CN110256576A - 一种柔嫩艾美耳球虫so7-il-2蛋白及制备方法 - Google Patents

一种柔嫩艾美耳球虫so7-il-2蛋白及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫SO7‑IL‑2蛋白及制备方法，是基于毕赤酵母为载体的柔嫩艾美耳球虫SO7‑IL‑2蛋白，为一种新型的柔嫩艾美耳球虫重组酵母蛋白，本发明采用重组酵母蛋白全菌破碎和诱导表达的蛋白免疫鸡只，全菌破碎法提取的重组蛋白的保护效果更强；通过检测体液免疫及细胞免疫水平，结果重组酵母球虫全菌破碎和诱导表达的蛋白组均相比对照组有明显上升，可用于柔嫩艾美耳球虫病的预防。

Description

一种柔嫩艾美耳球虫SO7-IL-2蛋白及制备方法
技术领域
本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫SO7-IL-2蛋白及制备方法，是基于毕赤酵母为载体的柔嫩艾美耳球虫SO7-IL-2蛋白，为一种新型的柔嫩艾美耳球虫重组酵母蛋白，用于柔嫩艾美耳球虫病的预防，属于基因工程技术领域。
背景技术
柔嫩艾美耳球虫是鸡的一种重要的寄生虫，寄生在细胞内的顶复门原虫，主要寄生在鸡的盲肠内，可引起鸡体重下降，严重的肠道病变和死亡，严重危害养禽业的发展。该病发生于15~50日龄的雏鸡中，发病率高达 50%~70%，死亡率约为 20%~30%。据估计，全球每年因柔嫩艾美耳球虫病造成的经济损失约为30亿美元。由于该病可引起鸡体的生长发育、产蛋率下降和死亡等，给养鸡业带来巨大危害及损失。药物预防是目前生产中控制球虫病最有效的措施，但长期使用药物防治球虫会导致耐药虫株以及药物残留等诸多问题。迫使人们寻求新的柔嫩艾美耳球虫病预防方法，其中免疫预防是控制柔嫩艾美耳球虫病的一种理想方法。新型的柔嫩艾美耳球虫蛋白疫苗的研究日渐引起研究者的兴趣，故研制出一种免疫效果好、使用安全的疫苗用于防治柔嫩艾美耳球虫病很有必要。
毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的真核表达系统。能够对表达的蛋白产物进行糖基化等加工修饰，且表达量大，操作简便。该系统表达产物从免疫学活性和生物学功能来讲均与天然蛋白质相对接近。毕赤酵母具有真核生物完整的蛋白加工、折叠、翻译后修饰等许多优点，且可以分泌表达较高的生物活性外源蛋白。因此研制安全、高效的柔嫩艾美耳球虫重组酵母疫苗是未来的防治手段之一。
发明内容
本发明目的是提供一种柔嫩艾美耳球虫SO7-IL-2蛋白及制备方法，基于毕赤酵母为载体的制备柔嫩艾美耳球虫蛋白，用于鸡柔嫩艾美耳球虫病的预防。
本发明所述的一种柔嫩艾美耳球虫SO7-IL-2蛋白，技术解决方案如下：
根据柔嫩艾美耳球虫保护性抗原SO7基因和鸡IL-2基因序列，利用primer5.0设计引物，分别扩增SO7基因与鸡IL-2基因，并将其串联，酶切鉴定正确后回收目的片段，将目的基因与表达载体pPICZαA连接。构建的重组质粒进行PCR和双酶切鉴定及测序，测序正确的重组质粒进行甲醇诱导表达，利用Western bloting进行分析，获得柔嫩艾美耳球虫重组酵母蛋白。
本发明提供的柔嫩艾美耳球虫重组酵母蛋白，将其命名为pPICZαA-S07-IL-2。
本发明以柔嫩艾美耳球虫保护性抗原SO7基因为例，进行重组酵母蛋白的制备。
重组酵母蛋白疫苗pPICZαA-S07-IL-2的制备：
首先提取柔嫩艾美耳球虫和鸡脾细胞的总RNA，并反转录为cDNA，通过PCR法扩增SO7基因、IL-2基因，并将两基因进行串联，然后连接至pMD18-T、并在DH5α克隆，且通过测序及酶切鉴定，目的片段大小为657 bp、468 bp、1141 bp。将重组质粒pMD18-T-SO7、pMD18-T-IL-2、pMD18-T-SO7-IL-2线性酶切并连接至表达载体pPICZαA，电转化至酵母细胞X33中进行诱导表达，并对表达产物进行Western blot分析鉴定，制备柔嫩艾美耳球虫重组酵母蛋白疫苗。
免疫效果检测：
分别纯化pPICZαA-S07-IL-2、pPICZαA-S07、pPICZαA-IL-2重组酵母全菌破碎和诱导表达蛋白，以100 ug/只的剂量通过腿部肌肉注射免疫，并同时设pPICZαA空载体组和红、白对照组，三免一周后进行攻虫试验，每只鸡攻1×104柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，对保护率、相对增重率、OPG、ACI等指标进行综合评价重组酵母蛋白疫苗的保护效果。三次免疫结束后对鸡血清抗体水平、细胞因子（IL-2、IL-4和IFN-γ）、T淋巴细胞增殖进行检测。结果表明重组酵母蛋白疫苗pPICZαA-S07-IL-2免疫雏鸡后能诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,pPICZαA-S07-IL-2免疫组和pPICZαA-S07免疫组与对照组相比，可以产生更高水平的抗体，诱导产生的细胞因子IL-2和IFN-γ水平升高，并能促进T淋巴细胞的增殖，且均差异极显著（P<0.01）。三次免疫后进行攻虫试验，结果发现pPICZαA-S07-IL-2免疫组和pPICZαA-S07免疫组与红对照组相比，卵囊数减少，体重增加，盲肠病变减轻，各项指标均明显优于对照组。经过综合评价红对照组ACI值为115.57，全菌破碎法重组酵母蛋白疫苗pPICZαA-S07-IL-2免疫组和pPICZαA-S07蛋白免疫组的ACI分别为175.48和171.69，显示出较好的保护性效果。
本发明的积极效果在于：提供一种新型的柔嫩艾美耳球虫重组酵母蛋白，基于毕赤酵母制备的重组柔嫩艾美耳球虫蛋白不仅能高效表达目的基因，而且酵母细胞壁主要成分有葡聚糖、甘露寡糖、糖蛋白和几丁质；其中的活性成分葡聚糖和甘露寡糖能够刺激细胞免疫和体液免疫。是本发明采用重组酵母蛋白全菌破碎和诱导表达的蛋白免疫鸡只，全菌破碎法提取的重组蛋白的保护效果更强；通过检测体液免疫及细胞免疫水平，结果重组酵母球虫全菌破碎和诱导表达的蛋白组均相比对照组有明显上升，可用于柔嫩艾美耳球虫病的预防。
本发明SO7 基因编码的蛋白具有良好的免疫原性，能减轻柔嫩艾美耳球虫攻击后的病变程度。IL-2主要是由T淋巴细胞或T淋巴细胞系产生的一类最有力的T细胞生长因子，能够有效提高免疫功能，促进T、B淋巴细胞的增殖、分化并可增强NK细胞、单核细胞等杀伤活性。据报导包含IL-2和球虫基因的融合蛋白能够增强球虫抗原的免疫原性，并对随后的球虫攻击产生更好的保护效果。因此将IL-2基因串联SO7基因制备出的酵母蛋白效果更佳。
附图说明
图1为本发明扩增克隆出的SO7-IL-2基因；
图2为本发明重组质粒pMD18-T-SO7-IL-2双酶切鉴定；
图3为本发明重组质粒pPICZαA-S07-IL-2的PCR鉴定；
图4为本发明重组质粒pPICZαA-S07-IL-2双酶切鉴定；
图5为本发明重组蛋白pPICZαA-S07-IL-2的Western blotting分析；
图6为本发明鸡血清中抗体水平的变化；
图7为本发明鸡血清中细胞因子水平变化；
图8为本发明脾脏T淋巴细胞增殖水平变化。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明。下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
重组酵母蛋白pPICZαA-S07-IL-2的制备：
根据GenBank SO7，鸡IL-2 基因序列和克隆载体pMD18-T、表达载体pPICZαA的多克隆位点序列，应用 Primer5.0 软件设计引物，用于SO7与IL-2基因的扩增,然后再SO7基因的上游与IL-2基因下游加入linker（GGTGGAGGCGGTTCAG），。SO7与IL-2基因序列合成引物见表1。
表1 引物序列
将扩增克隆出的目的基因SO7-IL-2（图1）纯化后与pMD18-T载体并进行酶切及测序鉴定（图2），将目的基因SO7-IL-2与酵母载体pPICZαA相连，连接产物电转化至X33感受态细胞，将经SacI酶切线性化的质粒10 μg与100 μL酵母感受态，轻柔混匀；冰浴5min后移入冰冷的电转杯中，利用电转仪电击后，加入600 μL冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL的 EP管中，30℃静置培养1 h；将菌体悬液涂布于含100 μg.mL-1 Zeocin的 YPDZ平板上，取100 μL涂布到平板上；平板在28-30℃条件下培养3-4 d至有转化子出现；筛选出阳性单克隆菌落，并提取酵母质粒，双酶切鉴定后1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物；用KpnI、XbaI进行双酶切反应，重组质粒命名为pPICZαA-S07, 用XbaI、NotI进行双酶切反应，重组质粒命名为pPICZαA-IL-2, 用KpnI、NotI进行双酶切反应，重组质粒命名为pPICZαA-S07-IL-2,并通过PCR进行验证（如图3和4所示）。
将PCR鉴定正确的菌液加入5 mL YPD液体培养基中30 ℃ 200 r/min,培养24 h。取500 μL加入30 mL BMGY培养基中，30 ℃ 200 r/min,培养24 h，直至OD值>2.5，1 500 r/min离心菌液10 min；1 mL BMMY液体培养基重悬菌体沉淀，取500 μl重悬后菌液加入到30ml BMMY液体培养基中30 ℃ 200 r/min继续培养，每隔12 h加入240 μL 100％甲醇进行诱导，24 h后每隔24 h补加240 μL100％甲醇直至96 h，加入甲醇前各取1 mL菌液离心，收集上清液，western blot方法检测目的蛋白（图5）。
甲醇诱导表达目的蛋白：将鉴定为阳性的酵母菌落摇瓶培养与20 mL BMGY中，48小时收集菌体转移至200 mL的BMMY中，培养条件同前，2000 r/min离心收集第3天上清。测量蛋白浓度后标记，-20 ℃备用。
全菌破碎法制备目的蛋白：将含有SO7蛋白、IL-2蛋白、SO7-IL-2蛋白的酵母宿主菌X33以及空酵母载体接种于500 mL YPD培养基，菌液饱和后，室温2000 r/min离心收集酵母细胞，加入200 μL细胞裂解液重悬酵母细胞，用酸洗玻璃珠破碎酵母细胞，提取蛋白，测定蛋白浓度备用。
试验例1
重组酵母蛋白疫苗pPICZαA-S07-IL-2抗柔嫩艾美耳球虫的保护效果
在严格消毒无球虫环境下，饲养270只1日龄雏鸡，饲养至6日龄，随机分为10组，每组30只。分别为pPICZαA-SO7-IL-2（全菌蛋白组A）、pPICZαA-SO7-IL-2（表达蛋白组B）、 pPICZαA-SO7（全菌蛋白组C）、pPICZαA-SO7（表达蛋白组D）、pPICZαA-IL-2（全菌蛋白组E）、pPICZαA-IL-2（表达蛋白组F）、空载体组、红对照组、白对照组并标记翅号，免疫组均进行肌肉注射，免疫组分别进行三次免疫，肌肉注射100 μg／只，7 day第一次免疫，21 day第二次免疫，35 day第三次免疫，药物组41 day-48 day按说明书饲喂， 42 day以E.tenella孢子化卵囊1×104 个／只进行攻虫，白对照组接种PBS，每次免疫前与攻虫前每组随机选5只鸡进行心脏采血并收集血清，-20 ℃保存备用。（分组见表2）。
表2 . 动物分组及免疫程序
组别 7day 21day 35day 42day攻虫
全菌蛋白组A 100μg／只 100μg／只 100μg／只 1×10<sup>4</sup> 个／只
表达蛋白组B 100μg／只 100μg／只 100μg／只 1×10<sup>4</sup> 个／只
全菌蛋白组C 100μg／只 100μg／只 100μg／只 1×10<sup>4</sup> 个／只
表达蛋白组D 100μg／只 100μg／只 100μg／只 1×10<sup>4</sup> 个／只
全菌蛋白组E 100μg／只 100μg／只 100μg／只 1×10<sup>4</sup> 个／只
表达蛋白组F 100μg／只 100μg／只 100μg／只 1×10<sup>4</sup> 个／只
空载体组 100μg／只 100μg／只 100μg／只 1×10<sup>4</sup> 个／只
红对照组 PBS PBS PBS 1×10<sup>4</sup> 个／只
白对照组 PBS PBS PBS PBS
评价指标有：存活率；相对增重率；盲肠病变记分；克粪便卵囊数（OPG），病变减少率和抗球虫指数（ACI）。
其中，存活率=实验结束时每组存活数/攻虫前存活数×100%；
相对增重率= ( 试验组增重 / 未免疫未攻虫组增重) ×100 %;
盲肠病变计分=（免疫组计分/红对照组计分）×100%；OPG=（X1+X2）/2÷0.15×60=N×200（0.15 表示计数室有效体积为 0.15ml）；
ACI=（存活率+相对增重率）-（病变值+卵囊值）。
同时在免疫之前和攻虫前每组随机选取5只鸡进行颈静脉采血和收集脾脏淋巴细胞，测定血清中抗体水平，IL-2、IL-4和IFN-γ表达水平，鸡脾脏淋巴细胞增殖情况等。
免疫保护效果观察：
临床观察，攻虫后，A、B 免疫组和C、D免疫组精神状态较好，但攻虫第 5d后有个别鸡只出现血便和食欲减退的状况，E、F免疫组pPICZαA空载体对照和红对照组鸡只出现精神萎靡、食欲减退、羽毛杂乱、血便等现象，除红对照组以外各组均未出现死亡（参见表3）：
表3.重组pPICZαA-S07-IL-2抗E. tenella的保护效果
组别 增重（g） X 相对增重率% 卵囊值10<sup>6</sup>个X 保护率% 盲肠病变记分X 相对病变
全菌蛋白组A 86.24* 87.48 0.63** 76.96 1.10* 42
表达蛋白组B 85.69* 86.35 0.69** 73.84 1.30* 52
全菌蛋白组C 84.76* 85.69 0.72** 71.22 1.30* 52
表达蛋白组D 84.13* 85.47 0.81** 70.69 1.40* 56
全菌蛋白组E 83.57 84.25 0.89* 68.54 1.40 56
表达蛋白组F 81.27 83.22 0.97* 61.29 1.60 59
空载体组 82.19 82.96 1.69 45.67 2.40 67
红对照组 45.27 66.57 2.85 0 3.10 100
白对照组 97.96 100 --- --- --- ---
由表3可以看出增重情况：A、B免疫组相对增重率最高，其次是C、D免疫组（P＜0.05）。E、F免疫组较红对照组也有明显增重。pPICZαA空载体免疫组较红对照组增重率变化不明显（P＞0.05）。A免疫组相对于B免疫组增重也有所增加，变化不显著（P＞0.05）。从表3可以看出OPG情况：A、B与C、D免疫组卵囊减少率较红对照组变化明显（P＜0.01），E、F免疫组较红对照组有变化（P＜0.05），空载体组卵囊减少率变化不明显（P＞0.05）。A免疫组相对于B免疫组卵囊值较少，卵囊减少率变化不明显（P＞0.05）。盲肠病变记分（表3）：每组鸡只口服1×104 个孢子化卵囊后，A、B与C、D免疫组盲肠病变计分明显小于红对照组（P＜0.05）。E、F免疫组、空载体免疫组与红对照组相比变化不明显（P＞0.05）。A免疫组盲肠病变记分小于B免疫组，变化不明显（P＞0.05）。 ACI，由存活率、增重、卵囊值等计算各免疫组和对照组ACI。
表4.重组pPICZαA-S07-IL-2抗E. tenella的抗球虫指数
组别 存活率 相对增重率（%） 病变值 卵囊值 抗球虫指数（ACI)
全菌蛋白组A 100 87.48 11 1 175.48
表达蛋白组B 100 86.35 11 1 174.35
全菌蛋白组C 100 85.69 13 1 171.69
表达蛋白组D 100 85.47 13 1 171.47
全菌蛋白组E 100 84.25 13 1 170.25
表达蛋白组F 100 83.22 14 1 168.22
空载体组 100 82.96 14 1 167.96
红对照组 90 66.57 31 10 115.57
白对照组 100 100 0 0 200
从表4可以看出：A、B免疫组 ACI 为175.48、174.35； C、D免疫组 ACI 为 171.69、171.47，保护效果良好。A免疫组相比于B免疫组保护效果更好。E、F免疫组与 pPICZαA 免疫组 ACI 分别为 169.25、168.22和 167.96，保护效果较差。
鸡体的免疫应答：在三次免疫之前和攻虫前每组随机选取5只鸡进行颈静脉采血和收集脾脏淋巴细胞。用于以下血清中的抗体水平、细胞因子（IL-2、IL-4、IFN-γ）和T淋巴细胞增殖情况等检测：
1、抗体水平检测：利用间接 ELASA 法检测各阶段每组鸡血清抗体水平的变化。以柔嫩艾美耳球虫全虫蛋白作为抗原包被酶标板，感染鸡球虫鸡只的阳性血清和健康鸡血清分别作阳性、阴性对照。每孔100 μg包被过夜，每孔加入200 μlPBST洗涤三次，每次5 min；随后每孔加入200 μl封闭液37℃封闭2h，洗涤，将待测血清和对照组血清分别加入，每孔100 μl，进行3组平行试验。37℃孵育1 h，洗涤，滤纸拍干后，每孔加入100 μl TMB显色液37℃避光30min后，每孔加入100 μl终止液10 min，测OD 490 nm处吸光值。结果表明，A、B免疫组和C、D对照组随着免疫次数的增加，抗体水平升高显著（P＜0.05），E、F免疫组和对照组相比抗体水差异不显著（P＞0.05）（图6所示）。
、细胞因子检测：用鸡细胞因子ELISA检测试剂盒对一免前、二免前、三面前和攻虫前鸡血清中的IL-2、IL-4、IFN-γ水平进行检测。结果表明，三次免疫后，A、B免疫组与C、D对照组相比 IL-2 和 IFN-γ 水平上升极显著（P＜0.01），与E、F对照组相比有所升高，但差异不明显（P＞0.05），E、F免疫组 IL-2 水平较对照组和空载体对照组上升显著（P＜0.01），而各免疫组IL-4水平无明显差异（P＞0.05）。（图7所示）。
、T淋巴细胞增殖试验：分别在一免、二免、三免以及攻虫前取脾脏淋巴细胞，用MTT法检测各组T淋巴细胞增殖情况。结果表明A组、B组与C组、D组的T淋巴细胞增殖水平较对照组升高明显（P＜0.05），A、B免疫组 T 淋巴细胞增殖水平较pPICZαA空载体对照组和白对照组相比差异极显著（P＜0.01）（图8所示）。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种柔嫩艾美耳球虫SO7-IL-2蛋白及制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 657
<212> DNA
<213> 柔嫩艾美尔球虫SO7(Eimeria tenella SO7 )
<400> 2
atgagtctgt catcttatcc tgatagagat ggttctacct cgtcggatat tcatcctggt 60
atctggaaca cggaatatat aaaatatatc aagaaatatt tgaactatga ttcatattaa 120
atattcagac ctctcgatcg gattcaaaaa aattttcttt tcaaagaaag aatttagaag 180
ctagaaatcg aaagattttt cttctttcaa actcctcttt atgcctattt tgtttaatca 240
acagacgaat ttttttttta tttttagtca ttatacctat cctattgatt gaataagtga 300
tgatccgatg gttcttactc aaggaatctt tgggcttagc tttggggttt tattgaatca 360
tcgtggttcg agtatgaatc tggggtttca atcgattcta tagggtctta acaagagaaa 420
ttcctattaa tgataaaaaa aaatagtaaa agccacatta cacacaataa aaaaaatagg 480
gaaagagaat attcaagagg cctgtagtaa caatcaacat aaagacgaat gagccgactt 540
gatattttgg cattatcccc acaaagaaga actttcggat ttttattcct tcgtatcttc 600
cgaaaagaga aaatcaggga ttaataagtt tcaaactttc tattctatta tatatcc 657
<210> 2
<211> 468
<212> DNA
<213> 鸡IL-2(chicken IL-2)
<400> 2
atgtacaaga tacaactctt gtcttgcatt gcactaactc ttgcactcgt tgcaaacggt 60
gcacctactt caagctctac ggggaacaca atgaaagaag tgaagtcatt gctgctggat 120
ttacagttgc ttttggagaa agttaaaaat cccgagaacc tcaagctctc caggatgcat 180
acatttaact tctacatgcc caaggttaac gctacagaat tgaaacatct taagtgttta 240
ctagaagaac tcaaacttct agaggaagtg ctagatttag ctccaagcaa aaacctgaac 300
accagagaga tcaaggattc aatggacaat atcaagagaa tagttttgga actacaggga 360
tctgaaacaa gattcacatg tgaatatgat gatgcgacag taaaggctgt agaatttctg 420
aacaaatgga ttaccttttg tcaaagcatc tactcaacaa tgacttga 468

Claims (3)

1.一种柔嫩艾美耳球虫SO7-IL-2蛋白，其特征在于是基于毕赤酵母为载体的制备柔嫩艾美耳球虫蛋白，其电泳图如图4所示。
2.用于扩增SO7与IL-2基因的引物，具有以下序列：
SO7 ：
KpnI：5’-GGTACCATGGGACTCGTGGGCGGCGGGTGGAGGCGGTTCAG -3’；
XbaI：5’-TCTAGATCTCCTGGGTGTGGGGAAT -3’；
IL-2 ：
XbaI：5’-TCTAGAATGTGCAAAGTACTGATCTTTGG -3’；
NotI： 5’-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGCCGCTTATTTTTGCAGATATCTCAC -3’。
3.如权利要求1所述的一种柔嫩艾美耳球虫SO7-IL-2蛋白的制备方法，其特征在于：
根据柔嫩艾美耳球虫保护性抗原SO7基因和鸡IL-2基因序列，设计如权利要求2所述的引物，分别扩增SO7基因与鸡IL-2基因，并将其串联；
2）酶切鉴定正确后回收目的片段，将目的基因与表达载体pPICZαA连接；
3）构建的重组质粒进行PCR和双酶切鉴定及测序，测序正确的重组质粒进行诱导表达，利用Western bloting鉴定，即得。
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