CN101434956A - 一种单克隆抗体重、轻链可变区基因，其编码的多肽以及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种单克隆抗体及用途，尤其是针对志贺毒素II型(Shiga toxin II，StxII)的单克隆抗体及用途，属于生物制药技术领域。本发明从能够分泌抗StxII单克隆抗体的杂交瘤细胞株S2C4中，通过PCR法克隆获得该抗体重链和轻链可变区基因，并通过基因工程的方法将两个基因重组后表达出能特异性识别StxII蛋白的ScFv抗体活性片段，可制备用于抗EHEC感染及并发症的药物。其优点是：单克隆抗体S2C4不仅对StxII原毒素具有坚强的中和活性，还对StxII多个变种具有坚强的中和活性。实验证明：单克隆抗体S2C4的中和谱广，可保护小鼠抵御致死量StxII毒素及其亚型的攻击，是一株极具应用前景的药物候选分子。

Description

一种单克隆抗体重、轻链可变区基因，其编码的多肽以及用途

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体及用途，尤其是志贺毒素II型A亚基的单克隆抗体及用途，属于生物制药技术领域。

背景技术

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli.，EHEC)感染是一种重要传染病，在世界各地都有不同规模的暴发流行，已成为全球性的公共卫生问题。EHEC血清型众多，包括0157，026，091，0103和0111等，而其中以0157型引起的暴发为最多。我国江苏、安徽、河南三省部分地区于1999-2000年暴发了EHEC0157:H7感染性腹泻病并发急性肾衰，造成了重大的人员和财产损失。美国2006年9-10月份也发生了由于食用污染的菠菜而导致EHEC0157:H7感染事件，波及26个州，多人引发溶血性尿毒综合征(HemolyticUremic Syndrome，HUS)，并导致死亡，引起世界广泛关注。EHEC感染可使人患腹泻(Diarrhoea)、出血性结肠炎(Hemorrhagic Colitis，HC)，还可引发HUS、血栓性血小板减少性紫癜(ThromboricThromobocytopenic Porpura，TTP)等严重并发症，严重者可导致死亡，致死率达5％～10％。对于EHEC感染，目前临床上尚缺乏有效的治疗和预防措施，特别是使用抗生素或止泻药可导致EHEC释放致死性志贺毒素(Shiga Toxin，Stx)，从而使患者并发HUS的危险性增加。而对于发生HUS的病人，其住院病死率可高达87％。

研究表明，EHEC感染的主要致病机理可分为两个方面，一是由菌体基因组毒力岛LEE(Locus of Enterocyte Effacement，LEE)编码的多种致病因子所介导的粘附抹平机制(Attaching andEffacing，A/E)，通过A/E机制，细菌可破坏肠上皮细胞，粘附并定居于肠道；二是分泌毒素，EHEC能产生如志贺毒素(Stx)、溶血素(Hly)等多种细胞外毒素，其中以Stx的致病性为最。Stx可以穿越肠上皮细胞进入血液循环，与其受体-丙糖酰基鞘氨醇(Gb3)结合，造成肠道、中枢神经系统等器官的损伤，特别是Gb3受体含量高的肾脏，受损后易引发HUS；同时Stx还可以促进EHEC在肠上皮细胞的吸附和定居，进一步加重病情。

目前针对HUS的免疫治疗主要有以下两种：口服人工合成的多糖衍生物作为Stx毒素受体Gb3的类似物在肠道内中和毒素，从而减少毒素在血液中的浓度。但是糖与蛋白质之间结合亲和力较低；由于病人的呕吐、肠梗阻等降低了多糖药物在肠道内的有效浓度；另外，对于已经进入血液循环的毒素分子和已发生HUS的病人再从胃肠道给药在时间上也为时过晚。第二，由Stx毒素中和抗体所介导的免疫治疗方案已在动物感染模型或临床前期试验中显示良好的应用前景。Stx毒素的中和单抗能以高特异性和高亲和力与毒素分子结合，封闭Stx分子中与其受体结合的表位，从而阻断HUS发生的可能性。目前世界范围内有数个研究小组(如美国Tufts大学和日本Teijin公司等)都在开展Stx中和单抗的研究工作，其中有多个抗体候选分子无论在体外毒素中和试验还是体内HUS的治疗均取得良好效果。在我国，疫情主要集中在经济不发达的农村地区，患者主要是农民，且目前已处于高发流行期，疫情不可能短期消失，而目前尚缺乏该方面的相关储备。据申请人了解，一篇申请号为200610054048.6，申请日为2006年1月20日，名称为“抗EHEC 0157志贺样毒素IIA亚单位单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因及应用”的中国发明专利申请公开了EHEC 0157志贺样毒素II毒素亚单位Stx2A单克隆抗体5F3重链和轻链可变区基因和其编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备用于诊断和治疗EHEC 0157感染及其并发症方面药物中的应用，虽然同样是对EHEC 0157感染及其并发症提供了治疗方案，但是由于Stx毒素分为StxI和StxII两个亚型，其中StxII又有c、d、e、f等多个变种。StxII较StxI更易引起HUS，而StxII中又以StxII原毒素和StxIIc、StxIIvha等变种的毒力最强，而该申请所提供的单克隆抗体只针对StxII原毒素，对StxII变种没有作用，无法抵御由StxII变种引起的EHEC 0157感染，且Stx在人体内分泌量很低，不足以刺激机体产生足量的抗体抵御再次感染，因此，阻断StxII毒素及其变种与其受体Gb3结合、防止HUS的发生已成为攻克EHEC感染所急需突破的瓶颈。

发明内容

本发明针对以上现有技术存在的缺点，提供抗志贺毒素II型A亚基的单克隆抗体S2C4重链和轻链可变区基因及其所编码的多肽，其重组后可以表达出特异性识别和结合StxII及其变种的抗体活性片段，并可制备用于EHEC 0157:H7感染及其并发症的药物，为临床治疗EHEC 0157感染提供新的途径。

为了解决以上技术问题，发明人从能够分泌抗志贺毒素II型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为：S2C4)中，通过PCR法克隆获得单克隆抗体重链和轻链可变区基因。其主要步骤是：从杂交瘤细胞株S2C4中提取总RNA，以oligo(dT)₂₀为引物，逆转录成cDNA，然后利用特异性引物分别扩增S2C4的重、轻链可变区基因，经过序列测定和利用NCBI中BLSAT服务器进行比对，确认S2C4重链可变区基因序列是序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码的多肽是序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区基因序列是序列表中SEQID NO.2所示的核苷酸序列，其编码的多肽是序列表SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。上述两个基因经重组后可表达出特异性识别志贺毒素II型蛋白的ScFv抗体活性片段。对于单克隆抗体S2C4重、轻链可变区基因，通过应用NCBI中BLAST专业数据库进行同源性比较，结果表明：所获得的基因序列的确来自小鼠胚系基因，和现有报道的各种抗体基因序列不一致；且所获得的重、轻链可变区基因可以编码正确的小鼠抗体可变区氨基酸序列。

本发明的单克隆抗体S2C4重链和轻链可变区基因可以采用基因工程方法，构建和表达多种形式的小分子基因工程抗体，如ScFv，Fab，嵌合抗体等，制备用于抗EHEC感染及并发症的药物。

本发明所制备的鼠源单克隆抗体S2C4的靶分子为Stx II分子的A亚基。S2C4不仅对Stx II原毒素具有坚强的中和活性，还对Stx II变种具有坚强的中和活性。实验证明：单克隆抗体S2C4的中和谱广，可保护小鼠抵御致死量StxII毒素及其亚型的攻击，是一株极具应用前景的药物候选分子。

附图说明

图1为S2C4重链和轻链可变区基因及其单链抗体基因的PCR产物，

图中1.Marker，2.ScFv，3.VH，4.VL。

图2为SDS-PAGE检测纯化的S2C4单链抗体ScFv，图中1.蛋白标记物，2.S2C4单链抗体ScFv，相对分子量(×10³)。

图3为Western-blot检测S2C4单链抗体ScFv，图中1.S2C4单链抗体ScFv，相对分子量(×10³)。

具体实施方式

实施例一

1.制备抗EHEC志贺毒素II型A亚单位的单克隆抗体S2C4

(1)Balb/c小鼠免疫

用融合蛋白Stx2A-GST免疫5周龄的雌性Balb/c小鼠，50ug/只，首次免疫，100ul抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，腹腔注射；第3周后抗原与不完全佐剂等量混合后腹腔免疫；第5周第3次免疫，不加佐剂。

(2)脾细胞与骨髓瘤细胞的融合

融合前一周，复苏小鼠骨髓瘤细胞sp2/0至OPTI-MEM培养基(含10％的胎牛血清)，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，融合前3天，将细胞传代一次。融合当天，收获骨髓瘤细胞，计数，把5×10⁷骨髓瘤细胞用无血清培养基洗涤2次备用。小鼠经第3次免疫后3-5天，摘除眼球放血、处死。无菌操作取出小鼠脾脏，置灭菌平皿中，分离脾细胞，计数，备用。

将等同于小鼠1/2脾脏的脾细胞与骨髓瘤细胞混合，1300rpm离心5min，尽可能去除上清液。在1.5分钟内加入1.5ml的50％的聚乙(PEG)，边加边摇匀；然后在8.5分钟内加入20ml的无血清培养基，边加边摇匀。

把经PEG融合的细胞1000rpm离心5分钟，除去上清液，加150ml的选择培养基HAT(含次黄嘌呤、氨基喋呤与胸苷的培养基)重悬，将融合细胞接种至无菌96孔板150ul/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养4天，每孔补加100ul选择培养基。

(3)杂交瘤细胞的筛选和克隆

融合后10天，从每孔中吸50ul上清，加到包被有Stx2A的96孔ELISA板(用1％的牛血血清蛋白(BSA)封闭)中，室温孵育1.5小时；洗2次。稀释HRP标记的山羊抗小鼠1：2000，每孔加50ul，室温孵育1.5小时；洗涤4次。

每孔加入50ul HRP底物(H₂O₂+四甲基联苯二胺TMB)，室温孵育0.5小时，每孔加入50ul 2M H₂SO₄，测A_460nm值。

收集阳性孔细胞，重悬于HAT中，采用有限稀释法稀释细胞，并种植于96孔细胞培养板中，5天后观察，对确定只有一个细胞克隆生长的孔，作ELISA进行鉴定。对阳性孔细胞进行有限稀释，经过3-4次单细胞分离培养，直至获得稳定的杂交瘤细胞克隆。

(4)单克隆抗体中和活性的鉴定

毒素对Vero细胞的毒性作用：纯化的志贺毒素II型经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，用OPTI-MEM(含10％的胎牛血清)进行倍比稀释，加入96孔细胞培养板，100μl/孔。调节处于对数生长期的Vero细胞浓度为4 x 10⁵/ml，接种量为100μl/孔，5％ CO2，37°C培养72小时。细胞经11％的戊二醇固定后，用0.1％结晶紫染色。毒素对Vero细胞的毒性作用以能杀死50％细胞的毒素最大稀释浓度表示-CD50(50％ cytotoxic dose)。

50ul OPTI-MEM培养基含5个CD50，与50ul杂交瘤上清混合，37℃孵育1小时。加入Vero细胞，100μl/孔，观察单克隆抗体对毒素的中和作用，从中选择具有中和活性的单克隆抗体，命名为S2C4。

2.克隆单克隆抗体的S2C4重、轻链可变区基因

所用细胞株为发明人通过杂交瘤技术制备的一株单克隆抗体S2C4，其靶位为StxII的A亚单位，并且与StxII的其它亚型，如Stx2c和Stx2vha的A亚单位都能结合，并能中和其对Vero细胞的毒性。S2C4与Stx2的B亚单位或Stx1不结合，其重、轻链同种型为G1/κ。

取对数生长期的S2C4细胞，采用Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA，用oligo(dT)₂₀为引物，逆转录生成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后，通过TA克隆插入pMD-18T载体，测序、进行序列分析。

有关操作步骤如下：

(1)抽提总RNA(参照Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA说明书)RT-PCR扩增单抗S2C4重链和轻链可变区基因VH和VL。

以抽提的总RNA为模板，oligo(dT)₂₀为引物，逆转录合成cDNA，

oligo(dT)20(500ug/ml)        1ul

RNA                          10ul

dNTPs mix(10mM each)         1ul

65℃孵育5分钟，然后快速置于冰上3分钟，加入以下成分：

5×first-strand buffer       4ul

0.1M DTT                     2ul

RNA酶抑制剂(40U/ul)          1ul

逆转录酶(200U/ul)            1ul

                             20ul

42℃孵育50分钟，然后70℃孵育15分钟灭活逆转录酶。

(2)PCR法扩增VH和VL

ExTaq(5U/ul)                0.25ul

10×buffer(Mg⁺⁺free)        5.0ul

MgCl₂(25mM)                 4.0ul

dNTPs(2.5mM each)           4.0ul

5’和3’引物(10uM)          1.0ul

cDNA                        2.0ul

加H ₂ O至                     50ul

扩增条件：94℃预变性5min，然后94℃变性30sec；56℃退火30sec；

72℃延伸1min，共30个循环，结果见图1。

其中，扩增VH的引物是：

MSCVH13

5’GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTG CAG CTT GTT GAG TC3’

MSCG1ab-B

5’CCT GGC CGG CCT GGC CAC TAG TGA CAG ATG GGG CTG TCG TTTTGG C 3’

扩增VL的引物是：

MSCJK12-BL

5’GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACCGCC ACC AGA GGA TTT KAT TTC CAG TTT GGT CCC 3’

MSCVK10

5’GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG ACA TTG AGC TCA CCC AAT C 3’

(3)PCR产物的克隆

根据大连TAKARA公司TA克隆试剂盒说明书，将单克隆抗体S2C4重链和轻链可变区基因的PCR产物插入pMD-18T载体，测序。

S2C4重、轻链可变区基因序列分析分别应用以下两个服务器：

http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest？livret＝0&Option＝mo useIg

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

对所得序列与现有已报道的其他抗体基因进行同源性比较，并分析其胚系基因来源，结果如下：

S2C4重链可变区的胚系基因来源：

V-GENE   IGHV10S3*01

D-GENE   IGHD2-4*01

J-GENE   IGHJ3*01

其可变区基因的超变区为：

CDR1：GGA TTC ACC TTC AAT ACC AAT GTC

CDR2：ATA AGA AGT AAA AGT AAT AAT TAT GCA ACA

CDR3：GTC ATC TAC TAT GAT TAC GGC GGT TTT AAT TAC

NCBI中同源性比较结果显示：

Sequence producing significant alignments：

gi：3420274|AF064446.1|AF064446     438e-124

gi：3420272|AF064445.1|AF064445     428e-122

gi：90704841|BN000872.1|BN000872    422e-120

S2C4轻链可变区的胚系基因来源：

V-GENE        IGKV3-5*01

J-GENE        IGKJ5*01

其可变区基因的超变区为：

CDR1：GAA AGT GTT GAG AGT TAT GGC AAT AGT TTT

CDR2：CGT GCA TCC

CDR3：CAG CAA ACT AAT GAG GAT CCG TTC ACG

NCBI中同源性比较结果显示：

Sequence producing significant alignments：

gi：197492|K02161.1|K02161|422 e-120

gi：197491|K02160.1|K02160|414 e-118

gi：3164087|Y15968.1|Y15968|3502 e-98

上述分析结果表明，单克隆抗体S2C4重链和轻链可变区基因序列来自小鼠胚系基因，和现有报道的其他抗体基因序列不完全一致，属于一种新的抗体可变区基因，其重链可变区基因的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；其轻链可变区基因的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；其重链可变区基因编码的多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；其轻链可变区基因编码的多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

3.单克隆抗体S2C4单链抗体ScFv的构建和表达

将单抗S2C4重链和轻链可变区基因VH和VL通过over-lap PCR连接，其连接链氨基酸残基序列为GGSSRSSSSGGGGSGGGG，构成5′VL-Linker-VH 3′形式。ScFv与表达载体pComb3xss经限制性内切酶SfiI酶切后，在连接酶T4作用下进行连接。连接产物转化大肠杆菌Top10F’，经酶切及DNA测序分析，证实基因构建正确。S2C4单链抗体ScFv在IPTG诱导下表达，用NiSO₄亲和层析柱进行纯化，

SDS-PAGE和Western-blot等方法检测表达产物。结果表明，ScFv在大肠杆菌中成功表达，其相对分子量为32KDa，并且可与志贺毒素II型A亚单位特异性结合。

有关操作步骤如下：

(1)S2C4单链抗体ScFv重组表达载体的构建：

over-lap PCR扩增ScFv基因

ExTaq(5U/ul)              0.25ul

10*buffer(Mg⁺⁺free)       5.0ul

MgCl₂(25mM)               4.0ul

dNTPs(2.5mM each)         4.0ul

VH(50ng)                  1.0ul

VL(50ng)                  1.0ul

5’和3’引物(10uM)        各1.0ul

加H ₂ O至                   50ul

其中，在扩增VH和VL时，分别在VL的3’端和VH的5’端增加了编码连接链的寡核苷酸序列，扩增条件：94℃预变性5min，然后94℃变性30sec；56℃退火30sec；72℃延伸1min，共20个循环结果见图1。以上扩增ScFv的引物是：

RSC-F(sense)

5’GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCG GGG CCC AGG CGG CCG AGC TC 3’

RSC-B(reverse)

5’GAG GAG GAG GAG GAG GAG CCT GGC CGG CCT GGC CAC TAG TG 3’

(2)PCR产物与表达载体pComb3xss分别用内切酶SfiI酶切：

pComb3xss或ScFv PCR产物    2ug

SfiI                       1ul

10*M                       4ul

加H ₂ O至                    40ul

50℃消化5小时，分别电泳，胶回收相应的酶切片段。

连接反应：

线性化pComb3xss          2ul

酶切后的ScFv             5ul

5*ligase buffer          2ul

T4 ligase                1ul

                         10ul

16℃连接过夜。

(3)表达宿主菌Top10F’化学感受态的制备：

在长有Top10F’的平板上挑单菌落于5ml LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。

过夜培养物按1:100接种置LB液体培养基中，37℃摇床培养至OD600nm约为0.6，8000g离心5分钟收集菌体。

加入预冷的0.1M的CaCl₂重悬菌体，冰浴30分钟，4℃ 8000g离心5分钟，弃上清。加100ul预冷的0.1M的CaCl₂重悬菌体，冰浴备用。

(4)连接产物转化：

取感受态Top10F’100ul，加入10ul连接产物，混匀，置冰浴30分钟，42℃热休克90秒，然后迅速置冰浴3分钟。加入0.5ml LB培养基，置摇床37℃培养1小时。

8,000g离心5分钟，吸弃上清，留约100ul，与沉淀混匀后涂板，37℃培养过夜。

(5)高效表达融合蛋白工程菌的筛选

在转化的过夜培养平板上，随机挑20个单菌落分别置2ml液体培养基中(含有100ug/ml的氨苄青霉素)，37℃培养约5-8小时，以菌液为模板PCR扩增克隆入载体中的ScFv基因，条件如下：

ExTaq(5U/ul)              0.25ul

10*buffer(Mg⁺⁺free)       5.0ul

MgCl₂(25mM)               4.0ul

dNTPs(2.5mM each)         4.0ul

菌液                      1.0ul

5’和3’引物(10uM)        各1.0ul

加H ₂ O至                   50ul

扩增条件：94℃预变性5min，然后94℃变性30sec；56℃退火30sec；72℃延伸1min，共30个循环。

所用引物是：

RSC-F(sense)

5’GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCG GGG CCC AGG CGG CCG AGC TC 3’

RSC-B(reverse)

5’GAG GAG GAG GAG GAG GAG CCT GGC CGG CCT GGC CAC TAG TG 3’

挑出阳性克隆。将含有重组质粒pComb3x-ScFv的工程菌接种10ml的LB液体培养基中(含有100ug/ml的氨苄青霉素)，37℃摇床培养至OD600nm至0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃诱导4小时。用SDS-PAGE和Western-blot鉴定高表达菌株，结果见图2和图3。

(6)S2C4单链抗体ScFv的纯化

配制如下缓冲液：

结合缓冲液：20mM磷酸钠缓冲液，0.5M NaCl，45mM咪唑，pH7.4。

洗脱缓冲液：20mM磷酸钠缓冲液，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH7.4。

样品准备：

经鉴定的高表达菌株，挑单克隆抗体置25ml的LB液体培养基中(含有100ug/ml的氨苄青霉素)，250rpm，37℃培养过夜。

取25ml过夜培养物加至500ml的LB液体培养基中(含有氨苄青霉素)，250rpm，37℃培养2小时，加入IPTG至终浓度为1mm。再诱导表达4小时。

培养物5,000g离心20分钟，弃上清。用50ml预冷的结合缓冲液(含有1mM的蛋白酶抑制剂PMSF)重悬菌体沉淀，在冰浴条件下超声波破碎细菌。

在菌体裂解物中加入终浓度为1％的Triton X-100，室温轻轻搅拌30分钟，以利于破碎包涵体。20000g离心30分钟，上清液过0.45um滤膜，备用。

纯化：

把NiSO4亲和层析柱(GE Healthcare产品)安装到蛋白质纯化仪上(AKTA purifier100)，用10个柱床体积的结合缓冲液冲洗酒精。

用10个柱床体积的结合缓冲液平衡柱床后，上样品，流速为1ml/分钟。

用结合缓冲液洗涤柱床至A280nm吸光度到基线，用5-10个柱床体积的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，用SDS-PAGE鉴定，结果见图2。

实施例二

LD₁₀₀的测定：EHEC StxII毒素用灭菌PBS倍比稀释，腹腔接种6周龄BALB/c小鼠，在12天实验期限内，能使受试组小鼠全部死亡的毒素最低剂量为5ng/只。

小鼠首先腹腔接种5ng/只的毒素，16小时后，腹腔接种S2C4单链抗体ScFv，其用量分别为60，30，15，8，4ug/只小鼠，用S2C4全分子抗体和PBS分别作为阳性、阴性参考。每天记录小鼠的死亡数量，整个实验在第12天结束。结果发现S2C4单链抗体ScFv的剂量在60-15ug/只小鼠时，可完全保护小鼠不受毒素的攻击；而ScFv的剂量在8和4ug/只小鼠时，其保护效率分别只有60％和20％，结果见表1和表2。

 

动物分组	动物数量	毒素剂量	抗体用量
				1	10	5ng/只	60ug/只
2	10	5ng/只	30ug/只
				3	10	5ng/只	15ug/只
4	10	5ng/只	8ug/只
				5	10	5ng/只	4ug/只
S2C4对照	10	5ng/只	10ug/只
				空白对照	10	5ng/只	0ug/只

表1

表2

结论：S2C4单链抗体ScFv保留了其母体的抗原结合特异性，可在体内中和毒素，对动物机体产生保护作用。

实施例三

取EHEC StxII毒素的三种亚型粗提物：StxIIc、StxIId和StxIIvha分别腹腔接种6周龄BALB/c小鼠(100ul/只)，16小时后，腹腔接种S2C4 10ug/只小鼠，每天记录小鼠的死亡数量，整个实验在第12天结束。结果发现，与对StxII一样，S2C4在可完全中和StxII的三种亚型的毒性作用，保护小鼠不受毒素的攻击，结果见表3。

表3

结论：S2C4具有较强的中和谱，其针对的表位在StxII及其亚型之间可能是相当保守的，这预示着S2C4是一株非常有希望的治疗EHEC感染抗体药物候选分子。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>江苏省疾病预防控制中心

<120>一种单克隆抗体重、轻链可变区基因，其编码的多肽以及用途

<160>17

<210>1

<211>396

<212>DNA

<213>鼠

<220>

<221>V-region

<222>(1)...(396)

<400>1

<210>2

<211>342

<212>DNA

<213>鼠

<220>

<221>V-region

<222>(1)...(342)

<400>2

<210>3

<211>132

<212>PRT

<213>鼠

<220>

<221>V-region

<222>(1)...(132)

<400>3

<210>4

<211>110

<212>PRT

<213>鼠

<220>

<221>V-region

<222>(1)...(110)

<400>4

<210>5

<211>44

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<221>5′primer for PCR

<222>(1)...(44)

<400>5

<210>6

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<221>3′primer for PCR

<222>(1)...(46)

<400>6

<210>7

<211>75

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<221>5′primer for PCR

<222>(1)...(75)

<400>7

<210>8

<211>40

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<221>3′primer for PCR

<222>(1)...(40)

<400>8

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>鼠

<220>

<221>CDR1(Complimentarity Determining Region　1，CDR1)of Heavy Chain V-region

<222>(1)...(24)

<400>9

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>鼠

<220>

<221>CDR2　of Heavy Chain V-region

<222>(1)...(30)

<400>10

<210>11

<211>33

<212>DNA

<213>鼠

<220>

<221>CDR3 of Heavy Chain V-region

<222>(1)...(33)

<400>11

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>鼠

<220>

<221>CDR1 of Light Chain V-region

<222>(1)...(30)

<400>12

<210>13

<211>9

<212>DNA

<213>鼠

<220>

<221>CDR2 of Light Chain V-region

<222>(1)...(9)

<400>13

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>鼠

<220>

<221>CDR3 of Light Chain V-region

<222>(1)...(27)

<400>14

<210>15

<211>18

<212>PRT

<213>Artifical Sequence

<220>

<221>Protein Linker between Heavy and Light Chain V-region

<222>(1)...(18)

<400>15

<210>16

<211>41

<212>DNA

<213>Artifical Sequence

<220>

<221>5′primer for PCR

<222>(1)...(41)

<400>16

<210>17

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<221>3′primer for PCR

<222>(1)...(41)

<400>17

Claims (6)

1.一种单克隆抗体重链可变区基因，其碱基序列如序列表中SEQID NO.1所示。

2.一种单克隆抗体轻链可变区基因，其碱基序列如序列表中SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述单克隆抗体重链可变区基因编码的多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求2所述单克隆抗体轻链可变区基因编码的多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求1或2所述基因在制备抗肠出血性大肠杆菌感染及并发症的药物中的用途。

6.根据权利要求3或4所述多肽在制备抗肠出血性大肠杆菌感染及并发症的药物中的用途。

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