CN111808856A

CN111808856A - 日本血吸虫UDP-4基因的siRNA及其应用

Info

Publication number: CN111808856A
Application number: CN202010481467.8A
Authority: CN
Inventors: 金亚美; 秦芳林; 吴洛斌; 任雨琪; 李肖纯; 程贵凤
Original assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Current assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center; Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2020-05-31
Filing date: 2020-05-31
Publication date: 2020-10-23

Abstract

本发明公开了日本血吸虫UDP‑4基因的siRNA，具体的siRNA为：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。本发明还公开了日本血吸虫UDP‑4基因的siRNA的应用。本发明日本血吸虫UDP‑4基因的siRNA，可明显抑制UDP‑4基因的转录，并能显著降低血吸虫感染小鼠的虫体数、肝荷卵数、每只雌虫的肝卵贡献率和虫卵孵化率，且对虫体的体被结构和生殖腺的细胞形态也造成了一定的病理影响，适用于制备防治和治疗血吸虫病的药物。

Description

日本血吸虫UDP-4基因的siRNA及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫UDP-4基因的siRNA 及其应用。

背景技术

血吸虫病是由血吸虫感染引起的一种人畜共患寄生虫病，是世界上最严重的寄生虫疾病之一，感染者超过2亿，有将近8亿人面临着感染的风险，每年造成数千人的死亡。目前该病的防治药物主要是吡喹酮，但该药不能阻止再次感染，且长期使用有产生耐药性的风险。因此，制备新的治疗血吸虫病的疫苗或药物迫在眉睫。

UDP-4在细菌和哺乳动物半乳糖代谢机制中介导UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的相互转化，参与细胞壁的合成，对锥虫和果蝇的生长发育起调控作用。该基因在日本血吸虫的免疫保护中也起一定作用，曹宇凡等（]曹宇凡,乔洪宾,刘萍萍,等.日本血吸虫重组抗原rSjGALE对小鼠的免疫保护效果分析[J].中国动物传染病学报,2013,21(03):51-56.）将其与206弗氏佐剂混合免疫小鼠，发现有一定的减卵和减孵化作用。

RNAi现象广泛存在于生物体中，由双链RNA介导，能特异性的降解目标mRNA，使其产生相应的表型缺失。RNAi具有以下几点鲜明的特征：RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的siRNA分子就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的RNAi技术；siRNA不得短于21个碱基，并且长链siRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的siRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡。该技术的广泛应用推进了科学和医学的进步。

发明内容

日本血吸虫UDP-4基因（UDP-4），其基因序列在GenBank中的编号为AY815833.1。在前期研究工作中本课题组通过qRT-PCR技术验证了UDP-4在正常发育雌虫与发育阻遏雌虫的表达，结果显示UDP-4在双性感染雌虫中表达较高，这与本实验室前期转录组学分析结果相符，这表明UDP-4在雌虫发育过程中起着一定的作用。研究UDP-4基因的功能及其在雌虫中的作用将对于我们从控制雌虫生殖发育及产卵的角度来控制血吸虫病奠定基础。

因此，本发明要解决的技术问题是提供一种日本血吸虫UDP-4基因的 siRNA，该siRNA 可抑制UDP-4基因的转录，可用于制备治疗血吸虫病的药物。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

本发明首先提供一种干扰日本血吸虫UDP-4基因的siRNA。更具体地，所述的siRNA，其特征在于，其序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种干扰日本血吸虫UDP-4基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。更优选地，所述siRNA的正义链序列为 SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列,反义链序列为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

本发明另外提供一种治疗血吸虫病的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为抑制日本血吸虫UDP-4基因表达的 siRNA。更优选地，所述siRNA的正义链序列为 SEQ IDNO.5所示的核苷酸序列,反义链序列为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

此外，本发明进一步提供干扰日本血吸虫UDP-4基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的疫苗中的应用。更优选地，所述siRNA的正义链序列为 SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列,反义链序列为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

本发明日本血吸虫UDP-4 基因的 siRNA，可用于干扰日本血吸虫 UDP-4基因转录、表达及血吸虫的生长发育，小鼠的体内 RNA 干扰实验表明，该 siRNA能显著降低感染小鼠肝脏虫卵孵化率，适于制备治疗血吸虫病的药物。

附图说明

图 1 是本发明实施例 1 实时定量 PCR 分析各处理组 UDP-4基因的转录结果图。

图 2 是本发明实施例 2 实时定量 PCR 分析各处理组UDP-4基因的转录结果图。

图 3 是本发明实施例2扫描电镜观察各处理组UDP-4基因干扰的结果图。

具体实施方式

为深入研究血吸虫雌虫的生殖发育，本实验室前期对感染后25天的两性感染雌虫和单性感染雌虫进行了差异蛋白质组学的分析，分别找到25天两性感染雌虫和单性感染雌虫的392个差异表达蛋白（fold change>1.5，P<0.05）[]Li Xiaochun, Qiao Hongbin,Qin Fanglin, Cheng Guifeng, Liu Jinming, Li Hao, Gu Shaopeng, Jin Yamei.Comparative analysis of iTRAQ-based proteome profiles of Schistosomajaponicum female worms coming from single-sex infections and bisexualinfections[J]. Journal of proteomics, 2019, (213):16-21.]，生信分析发现，两性感染雌虫高表达的蛋白主要和代谢，转录，降解，运输和分解等通路相关，这可能和两性感染雌虫为满足大量产卵需吞噬大量血细胞有关。虫卵的主要构成成分是蛋白质，为满足每天的高产卵量，雌虫需要合成大量的蛋白质，转录翻译相关蛋白高表达才能满足高产卵的需求。雌虫大量产卵需要消耗大量血红蛋白，此过程会导致产生许多有害物质，降解，分解和运输功能相关的蛋白大量表达就应需而生；单性感染雌虫高表达的蛋白主要参与移动、生理粘附、细胞信号通讯和神经传递通路，这应该是与单性感染雌虫为了寻求与雄虫相遇需保持活跃的状态有关。

虽然两性感染雌虫和单性感染雌虫差异表达蛋白的发现和生物信息学分析结果符合正常发育雌虫或未合抱雌虫的生理生化特性，但很难从25天这单一时间点的差异表达蛋白中找出调控血吸虫雌虫生殖发育的关键分子。因此，本发明人对不同发育时间节点的两性感染雌虫和单性感染雌虫的蛋白表达差异进行了更为系统的分析。分析发现：两性感染雌虫与单性感染雌虫的差异表达蛋白在感染后第18天（合抱后三天）即达286个，在卵壳形成和产卵前后，差异表达蛋白逐渐增多，从21天的220个到23天的300个，25天的447个（Fold change >1.5 ，Q-value<0.05 ）。生信分析表明随着血吸虫的生长发育，在两性感染雌虫中较多的蛋白参与合成与代谢，催化，抗氧化，在单性感染的未合抱雌虫中较多的蛋白参与生物体运动和细胞周期，信号传递，能量代谢。

本发明人从中选出在18、21、23、25d的MF中都高表达，差异倍数在1.5倍以上的蛋白进行简述，分别为：TCTP、UL-30、CAX70812、SjGST、Annexin A13、CAX70849、和UDP-4。其中按产生虫体表面的角度进行归类：干扰TCTP、UL-30、CAX70812、Annexin A13、CAX70849的表达造成雄虫头部乳头状突起或刺突减少，表面横向纹路发生改变，虫体中间部分刺突减少，尾部刺突和泡状突起均减少，表面纹路由条纹状变成网状。雌虫头部刺突大量减少，中间部分条状纹路变平滑，尾部泡状突起大量减少甚至完全消失；干扰SjGST雄虫体表变化同上，雌虫中间部分结构变得不规则，其余部位差异不显著；UDP-4干扰后试验组雄虫表面出现溃烂，刺突和泡状突起消失。雌虫中部表面纹理发生改变，泡状突起几乎没有，成纵向条状排列；尾部有白色屑状物，表面出现龟裂泡状突起减少。

本发明涉及其中干扰UDP-4基因的发明，下面结合实验进行具体说明。下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》（J. 萨姆布鲁克，D. W. 拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译. 第 3 版，北京：科学出版社，2002）中所述的方法进行。

实施例1：体内筛选siRNA

1、siRNA 分子和 UDP-4 基因实时定量 PCR 引物的准备

在NCBI 网（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）找出血吸虫UDP-4基因序列（AY815833.1），设计并合成三对 siRNA。同时合成一对无关对照 siRNA（NC siRNA）。

S1 siRNA:正义链: 5'-GCACAUCCCAGUGGAUUAATT-3'(SEQ ID NO.1)

反义链: 5'-UUAAUCCACUGGGAUGUGCTT-3'(SEQ ID NO.2)

S2 siRNA: 正义链:5'-GGCCUUAUGUGAAUGUUUATT-3'(SEQ ID NO.3)

反义链:5'-UAAACAUUCACAUAAGGCCTT-3'(SEQ ID NO.4)

S3 siRNA: 正义链:5'-GCCGAACGAGAAUUAGGAUTT-3'(SEQ ID NO.5)

反义链:5'-AUCCUAAUUCUCGUUCGGCTT-3'(SEQ ID NO.6)

NC siRNA:正义链:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'(SEQ ID NO.7)

反义链:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.8)

根据 UDP-4的基因序列，设计实时定量 PCR 引物，然后送公司（Invitrogen）合成。

正义链：5'-GTGGTTTGCGGCCTTATGTG-3'

反义链：5'-ATGCGCTTCAGCCAGATCAA-3'

2、感染小鼠

采用腹部贴片法感染4-6周龄的雄性BALB/c小鼠，每只感染200条尾蚴，以肝门静脉灌注法收集虫体，所收集虫体均用PBS洗涤3 次，液氮罐冻存备用。

3、注射siRNA

于感染后22 d尾静脉注射1OD S1、S2、S3、NC或等体积的PBS。在48 h后剖杀小鼠，肝门静脉灌注法收集虫体，实验分为：空白组（PBS），无关对照组（NC组），S1、S2、S3 siRNA处理组，每组三只小鼠。

4、体内 RNA 干扰效果的实时定量 PCR 验证

Trizol法提取日本血吸虫虫体总RNA，反转录为cDNA，以此为模板进行实时定量PCR分析。

实验结果：如图 1所示，三种不同的 siRNA分子均显著地降低了UDP-4基因的转录水平，其中S3 siRNA组小分子降低的转录水平最低，选取 S3 siRNA 组小分子作为体内RNA 干扰用小分子。

实施例2

1、siRNA注射

试验共设对照组、无关对照组（NC 组）和 S3 siRNA 处理组，每组共三只小鼠。于感染后的 4天、8天、12天、16天、20天、24天、28天、32天、36天和40天分别尾静脉快速注射200µlPBS，200µl NC siRNA（8µg）DEPC水和 200µl UDP-4基因 S3 siRNA（8µg）DEPC 水，共10次。

2、肝脏虫卵和毛蚴计数

收集肝脏并称重，加入去氯水，用匀浆机混匀后，定容至20 mL，取1 mL肝脏匀浆液，加入等体积10% NaOH（W/V），56℃水浴锅中消化2 h，消化完全后混匀取三次50µL样品，镜检计数虫卵。取4 mL肝匀浆液于细颈平底烧瓶中，加入去氯水，并用一薄层棉花覆盖在液面下5cm处，28℃孵化4 h后收集棉花上层清液，转移至15 mL离心管中，加入50 mL碘酊染液固定毛蚴，4000×g离心5 min，吸去上清，定容至2 mL，混匀后取三次100µL样品，镜检计数毛蚴。

Balb/c 小鼠于感染日本血吸虫 4天、8天、12天、16天、20天、24天、28天、32天、36天和40天尾静脉注射siRNA，42 天剖杀小鼠，收集虫体，数虫数，收集小鼠肝脏，称重，虫卵计数，25-30 ℃孵化 2 h，计数毛蚴数。计算 RNA 干扰后的减孵化率，结果表明干扰组宿主的虫体减少率分别为54%和45.24%，每克肝荷卵的降低分别达64%和63.89%，雌虫对肝脏卵的贡献分别下降了24.45%和29.96%，虫卵的肝卵胚孵化分别下降达38.24%和37.34%，说明RNA 干扰对日本血吸虫的孵化率有显著的影响（见下表1）。

其中，减卵率=（1-处理组每克肝脏荷卵数目/对照组每克肝脏荷卵数目）× 100 %

孵化率=毛蚴总数/卵胚总数× 100 %

减孵化率=（1-处理组平均孵化率/对照组平均孵化率）× 100 %

表1 siRNA干扰效果评估

**为P<0.01.*为P<0.05

3、体内 RNA 干扰效果的实时定量 PCR 验证

以 Trizol 试剂盒提取各处理组日本血吸虫虫体的总 RNA，反转录为 cDNA，以此为模板进行实时定量 PCR 分析。

如图 2 所示，对照组和处理组小鼠虫体 RT-PCR 分析表明处理组UDP-4基因的转录水平显著降低，而注射无关siRNA分子的对照组未见影响。

4、扫描电镜

将干扰试验中收集的雌、雄虫体用PBS洗涤后，4℃置于4%戊二醛中固定24h。固定好的标本经0.1 mol/L PBS漂洗3次（15min/次），1%锇酸固定染色2 h，0.1 mol/L PBS漂洗3次（15 min/次），30%、50%、70%、80%、90%系列浓度乙醇脱水分别20 min，100%乙醇脱水2次（20min/次），真空干燥，用离子溅射仪喷金后，用JEOL JSM-6380LV电镜对虫体体壁作扫描电镜观察并拍照。

在小鼠受到干扰后，收集虫体并通过扫描电子显微镜观察干扰对虫体形态的影响，结果发现，对照组（图3）与干扰组（图3）相比，虫体形态结构发生了明显的变化。正常血吸虫雌虫中部的体壁组织整齐排列，并在其中分布少量突状物；而干扰组的雌虫中部的体壁组织间排列较杂乱，干扰后试验组雄虫表面出现溃烂，刺突和泡状突起消失。雌虫中部表面纹理发生改变，泡状突起几乎没有，成纵向条状排列；尾部有白色屑状物，表面出现龟裂泡状突起减少。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120> 日本血吸虫UDP-4基因的siRNA及其应用

<160> 10

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<400> 1

gcacaucccag uggauuaatt 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列

<400> 2

uuaauccacu gggaugugct t 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<400>3

ggccuuaugu gaauguuuat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<400> 4

uaaacauuca cauaaggcct t 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<400> 5

gccgaacgag aauuaggaut t 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<400>6

auccuaauuc ucguucggct t 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<400> 7

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210>8

<211> 21

<212> RNA

<400> 8

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<400> 9

gtggtttgcg gccttatgtg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<400> 10

atgcgcttca gccagatcaa 20

Claims

1.一种干扰日本血吸虫UDP-4基因的siRNA。

2.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，其序列为 SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

3.一种干扰日本血吸虫UDP-4基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述siRNA的正义链序列为 SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，反义链序列为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

5.一种治疗血吸虫病的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为抑制日本血吸虫UDP-4基因表达的siRNA。

6.根据权利要求5所述治疗血吸虫病的药物，其特征在于，所所述siRNA的正义链序列为 SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，反义链序列为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

7.干扰日本血吸虫UDP-4基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的疫苗中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述siRNA的正义链序列为 SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，反义链序列为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。