CN103319593A

CN103319593A - 一种抗StxⅡ单克隆抗体

Info

Publication number: CN103319593A
Application number: CN2013101369926A
Authority: CN
Inventors: 焦永军; 曾晓燕; 郭喜玲; 史智扬; 汪华; 周明浩
Original assignee: JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Current assignee: JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Priority date: 2013-04-19
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-04-19
Also published as: CN103319593B

Abstract

本发明公开了一种抗StxII单克隆抗体，所述单克隆抗体其重链氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2，轻链氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4，其中重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；本发明公开了上述抗体纯化志贺毒素的方法；本发明所述的抗体可以用于志贺毒素的检测以及治疗由志贺毒素感染引起的疾病。

Description

一种抗StxⅡ单克隆抗体

技术领域

本发明涉及一种抗体，具体而言涉及一种抗StxII的鼠源抗体。

背景技术

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)感染是一种重要的人畜共患病，在世界各地包括发达及发展中国家都有流行，其感染具有暴发性、强烈的致病性与致死性等特点，已成为全球性的公共卫生问题，对人类健康构成巨大威胁。EHEC感染可使人患腹泻(Diarrhea)、出血性结肠炎(Hemorrhagic Colitis，HC)，还可引发溶血性尿毒综合征(Hemolytic Uremic Syndrome，HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(Thromboric Thromobocytopenic Porpura，TTP)等严重并发症，特别是HUS可对患者肾脏造成不可恢复性的功能损伤，病死率较高。该致病菌自上个世纪80年代首次被发现以来，已经引起多次大规模暴发。[K C Kain，R L Barteluk，M T Kelly，et al.Etiology of childhood diarhea in Beijing，China.J.Clin.Microbiol.1991，29(1)：90-95]我国江苏、安徽及河南三省交界部分地区于1999-2000年多次暴发了EHEC O157:H7感染性腹泻病并发急性肾衰，先后共有230例患者发展成HUS，死亡205人，恢复者也造成了肾脏、及神经系统功能损伤等后遗症。美国2006年夏季也发生了由于食用污染的菠菜而导致EHECO157:H7感染事件，先后波及26个州，共有183人发病，29人引发HUS，3人死亡，引起世界广泛关注。2011年欧洲包括德国等在内的多个国家也暴发了人感染EHEC O104:H4事件。

研究表明，EHEC感染的主要致病机理可分为两个方面，一是由菌体基因组毒力岛LEE(Locus of Enterocyte Effacement)编码的多种致病因子所介导的粘附抹平机制(Attaching and Effacing，A/E)，通过A/E机制，细菌可破坏肠上皮细胞，粘附并定植于肠道；二是分泌志贺毒素(Shiga toxin，Stx)，Stx可以穿越破损的肠上皮细胞进入血液循环，与其受体-丙糖酰基鞘氨醇Gb3或丁糖酰基鞘氨醇Gb4结合，造成肠道、中枢神经系统等器官的损伤，特别是Gb3受体含量较高的肾脏，受损后易引发HUS，危及生命。

该毒素分为Stx1和Stx2两个亚型，临床引起HUS的大多为Stx2。由于Stx是由整合到EHEC基因组中λ噬菌体基因编码，临床上某些抗生素的使用容易使残存的细菌进入应激状态，噬菌体从静止的溶源状态进入裂解状态，在肠道内产生大量的Stx毒素，并进入血液循环，使患者发生HUS。所以作为引发HUS的物质基础，Stx，特别是Stx2已成为诊断、治疗EHEC感染及其并发症的靶向分子。

通过基因工程表达出功能性、全分子的Stx毒素几乎是不可能的，它受到了诸如A、B两个亚单位表达效率的匹配和后期的组装等条件的限制，因此对该毒素精确结构的解析必须依赖于天然毒素分子的提纯。在食品污染检测中也需要Stx2毒素标准品用于样品中志贺毒素毒素的定量。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种单克隆抗体S2D8，所述抗体能够与II型志贺毒素特异性结合，可以用于志贺毒素的检测；此外，所述抗体与II型志贺毒素具有较高的亲和活性，所以还可以用于志贺毒素的纯化。

本发明采用杂交瘤细胞技术，以纯化的II型志贺毒素为靶标，筛选鼠源抗体，获得一株具有结合活性的鼠源单克隆抗体分子S2D8。

本发明所述的S2D8抗体分子可特异地捕捉志贺毒素，对利用该抗体纯化的StxII的毒性特征研究结果表明，毒素分子获得富集、纯化，具有明显的毒性特征，说明本发明所述的抗体纯化的毒素能保持天然活性。

本发明公开了一种抗II型志贺毒素的鼠源单克隆抗体S2D8，所述单克隆抗体S2D8包括重链和轻链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4所示，其编码基因分别如序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3所示

本发明还公开了上述单克隆抗体S2D8的制备方法，主要包括如下：

1.抗StxII单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

首先，融合蛋白StxIIA-GST分三次免疫5周龄雌性Balb/c小鼠。取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，融合后10天，从每孔中吸50μl上清，加到包被有StxIIA-GST的96孔ELISA板(用1％的BSA封闭)，室温孵育对于阳性克隆，按上述方法检测其对GST标签蛋白的反应性，只有与StxIIA-GST融合蛋白结合而与GST不结合的抗体克隆才被保留，收集阳性孔细胞，重悬于HT选择培养基中，采用有限稀释法稀释细胞，并种植于96孔细胞培养板中，5天后观察，对确定只有一个细胞克隆生长的孔，作ELISA进行鉴定。对阳性孔细胞进行有限稀释，经过3-4次单细胞分离培养，直至获得稳定的杂交瘤细胞克隆。

2.单克隆抗体S2D8重、轻链可变区基因的克隆

取对数生长期的S2D8杂交瘤细胞，采用Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA，逆转录得到cDNA，使用合成的VL和VH的轻重链引物分别进行PCR扩增，根据大连TAKARA公司TA克隆试剂盒说明书，将单抗S2D8重、轻可变区基因PCR产物插入pMD-18T载体，送公司测序。

3.单克隆抗体S2D8可变区氨基酸序列和互补决定区氨基酸序列的分析

用www.expasy.org在线软件将单克隆抗体S2D8的轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列，单克隆抗体S2D8的重链和轻链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示；根据Kabat数据库确定单克隆抗体S2D8重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；

利用本发明所述的单克隆抗体S2D8纯化了StxII，并对纯化后的 StxII做毒素特征鉴定，纯化方法如下：

1)称量1g柱层析填料CNBr-activated Sepharose4B(GE Healthcare)至2mMHCl中溶胀，然后用2mM HCl充分洗涤。

2)把5ml溶于偶联缓冲液(0.2M NaHCO₃，0.5M NaCl)浓度为10mg/ml的单克隆抗体S2D8和S1D8分别与溶胀的柱填料混合，4℃过夜。

3)用偶联缓冲液洗去多余的抗体分子，柱填料中多余的活性基团则用0.1M Tris-HCl封闭，室温作用2小时，抗体-填料偶联物先用0.2M醋酸钠缓冲液(含0.5M NaCl)洗涤，然后用0.2MTris-HCl缓冲液(含0.5M NaCl)洗涤，轮流洗3个循环。

4)按层析柱说明书装柱，用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl)4℃平衡过夜。

5)StxII粗提物的制备方法如实施例2中2.3所述，将StxII粗提物上样，流速为2ml/min。

6)用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl)洗至基线，用5个柱床体积洗脱缓冲液(0.1M Glycine-HCl)洗脱，收集洗脱峰。

7)用中和液(1M Tris-HCl pH9.0)调节pH至7.0。把纯化的毒素蛋白用透析袋透析至PBS中，测浓度。

实验结果显示：本发明所述单克隆抗体S2D8纯化StxII的产率为86％，洗脱后的毒素纯度达到97％；用单克隆抗体S1D8纯化StxII的产率为52％，洗脱后的毒素纯度达到95％，说明本发明所述的单克隆抗体S2D8纯化StxII的产率较之前的单克隆抗体S1D8提高了34％，纯度也提高了2％。

本发明通过细胞实验和动物实验检测了单克隆抗体S2D8纯化StxII的生物活性，实验结果显示本发明纯化的毒素分子具有良好的生物活性，本发明的纯化工艺适合毒素的纯化。

本发明还测定了单克隆抗体S2D8、S1D8与毒素StxII的亲和力，结果显示本发明所述的单克隆抗体S2D8与毒素StxII的亲和力常数为1.21×109，S1D8与抗原StxII亲和力常数为5.82×108，本发明单克隆抗体S2D8与毒素StxII的亲和力优于S1D8与抗原StxII亲和力，所以本发明单克隆抗体S2D8捕获毒素StxII的能力更强。

附图说明

图1STXIIA亚单位的纯化电泳图；

图2S2D8杂交瘤细胞的总RNA电泳图；

图3重链可变区、轻链可变区扩增出的阳性条带；

图4纯化的II型志贺毒素SDS-PAGE电泳，1.蛋白marker；2.纯化的毒素分子；3.毒素粗提液；

图5StxII对Vero细胞的毒性作用A，毒素分子作用于Vero细胞产生的病变；B.阴性对照；

图6单克隆抗体S2D8亲和力常数测定图；

图7单克隆抗体S1D8亲和力常数测定图；

具体实施方式

通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1志贺毒素StxIIA亚单位的制备：

1材料：

菌株XLI-Blue、Top10F’分别购自stratagene、Invitrogen公司，EHEC菌株编号为为本实验室分离、保存，GEX-4T-2载体、Protein G亲和层析柱、GST rapTMFF亲和层析柱、填料CNBr-activated Sepharose4B购自GE公司。试剂Taq酶、限制性内切酶BamHI和EcoRI、T4DNA连接酶、质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、T-A克隆载体购自大连宝生物有限公司。Duopath verotoxins志贺毒素检测试剂盒购自Merck公司。5周龄雌性BALB/c小鼠(SPF级)购自扬州大学比较医学中心。

2方法和结果：

根据GenBank发表的StxIIA DNA序列，设计引物扩增A亚基单位基因。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用胶回收试剂盒回收相应片段。经测序、酶切(BamHI和EcoRI)后导入表达载体pGEX-4T-2(该载体含有GST标签用于纯化)。重组质粒转化大肠杆菌Top10F％。将重组工程菌接种Luria-Bertani(LB)养肉汤(含100ng/L氨苄青霉素)中，37℃、250rpm振荡培养至A600nm约为0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthioga「lactoside，IPTG)至终浓度为1mmol/L，诱导3h。表达菌体经PBS重悬后，超声波裂解，用1％的TritonX-100乳化包涵体，20000g离心30min，上清液上AKTA^TM-GS Trap TMFF亲和层析柱进行纯化重组蛋白GST-StxIIA。PCR扩增的StxIIA亚单位基因片段大小为894bp，测序结果与GenBank检索序列一致。经BamHI、EcoRI双酶切后导入表达载体pGEX-4T-2中，构建重组表达载体pGEX-4T-2-StxIIA。转化大肠杆菌Top10，用IPTG诱导表达。经亲和层析纯化后，SDS-PAGE显示约在55kDa处有单一条带，此为表达的GST-StxIIA融合蛋白，见附图1。

实施例2抗体的制备

1.材料：融合蛋白GST-StxII A，5周龄雌性Balb/c小鼠

2.方法和结果：

2.1脾细胞与骨髓瘤细胞的融合

融合前一周，复苏小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0至OPTI-MEM培养基(含10％的胎牛血清)，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，融合前3天，将细胞传代一次。融合当天，收获骨髓瘤细胞，计数，把5.0×10⁷骨髓瘤细胞用无血清培养基洗涤2次备用。小鼠经第3次免疫后3-5天，摘除眼球放血、处死。无菌操作取出小鼠脾脏，置灭菌平皿中，分离脾细胞，计数，备用。

把等同于小鼠1/2脾脏的脾细胞与骨髓瘤细胞混合，1300rpm离心5min，尽可能去除上清液。在1.5分钟内加入1.5ml的50％的PEG，边加边摇匀；然后在8.5分钟内加入20ml的无血清培养基，边加边摇匀。把经PEG融合的细胞1000rpm离心5分钟，除去上清液，加150ml的HAT选择培养基重悬，将融合细胞接种至无菌96孔板150μl/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养4天，每孔补加100μl选择培养基。

2.2杂交瘤细胞的筛选和克隆

融合后10天，从每孔中吸50μl上清，加到包被有StxIIA-GST的96孔ELISA板(用1％的BSA封闭)，室温孵育1.5小时；洗2次。稀释辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的山羊抗小鼠1∶2000，每孔加50μl，室温孵育1.5小时；洗涤4次。每孔加入100μl HRP底物(H₂O₂+TMB)，室温孵育0.5小时，每孔加入100μl 2M H₂SO₄，测A450nm值。对于阳性克隆，按上述方法检测其对GST标签蛋白的反应性，只有与StxIIA-GST融合蛋白结合而与GST不结合的抗体克隆才被保留，继续下面的实验。

收集阳性孔细胞，重悬于HT选择培养基中，采用有限稀释法稀释细胞，并种植于96孔细胞培养板中，5天后观察，对确定只有一个细胞克隆生长的孔，作ELISA进行鉴定。对阳性孔细胞进行有限稀释，经过3-4次单细胞分离培养，直至获得稳定的杂交瘤细胞克隆。大量培养杂交瘤细胞，收集含有抗体的培养上清，用protein G亲和层析柱进行纯化，并透析到PBS中，测浓度，-20℃冻存备用。

2.3StxII粗提物的制备

在LB平板上挑取编号为99A211的EHEC(血清型为O157：H7，该菌株只含有StxII基因)单菌落，置LB液体培养基中250rpm，37℃培养过夜。次日过夜培养物1∶100稀释至2L，培养至4小时，加入终浓度为0.4mg/L丝裂霉素C(mitomycin C)，然后继续培养20小时。培养物 16，000g4℃离心30分钟，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，调节pH值至7.5，分装，-20℃冻存备用。

2.4免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)

于1.5ml的EP管中，分别加入StxII粗提物500μl，单克隆抗体50μl，protein G填料(Invitrogen)50μl，置于4℃冰箱中摇震过夜。次日用PBS充分洗涤后，于protein G填料中加入80μlPBS和20μl SDS-PAGE的loading buffer，100℃煮沸10分钟后，短暂离心，上清液行SDS-PAGE电泳，结束后经考马斯亮蓝染色剂脱色后，若在胶上可见分子量分别为32kDa和7.7kDa的两条带(分别为StxII的A、B亚单位)，则说明该抗体能在毒素粗提物中抓住毒素分子，从而起到纯化之目的。利用免疫共沉淀实验分别验证获得了5株单克隆抗体能结合毒素，上述5株抗体中，有一株编号为S2D8的抗体较其它抗体更能有效地抓住StxII。

实施例3单克隆抗体S2D8重、轻链同种型的鉴定及可变区基因的克隆

1.材料：

引物合成自上海生物工程公司、SBA Cloning System/HRP同种型鉴定试剂盒(5300-05)购自SouthernBiotech公司、ELISA酶标板为Coming公司产品。

2.方法与结果

使用SBA Cloning System/HRP同种型鉴定试剂盒(5300-05)，用PBS，pH7.4，稀释山羊抗小鼠(H+L)抗体至10μg/ml，加至ELISA酶标板，每孔100μl，4℃孵育过夜。弃包被液，用含有0.05％Tween20的PBS(PBST)洗涤3次，每孔加入200μl的1％的BSA，4℃封闭过夜。用PBST洗涤3次，于12个孔中每孔加入100μl杂交瘤培养上清液，置于37℃水浴中孵育1小时，用PBST洗涤3次。用含有1％BSA的PBS按1∶500分别稀释HRP标记的山羊抗小鼠二抗，其特异性如下：重链为IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃，轻链为κ、λ，每个特异性二抗加入2个孔，每孔100μl，置于37℃水浴中孵育1小时，用PBST洗涤5次。每孔加入100μl底物(TMB+H₂O₂)，室温放置20 分钟，每孔加入2M H₂SO₄100μl终止反应，置于450nm下测量吸光度。从下表列出的结果可以看出，单克隆抗体S2D8的重轻链同种型分别为：重链的同种型为G1，而轻链的同种型为κ。

酶标二抗	IgG₁	IgG_2a	IgG_2b	IgG₃	κ	λ
							OD450mm	1.453	0.105	0.056	0.091	1.975	0.085

取对数生长期的S2D8杂交瘤细胞，采用Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA，用oligo(dT)20为引物，逆转录合成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后，通过TA克隆插入pMD-18T载体，测序、进行序列分析。

总RNA抽提(参照Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA说明书)，电泳图见附图2，说明其RNA没有降解。

cDNA合成

以抽提的总RNA为模板，oligo(dT)₂₀为引物，逆转录合成cDNA.

oligo(dT)₂₀(500μg/ml) 1μl

RNA 10μl

dNTPs mix(10mM each) 1μl

65℃孵育5分钟，然后快速置于冰上3分钟，加入以下成分：

42℃孵育50分钟，然后70℃孵育15分钟灭活逆转录酶。

PCR扩增单抗S2D8重、轻链可变区基因VH和VL

扩增条件：94℃预变性5min，然后94℃变性30sec；56℃退火30sec；72℃延伸1min，共30个循环。

其中，扩增VH的引物是：

MHV1：5’ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC3’

MHV2：5’ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT3’

MHV3：5’ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT3’

MHV4：5’ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT3’

MHV5：5’ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT3’

MHV6：5’ATGGCTTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC3’

MHV7：5’ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT3’

MHV8：5’ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG3’

MHV9：5’ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG3’

MHV10：5’ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG3’

MHV11：5’ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG3’

MHV12：5’ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG3’

MHCG1：5’CAGTGGATAGACAGATGGGGG3’

扩增VL的引物是：

MKV1：5’ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG3’

MKV2：5’ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG3’

MKV3：5’ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG3’

MKV4：5’ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG3’

MKV5：5’ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC3’

MKV6：5’ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG3’

MKV7：5’ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG3’

MKV8：5’ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATTG3’

MKV9：5’ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG3’

MKV10：5’ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT3’

MKV11：5’ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC3’

MKC：5’ACTGGATGGTGGGAAGATGG3’

兼并密码子：R＝A or G Y＝C or C M＝A or C K＝G or T S＝C or G W＝A or T H＝A or C or T B＝C or G or T V＝A or C or G D＝A or G or T N＝A or C or G or T.

对于重链可变区，只有MHV4/MHCG1引物组合能够扩增出阳性条带，对于轻链可变区MKV5\MKC引物组合能够扩增出阳性条带，条带大小均为450bp左右，见附图3。

PCR产物的克隆

根据大连TAKARA公司TA克隆试剂盒说明书，将单抗S2D8重、轻可变区基因PCR产物插入pMD-18T载体，送公司测序。结果如下：VH的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列为，SEQ ID NO.2；VL的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，其编码的氨基酸序列为，SEQ ID NO.4。

实施例4用单克隆抗体S2D8纯化StxII

利用本发明所述的单克隆抗体S2D8纯化StxII，同时用发明人前期研究获得的抗志贺毒素单克隆抗体S1D8纯化StxII，比较本发明获得的单克隆抗体S2D8纯化StxII的效率及纯度，纯化方法如下：

1)称量1g柱层析填料CNBr-activated Sepharose4B(GE Healthcare)至2mM HCl中溶胀，然后用2mM HCl充分洗涤。

2)把5ml溶于偶联缓冲液(0.2M NaHCO₃，0.4M NaCl)浓度为10mg/ml的单克隆抗体S2D8和S1D8分别与溶胀的柱填料混合，4℃过夜。

实施例5.单克隆抗体S2D8纯化毒素的活性鉴定

分别取毒素粗提液和纯化的毒素各40μl，加10μl的loading buffer(含有β-巯基乙醇)，混匀，100℃煮沸10分钟，短暂离心后上样，行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，如下图所示，纯化的毒素分子A亚单位分子量约为34kDa，B亚单位分子量约为13kDa，与相关文献报道一致。毒素粗提液经过S2D8亲和层析柱后，其中的微量的毒素分子获得富集、纯化，见图4。

毒素对Vero细胞的毒性作用：

纯化的StxII经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，用OPTI-MEM(含10％的胎牛血清)培养基进行倍比稀释，加入96孔细胞培养板，100μl/孔。调节处于对数生长期的Vero细胞浓度为4x10⁵/ml，接种量为100μl/孔，5％CO₂，37℃培养72小时。随着毒素浓度的不同，Vero细胞先后都能产生明显的细胞病变，包括：细胞停止分裂，失去其原有梭状形态，皱缩、变圆，细胞从板底脱落、死亡(图5)。

毒素对BALB/c小鼠的毒性作用：

纯化的毒素经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，用灭菌的PBS稀释，小鼠腹腔注射0.1ml/只，接种剂量为分别为40、20、10、5和2.5ng/只，用稀释液PBS作对照。每天观察、记录小鼠的死亡情况，共7 天。接种后40h，高剂量组小鼠即表现出渐进性精神沉郁，背毛耸立，后肢麻痹等毒素中毒症状。随时间延长，出现眼结膜出血，体温下降，趾尖、尾部淤血，至接种后50h，高剂量组小鼠出现死亡，其中能在7天内致全组小鼠死亡的最小剂量为5ng/只。对照组小鼠均能维持健康状态，无死亡。

以上实验说明本发明纯化的毒素分子具有良好的生物活性，本发明的纯化工艺适合毒素的纯化。

实施例6.单克隆抗体亲和力常数测定

将不同浓度的抗原铺板，间接ELISA法测定单克隆抗体S2D8、S1D8与抗原StxII的反应曲线，当曲线接近平台表示全部抗原被结合，在曲线上找出与抗原最大结合50％的抗体浓度(mol/L)，带入如下公式即可求出Ka：

Ka＝(n-1)/2(nAb′-Ab)其中n＝Ag/Ag′

具体实验步骤如下：

1.取不同浓度抗原(1，2，4mg/ml)包被的酶标板，4℃过夜。

2.测定提纯抗体浓度，将抗体作系列稀释，加入依次稀释的抗体100μl/孔，37℃，孵育45min，洗涤5遍。

3.加HRP标记的二抗羊抗小鼠IgG抗体工作液(1∶10000稀释)，100μl/孔，37℃，孵育45min，洗涤5遍。

4.加底物显色液，100μl/孔，室温避光5-10min。

5.加终止液2mol/L H₂SO₄，50μl/孔，立即在酶标仪上以492nm波长测定吸光值。

6.以492吸光值为纵坐标，抗体浓度为横坐标作图，从图中找出结合率从最高点下降到50％时相对应的抗体浓度，代入公式计算抗体亲和常数。

通过间接ELISA法测定单克隆抗体S2D8、S1D8与抗原StxII的反应曲线，分别见图6和图7，结果显示S2D8与抗原StxII亲和力常数为1.21×109，S1D8与抗原StxII亲和力常数为5.82×108。

Claims

1.一种志贺毒素的单克隆抗体或其片段，包括轻链CDR1-3和重链CDR1-3，其特征在于，所述轻链CDR1-3的氨基酸序列为∶

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：8所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：9所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：10所示；

所述重链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：5所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：6所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：7所示。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区的编码序列如序列表中SEQ ID NO：3的核甘酸序列所示，所述重链可变区的编码序列如序列表中SEQ ID NO：1的核甘酸序列所示。

4.权利要求1-3中任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备检测StxII试剂盒中的应用。

5.权利要求1-3中任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备治疗StxII所引起疾病的药物中的应用。

6.权利要求1-3中任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备纯化志贺毒素的试剂中的应用。

7.一种纯化志贺毒素的方法，包括以下步骤：

3)用偶联缓冲液洗去多余的抗体分子，柱填料中多余的活性基团则用0.1MTris-HCl封闭，室温作用2小时，抗体-填料偶联物先用0.2M醋酸钠缓冲液(含0.5M NaCl)洗涤，然后用0.2M Tris-HCl缓冲液(含0.5M NaCl)洗涤，轮流洗3个循环。

4)将上述第3)步得到的填料装柱，用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl)4℃平衡过夜。

5)制备StxII粗提物，将StxII粗提物上样，流速为2ml/min。