CN110564724B - 日本血吸虫SjFrzb2基因的siRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了日本血吸虫SjFrzb2基因的siRNA，所述siRNA为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明还公开了日本血吸虫SjFrzb2基因的siRNA的应用。本发明日本血吸虫SjFrzb2基因的siRNA，可明显抑制SjFrzb2基因的转录，并能显著降低血吸虫感染小鼠的虫体数、肝荷卵数、每只雌虫的肝卵贡献率和虫卵孵化率，且对虫体的体被结构和生殖腺的细胞形态也造成了一定的病理影响，适用于制备防治和治疗血吸虫病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫SjFrzb2基因的siRNA 及其应用。
背景技术
血吸虫病（Schistosomiasis）是由血吸虫感染引起的一种人畜共患寄生虫病，是世界上最严重的寄生虫疾病之一，感染者超过2亿，有将近8亿人面临着感染的风险，每年造成数千人的死亡。目前该病的防治药物主要是吡喹酮，但该药不能阻止再次感染，且长期使用有产生耐药性的风险。因此，制备新的治疗血吸虫病的疫苗或药物迫在眉睫。
Frzb2（frizzled motif associated with bone development 2）是sFrp（secreted frizzled related protein）家族的成员之一，该基因在非洲爪蟾中首次克隆获得，之后在鸡早期神经组织中也发现了该基因的表达，且研究证明Frzb2基因的异位表达，会抑制爪蟾头部的形成以及Wnt-8c的表达。该家族成员可通过竞争性结合wnt信号通路的特异性卷曲蛋白受体(Fz受体)而抑制wnt信号通路的传导，它们在人类、鼠、鸡及爪蟾等动物体内皆有表达。Frzb2基因的存在并不仅仅在非洲爪蟾和鸡中表达，该基因的同系物已经在曼氏血吸虫、华支睾吸虫和细粒棘球绦虫中被鉴定。日本血吸虫Frzb2基因（SjFrzb2），其基因序列在GenBank中的编号为AAX24900.2。在前期研究工作中本发明人课题组通过qRT-PCR技术验证了SjFrzb2在正常发育雌虫与发育阻遏雌虫的表达，结果显示SjFrzb2在发育阻遏雌虫中表达较高，这与本实验室前期转录组学分析结果相符，这表明SjFrzb2在雌虫发育过程中起着一定的作用。研究SjFrzb2基因的功能及其在雌虫中的作用将对于我们从控制雌虫生殖发育及产卵的角度来控制血吸虫病奠定基础。
RNAi现象广泛存在于生物体中，由双链RNA介导，能特异性的降解目标mRNA，使其产生相应的表型缺失。RNAi具有以下几点鲜明的特征：RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的RNAi技术；dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡。该技术的广泛应用推进了科学和医学的进步。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种日本血吸虫SjFrzb2基因的 siRNA，该siRNA 可明显抑制SjFrzb2基因的转录，可用于制备治疗血吸虫病的药物。此外，还提供一种日本血吸虫SjFrzb2基因的 siRNA 在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
本发明提供了一种日本血吸虫SjFrzb2基因的 siRNA，所述 siRNA为 SEQ IDNO.1 和SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列；或SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4 所示的核苷酸序列；或SEQ ID NO.5 和SEQ ID NO.6 所示的核苷酸序列。
优选地，所述日本血吸虫SjFrzb2基因的siRNA为 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种治疗血吸虫病的药物，所述药物的活性成分为：通过RNA 干扰抑制日本血吸虫SjFrzb2基因表达的 siRNA，所述 siRNA 为 SEQ ID NO.1 和 SEQ IDNO.2 所示的核苷酸序列。
同时，本发明还提供了一种上述日本血吸虫SjFrzb2基因的 siRNA 在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。
本发明还提供了一种上述日本血吸虫SjFrzb2基因的 siRNA 在制备预防血吸虫病的疫苗中的应用。
本发明日本血吸虫SjFrzb2基因的 siRNA，可用于干扰日本血吸虫SjFrzb2基因转录、表达及血吸虫的生长发育，小鼠的体内 RNA 干扰实验表明，该 siRNA 能显著降低感染小鼠肝脏虫卵孵化率，适于制备治疗血吸虫病的药物。
附图说明
图 1 是本发明实施例 1 实时定量 PCR 分析各处理组SjFrzb2基因的转录结果图；
图 2 是本发明实施例 2 实时定量 PCR 分析各处理组SjFrzb2基因的转录结果图。
图 3 是本发明实施例2扫描电镜观察各处理组SjFrzb2基因干扰的结果图；其中，A，C，E，G：阴性组； B，D，F，H：S1干扰；A，B：雌虫中段体壁；C，D：雌虫的口腔和腹部吸盘之间的体壁； E，F：雄虫抱雌沟体壁的后段； G，H：雄虫后段；flp：花状乳突；ns：网状结构； p：突状物； b：泡状突出物；与对照组相比，干扰组突状物更多，体壁排列稀疏。
图 4 是本发明实施例2透射电镜观察各处理组SjFrzb2基因干扰的结果图；其中，A，C，E：阴性对照； B，D，F：干扰组； A-B：雄虫的精母细胞； C-F：雌虫的卵黄细胞； S：精母细胞； ch：染色质； vc：卵黄细胞； vg：卵黄球； vd：卵黄滴； l：脂滴； n：细胞质； nu：核仁。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》（J. 萨姆布鲁克，D. W. 拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译. 第 3 版，北京：科学出版社，2002）中所述的方法进行。
实施例1：体内筛选小RNA
1．方法步骤
1.1 siRNA 分子和SjFrzb2基因实时定量 PCR 引物的准备
在NCBI 网（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）找出血吸虫Frzb2基因序列（登录号AAX24900.2），设计并合成三对 dsRNA，设计原则主要包括以下几个方面：一、从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基来设计；二、避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列；三、序列GC含量应为30%—60%左右；四、将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。同时合成一对无关对照 dsRNA（NC siRNA）。
S1 dsRNA:sense: 5'-GCGCACAGAUUGCAUAUAUTT-3'(SEQ ID NO.1)
anti-sence: 5'-AUAUAUGCAAUCUGUGCGCTT-3'(SEQ ID NO.2)
S2 dsRNA: sense:5'-GCUUCCAUCAACUAAUGUUTT-3'(SEQ ID NO.3)
anti-sence:5'-AACAUUAGUUGAUGGAAGCTT-3'(SEQ ID NO.4)
S3 dsRNA: sense:5'-GGAGUAUUGCAUGUUGAAUTT-3'(SEQ ID NO.5)
anti-sence:5'-AUUCAACAUGCAAUACUCCTT-3'(SEQ ID NO.6)
NC dsRNA:sense:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'(SEQ ID NO.7)
anti-sence:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.8)
根据SjFrzb2的基因序列，设计实时定量 PCR 引物，然后送公司（Invitrogen）合成。
Sense：5'-TGAGACGTCCACCTTCACAA-3'
anti-sence： 5'-AGACCGTCTAGTTGGTGTTG-3'
1.2感染小鼠
采用腹部贴片法感染4-6周龄的雄性BALB/c小鼠，每只感染200条尾蚴，以肝门静脉灌注法收集虫体，所收集虫体均用PBS洗涤3 次，液氮罐冻存备用。
1.3注射siRNA
于感染后22 d尾静脉注射1OD S1、S2、S3、NC或等体积的PBS。在48 h后剖杀小鼠，肝门静脉灌注法收集虫体，实验分为：空白组（PBS），无关对照组（NC组），S1、S2、S3 dsRNA处理组，每组三只小鼠。
1.4体内 RNA 干扰效果的实时定量 PCR 验证
Trizol法提取日本血吸虫虫体总RNA，反转录为cDNA，以此为模板进行实时定量PCR分析。
2、结果
如图 1所示，三种不同的 dsRNA分子均显著地降低了SjFrzb2基因的转录水平，其中S1 dsRNA组小分子降低的转录水平最低，优选 S1dsRNA 组小分子作为体内 RNA 干扰用小分子。
实施例2： RNA干扰实验
1、方法步骤
1.1 dsRNA 注射
试验共设对照组、无关对照组（NC 组）和 S1 dsRNA 处理组，每组共三只小鼠。于感染后的 4天、8天、12天、16天、20天、24天、28天、32天、36天和40天分别尾静脉快速注射200µl PBS，200µl NC dsRNA（8µg）DEPC水和 200µl SjFrzb2基因 S1 dsRNA（8µg）DEPC 水，共10次。
1.2肝脏虫卵和毛蚴计数
收集肝脏并称重，加入去氯水，用匀浆机混匀后，定容至20 mL，取1 mL肝脏匀浆液，加入等体积10% NaOH（W/V），56℃水浴锅中消化2 h，消化完全后混匀取三次50 uL样品，镜检计数虫卵。取4 mL肝匀浆液于细颈平底烧瓶中，加入去氯水，并用一薄层棉花覆盖在液面下5 cm处，28℃孵化4 h后收集棉花上层清液，转移至15 mL离心管中，加入50 mL碘酊染液固定毛蚴，4000×g离心5 min，吸去上清，定容至2 mL，混匀后取三次100 uL样品，镜检计数毛蚴。
1.3体内 RNA 干扰效果的实时定量 PCR 验证
以 Trizol 试剂盒提取各处理组日本血吸虫虫体的总 RNA，反转录为 cDNA，以此为模板进行实时定量 PCR 分析。
1.4 扫描电镜
将干扰试验中收集的雌、雄虫体用PBS洗涤后，4℃置于4%戊二醛中固定24h。固定好的标本经0.1 mol/L PBS漂洗3次（15min/次），1%锇酸固定染色2 h，0.1 mol/L PBS漂洗3次（15 min/次），30%、50%、70%、80%、90%系列浓度乙醇脱水分别20 min，100%乙醇脱水2次（20 min/次），真空干燥，用离子溅射仪喷金后，用JEOL JSM-6380LV电镜对虫体体壁作扫描电镜观察并拍照。
1.5透射电镜
取上述固定后的雌、雄虫体，同样经PBS洗涤后，1%锇酸固定2h，依次在50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇+90%丙酮（1:1）、90%丙酮、100%丙酮中脱水20 min，纯丙酮：包埋液按3:1、1:1和1:3，室温分别浸泡2h、4 h和37℃过夜；挑取虫体置入含包埋液的模具中，放入60℃烘箱内24h；包埋块于超薄切片机切片后，置于铜网上，用0.1 mol/L PBS清洗铜网6次，每次5 min，再用ddH2O冲洗3次，每次5 min；在铜网上加入醋酸铀溶液，染色3 min，再加入混合铅溶液，染色1 min；同样方法清洗铜网，置于烘箱中干燥；在电镜下找出铜网上切片的位置，观察并拍照。
2．结果与分析
2.1体内 RNA 干扰效果的 RT-PCR 分析
如图 2 所示，对照组和处理组小鼠虫体 RT-PCR 分析表明处理组SjFrzb2基因的转录水平显著降低，而注射无关 dsRNA 分子的对照组未见影响。
2.2 RNA 干扰后对肝脏虫卵孵化率的影响
Balb/c 小鼠于感染日本血吸虫 4天、8天、12天、16天、20天、24天、28天、32天、36天和40天尾静脉注射 dsRNA，42 天剖杀小鼠，收集虫体，数虫数，收集小鼠肝脏，称重，虫卵计数，25-30 ℃孵化 2 h，计数毛蚴数。计算 RNA 干扰后的减孵化率，结果表明干扰组宿主的虫体减少率分别为45.95%和35.49%，每克肝荷卵的降低分别达64.29%和48.3%，雌虫对肝脏卵的贡献分别下降了33.28%和46.70%，虫卵的肝卵胚孵化分别下降达64.24%和61.71%，说明 RNA 干扰对日本血吸虫的孵化率有显著的影响（见下表 1）。
表1 siRNA干扰效果评估
减卵率=（1-处理组每克肝脏荷卵数目/对照组每克肝脏荷卵数目）× 100 %
孵化率=毛蚴总数/卵胚总数× 100 %
减孵化率=（1-处理组平均孵化率/对照组平均孵化率）× 100 %
**为P<0.01。
2.3 RNA干扰对虫体体被和生殖细胞的影响
2.3.1 SEM观察结果
在小鼠受到干扰后，收集虫体并通过扫描电子显微镜观察干扰对虫体形态的影响，结果发现，对照组（图3A、C、E、G）与干扰组（图3B、D、F、H）相比，虫体形态结构发生了明显的变化。正常血吸虫雌虫中部的体壁组织整齐排列，并在其中分布少量突状物；而干扰组的雌虫中部的体壁组织间排列较杂乱，分布的突状物明显增多（图3A-B）。正常雌虫口腹吸盘间的体壁有少量的泡状物，同时乳突形态完整；而干扰组雌虫口腹吸盘间的体壁分布的泡状物增多，且乳突形态无规则（图3C-D）。正常血吸虫雄性抱雌沟后段组织有序排列，网状结构形态规则；而干扰组的雄虫抱雌沟后段的网状结构组织间形态稀疏（图3E-F）。正常雄虫尾段体壁组织间结构紧密，分布有少量泡状小颗粒；而干扰后的雄虫尾段体壁组织间结构稀疏，泡状颗粒物增多（图3G-H）。
2.3.2 TEM观察结果
在干扰后收集的虫体用于观察雌性和雄性的性腺，在透射电子显微镜下，将对照组（图4A、C、E）与干扰组（图4B、D、F）进行比较，雌性和雄性虫体的生殖细胞发生了显着变化。正常雄性睾丸中精母细胞（s）数量众多，是椭圆状，形态也大，细胞核周围存在染色质（ch）；S1干扰后，精母细胞数目锐减，细胞变小，染色质也近乎消失（图4A-B）；正常雌性的卵黄腺中的卵黄细胞（vc）整齐排列并呈规则形态，卵黄细胞中含有卵黄滴（vd）、卵黄球（vg）和脂滴（l），卵黄滴中含有卵黄小球，数量众多，为大小相对均匀的圆形；而S1干扰后的卵黄细胞之间排列散乱，形态呈现不规则状，且卵黄滴数目减少，它含有较少的卵黄球，大小和形状各不相同（图4C-F）。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120> 日本血吸虫SjFrzb2基因的siRNA及其应用
<160> 8
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<400> 1
GCGCACAGAUUGCAUAUAUTT 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<400> 2
AUAUAUGCAAUCUGUGCGCTT 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<400> 3
GCUUCCAUCAACUAAUGUUTT 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<400> 4
AACAUUAGUUGAUGGAAGCTT 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<400> 5
GGAGUAUUGCAUGUUGAAUTT 21
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<212> RNA
<400> 6
AUUCAACAUGCAAUACUCCTT 21
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<211> 21
<212> RNA
<400> 7
UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<400> 8
ACGUGACACGUUCGGAGAATT 21
Claims (4)
1.一种日本血吸虫基因的SjFrzb2 siRNA，其序列为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2.一种治疗血吸虫病的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为：如权利要求1所述日本血吸虫SjFrzb2 siRNA基因的siRNA。
3.权利要求 1所述日本血吸虫SjFrzb2基因的 siRNA 在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。
4.权利要求 1所述日本血吸虫SjFrzb2基因的 siRNA 在制备预防血吸虫病的疫苗中的应用。
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