CN108795934B - 日本血吸虫SjELAV-like 2基因的siRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种日本血吸虫SjELAV‑like 2基因的siRNA，所述siRNA选自下述的一对或任意两对以上的组合：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。本发明还公开了日本血吸虫SjELAV‑like 2基因的siRNA的应用。本发明日本血吸虫SjELAV‑like 2基因的siRNA，可明显抑制SjELAV‑like 2基因的转录，并能显著降低血吸虫感染小鼠的肝脏虫卵孵化率，适用于制备治疗血吸虫病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫SjELAV- like 2基因的siRNA及其应用。
背景技术
血吸虫病（Schistosomiasis）是由血吸虫感染引起的，严重危害人畜健康和经济发展的重大寄生虫病，至今仍是一个需要重视的公共卫生问题。目前对于血吸虫病的治疗主要应用化学药物，如吡喹酮，虽然药物对感染血吸虫的个体有治疗效果，但是药物治疗不能解决重复感染问题，也不能起到预防的目的。因此有必要寻找新的治疗血吸虫病的药物。
ELAV-like（embryonic lethal abnormal vision like）蛋白家族是一类mRNA结合蛋白，含有3个高度保守的RNA识别基序（RRM），存在于多种生物体中，对神经系统的发育和功能维持起重要作用，且多项研究表明，RRM RNA结合蛋白在细胞代谢过程中起着重要作用，在人和其他多种生物中其表达量变化或突变会引起发育异常或导致神经性自身免疫病的产生。ELAV在果蝇中首次克隆获得，因其表达改变致果蝇视神经发育异常并于胚胎期死亡而得名。ELAV-like蛋白家族有ELAV-like 1、ELAV-like 2、ELAV-like 3和ELAV-like 4四个成员，其中ELAV-like 1在各组织广泛表达，ELAV-like 3和ELAV-like 4作为自身抗原在多系统神经障碍肿瘤性脑病中被发现，ELAV-like 2蛋白不仅在多种物种的神经系统表达，在小鼠的生殖腺及非洲爪蟾的睾丸、卵巢和早期胚胎中也有特异性表达，且研究表明，小鼠的卵母细胞生长期间，ELAV-like 2的过早降低导致成熟卵母细胞减数分裂效益低下。
前期分析正常发育雌虫与发育阻遏雌虫转录组表达差异时发现一条在发育阻遏雌虫中高表达的基因，序列分析发现其编码的氨基酸序列与ELAV-like 2同源。通过5'-RACE和3'-RACE获得了SjELAV-like 2基因序列全长，将该基因序列提交到GeneBank，登录号为MG515726。血吸虫雌雄异体，只有与雄虫合抱方能引发雌虫的性成熟和产卵，成熟雌虫所产虫卵沉积于肝脏造成宿主的病理损害，排出体外造成疾病再传播。单性感染的雌虫生长缓慢，处于生殖系统发育阻遏状态，卵黄腺和卵巢不能发育成熟、不能正常产卵；而经两性感染达到性成熟的雌虫一旦与合抱雄虫分开，虫体也会逐渐变小，性器官退化，回到发育不完善的发育阻遏状态，因此从控制雌虫的生殖发育入手控制血吸虫病传播与发生有着重要的理论意义。
RNA干扰（RNAi）技术目前已经在功能基因组学、基因治疗、微生物学研究和药物研发等领域里取得了令人瞩目的进展。RNA干扰是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，是双链RNA（dsRNA）介导的、序列特异的靶基因转录后基因沉默的过程。将与靶基因转录的产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。所谓的小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs），是为能够以同源互补序列mRNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片段双链RNA分子，通常由20多个核苷酸组成，能进行特异性的转录后基因沉默。siRNA已经广泛应用于基因表达调控机制研究等领域。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种日本血吸虫SjELAV-like 2基因的siRNA，该siRNA可明显抑制SjELAV-like 2基因的转录，可用于制备治疗血吸虫病的药物。
此外，还需要提供一种日本血吸虫SjELAV-like 2基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种日本血吸虫SjELAV-like 2基因的siRNA，所述siRNA选自下述的一对或任意两对以上的组合：
SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列；
SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4 所示的核苷酸序列；
SEQ ID NO.5 和SEQ ID NO.6 所示的核苷酸序列。
优选的，所述siRNA为SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种治疗血吸虫病的药物，所述药物的活性成分为：通过RNA干扰抑制日本血吸虫SjELAV-like 2基因表达的siRNA。
优选的，所述siRNA 选自下述的一对或任意两对以上的组合：
SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列；
SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4 所示的核苷酸序列；
SEQ ID NO.5 和SEQ ID NO.6 所示的核苷酸序列。
更优选的，所述siRNA为SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫SjELAV-like 2基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫SjELAV-like 2基因的siRNA在制备预防血吸虫病的疫苗中的应用。
本发明日本血吸虫SjELAV-like 2基因的siRNA，可用于干扰日本血吸虫SjELAV- like 2基因转录、表达及血吸虫的生长发育，小鼠的体内RNA干扰实验表明，该siRNA能显著降低感染小鼠肝脏虫卵孵化率，适于制备治疗血吸虫病的药物。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1 是本发明实施例1实时定量 PCR 分析各处理组SjELAV-like 2基因的转录结果图；
图2 是本发明实施例2实时定量PCR 分析各处理组SjELAV-like 2基因的转录结果图。
图3 是利用扫描电镜观察干扰组虫体及NC组虫体的体被表膜变化情况，其中，（A,B,C）：日本血吸虫正常状态下体被表膜形态；箭头所示 A：光面乳突B：泡状突出物C：有蒂乳突；（D,E,F）：SjELAV-like 2 siRNA干扰组虫体表膜形态；箭头所示 E、F：泡状突出物。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》（J. 萨姆布鲁克，D. W. 拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译. 第3 版，北京：科学出版社，2002）中所述的方法进行。
实施例1 体内RNA干扰筛选最佳dsRNA
1.方法步骤
1.1 siRNA分子和SjELAV-like 2基因实时定量PCR引物的准备
根据血吸虫SjELAV-like 2基因序列（MG515726）通过分析比较，设计并合成三对dsRNA，siRNA设计原则如下：
1．从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。
2．避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。
3．siRNA序列的GC含量应为30%-60%左右。
4．在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
5．将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。
6．将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm..nih.gov/BLAST/）。
7．选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
同时，合成一对无关对照dsRNA（NC dsRNA）为：
sense：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'（ SEQ ID NO.7），
Anti-sense：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'（ SEQ ID NO.8）；
三对日本血吸虫SjELAV-like 2基因的dsRNA小分子为：
S1dsRNA：sense：5'-GCGUUAUUCAAUGCCGCAUTT-3'（ SEQ ID NO.1），
Anti-sense：5'-AUGCGGCAUUGAAUAACGCTT-3'（ SEQ ID NO.2），该第一对siRNA针对的靶点序列是448-464bp（GUUAUUCAAUGCCGCAU）；
S2dsRNA：sense：5'-GCUACAGUCCAACCACAAATT-3'（ SEQ ID NO.3），
Anti-sense：5'-UUUGUGGUUGGACUGUAGGTT-3'（ SEQ ID NO.4），该第二对siRNA针对的靶点序列是858-874bp（UACAGUCCAACCACAAA）；
S3dsRNA：sense：5'-GCUACUUGACUCCCUACUUTT-3'（ SEQ ID NO.5），
Anti-sense：5'-AAGUAGGGAGUCAAGUAGCTT-3'（ SEQ ID NO.6），该第三对siRNA针对的靶点序列是961-977bp（UACUUGACUCCCUACUU）。
根据SjELAV-like 2的基因序列，设计用于检测RNA干扰效果的实时定量 PCR 引物，然后送公司（Invitrogen）合成。
Sense：5'-CATCAGTCGGCACCATC-3'（ SEQ ID NO.9），
Anti-sense：5'-TCGCCCTTGCAGTTT-3'（ SEQ ID NO.10）。
1.2 收集22天日本血吸虫虫体
BALB/c小鼠（4-6周龄，雄性）腹部人工贴片感染日本血吸虫尾蚴，每只感染200条，于感染后22天尾静脉快速注射dsRNA(每只注射1 OD dsRNA，溶于200 μL DEPC水中），48小时后剖杀小鼠静脉灌注法收集虫体。实验分为：空白组，无关对照组（NC组），S1、S2、S3dsRNA处理组。
1.3 RNA干扰效果的实时定量PCR验证
Trizol法提取各处理组日本血吸虫虫体的总RNA，消化基因组，反转录为cDNA，进行实时定量PCR分析。
2. 结果
如图1所示，三种不同的dsRNA分子均显著地降低了SjELAV-like 2基因的转录水平，其中S1dsRNA组小分子降低的转录水平最低，选取S1dsRNA 组小分子作为体内RNA干扰用小分子。NC组和空白组相差不多。
实施例2 体内长期RNA干扰
1.方法步骤
1.1 dsRNA注射及虫体收集
试验共设空白对照组（PBS）、无关对照组（NC组）和S1dsRNA处理组，每组共三只小鼠。于感染后的4、8、12、16、20、24、28、32、36和40 d分别尾静脉快速注射dsRNA(每只注射1OD dsRNA，溶于200 μL DEPC水中）。42 d剖杀小鼠，分别收集虫体和肝脏。同时，每组挑选6对雌雄合抱虫体，于0.1 M PBS缓冲液中迅速清洗三次，每次5分钟，然后加入4%多聚甲醛与2.5% 戊二醛的混合固定液，于4℃固定24小时后，换一次混合固定液，使固定液渗透至整个虫体中，4℃保存备用。
1.2 肝脏虫卵计数及孵化率计算
虫卵计数：剖杀后的小鼠，取肝脏称重，加去氯水定容至20 mL，用匀浆机混匀后，各取1 mL肝脏匀浆液与1 mL10% NaOH混合，37℃消化30 min，摇匀后取50 μL于显微镜下计数虫卵，重复三次取平均值。
减卵率=（1-实验组卵胚数目/对照组卵胚数目）×100%
虫卵孵化：分别取4 mL肝脏匀浆液加入平底烧瓶中，加入去氯水至瓶颈上3-5 cm，在液面上塞入一薄层棉花（注意避免气泡产生），棉花上加入8 mL去氯水，26-27℃孵化6 h，6 h后将棉花以上的上清液转移至15 mL尖底离心管中，加入2-3滴碘酊染液固定毛蚴，4000×g离心5 min，用5 mL移液枪吸走上清，管底留2 mL液体，摇匀后取100 μL显微镜下计数，重复三次取平均数。
孵化率=毛蚴总数/卵胚总数×100%
减孵化率=（对照组平均孵化率-处理组平均孵化率）/对照组平均孵化率×100%
1.3 体内长期RNA干扰效果的实时定量PCR 验证
Trizol法提取各处理组日本血吸虫虫体的总RNA，消化基因组，反转录为cDNA，进行实时定量PCR分析。
1.4抑制SjELAV-like 2基因表达引起虫体体被的变化观察
利用扫描电镜（SEM）观察SjELAV-like 2 siRNA干扰组与对照组虫体的表膜及体被结构的形态，具体操作步骤如下（Michae et al.）：
1）取固定好的虫体，于0.1 M PBS缓冲液中清洗6次，每次5 min，吸干残留液体后，在通风橱中加入0.5%锇酸，室温固定1 h；
2）用0.1 M PBS缓冲液清洗虫体，并用吸水纸吸干残留液体后，将虫体依次放入梯度浓度为30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇中脱水，每次15 min；
3）将脱水后的虫体，置于真空干燥器内，抽低真空使液态物质挥发，干燥样品，注意使样品体积和结构均不变形，且干燥彻底；
4）用粘接剂（碳粉导电胶）将虫体粘样于样品托上，并用离子溅射喷镀的方法，在样品及样品托表面同时镀一层金属膜，镀膜应薄而均匀，能够再现样品表面的固有形态；
5）在扫描电镜下，观察SjELAV-like 2 siRNA干扰组与对照组虫体不同部位的表膜形态，并拍照；
2.结果与分析
2.1 体内长期RNA干扰效果的实时定量PCR分析
如图2所示，对照组和处理组小鼠虫体实时定量PCR分析表明处理组SjELAV-like 2基因的转录水平显著降低，而注射无关dsRNA分子的对照组和空白组未见影响。
2.2 长期RNA干扰后对肝脏虫卵孵化率的影响
BALB/c小鼠于感染日本血吸虫4、8、12、16、20、24、28、32、36和40天尾静脉注射dsRNA，42 d剖杀小鼠，收集小鼠肝脏，称重，虫卵计数，26-27℃孵化6 h，计数毛蚴数。结果表明RNA干扰后处理组（S1）的虫卵孵化率较NC对照组明显降低，干扰组减虫率为28.57%，肝脏减卵率为46.02%，每只雌虫肝脏虫卵负荷的贡献率下降17.74%，减孵化率达75.79%，说明RNA干扰对日本血吸虫的孵化率有较大的影响（见表1）
表1 RNA干扰后的减卵率和减孵化率
n=3，**为P<0.01
2.3 RNA干扰引起虫体体被表膜的变化
利用扫描电镜观察干扰组虫体及NC组虫体的体被表膜变化情况。扫描电镜下观察发现，SjELAV-like 2 siRNA干扰组体被上泡状突出物明显增多（图3）。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120> 日本血吸虫SjELAV-like 2基因的siRNA及其应用
<160> 8
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<400> 1
GCGUUAUUCAAUGCCGCAUTT 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<400> 2
AUGCGGCAUUGAAUAACGCTT 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<400> 3
GCUACAGUCCAACCACAAATT 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<400> 4
UUUGUGGUUGGACUGUAGGTT 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<400> 5
GCUACUUGACUCCCUACUUTT 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<400> 6
AAGUAGGGAGUCAAGUAGCTT 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<400> 7
UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<400> 8
ACGUGACACGUUCGGAGAATT 21
Claims (6)
1.一种治疗日本血吸虫病的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为：针对日本血吸虫SjELAV-like 2基因的siRNA，其中所述siRNA的靶点序列是日本血吸虫SjELAV-like 2基因的448-464bp，即GUUAUUCAAUGCCGCAU。
2.如权利要求1所述的治疗日本血吸虫病的药物，其特征在于，所述siRNA是SEQ IDNO.1 和SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列。
3.针对日本血吸虫SjELAV-like 2基因的siRNA在制备治疗日本血吸虫病的药物中的应用，其中所述siRNA的靶点序列是日本血吸虫SjELAV-like 2基因的448-464bp，即GUUAUUCAAUGCCGCAU。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述siRNA是SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
5.针对日本血吸虫SjELAV-like 2基因的siRNA在制备预防日本血吸虫病的疫苗中的应用，其中所述siRNA的靶点序列是日本血吸虫SjELAV-like 2基因的448-464bp，即GUUAUUCAAUGCCGCAU。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述siRNA是SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
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