.权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗的应用，其特征在于：将该亚单位疫苗按照2mg疫苗蛋白/g鱼体重量注射草鱼腹腔后，通过诱导鱼体产生特异性抗体有效提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力，进而用于预防水产养殖中因草鱼呼肠孤病毒感染而引起的草鱼出血病。