CN111979239A - 用于日本血吸虫减虫减卵的siRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于日本血吸虫减虫减卵的siRNA及其应用，具体是日本血吸虫CAX72463基因、UL‑30基因、TCTP基因、CAX70849基因、Annexin A 13基因的siRNA，以及所述基因的siRNA的应用。通过siRNA抑制所述基因的转录，能显著降低血吸虫感染小鼠的肝脏荷卵数和虫卵孵化率，对血吸虫体被结构造成了一定的损伤，并造成生殖细胞的形态异常，适用于制备治疗血吸虫病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、Annexin A 13基因的siRNA及其应用。
背景技术
血吸虫病(Schistosomiasis)是一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病，呈地方性流行；血吸虫性成熟雌虫产生的大量虫卵在动物肝脏中形成的肉芽肿是导致宿主损伤的根本原因，而大量虫卵排出体外又造成血吸虫病的传播和流行。目前，主要采用药物，例如吡喹酮，对已经感染血吸虫病的人或动物进行治疗，但是这些药物不能够防治血吸虫病的再次感染，因此，有必要寻找新的治疗血吸虫病的药物。此外，抗原伪装和抗原模拟是血吸虫免疫逃避的重要机制，这也是没有一种安全性高、特异性强的疫苗可以广泛应用于控制血吸虫病的原因，故研究有效的抗原靶点对血吸虫疫苗、药物靶标和诊断工具的开发方面具有潜在应用价值。
RNA干扰(RNAi)是发生在mRNA水平上的一种基因沉寂现象，即将外源性双链 RNA(siRNA)引入细胞后可以引起细胞内与其同源的mRNA特异性降解，使该基因在 RNA水平上被关闭而致其不表达，即转录后基因沉寂，从而产生相应的功能表型缺失。该技术目前已经在功能基因组学、基因治疗、微生物学研究和药物研发等领域里取得了令人瞩目的进展。小分子干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，是一种短片段双链 RNA分子，通常由20个左右核苷酸组成，能够以同源互补序列mRNA为靶标并将其降解，从而介导特异性RNA干扰途径的能进行的，使转录后基因沉默。siRNA已经广泛应用于基因表达调控机制研究等领域。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、或Annexin A 13基因的siRNA，该siRNA可明显抑制CAX72463 基因、、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、或Annexin A 13基因的转录，可用于制备治疗血吸虫病的药物。此外，还需要提供一种日本血吸虫CAX72463基因\、UL-30 基因、TCTP基因、CAX70849基因、或Annexin A 13基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。
本发明一方面提供一种干扰日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、或Annexin A 13基因的siRNA。
更优选地,干扰日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、Annexin A 13基因的siRNA分别为：正义链序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.21 所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ IDNO.41所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列。
本发明还提供一种干扰日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、Annexin A 13基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。
在具体实施方式中，所述干扰日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、Annexin A 13基因的siRNA分别为：正义链序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.11 所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ IDNO.21所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列。
本发明进一步提供一种治疗血吸虫病的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为抑制CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、Annexin A 13基因表达的siRNA。更优选地，抑制日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849 基因、Annexin A 13基因的siRNA分别为：正义链序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.21 所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ IDNO.41所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列。
本发明进一步提供一种干扰日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、Annexin A 13基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的疫苗中的应用。
更优选地，干扰日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849 基因、Annexin A 13基因的siRNA分别为：正义链序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.21 所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ IDNO.41所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列。
本发明日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、AnnexinA 13基因的siRNA，可用于干扰日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、 CAX70849基因、Annexin A 13基因转录、表达及血吸虫的生长发育。小鼠的体内RNA 干扰实验表明，通过siRNA抑制这些基因能够显著降低感染小鼠肝脏虫卵孵化率，适于制备治疗血吸虫病的药物。
附图说明
图1是本发明实施例1实时定量PCR分析三种处理组CAX72463基因的转录结果图；
图2是本发明实施例1实时定量PCR分析S1 siRNA处理组CAX72463基因的转录结果图。
图3是本发明实施例1扫描电镜观察各处理组CAX72463基因干扰的结果图；
图4是本发明实施例2实时定量PCR分析三种处理组UL-30基因的转录结果图；
图5是本发明实施例2实时定量PCR分析S1 siRNA处理组UL-30基因的转录结果图。
图6是本发明实施例2扫描电镜观察各处理组UL-30基因干扰的结果图；
图7是本发明实施例3实时定量PCR分析三种处理组TCTP基因的转录结果图；
图8是本发明实施例3实时定量PCR分析S1 siRNA处理组TCTP基因的转录结果图。
图9是本发明实施例3扫描电镜观察S1 siRNA处理组TCTP基因干扰的结果图；
图10是本发明实施例3透射电镜观察各处理组TCTP基因干扰的结果图。
图11是本发明实施例4实时定量PCR分析三种处理组CAX70849基因的转录结果图；
图12是本发明实施例4实时定量PCR分析S1 siRNA处理组CAX70849基因的转录结果图；
图13是本发明实施例4扫描电镜观察各处理组CAX70849基因干扰的结果图；
图14是本发明实施例5实时定量PCR分析S1 siRNA处理组Annexin A13基因的转录结果图；
图15是本发明实施例5扫描电镜观察各处理组Annexin A 13基因干扰的结果图。
具体实施方式
为深入研究血吸虫雌虫的生殖发育，本实验室前期对感染后25天的两性感染雌虫和单性感染雌虫进行了差异蛋白质组学的分析，分别找到25天两性感染雌虫和单性感染雌虫的392个差异表达蛋白(fold change>1.5，P<0.05)[]Li Xiaochun,Qiao Hongbin,QinFanglin,Cheng Guifeng,Liu Jinming,Li Hao,Gu Shaopeng,Jin Yamei.Comparativeanalysis of iTRAQ-based proteome profiles of Schistosoma japonicum femaleworms coming from single-sex infections and bisexual infections[J].Journal ofproteomics,2019,(213):16-21.]，生信分析发现，两性感染雌虫高表达的蛋白主要和代谢，转录，降解，运输和分解等通路相关，这可能和两性感染雌虫为满足大量产卵需吞噬大量血细胞有关。虫卵的主要构成成分是蛋白质，为满足每天的高产卵量，雌虫需要合成大量的蛋白质，转录翻译相关蛋白高表达才能满足高产卵的需求。雌虫大量产卵需要消耗大量血红蛋白，此过程会导致产生许多有害物质，降解，分解和运输功能相关的蛋白大量表达就应需而生；单性感染雌虫高表达的蛋白主要参与移动、生理粘附、细胞信号通讯和神经传递通路，这应该是与单性感染雌虫为了寻求与雄虫相遇需保持活跃的状态有关。
虽然两性感染雌虫和单性感染雌虫差异表达蛋白的发现和生物信息学分析结果符合正常发育雌虫或未合抱雌虫的生理生化特性，但很难从25天这单一时间点的差异表达蛋白中找出调控血吸虫雌虫生殖发育的关键分子。因此，本发明人对不同发育时间节点的两性感染雌虫和单性感染雌虫的蛋白表达差异进行了更为系统的分析。分析发现：两性感染雌虫与单性感染雌虫的差异表达蛋白在感染后第18天(合抱后三天)即达286个，在卵壳形成和产卵前后，差异表达蛋白逐渐增多，从21天的220个到23天的300个，25天的447个(Fold change>1.5，Q-value<0.05)[Li Xiaochun,Qiao Hongbin,Qin Fanglin,ChengGuifeng,Liu Jinming,Li Hao,Gu Shaopeng,Jin Yamei.Comparative analysis ofiTRAQ-based proteome profiles of Schistosoma japonicum female worms comingfrom single-sex infections and bisexual infections[J].Journal of proteomics,2019,(213):16-21.]。生信分析表明随着血吸虫的生长发育，在两性感染雌虫中较多的蛋白参与合成与代谢，催化，抗氧化，在单性感染的未合抱雌虫中较多的蛋白参与生物体运动和细胞周期，信号传递，能量代谢。
本发明人从中选出在18、21、23、25d的MF中都高表达，差异倍数在1.5倍以上的蛋白进行简述，分别为：TCTP、UL-30、CAX72463、SjGST、Annexin A13、CAX70849、和 UDP-4。其中按产生虫体表面的角度进行归类：干扰TCTP、UL-30、CAX72463、Annexin A13、 CAX70849的表达造成雄虫头部乳头状突起或刺突减少，表面横向纹路发生改变，虫体中间部分刺突减少，尾部刺突和泡状突起均减少，表面纹路由条纹状变成网状。雌虫头部刺突大量减少，中间部分条状纹路变平滑，尾部泡状突起大量减少甚至完全消失；干扰SjGST 雄虫体表变化同上，雌虫中间部分结构变得不规则，其余部位差异不显著；UDP-4干扰后试验组雄虫表面出现溃烂，刺突和泡状突起消失。雌虫中部表面纹理发生改变，泡状突起几乎没有，成纵向条状排列；尾部有白色屑状物，表面出现龟裂泡状突起减少。
本发明涉及抑制日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849 基因、Annexin A 13基因的发明。
CAX72463功能未知。日本血吸虫CAX72463基因(CAX72463)，其基因序列在GenBank中的编号为CAX72463。在前期研究工作中通过qRT-PCR技术验证了CAX72463 在正常发育雌虫与发育阻遏雌虫的表达，结果显示CAX72463在双性感染雌虫中表达较高；UL-30(大亚基核糖体蛋白L7e)是编码DNA聚合酶的基因，在病毒基因组的复制及病毒增殖中起重要作用。在传代培养细胞中，Cas9介导的细胞没有影响PRV的裂解，而来自不同传代的PX459-PRV细胞可以稳定表达sg RNA以促进在UL30基因上的Cas9/ sg RNA裂解PRV(伪狂犬病毒)。日本血吸虫UL-30基因(UL-30)，其基因序列在GenBank 中的编号为CAX72463。在前期研究工作中通过qRT-PCR技术验证了UL-30在正常发育雌虫与发育阻遏雌虫的表达，结果显示UL-30在双性感染雌虫中表达较高，这表明UL-30 在雌虫发育过程中起着一定的作用；Annexin A13是一种钙依赖性磷脂结合蛋白属于 Annexins蛋白超家族中的一员，它能与钙离子结合，进而以钙离子依赖的方式与膜磷脂相结合，参与膜转运及膜表面与钙调蛋白相关的生物功能，在人体中该蛋白与肿瘤的形成有关。其蛋白家族中A1和A2在大鼠基因敲除试验中，它们分别表现为中性粒细胞外渗调节受损和纤维酶生成缺陷。日本血吸虫AnnexinA 13基因(Annexin A13)，其基因序列在GenBank中的编号为FN315080.1。在前期研究工作中通过qRT-PCR技术验证了 Annexin A 13在正常发育雌虫与发育阻遏雌虫的表达，结果显示Annexin A13在双性感染雌虫中表达较高；日本血吸虫CAX70849基因(CAX70849)，其基因序列在GenBank 中的编号为FN315117.1。在前期研究工作中通过qRT-PCR技术验证了CAX70849在正常发育雌虫与发育阻遏雌虫的表达，结果显示CAX70849在双性感染雌虫中表达较高；TCTP 具有结合钙离子和IgE依赖性组胺释放因子等功能，研究发现曼氏血吸虫TCTP的表达与虫卵肉芽肿的形成有关,该蛋白与细胞生长及人类的过敏性变态反应有关。其具体的生物学功能尚不清楚，但它对生物核细胞的生长发育有重要作用，其基因序列在GenBank中的编号为U85483.1。在前期研究工作中通过qRT-PCR技术验证了TCTP在正常发育雌虫与发育阻遏雌虫的表达，结果显示TCTP在双性感染雌虫中表达较高。
上述研究结果与前期转录组学分析结果相符，这表明这些基因在雌虫发育过程中起着一定的作用，而研究它们的功能及其在雌虫中的作用将对于从控制雌虫生殖发育及产卵的角度来控制血吸虫病奠定基础。
下面结合实验进行具体说明。下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
实施例1：siRNA抑制CAX72463基因
一、体内筛小RNA
1、siRNA分子和CAX72463基因实时定量PCR引物的准备
在NCBI网(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找出血吸虫CAX72463基因序列(FN316732.1)，设计并合成三对siRNA。同时合成一对无关对照siRNA(NC siRNA)。
S1 siRNA:正义链:5'-GGUGGAGAAGGUCCCGAAUTT-3'(SEQ ID NO.1)
反义链:5'-AUUCGGGACCUUCUCCACCTT-3'(SEQ ID NO.2)
S2 siRNA:正义链:5'-GGCCUUAAUGUUGUUUCAUTT-3'(SEQ ID NO.3)
反义链:5'-AUGAAACAACAUUAAGGCCTT-3'(SEQ ID NO.4)
S3 siRNA:正义链:5'-CCACCUUCCUAAUGCAUAUTT-3'(SEQ ID NO.5)
反义链:5'-AUAUGCAUUAGGAAGGUGGUGGTT-3'(SEQ ID NO.6)
NC siRNA:正义链:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'(SEQ ID NO.7)
反义链:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.8)
根据CAX72463的基因序列，设计实时定量PCR引物，然后送公司(Invitrogen) 合成。
正义链：5'-AACAGCTGATGGTAGTTGGTG-3'(SEQ ID NO.9)
反义链：5'-TACTTGCTCAAACAACGTCGC-3(SEQ ID NO.10)
2、感染小鼠
采用腹部贴片法感染6-8周龄的雄性BALB/c小鼠，每只感染200条尾蚴，以肝门静脉灌注法收集虫体，所收集虫体均用PBS洗涤3次，液氮罐冻存备用。
3、注射siRNA
于感染后22d尾静脉注射1OD S1、S2、S3、NC或等体积的PBS。在48h后剖杀小鼠，肝门静脉灌注法收集虫体，实验分为：空白组(PBS)，无关对照组(NC组)， S1、S2、S3 siRNA处理组，每组三只小鼠。
4、内RNA干扰效果的实时定量PCR验证
Trizol法提取日本血吸虫虫体总RNA，反转录为cDNA，以此为模板进行实时定量PCR分析。
实验结果：如图1所示，三种不同的siRNA分子均显著地降低了CAX72463基因的转录水平，其中S1 siRNA组小分子降低的转录水平最低，选取S1 siRNA组小分子作为体内RNA干扰用小分子。
二、抑制血吸虫实验
1、siRNA注射
试验共设对照组、无关对照组(NC组)和S1 siRNA处理组，每组共三只小鼠。于感染后的4天、8天、12天、16天、20天、24天、28天、32天、36天和40天分别尾静脉快速注射200μlPBS，200μl NC siRNA(8μg)DEPC水和200μl CAX72463基因S1 siRNA(8μg)DEPC水，共10次。
2、肝脏虫卵和毛蚴计数
收集肝脏并称重，加入去氯水，用匀浆机混匀后，定容至20mL，取1mL肝脏匀浆液，加入等体积10％NaOH(W/V)，56℃水浴锅中消化2h，消化完全后混匀取三次50 μL样品，镜检计数虫卵。取4mL肝匀浆液于细颈平底烧瓶中，加入去氯水，并用一薄层棉花覆盖在液面下5cm处，28℃孵化4h后收集棉花上层清液，转移至15mL离心管中，加入50mL碘酊染液固定毛蚴，4000×g离心5min，吸去上清，定容至2mL，混匀后取三次100μL样品，镜检计数毛蚴。
Balb/c小鼠于感染日本血吸虫4天、8天、12天、16天、20天、24天、28天、32 天、36天和40天尾静脉注射siRNA，42天剖杀小鼠，收集虫体，数虫数，收集小鼠肝脏，称重，虫卵计数，25-30℃孵化2h，计数毛蚴数。计算RNA干扰后的减孵化率，结果表明干扰组宿主的虫体减少率分别为29.3％和41.5％，每克肝荷卵的降低分别达 19.8％和44.3％，雌虫对肝脏卵的贡献分别下降了35.5％和51.6％，虫卵的肝卵胚孵化分别下降达60％和45.8％，说明RNA干扰对日本血吸虫的孵化率有显著的影响(见下表 1)。
其中，减卵率＝(1-处理组每克肝脏荷卵数目/对照组每克肝脏荷卵数目)×100％
孵化率＝毛蚴总数/卵胚总数×100％
减孵化率＝(1-处理组平均孵化率/对照组平均孵化率)×100％
表1 siRNA干扰效果评估
**为P<0.01.*为P<0.05
3、体内RNA干扰效果的实时定量PCR验证
以Trizol试剂盒提取各处理组日本血吸虫虫体的总RNA，反转录为cDNA，以此为模板进行实时定量PCR分析。
如图2所示，对照组和处理组小鼠虫体RT-PCR分析表明处理组CAX72463基因的转录水平显著降低，而注射无关siRNA分子的对照组未见影响。
4、扫描电镜
将干扰试验中收集的雌、雄虫体用PBS洗涤后，4℃置于4％戊二醛中固定24h。固定好的标本经0.1mol/L PBS漂洗3次(15min/次)，1％锇酸固定染色2h，0.1mol/L PBS 漂洗3次(15min/次)，30％、50％、70％、80％、90％系列浓度乙醇脱水分别20min，100％乙醇脱水2次(20min/次)，真空干燥，用离子溅射仪喷金后，用JEOL JSM-6380LV电镜对虫体体壁作扫描电镜观察并拍照。
在小鼠受到干扰后，收集虫体并通过扫描电子显微镜观察干扰对虫体形态的影响，结果发现，对照组与干扰组(图3)相比，虫体形态结构发生了明显的变化。雄虫头部乳头状突起减少，表面横向纹路发生改变，虫体中间部分刺突减少，尾部刺突和泡状突起均减少，表面纹路由条纹状变成网状。雌虫头部刺突大量减少，中间部分条状纹路变平滑，尾部泡状突起大量减少甚至完全消失。
实施例2：siRNA抑制UL-30基因
一、体内筛选小RNA
1、siRNA分子和UL-30基因实时定量PCR引物的准备
在NCBI网(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找出血吸虫UL-30基因序列(FN321881)，设计并合成三对siRNA。同时合成一对无关对照siRNA(NC siRNA)。
S1 siRNA:正义链:5'-GCUAGUUACGGGCGUGAAUTT-3'(SEQ ID NO.11)
反义链:5'-AUUCACGCCCGUAACUAGCTT-3'(SEQ ID NO.12)
S2 siRNA:正义链:5'-GCGCAUUCGUGGUAUAAAUTT-3'(SEQ ID NO.13)
反义链:5'-AUUUAUACCACGAAUGCGCTT-3'(SEQ ID NO.14)
S3 siRNA:正义链:5'-GGAGGAUCUUGUGCAUGAATT-3'(SEQ ID NO.15)
反义链:5'-UUCAUGCACAAGAUCCUCCTT-3'(SEQ ID NO.16)
NC siRNA:正义链:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'(SEQ ID NO.17)
反义链:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.18)
根据UL-30的基因序列，设计实时定量PCR引物，然后送公司(Invitrogen)合成。
正义链：5'-GCTTGTGACTTCGTAGCGTG-3'(SEQ ID NO.19)
反义链：5'-GACGAAGACCTTCCGGCTTT-3'(SEQ ID NO.20)
2、感染小鼠
采用腹部贴片法感染4-6周龄的雄性BALB/c小鼠，每只感染200条尾蚴，以肝门静脉灌注法收集虫体，所收集虫体均用PBS洗涤3次，液氮罐冻存备用。
3、注射siRNA
于感染后22d尾静脉注射1OD S1、S2、S3、NC或等体积的PBS。在48h后剖杀小鼠，肝门静脉灌注法收集虫体，实验分为：空白组(PBS)，无关对照组(NC组)，S1、 S2、S3 siRNA处理组，每组三只小鼠。
4、体内RNA干扰效果的实时定量PCR验证
Trizol法提取日本血吸虫虫体总RNA，反转录为cDNA，以此为模板进行实时定量PCR 分析。
实验结果：如图4所示，三种不同的siRNA分子均显著地降低了UL-30基因的转录水平，其中S1 siRNA组小分子降低的转录水平最低，选取S1 siRNA组小分子作为体内 RNA干扰用小分子。
二、抑制血吸虫实验
按照类似于实施例1的实验方案进行换制血吸虫实验。
结果表明干扰组宿主的虫体减少率分别为37％和47.8％，每克肝荷卵的降低分别达 23.9％和48.73％，雌虫对肝脏卵的贡献分别下降了11.4％和33.6％，虫卵的肝卵胚孵化分别下降达49.7％和31.7％，说明RNA干扰对日本血吸虫的孵化率有显著的影响(见下表1)。
表1 siRNA干扰效果评估
**为P<0.01.*为P<0.05
如图5所示，对照组和处理组小鼠虫体RT-PCR分析表明处理组UL-30基因的转录水平显著降低，而注射无关siRNA分子的对照组未见影响。
在小鼠受到干扰后，收集虫体并通过扫描电子显微镜观察干扰对虫体形态的影响，结果发现，对照组与干扰组(图6)相比，虫体形态结构发生了明显的变化。雄虫头部乳头状突起减少，表面横向纹路发生改变，虫体中间部分刺突减少，尾部刺突和泡状突起均减少，表面纹路由条纹状变成网状。雌虫头部刺突大量减少，中间部分条状纹路变平滑，尾部泡状突起大量减少甚至完全消失。
实施例3：siRNA抑制TCTP基因
一、体内筛选小RNA
1、siRNA分子和TCTP基因实时定量PCR引物的准备
在NCBI网(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找出血吸虫TCTP基因序列(U85483.1)，设计并合成三对siRNA。同时合成一对无关对照siRNA(NC siRNA)。
S1 siRNA:正义链:5'-GCAAAUUGAUCGCUGCUAATT-3'(SEQ ID NO.21)
反义链:5'-UUAGCAGCGAUCAAUUUGCTT-3'(SEQ ID NO.22)
S2 siRNA:正义链:5'-GGCUACUUGAAAGCCAUAATT-3'(SEQ ID NO.23)
反义链:5'-UUAUGGCUUUCAAGUAGCCTT-3'(SEQ ID NO.24)
S3 siRNA:正义链:5'-GGUAGCACUGAUGAACUUUTT-3'(SEQ ID NO.25)
反义链:5'-AAAGUUCAUCAGUGCUACCTT-3'(SEQ ID NO.26)
NC siRNA:正义链:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'(SEQ ID NO.27)
反义链:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.28)
根据TCTP的基因序列，设计实时定量PCR引物，然后送公司(Invitrogen)合成。
正义链：5'-GTCGTGTATGAAGTCGATGCC-3'(SEQ ID NO.29)
反义链：5'-GTCGGCTCGCATGAACTAGA-3'(SEQ ID NO.30)
2、感染小鼠
采用腹部贴片法感染4-6周龄的雄性BALB/c小鼠，每只感染200条尾蚴，以肝门静脉灌注法收集虫体，所收集虫体均用PBS洗涤3次，液氮罐冻存备用。
3、注射siRNA
于感染后22d尾静脉注射1OD S1、S2、S3、NC或等体积的PBS。在48h后剖杀小鼠，肝门静脉灌注法收集虫体，实验分为：空白组(PBS)，无关对照组(NC组)，S1、 S2、S3 siRNA处理组，每组三只小鼠。
4、体内RNA干扰效果的实时定量PCR验证
Trizol法提取日本血吸虫虫体总RNA，反转录为cDNA，以此为模板进行实时定量PCR 分析。
如图7所示，三种不同的siRNA分子均显著地降低了TCTP基因的转录水平，其中 S1siRNA组小分子降低的转录水平最低，选取S1 siRNA组小分子作为体内RNA干扰用小分子。
二、抑制血吸虫实验
按照类似于实施例1的实验方案进行换制血吸虫实验。
实验结果，如图8所示，对照组和处理组小鼠虫体RT-PCR分析表明处理组TCTP 基因的转录水平显著降低，而注射无关siRNA分子的对照组未见影响。
干扰组宿主的虫体减少率分别为46.7％和55.9％，每克肝荷卵的降低分别达65.3％和69.9％，雌虫对肝脏卵的贡献分别下降了20.2％和40.1％，虫卵的肝卵胚孵化分别下降达 77.5％和69.5％，说明RNA干扰对日本血吸虫的孵化率有显著的影响(见下表1)。
表1 siRNA干扰效果评估
**为P<0.01.*为P<0.05
在小鼠受到干扰后，收集虫体并通过扫描电子显微镜观察干扰对虫体形态的影响，结果发现，对照组与干扰组(图9)相比，虫体形态结构发生了明显的变化。雄虫头部乳头状突起减少，表面横向纹路发生改变，虫体中间部分刺突减少，尾部刺突和泡状突起均减少，表面纹路由条纹状变成网状。雌虫头部刺突大量减少，中间部分条状纹路变平滑，尾部泡状突起大量减少甚至完全消失。
此外，还进行了TEM观察结果，即将固定好的TCTP的雌虫虫体置于透射电镜下观察其生殖结构(图10)，TCTP与NC组相比有显著变化。TCTP卵黄细胞不规则没有明显的细胞膜，卵黄细胞周围的粗面内质网(ger)不明显，脂滴(I)小且数量少，卵黄球 (vg)散步未聚集成卵黄滴(vd)，图中未发现高尔基体(Go)。NC组卵黄细胞核仁呈圆形有明显细胞膜，粗面内质网丰富(ger)，脂滴大且数量多，卵黄球聚集成卵黄滴，高尔基体肉眼可见且有一定数量的线粒体(mi)。
实施例4：siRNA抑制CAX70849基因
一、体内筛选小RNA
1、siRNA分子和CAX70849基因实时定量PCR引物的准备
在NCBI网(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找出血吸虫CAX70849基因序列(FN315117.1)，设计并合成三对siRNA。同时合成一对无关对照siRNA(NC siRNA)。
S1 siRNA:正义链:5'-GACGAUAAUGCUACCUGUUTT-3'(SEQ ID NO.31)
反义链:5'-AACAGGUAGCAUUAUCGUCTT-3'(SEQ ID NO.32)
S2 siRNA:正义链:5'-UCUUCGAACUUACGCUGAATT-3'(SEQ ID NO.33)
反义链:5'-UUCAGCGUAAGUUCGAAGATT-3'(SEQ ID NO.34)
S3 siRNA:正义链:5'-GCUGAAACAAUGCAAGUTT-3'(SEQ ID NO.35)
反义链:5'-ACUUGCAUAUUGUUUCAGCTT-3'(SEQ ID NO.36)
NC siRNA:正义链:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'(SEQ ID NO.37)
反义链:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.38)
根据CAX70849的基因序列，设计实时定量PCR引物，然后送公司(Invitrogen) 合成。
正义链：5'-AATGCTACCTGTTCAATGTGC-3'(SEQ ID NO.39)
反义链：5'-AGTCACAGGTTATTTCAGCGT-3'(SEQ ID NO.40)
2、感染小鼠
采用腹部贴片法感染4-6周龄的雄性BALB/c小鼠，每只感染200条尾蚴，以肝门静脉灌注法收集虫体，所收集虫体均用PBS洗涤3次，液氮罐冻存备用。
3、注射siRNA
于感染后22d尾静脉注射1OD S1、S2、S3、NC或等体积的PBS。在48h后剖杀小鼠，肝门静脉灌注法收集虫体，实验分为：空白组(PBS)，无关对照组(NC组)， S1、S2、S3 siRNA处理组，每组三只小鼠。
4、体内RNA干扰效果的实时定量PCR验证
Trizol法提取日本血吸虫虫体总RNA，反转录为cDNA，以此为模板进行实时定量PCR分析。
如图11所示，三种不同的siRNA分子均显著地降低了CAX70849基因的转录水平，其中S1 siRNA组小分子降低的转录水平最低，选取S1 siRNA组小分子作为体内RNA 干扰用小分子。
二、抑制血吸虫实验
按照类似于实施例1的实验方案进行换制血吸虫实验。
实验结果，如图12所示，对照组和处理组小鼠虫体RT-PCR分析表明处理组CAX70849基因的转录水平显著降低，而注射无关siRNA分子的对照组未见影响。
结果表明干扰组宿主的虫体减少率分别为28.3％和40.6％，每克肝荷卵的降低分别达 22.8％和42.8％，雌虫对肝脏卵的贡献分别下降了24.5％和43.3％，虫卵的肝卵胚孵化分别下降达56％和40.4％，说明RNA干扰对日本血吸虫的孵化率有显著的影响(见下表1)。
表1 siRNA干扰效果评估
**为P<0.01.*为P<0.05
在小鼠受到干扰后，收集虫体并通过扫描电子显微镜观察干扰对虫体形态的影响，结果发现，对照组与干扰组(图13)相比，虫体形态结构发生了明显的变化。雄虫头部乳头状突起减少，表面横向纹路发生改变，虫体中间部分刺突减少，尾部刺突和泡状突起均减少，表面纹路由条纹状变成网状。雌虫头部刺突大量减少，中间部分条状纹路变平滑，尾部泡状突起大量减少甚至完全消失。
实施例5：siRNA抑制Annexin A 13基因
一、体内筛选小RNA
1、siRNA分子和Annexin A 13基因实时定量PCR引物的准备
在NCBI网(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找出血吸虫Annexin A 13基因序列(FN315080.1)，设计并合成三对siRNA。同时合成一对无关对照siRNA(NC siRNA)。
S1 siRNA:正义链:5'-GGUCCAAAUGGUGAAAUAUTT-3'(SEQ ID NO.41)
反义链:5'-AUAUUUCACCAUUUGGACCTT-3'(SEQ ID NO.42)
S2 siRNA:正义链:5'-GGAAUAAGCGAUCCUAGAATT-3'(SEQ ID NO.43)
反义链:5'-UUCUAGGAUCGCUUAUUCCTT-3'(SEQ ID NO.44)
S3 siRNA:正义链:5'-GCACAUUGAUGCGCAUUAUTT-3'(SEQ ID NO.45)
反义链:5'-AUAAUGCGCAUCAAUGUGCTT-3'(SEQ ID NO.46)
NC siRNA:正义链:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'(SEQ ID NO.47)
反义链:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.48)
根据Annexin A 13的基因序列，设计实时定量PCR引物，然后送公司(Invitrogen)合成。
正义链：5'-CTGGTGAAGCACGTCTAGGA-3'(SEQ ID NO.49)
反义链：5'-CCAGATGTTTCCGATGCAAGTG-3'(SEQ ID NO.50)
2、感染小鼠
采用腹部贴片法感染4-6周龄的雄性BALB/c小鼠，每只感染200条尾蚴，以肝门静脉灌注法收集虫体，所收集虫体均用PBS洗涤3次，液氮罐冻存备用。
3、注射siRNA
于感染后22d尾静脉注射1OD S1、S2、S3、NC或等体积的PBS。在48h后剖杀小鼠，肝门静脉灌注法收集虫体，实验分为：空白组(PBS)，无关对照组(NC组)，S1、 S2、S3 siRNA处理组，每组三只小鼠。
4、体内RNA干扰效果的实时定量PCR验证
Trizol法提取日本血吸虫虫体总RNA，反转录为cDNA，以此为模板进行实时定量PCR 分析。
如图14所示，三种不同的siRNA分子均显著地降低了Annexin A 13基因的转录水平，其中S1 siRNA组小分子降低的转录水平最低，选取S1 siRNA组小分子作为体内RNA干扰用小分子。
二、抑制血吸虫实验
按照类似于实施例1的实验方案进行换制血吸虫实验。实验结果如图14所示，对照组和处理组小鼠虫体RT-PCR分析表明处理组Annexin A 13基因的转录水平显著降低，而注射无关siRNA分子的对照组未见影响。
RNA干扰后对肝脏虫卵孵化率的影响结果表明干扰组宿主的虫体减少率分别为14.5％和 29.5％，每克肝荷卵的降低分别达61.5％和71.5％，雌虫对肝脏卵的贡献分别下降了77.1％和82.8％，虫卵的肝卵胚孵化分别下降达44.2％和24.2％，说明RNA干扰对日本血吸虫的孵化率有显著的影响(见下表1)。
表1 siRNA干扰效果评估
**为P<0.01.*为P<0.05
在小鼠受到干扰后，收集虫体并通过扫描电子显微镜观察干扰对虫体形态的影响，结果发现，对照组与干扰组(图15)相比，虫体形态结构发生了明显的变化。雄虫头部乳头状突起减少，表面横向纹路发生改变，虫体中间部分刺突减少，尾部刺突和泡状突起均减少，表面纹路由条纹状变成网状。雌虫头部刺突大量减少，中间部分条状纹路变平滑，尾部泡状突起大量减少甚至完全消失。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120>用于日本血吸虫减虫减卵的siRNA及其应用
<160> 50
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<400> 1
GGUGGAGAAGGUCCCGAAUTT 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<400> 2
AUUCGGGACCUUCUCCACCTT 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<400>3
GGCCUUAAUGUUGUUUCAUTT 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<400> 4
AUGAAACAACAUUAAGGCCTT 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<400> 5
CCACCUUCCUAAUGCAUAUTT 21
<210> 6
<211> 24
<212> RNA
<400>6
AUAUGCAUUAGGAAGGUGGUGGTT 24
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<400> 7
UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 21
<210>8
<211> 21
<212> RNA
<400> 8
ACGUGACACGUUCGGAGAATT 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<400> 9
AACAGCTGATGGTAGTTGGTG 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<400> 10
TACTTGCTCAAACAACGTCGC 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<400> 11
GCUAGUUACGGGCGUGAAUTT 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<400> 12
AUUCACGCCCGUAACUAGCTT 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<400> 13
GCGCAUUCGUGGUAUAAAUTT 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<400> 14
AUUUAUACCACGAAUGCGCTT 21
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<400> 21
GGAGGAUCUUGUGCAUGAATT 21
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<400> 16
UUCAUGCACAAGAUCCUCCTT 21
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<400> 17
UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 21
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<400> 18
ACGUGACACGUUCGGAGAATT 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<400> 19
GCTTGTGACTTCGTAGCGTG 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<400> 20
GACGAAGACCTTCCGGCTTT 20
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<400> 21
GCAAAUUGAUCGCUGCUAATT 21
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<400> 22
UUAGCAGCGAUCAAUUUGCTT 21
<210> 23
<211> 21
<212> RNA
<400> 23
GGCUACUUGAAAGCCAUAATT 21
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<400> 24
UUAUGGCUUUCAAGUAGCCTT 21
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<400> 25
GGUAGCACUGAUGAACUUUTT 21
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213>人工序列
<400> 26
AAAGUUCAUCAGUGCUACCTT 21
<210> 27
<211> 21
<212> RNA
<213>人工序列
<400> 27
UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 21
<210> 28
<211> 21
<212> RNA
<213>人工序列
<400> 28
ACGUGACACGUUCGGAGAATT 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 29
GTCGTGTATGAAGTCGATGCC
<210> 30
<211> 20
<212> RNA
<400>30
GTCGGCTCGCATGAACTAGA 20
<210> 31
<211> 21
<212> RNA
<400>31
GACGAUAAUGCUACCUGUUTT 21
<210> 32
<211> 21
<212> RNA
<400>32
AACAGGUAGCAUUAUCGUCTT 21
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<400>33
UCUUCGAACUUACGCUGAATT 21
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<400>34
UUCAGCGUAAGUUCGAAGATT 21
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<400>35
GCUGAAACAAUGCAAGUTT 21
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<400>36
ACUUGCAUAUUGUUUCAGCTT 21
<210> 37
<211> 21
<212> RNA
<400>37
UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 21
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<400>38
ACGUGACACGUUCGGAGAATT 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<400>39
AATGCTACCTGTTCAATGTGC 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<400> 40
AGTCACAGGTTATTTCAGCGT 21
<210> 41
<211> 21
<212> RNA
<400> 41
GGUCCAAAUGGUGAAAUAUTT 21
<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<400> 42
AUAUUUCACCAUUUGGACCTT 21
<210> 43
<211> 21
<212> RNA
<400> 43
GGAAUAAGCGAUCCUAGAATT 21
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<400> 44
UUCUAGGAUCGCUUAUUCCTT 21
<210> 45
<211> 21
<212> RNA
<400> 45
GCACAUUGAUGCGCAUUAUTT 21
<210> 46
<211> 21
<212> RNA
<400> 46
AUAAUGCGCAUCAAUGUGCTT 21
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<400> 47
UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 21
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<400> 48
ACGUGACACGUUCGGAGAATT 21
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<400> 49
CTGGTGAAGCACGTCTAGGA 20
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<400> 50
CCAGATGTTTCCGATGCAAGTG 22
Claims (8)
1.一种干扰日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、或Annexin A 13基因的siRNA。
2.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，其中，干扰日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、Annexin A 13基因的siRNA分别为：正义链序列为 SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；正义链序列为 SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列；正义链序列为 SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；正义链序列为 SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ IDNO.42所示的核苷酸序列。
3.一种干扰日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、AnnexinA 13基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述干扰日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、Annexin A 13基因的siRNA分别为：正义链序列为 SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；正义链序列为 SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列；正义链序列为 SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；正义链序列为 SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ IDNO.42所示的核苷酸序列。
5.一种治疗血吸虫病的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为抑制CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、Annexin A 13基因表达的 siRNA。
6. 根据权利要求5所述治疗血吸虫病的药物，其特征在于，其中抑制日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、Annexin A 13基因的siRNA分别为：正义链序列为 SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；正义链序列为 SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；正义链序列为 SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ IDNO.22所示的核苷酸序列；正义链序列为 SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；正义链序列为 SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列。
7.干扰日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、Annexin A 13基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的疫苗中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，干扰日本血吸虫CAX72463基因、UL-30基因、TCTP基因、CAX70849基因、Annexin A 13基因的siRNA分别为：正义链序列为 SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；正义链序列为 SEQ IDNO.11所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；正义链序列为SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列；正义链序列为 SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；正义链序列为 SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列或反义链序列为SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列。
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-
2020
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| HAORAN ZHONG等: "Schistosoma japonicum translationally controlled tumour protein, which is associated with the development of female worms, as a target for control of schistosomiasis" * |
| LIU,F等: "Schistosoma japonicum isolate Anhui full length mRNA clone SJFCA3911.030|FSA001-P00022-M02, complete sequence" * |
| 任雨琪: "日本血吸虫病免疫保护候选抗原的筛选" * |
| 秦芳林: "日本血吸虫雌虫生殖发育相关蛋白生物学功能初步分析" * |
| 秦芳林等: "日本血吸虫发育正常雌虫与发育阻遏雌虫差异蛋白的生物学功能分析" * |
Also Published As
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