CN104379745A - 包含核苷酸类似物的治疗性寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本文公开了双链RNA核酸分子，其包括至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物且已被修饰来展现以下一者：相较于未修饰或类似修饰的dsRNA时的中靶活性增加、靶标特异性增加、核酸酶稳定性增强、脱靶活性降低和/或免疫原性降低；包含所述分子的药物组合物及其在疗法中的使用方法。

Description

包含核苷酸类似物的治疗性寡核苷酸
相关申请
本申请要求2012年5月31日提交的题为“包含核苷酸类似物的治疗性寡核苷酸(Therapeutic Oligonucleotides Comprising NucleotideAnalogues)”且以引用的方式整体并出于所有目的并入本文的美国临时申请号61/653,432的权益。
序列表
本申请以引用的方式并有存在于名为“244_PCT1_ST25.txt”的文件中的核苷酸和/或氨基酸序列，所述文件在大小方面是27千字节且于2013年5月28日以与MS-Windows具有操作系统相容性的IBM-PCT机器格式创建。
发明领域
本文公开包含至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物的核酸分子、包含所述核酸分子的药物组合物及其调节基因表达的使用方法。核酸分子包括适用于治疗罹患其中调节基因表达是有益的疾病或病状和/或与所述疾病或病状相关的症状或处于感染疾病或病状的风险下的受试者的双链RNA(dsRNA)，包括siRNA和saRNA。
发明背景
属于本公开的共同受让人的国际专利公布号WO 2008/104978、WO 2009/044392、WO 2011/066475、WO 2011/084193和WO 2011/085056据此以引用的方式整体并入本文。
仍然需要展现核酸酶稳定性增加、靶标特异性增加、免疫原性降低或脱靶效应降低中的至少一者，同时保留治疗活性的活性以及有效性dsRNA治疗剂。
发明概述
本文公开的dsRNA核酸分子具有当相较于未修饰dsRNA分子时，例如增加稳定性、降低免疫原性、降低脱靶效应、改进细胞摄取或增强向RISC复合物中的加载的结构和修饰。化学修饰适用于产生用于调节靶标基因表达的核酸分子。属于一些共同发明者的共同待决的专利申请公开根据通式I的新型吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物和包含所述类似物的DNA寡核苷酸
其中
R1和R4各自独立地选自H、卤素、-CN、-SCN、-NO2、-O-烃基、-S-烃基、-CO-H、-CO-烃基、-NR8R9、杂芳基、或任选被一个或多个各自独立地是卤素、-CN、-SCN或-NO2的基团取代的烃基，其中R8和R9各自独立地是H、烃基或胺保护基；或R8和R9连同它们所连接的氮原子一起形成任选含有1-2个选自氧、氮或硫的其它杂原子的饱和或不饱和杂环；
R2是H或不存在；
R3是O或–NR10R10’，其中R10和R10’各自独立地是H、烃基、-CO-烃基或胺保护基；且
R5是H、卤素、-O-或-OR11；
R6是-O-或-OR11；
R7是-OR11或磷酸酯部分；
R11各自独立地是H、(C1-C8)烷基、(C1-C8)亚烷基-OR12、(C1-C8)亚烷基-SR12、(C1-C8)亚烷基-NR12R13、羟基保护基、或具有式-P(OR14)NR15R16的亚磷酰胺部分，其中R14是H或氰基-(C1-C8)烷基，优选是氰基乙基，且R15和R16各自独立地是H或(C1-C8)烷基，优选是异丙基；
R12和R13各自独立地是H或(C1-C8)烷基；且
点线代表4位碳原子与3位氮原子或残基R3之间的潜在双键，前提是当R2是H时，在4位碳原子与R3之间存在双键，且当R2不存在时，在4位碳原子与3位氮原子之间存在双键，但排除其中R5和R6各自独立地是-OH或-O-的类似物和其中R5是H且R1是烃基的类似物。
在一个方面，本文提供适用于调节基因表达的dsRNA分子。在各种实施方案中，提供包含至少一个吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物的双链dsRNA分子。在一些实施方案中，双链RNA分子包括saRNA。在一些实施方案中，双链RNA分子包括siRNA。至少一个PT核苷酸类似物存在于正义链中、反义链中或正义链与反义链两者中。
在各种实施方案中，本文提供一种包含通式II PT核苷酸类似物的双链RNA分子：
其中
R1和R4各自独立地选自H、卤素、-CN、-SCN、-NO2、-O-烃基、-S-烃基、-CO-H、-CO-烃基、-NR8R9、杂芳基、或任选被一个或多个各自独立地是卤素、-CN、-SCN或-NO2的基团取代的烃基，其中R8和R9各自独立地是H或烃基，或R8和R9连同它们所连接的氮原子一起形成任选含有1-2个选自氧、氮或硫的其它杂原子的饱和或不饱和杂环；
R2是H或不存在；
R3是O或-N R10R10’，其中R10和R10’各自独立地是H、烃基或-CO-烃基；
R5是H、卤素、-O-或-OR11；
R6是-O-或-OR11，
R7是OR11、单磷酸酯部分或磷酸酯连接部分；且
R11各自独立地是H、(C1-C8)烷基、(C1-C8)亚烷基-OR12、(C1-C8)亚烷基-SR12或(C1-C8)亚烷基-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是H或(C1-C8)烷基；且
点线代表4位碳原子与3位氮原子或基团R3之间的潜在双键，前提是当R2是H时，在4位碳原子与R3之间存在双键，且当R2不存在时，在4位碳原子与3位氮原子之间存在双键。
在一些实施方案中，PT核苷酸类似物包括如下在表1中的式IIa的腺嘌呤PT核苷酸类似物或式IIb鸟嘌呤PT核苷酸类似物：
表1：式IIa和IIb的腺嘌呤和鸟嘌呤PT核苷酸类似物
在一些优选实施方案中，吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物是式IIa的腺嘌呤PT核苷酸类似物(即R2不存在且R3是NHR10)，其中R1是H，R10是H；R4是H；R5是H、卤素或-OR11，其中R11是H、(C1-C8)烷基、(C1-C8)亚烷基-OR12、(C1-C8)亚烷基-SR12或(C1-C8)亚烷基-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是H或(C1-C8)烷基；R6是-O-或–OH；且R7是OH或磷酸酯连接部分。在一些实施方案中，R11是H、CH3或(CH2)2-OCH3。在一些实施方案中，R11是H(即R5是羟基；2’OH)。在一些实施方案中，R11是CH3(即R5是甲氧基，2’OMe)。在一些实施方案中，R11是(CH2)2-OCH3(即R5是甲氧基乙氧基；2’MOE)。
在一些优选实施方案中，吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物是式IIa脱氧腺苷PT核苷酸类似物，其中R1是H，R10是H；R4是H；R5是H或卤素；R6是-O-或–OH；且R7是OH或磷酸酯部分。在一些实施方案中，R5是H。在一些实施方案中，R5是卤素，优选是氟基(F)。
在一些优选实施方案中，吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物是式IIb的鸟苷PT核苷酸类似物，其中R4、R8和R9各自是H，R5是-OR11，其中R11是H、(C1-C8)烷基、(C1-C8)亚烷基-OR12、(C1-C8)亚烷基-SR12或(C1-C8)亚烷基-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是H或(C1-C8)烷基；R6是-O-或–OH；且R7是OH或磷酸酯部分。在一些实施方案中，R11是H、CH3或(CH2)2-OCH3。在一些实施方案中，R11是H(即R5是羟基；2’OH)。在一些实施方案中，R11是CH3(即R5是甲氧基，2’-O甲基)。在一些实施方案中，R11是(CH2)2-OCH3(即R5是甲氧基乙氧基；2’MOE)。
在一些优选实施方案中，吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物是式IIb脱氧鸟苷PT核苷酸类似物(即R2是H且R3是O)，其中R4、R8和R9各自是H，R5是H、卤素或-OR11；R6是-O-或–OH；且R7是OH或磷酸酯连接部分。在一些实施方案中，R5是H。在一些实施方案中，R5是卤素，优选是氟基(F)。
在一些实施方案中，提供双链RNA分子，其中：
(a)所述双链RNA分子包括正义链和反义链，其中各链的长度独立地是15至49个核苷酸；
(b)所述正义链和/或所述反义链包括至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物；
(c)所述反义链的15至49个核糖核苷酸的序列互补于靶标基因的mRNA的序列；且
(d)所述正义链的15至49个核苷酸的序列互补于所述反义链且包括靶标基因的mRNA的15至49个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，双链核糖核酸分子具有以下在结构A1中阐述的结构：
(A1)  5’ (N)x-Z 3’(反义链)
3’ Z’-(N’)y-z”5’(正义链)
其中N和N’各自是未修饰核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中N或N’的至少一者包括吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物；
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续N或N’是通过共价键接合于下一N或N’的寡核苷酸；
其中Z和Z’各自独立地存在或不存在，但如果存在，那么独立地包括在它所存在于其中的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸、吡唑并三嗪核苷酸类似物或非核苷酸部分或其组合、或维生素或药物部分；
其中z”可存在或不存在，但如果存在，那么是在(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分、维生素或药物部分；
其中x和y各自独立地是在15与49之间的整数；且
其中(N’)y的序列互补于(N)x的序列且其中(N)x的至少一部分序列互补于靶标RNA中的连续序列；前提是并非各N和N’都是脱氧核糖核苷酸。
在一些实施方案中，接合各连续N或N’的共价键是磷酸二酯键。
在一些实施方案中，x＝y且x和y各自是19、20、21、22或23。在优选实施方案中，x＝y＝19。
在一些实施方案中，Z存在且包括2个吡唑并三嗪核苷酸类似物。在一些实施方案中，Z’存在且包括2个吡唑并三嗪核苷酸类似物。在一些实施方案中，Z和Z’存在且各自包括2个吡唑并三嗪核苷酸类似物。
在一些实施方案中，x＝y＝19且吡唑并三嗪核苷酸类似物存在于反义链的1位。在一些实施方案中，x＝y＝19且吡唑并三嗪核苷酸类似物存在于反义链的3、4、5、6、7或8位。在一些实施方案中，x＝y＝19且吡唑并三嗪核苷酸类似物存在于反义链的3位。在一些实施方案中，x＝y＝19且吡唑并三嗪核苷酸类似物存在于反义链的4位。在一些实施方案中，x＝y＝19且吡唑并三嗪核苷酸类似物存在于反义链的5位。在一些实施方案中，x＝y＝19且吡唑并三嗪核苷酸类似物存在于反义链的6位。在一些实施方案中，x＝y＝19且吡唑并三嗪核苷酸类似物存在于反义链的7位。在一些实施方案中，x＝y＝19且吡唑并三嗪核苷酸类似物存在于反义链的8位。在一些实施方案中，正义链在3’末端包含PT核苷酸类似物。在一些实施方案中，正义链在3’末端位置或3’倒数第二位置包括PT核苷酸类似物。在一些实施方案中，x＝y＝19且吡唑并三嗪核苷酸类似物存在于正义链的17、18或19位(5’>3’)。
在结构A1的一些实施方案中，正义链包含至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链包含至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物。在一些实施方案中，正义链和反义链各自包含至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物。在各种实施方案中，反义链的5’末端包含选自化合物3、7、9、13、15、19、21、25、27或31的通式IIa的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，反义链的5’末端包含选自化合物3、7、9、13、15、19、21、25、27或31的通式IIa的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，正义链的5’末端包含选自化合物33、37、39、43、45、49、51、55、57或61的通式IIb的PT核苷酸类似物。
在各种实施方案中，正义链的3’末端包含选自化合物5、11、17、23或29的通式IIa的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，反义链的3’位包含选自化合物5、11、17、23或29的通式IIa的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，正义链的3’位包含选自化合物35、41、47、53或59的通式IIb的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，反义链的3’位包含选自化合物35、41、47、53或59的通式IIb的PT核苷酸类似物。
在各种实施方案中，正义链在内部位置中包含选自化合物7、13、19、25或31的通式IIa的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，反义链在内部位置中包含选自化合物7、13、19、25或31的通式IIa的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，正义链在内部位置中包含选自化合物37、43、49、55或61的通式IIb的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，反义链在内部位置中包含选自化合物37、43、49、55或61的通式IIb的PT核苷酸类似物。
在一些实施方案中，正义链中的所有腺苷都被腺苷和/或脱氧腺苷吡唑并三嗪核苷酸类似物取代。在一些实施方案中，反义链中的所有腺苷都被腺苷和/或脱氧腺苷吡唑并三嗪核苷酸类似物取代。在一些实施方案中，正义链中和反义链中的所有腺苷都被腺苷和/或脱氧腺苷吡唑并三嗪核苷酸类似物取代。
在一些实施方案中，反义链的1位(5’>3’)中的核糖核苷酸被如本文所述的腺苷或脱氧腺苷PT核苷酸类似物取代。
在一些实施方案中，反义链的3、4、5、6、7、8或9位(5’>3’)中的核糖核苷酸被如本文所述的PT核苷酸类似物取代。在一些实施方案中，反义链的3位(5’>3’)中的核糖核苷酸被腺苷或脱氧腺苷PT核苷酸类似物取代。在一些实施方案中，反义链的4位(5’>3’)中的核糖核苷酸被腺苷或脱氧腺苷PT核苷酸类似物取代。在一些实施方案中，反义链的5位(5’>3’)中的核糖核苷酸被腺苷或脱氧腺苷PT核苷酸类似物取代。
在一些实施方案中，正义链的18位(5’>3’)中的核糖核苷酸被PT核苷酸类似物取代。在一些实施方案中，PT核苷酸类似物是腺苷或脱氧腺苷PT核苷酸类似物。在一些实施方案中，PT核苷酸类似物是鸟苷或脱氧鸟苷PT核苷酸类似物。
在一些实施方案中，正义链中的所有鸟苷都被鸟苷和/或脱氧鸟苷吡唑并三嗪核苷酸类似物取代。在一些实施方案中，反义链中的所有鸟苷都被鸟苷和/或脱氧鸟苷吡唑并三嗪核苷酸类似物取代。在一些实施方案中，正义链中和反义链中的所有鸟苷都被鸟苷或脱氧鸟苷吡唑并三嗪核苷酸类似物取代。
在一些实施方案中，(N’)y的序列完全互补于(N)x的序列。在一些实施方案中，(N)x的序列完全互补于靶标RNA中的连续序列。
在各种实施方案中，本文提供一种双链核糖核酸分子，其中引导链(反义链)在5’末端核苷酸处包含与靶标mRNA的错配。因此，在各种实施方案中，提供一种具有以下结构A2的双链核糖核酸分子：
(A2)5’ N1-(N)x-Z 3’(反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y-z” 5’(正义链)
其中N2、N和N’各自是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中N1、N2、N或N’的至少一者包括吡唑并三嗪核苷酸类似物；
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续N或N’是通过共价键接合于邻近N或N’的寡核苷酸；
其中x和y各自独立地是在17与24之间的整数；
其中(N’)y的序列互补于(N)x的序列且其中(N)x的至少一部分序列互补于靶标RNA中的连续序列；
其中N1共价结合于(N)x且与所述靶标RNA错配或是与所述靶标RNA互补的DNA部分；
其中N1是选自由天然或修饰的尿苷、脱氧核糖尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、天然或修饰的腺苷、脱氧腺苷、腺苷吡唑并三嗪类似物和脱氧腺苷吡唑并三嗪核酸类似物组成的组的部分；其中z”可存在或不存在，但如果存在，那么是在N2-(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分、维生素或药物部分；且
其中Z和Z’各自独立地存在或不存在，但如果存在，那么独立地是在它所存在于其中的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸、吡唑并三嗪核苷酸类似物、连续非核苷酸部分或其组合、或维生素或药物部分；前提是并非各N和N’都是脱氧核糖核苷酸。
在优选实施方案中，dsRNA分子中的吡唑并三嗪核苷酸类似物包括式IIa的腺嘌呤PT核苷酸类似物或式IIb的鸟嘌呤PT核苷酸类似物。
在结构A2的优选实施方案中，x＝y＝18。在一些实施方案中，具有结构A2的分子的正义链包含至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链包含至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物。在一些实施方案中，正义链和反义链各自包含至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物。在各种实施方案中，正义链的5’末端包含选自化合物3、7、9、13、15、19、21、25、27或31的通式IIa的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，反义链的5’末端包含选自化合物3、7、9、13、15、19、21、25、27或31的通式IIa的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，正义链的5’末端包含选自化合物33、37、39、43、45、49、51、55、57或61的通式IIb的PT核苷酸类似物。
在各种实施方案中，正义链的3’末端包含选自化合物5、11、17、23或29的通式IIa的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，反义链的3’位包含选自化合物5、11、17、23或29的通式IIa的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，正义链的3’位包含选自化合物35、41、47、53或59的通式IIb的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，反义链的3’位包含选自化合物35、41、47、53或59的通式IIb的PT核苷酸类似物。
在各种实施方案中，正义链在内部位置中包含选自化合物7、13、19、25或31的通式IIa的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，反义链在内部位置中包含选自化合物7、13、19、25或31的通式IIa的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，正义链在内部位置中包含选自化合物37、43、49、55或61的通式IIb的PT核苷酸类似物。在各种实施方案中，反义链在内部位置中包含选自化合物37、43、49、55或61的通式IIb的PT核苷酸类似物。
在一些实施方案中，(N’)y的序列完全互补于(N)x的序列。在各种实施方案中，N2-(N’)y的序列完全互补于N1-(N)x的序列。在一些实施方案中，(N)x包含完全互补于靶标RNA中的约17至约24个连续核苷酸的反义序列。在其它实施方案中，(N)x包含实质上互补于靶标RNA中的约17至约39个连续核苷酸的反义序列。
在一些实施方案中，N1和N2形成沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对。在一些实施方案中，N1和N2形成非沃森-克里克碱基对。在一些实施方案中，碱基对是在核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸之间形成。
在一些实施方案中，x＝y＝18、x＝y＝19或x＝y＝20。在优选实施方案中，x＝y＝18。
在一些实施方案中，N1共价结合于(N)x且与靶标RNA错配。在各种实施方案中，N1共价结合于(N)x且是互补于靶标RNA的DNA部分。
在一些实施方案中，N1共价结合于(N)x且是互补于靶标RNA的DNA部分。
在一些实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷、天然或修饰的尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷、腺苷吡唑并三嗪核苷酸类似物或脱氧腺苷吡唑并三嗪核苷酸类似物；且其中靶标RNA中的配对核苷酸是腺苷。在优选实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷或脱氧尿苷。
在一些实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷、腺苷或脱氧腺苷的吡唑并三嗪核苷酸类似物、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷且其中靶标RNA中的配对核苷酸是胞苷。在优选实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷、腺苷或脱氧腺苷的吡唑并三嗪核苷酸类似物、尿苷或脱氧尿苷。
在一些实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷、腺苷或脱氧腺苷的吡唑并三嗪核苷酸类似物、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷且其中靶标RNA中的配对核苷酸中的核苷酸是鸟苷。
在优选实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷、腺苷或脱氧腺苷的吡唑并三嗪核苷酸类似物、尿苷或脱氧尿苷。
在一些实施方案中，N1选自脱氧腺苷、腺苷或脱氧腺苷的吡唑并三嗪核苷酸类似物、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷且其中靶标RNA中的配对核苷酸中的核苷酸是尿苷。在优选实施方案中，N1选自脱氧腺苷或脱氧尿苷。
在一些实施方案中，N1和N2在尿苷或脱氧尿苷与腺苷或脱氧腺苷之间形成碱基对。在其它实施方案中，N1和N2在脱氧尿苷与腺苷之间形成碱基对。
在包括结构A1和A2的双链核糖核酸分子的一些实施方案中，PT核苷酸类似物包含脱氧核糖。在包括结构A1和A2的双链核糖核酸分子的一些实施方案中，PT核苷酸类似物包含未修饰核糖或修饰的核糖。在一些实施方案中，修饰的核糖核苷酸在糖部分的2’位包含修饰且包括2’烷基、2’烷氧基、2’氨基或2’氟基修饰。在一些实施方案中，2’修饰是选自2’甲氧基(2’OMe)、2’乙氧基(2’OEt)或2’甲氧基乙氧基(2’MOE)修饰的2’烷氧基修饰。
在包括结构A1和A2的双链核糖核酸分子的一些实施方案中，正义链或反义链或两个链包含至少一个腺嘌呤吡唑并三嗪核苷酸类似物。在包括结构A1和A2的双链核糖核酸分子的一些实施方案中，正义链或反义链或两个链包含至少一个脱氧腺苷PT核苷酸类似物。在优选实施方案中，腺苷PT核苷酸类似物和脱氧腺苷PT核苷酸类似物具有式IIa。
在包括结构A1和A2的双链核糖核酸分子的一些实施方案中，正义链或反义链或两个链包含鸟苷吡唑并三嗪核苷酸类似物。在包括结构A1和A2的双链核糖核酸分子的某一实施方案中，正义链或反义链或两个链包含至少一个脱氧鸟苷吡唑并三嗪核苷酸类似物。在优选实施方案中，鸟苷吡唑并三嗪核苷酸类似物和脱氧鸟苷吡唑并三嗪核苷酸类似物具有式IIb。
在包括结构A1和A2的双链核糖核酸分子的一些实施方案中，反义链包含一个或多个脱氧腺苷吡唑并三嗪核酸类似物和/或一个或多个腺苷吡唑并三嗪核酸类似物替代一个或多个腺苷核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N)x包含一个或多个脱氧鸟苷吡唑并三嗪核酸类似物和/或一个或多个鸟苷吡唑并三嗪核酸类似物替代一个或多个鸟苷核糖核苷酸。
在包括结构A1和A2的双链核糖核酸分子的一些实施方案中，正义链包含一个或多个脱氧腺苷吡唑并三嗪核酸类似物和/或一个或多个腺苷吡唑并三嗪核酸类似物替代一个或多个腺苷核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N’)y包含一个或多个脱氧鸟苷吡唑并三嗪核酸类似物和/或一个或多个鸟苷吡唑并三嗪核酸类似物替代一个或多个鸟苷核糖核苷酸。在优选实施方案中，正义链(N2-(N’)y或(N’)y包含一个或多个吡唑并三嗪核酸类似物和一个或多个修饰的核糖核苷酸或非常规部分。
在包括结构A1和A2的双链核糖核酸分子的一些实施方案中，正义链包括至少一个PT核苷酸类似物。在包括结构A1和A2的双链核糖核酸分子的一些实施方案中，反义链包括至少一个PT核苷酸类似物。在优选实施方案中，y＝19。在一些实施方案中，正义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个吡唑并三嗪核酸类似物。在一些实施方案中，正义链包含1、2、3、4、5、6、7或8个吡唑并三嗪核酸类似物。在一些实施方案中，正义链包含至少一个PT核苷酸类似物来替代腺苷或鸟苷核糖核苷酸且进一步包含至少一个2’OMe糖修饰的嘧啶核糖核苷酸，且反义链任选在5’末端的5、6、7、8或9位的一者中包含吡唑并三嗪核酸类似物。
在包括结构A1和A2的双链核糖核酸分子的一些实施方案中，正义链包括至少一个PT核苷酸类似物和至少一个其它修饰的核糖核苷酸或非常规部分。在一些实施方案中，非常规部分选自镜像核苷酸、2’5’连接的核苷酸和苏糖核酸。
在包括结构A1和A2的双链核糖核酸分子的一些实施方案中，反义链在5’末端的5、6、7、8或9位的一者中包括吡唑并三嗪核酸类似物且进一步包括一个或多个2’OMe糖修饰的嘧啶核糖核苷酸。在一些实施方案中，正义链在3’末端包括2-5个连续2’5’连接的核苷酸且任选进一步包括至少一个2’OMe糖修饰的嘧啶核糖核苷酸。
在包括结构A1和A2的双链核糖核酸分子的一些实施方案中，作为嘌呤的各N被PT核苷酸类似物取代。在包括结构A1和A2的双链核酸分子的一些实施方案中，至少一个作为嘌呤的N是PT核苷酸类似物且反义链[(A1)的(N)x或(A2)的N1-(N)x]的5’末端的5、6、7、8或9位的至少一者中的另一N选自苏糖核酸(TNA)部分、2’5’连接的核苷酸或镜像核苷酸。
在一些实施方案中，反义链[例如(A1)的(N)x或(A2)的N1-(N)x]在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19位(5’>3’)的至少一者中，优选在1位中包含PT核苷酸类似物，且在5位(5’>3’)中、在6位中、在7位中、在8位中、在9位中、在5-6位中、在6-7位中、在7-8位中、在8-9位中、在5-7位中、在6-8位中、在7-9位中、在5-8位中、在6-9位中或在5-9位中进一步包含TNA部分。
在一些实施方案中，反义链[例如(A1)的(N)x或(A2)的N1-(N)x]在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19位(5’>3’)的至少一者中，优选在1位中包含PT核苷酸类似物，且在5’末端的5位(5’>3’)中进一步包含2’5’连接的核苷酸。在一些实施方案中，反义链在5’末端的6位(5’>3’)中包含2’5’连接的核苷酸或PT核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链在5’末端的7位中包含2’5’连接的核苷酸。在一些实施方案中，反义链在5’末端的8位中包含2’5’连接的核苷酸。在一些实施方案中，反义链在5’末端的9位中包含2’5’连接的核苷酸。
在一些实施方案中，反义链[例如(A1)的(N)x或(A2)的N1-(N)x]在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19位(5’>3’)的至少一者中，优选在1位中包含PT核苷酸类似物，且在5’末端的5位(5’>3’)中进一步包含镜像核苷酸。在一些实施方案中，反义链在5’末端的6位中包含镜像核苷酸。在一些实施方案中，反义链在5’末端的7位中包含镜像核苷酸。在一些实施方案中，反义链在5’末端的8位中包含镜像核苷酸。在一些实施方案中，反义链在5’末端的9位中包含镜像核苷酸。
在一些实施方案中，正义链[例如(A1)的(N’)y或(A2)的N2-(N’)y]在至少一个位置中，优选在1位中包含PT核苷酸类似物，且在5’末端的9位中进一步包含苏糖核酸部分。在一些实施方案中，正义链在至少一个位置中包含PT核苷酸类似物，且在5’末端的10位中进一步包含苏糖核酸部分。
在一些实施方案中，正义链[例如(A1)的(N’)y或(A2)的N2-(N’)y]在至少一个位置中，优选在1位中包含PT核苷酸类似物，且在5’末端的9位中进一步包含2’5’连接的核苷酸。在一些实施方案中，正义链[(A1)的(N’)y或(A2)的N2-(N’)y]在至少一个位置中包含PT核苷酸类似物，且在5’末端的10位中进一步包含2’5’连接的核苷酸。
在一些实施方案中，正义链[例如(A1)的(N’)y或(A2)的N2-(N’)y]在至少一个位置中，优选在1位中包含PT核苷酸类似物，且在5’末端的9位中进一步包含假尿苷。在一些实施方案中，正义链[(A1)的(N’)y或(A2)的N2-(N’)y]在至少一个位置中包含PT核苷酸类似物，且在5’末端的10位中进一步包含假尿苷。
在一些实施方案中，正义链[例如(A1)的(N’)y或(A2)的N2-(N’)y]在至少一个位置中，优选在1位中包含PT核苷酸类似物，且在正义链的3’末端或倒数第二位置进一步包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个苏糖核酸部分。在一些实施方案中，正义链[例如(A1)的(N’)y或(A2)的N2-(N’)y]在至少一个位置中包含PT核苷酸类似物，且在正义链的3’末端或倒数第二位置进一步包含2、3、4、5、6、7或8个连续苏糖核酸部分。在一些实施方案中，正义链[例如(A1)的(N’)y或(A2)的N2-(N’)y]在至少一个位置中包含PT核苷酸类似物，且在5’末端的18–19、17-18、16-17、或15-16位中进一步包含苏糖核酸部分。在一些实施方案中，正义链[例如(A1)的(N’)y或(A2)的N2-(N’)y]在至少一个位置中包含PT核苷酸类似物，且在5’末端的15-17、15-18或15-19位中进一步包含苏糖核酸部分。在一些实施方案中，正义链[例如(A1)的(N’)y或(A2)的N2-(N’)y]在至少一个位置中包含替代嘌呤核糖核苷酸的PT核苷酸类似物，且在5’末端的11-19、12-19、13-19、14-19、15-19、16-19或17-19位中进一步包含苏糖核酸部分。在一些实施方案中，正义链[例如(A1)的(N’)y或(A2)的N2-(N’)y]在至少一个位置中包含替代嘌呤核糖核苷酸的PT核苷酸类似物，且在5’末端的11-18、12-18、13-18、14-18、15-18或16-18位中进一步包含苏糖核酸部分。
在一些实施方案中，双链核糖核酸分子在正义链中或在反义链中或在正义链与反义链两者中，优选在反义链的1位中包括至少一个PT核苷酸类似物，且dsRNA进一步包括以下修饰的组合
a)反义链在5’末端的5、6、7、8或9位的至少一者中包括2’5’连接的核苷酸、TNA部分或镜像核苷酸；且
b)正义链在5’末端的9或10位中包括2’5’连接的核苷酸或TNA部分的至少一者。
在一些实施方案中，双链核糖核酸分子在正义链中或在反义链中或在正义链与反义链两者中包括至少一个PT核苷酸类似物，且进一步包括以下修饰的组合
a)反义链在5’末端的5、6、7、8或9位的至少一者中包括2’5’连接的核苷酸、TNA部分或镜像核苷酸；且
b)正义链在3’倒数第二位置或3’末端包括2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续TNA。
在一些实施方案中，在双链核糖核酸分子中，正义链进一步包括共价连接于5’末端的加帽部分(z”)。在一些实施方案中，Z和/或Z’存在且包括共价连接于它所存在于其中的链的3’末端的核苷酸或非核苷酸悬突。在一些实施方案中，Z包括dTdT二核苷酸悬突或C3Pi-C3Pi非核苷酸悬突。在一些实施方案中，Z’包括dTdT二核苷酸悬突或C3Pi或C3OH非核苷酸悬突。
在一些实施方案中，双链核糖核酸分子包括在反义链的5’末端的5、6、7、8或9位的至少一者中的苏糖核酸部分或2’5’连接的核苷酸或镜像核苷酸以及
在正义链的3’末端或倒数第二位置的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个苏糖核酸部分。正义链和/或反义链任选进一步包括至少一个2’OMe糖修饰的嘧啶核糖核苷酸。在一些实施方案中，正义链包括至少一个2’OMe糖修饰的嘧啶核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链包括至少一个2’OMe糖修饰的嘧啶核糖核苷酸。在一些实施方案中，正义链与反义链两者均包括至少一个2’OMe糖修饰的嘧啶核糖核苷酸。在一些实施方案中，双链分子进一步包括共价连接于正义链的5’末端的加帽部分。
在另一实施方案中，双链核糖核酸分子包括在反义链的5’末端的5、6、7、8或9位的至少一者中的PT核苷酸类似物和苏糖核酸部分或2’5’连接的核苷酸或镜像核苷酸以及在正义链的3’末端或倒数第二位置的4、5或6个2’5’连接的核苷酸。在一些实施方案中，双链分子在正义链中的9或10位中进一步包含2’5’连接的核苷酸。在其它实施方案中，正义链、反义链或两个链进一步包括2’OMe糖修饰的嘧啶核糖核苷酸。
在另一实施方案中，双链核糖核酸分子在5’末端的5、6、7、8或9位中包括PT核苷酸类似物和至少一个苏糖核酸部分、2’5’连接的核苷酸或镜像核苷酸；且在正义链的3’末端或倒数第二位置包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续2’5’连接的核苷酸。
在另一实施方案中，双链核糖核酸分子在反义链的5’末端的5、6、7、8或9位中包括PT核苷酸类似物和至少一个苏糖核酸部分、2’5’连接的核苷酸或镜像核苷酸；且在正义链的3’末端或倒数第二位置包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续TNA部分。
在另一方面，提供包含以下的组合物：有效下调基因的表达的量的双链RNA核酸分子，其中
(a)所述核糖核酸分子包括正义链和反义链，其中各链的长度独立地是15至49个核苷酸；
(b)所述正义链和/或所述反义链包括至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物；
(c)所述反义链的15至49个核苷酸的序列互补于靶标基因的mRNA的序列；且
(d)所述正义链的15至49个核苷酸的序列互补于所述反义链且包括靶标基因的mRNA的15至49个核苷酸的序列；
和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，反义链和正义链各自是19-21个核苷酸且PT核苷酸类似物存在于反义链的5’末端(1位)或正义链的3’末端(即19、20和/或21位)或倒数第二位置(18位)。
在一些实施方案中，基因是哺乳动物基因。在其它实施方案中，基因是非哺乳动物基因，例如细菌、病毒或真菌基因。
在一些实施方案中，双链RNA核酸分子是根据结构(A1)。在一些实施方案中，双链核酸分子是根据结构(A2)。
在一些实施方案中，哺乳动物基因是人基因。在一些实施方案中，非哺乳动物基因是细菌基因或病毒基因。在一些实施方案中，非哺乳动物基因与哺乳动物疾病，优选人疾病有关。
进一步提供用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病状的发生或严重性和/或用于降低疾病或病状的风险或严重性的方法，其中所述疾病或病状和/或与其相关的症状和/或风险与哺乳动物或非哺乳动物基因的表达相关。在一优选实施方案中，受试者是人受试者。
在另一方面，提供用于下调靶标基因表达的根据本文所述的任何实施方案的双链核糖核酸分子和包含所述分子的组合物，其中所述靶标基因是哺乳动物或非哺乳动物靶标基因。
进一步提供根据本文所述的任何实施方案的双链核糖核酸分子或包含所述分子的组合物制造用于疗法中的药剂的用途。
在一些实施方案中，疾病或病状选自听力损失、急性肾衰竭(ARF)、在肾移植之后移植物功能恢复延迟(DGF)、青光眼、眼缺血性病状(包括前部缺血性视神经病变、年龄相关性黄斑变性(AMD)、缺血性视神经病变(ION)、干眼综合征、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和其它急性肺和呼吸道损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、原发性移植物失败、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、肺再植入反应和/或在器官移植之后的原发性移植物功能障碍(PGD)(特别是在肺移值、器官移植，包括肺、肝、心脏、胰脏和肾移植中)、肾毒性和神经毒性、脊髓损伤、脑损伤、神经退化性疾病或病状、褥疮、口腔粘膜炎、纤维化病状(包括肝纤维化、肺纤维化)、眼神经病变、眼内压(IOP)升高、综合征、糖尿病性视网膜病变(DR)、糖尿病性黃斑水肿(DME)、视神经炎、中心视网膜静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、视神经损伤、早产视网膜病变(ROP)、视网膜色素变性(RP)、视网膜神经节变性、黄斑变性、遗传性视神经病变、利伯氏遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy)、归因于毒性剂的神经病变和由不利药物反应或维生素缺乏引起的神经病变；美尼尔氏病(Ménière’s disease)和癌症。所述方法涉及向需要所述治疗的哺乳动物施用防治或治疗有效量的一种或多种抑制或降低至少一种所述基因的表达或活性的所述化合物。
附图简述
图1A和1B显示相较于在正义链中的18位具有未修饰的核糖腺苷(EGFP_1_S1957)、在正义链中的18位具有脱氧核糖腺苷(EGFP_1_S1992)或在正义链中的18位具有2’-O甲基(2’-OMe)糖修饰的核糖腺苷(EGFP_1_S500)的dsRNA分子，在正义链中的18位具有脱氧核糖腺苷PT部分(EGFP_1_S1913)或在正义链中的18位具有核糖腺苷PT部分(EGFP_1_S2141)的dsRNA分子在小鼠和大鼠血浆中的血浆稳定性(以小时计)增加。化学修饰的EGFP dsRNA在小鼠和大鼠血浆中的稳定性：通过15％变性PAGE检测正义链。EGFP_1_S500、EGFP_1_S1957、EGFP_1_S1913、EGFP_1_S2141和EGFP_1_S1992共有相同反义链。共有的反义链包括在1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位(5’>3’)中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸和在2、4、6、8、10、12、14、16和18位中的未修饰核糖核苷酸。EGFP_1_S500正义链包括在1、3、5、7、9、11、13、15、17、19位(5’>3’)中的未修饰核糖核苷酸和在2、4、6、8、10、12、14、16和18位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸；EGFP_1_S1957正义链包括在1、3、5、7、9、11、13、15、17、18和19位(5’>3’)中的未修饰核糖核苷酸(在18位中未修饰的核糖腺苷)和在2、4、6、8、10、12、14和16位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸；EGFP_1_S1913正义链包括在1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位(5’>3’)中的未修饰核糖核苷酸、在2、4、6、8、10、12、14和16位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸以及在18位中的PT脱氧腺苷(PT dA)；EGFP_1_S2141正义链包括在1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位(5’>3’)中的未修饰核糖核苷酸、在2、4、6、8、10、12、14和16位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸以及在18位中的PT核糖腺苷(PT rA)。EGFP_1_S1992正义链包括在1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位(5’>3’)中的未修饰核糖核苷酸、在2,4,6,8,10,12,14和16位中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸以及在18位中的标准未修饰的脱氧腺苷(dA)。
图2A显示在GFP转染的RAT1细胞中测试的不同浓度的EGFP_1_S500、EGFP_1_S1913和EGFP_1_S2141分子(其稳定性显示于图1A中)的活性(残余mRNA％)(下文实施例3)。图2B显示相较于在反义链中的1位具有未修饰的核糖腺苷的dsRNA分子(EGFP_1_S024)和在反义链中的1位具有2’-O甲基糖修饰的核糖腺苷的dsRNA分子，不同浓度的dsRNA分子EGFP_1_S2178、EGFP_1_S1911、EGFP_1_S500、EGFP_1_S024(即在反义链中的1位具有脱氧核糖腺苷PT的dsRNA分子(EGFP_1_S1911)或在反义链中的1位具有核糖腺苷PT部分的dsRNA分子(EGFP_1_S2178))的活性(残余mRNA％)。一般来说，在反义链中的1位包括PT部分的dsRNA分子显示敲低活性增强超过在相同位置中具有未修饰或2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸的类似修饰的dsRNA分子。
图3A显示反义链在1位中具有PT脱氧腺苷的dsRNA分子的细胞提取物稳定性(以小时计)。EGFP_1_S500、EGFP_1_S1911和EGFP_1_S1910共有相同正义链。共有的正义链包括在1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位(5’>3’)中的未修饰核糖核苷酸和在2、4、6、8、10、12、14、16和18位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸。EGFP_1_S500反义链包括在1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位(5’>3’)中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸和在2、4、6、8、10、12、14、16和18位中的未修饰核糖核苷酸；EGFP_1_S1911反义链包括在2、4、6、8、10、12、14、16和18位(5’>3’)中的未修饰核糖核苷酸；以及在3、5、7、9、11、13、15、17和19位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸和在1位中的PT脱氧腺苷核苷酸类似物。图3B显示不同浓度的两种图3A的化合物(即EGFP_1_S1911和EGFP_1_S500)的活性(残余mRNA％)。
图4A和4B显示反义链在1位中具有PT脱氧腺苷的dsRNA分子在细胞提取物中的稳定性(图4A：HCT116提取物；图4B：Skov 3提取物)。EGFP_1_S2043、EGFP_1_S2044和EGFP_1_S1911共有相同正义链。共有的正义链包括在1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位(5’>3’)中的未修饰核糖核苷酸和在2、4、6、8、10、12、14、16和18位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸。EGFP_1_S2043反义链包括在2、4、6、8、10、12、14、16和18位(5’>3’)中的未修饰核糖核苷酸；在3、5、7、9、11、13、15、17和19位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸和在1位中的腺苷(标准DNA)；EGFP_1_S2044与EGFP_1_S2043相同，例外之处是在反义链的1位中存在核糖腺苷；EGFP_1_S1911与EGFP_1_S2043和EGFP_1_S2044相同，例外之处是在反义链的1位中存在PT脱氧腺苷核苷酸类似物。图4A和4B显示相较于在反义链的1位中具有DNA或RNA部分的反义链，在1位中具有脱氧吡唑并三嗪核苷酸类似物的反义链的细胞提取物稳定性增加。
图5A显示在正义链的5位(种子区域)中具有PT脱氧腺苷核苷酸类似物的吡唑并三嗪修饰的RAC1_28dsRNA分子的血浆(小鼠和大鼠)稳定性。RAC1_28_S1917和RAC1_28_S1908共有相同正义链。共有的正义链包括在2、4、6、7、8、9、11、12、14、15、17和19位(5’>3’)中的未修饰核糖核苷酸和在1、3、5、10、13、16和18位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸。RAC1_28_S1917反义链包括在1、6、9、11、13、15、17和19位(5’>3’)中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸、在2、3、4、7、8、10、12、14、16和18位中的未修饰核糖核苷酸和在5位中的PT脱氧腺苷核苷酸类似物；RAC1_28_S1908反义链包括在2、3、4、5、7、8、10、12、14、16和18位(5’>3’)中的未修饰核糖核苷酸；和在1、6、9、11、13、15、17和19位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸(未修饰核糖核苷酸在5位中)。图5B显示RAC1_28_S1917和RAC1_28_S1908在不同浓度下的活性(残余mRNA％)(Syn1和Syn2是指_S1917的两种不同合成物)。当相较于低浓度的dsRNA化合物(即0.4nM、0.14nM、0.045nM、0.015nM和0.005nM)时，具有PT脱氧腺苷核苷酸的dsRNA(即RAC1_28_S1917)的敲低活性显著好于在相同位置(反义链的5位)具有未修饰的RNA的dsRNA。
图6显示以上在图5A和5B中所述的化合物关于种子匹配(SMx3)的脱靶活性降低。相较于RAC1_28_S1908，吡唑并三嗪修饰的RAC1_28_S1917显示降低的反义链(AS_SMx3，反义种子匹配3拷贝)脱靶活性和更好中靶活性(AS_CM，反义完全匹配)。
图7显示以上在图5A和5B中所述的dsRNA分子(即RAC1_28_S1917和RAC1_28_S1908)和在反义链的5位中具有RNA或标准DNA的dsRNA分子(即RAC1_28_S2025和RAC1_28_S2001)关于种子匹配(SMx3)的脱靶活性降低。RAC1_28_S1917、RAC1_28_S1908、RAC1_28_S2025和RAC1_28_S2001共有相同正义链。共有的正义链包括在2、4、6、7、8、9、11、12、14、15、17和19位(5’>3’)中的未修饰核糖核苷酸、在1、3、5、10、13、16和18位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸和3’末端磷酸酯。RAC1_28_S1917和RAC1_28_S1908反义链是以上所述。RAC1_28_S2025反义链包括在1、6、9、11、13、15、17和19位(5’>3’)中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸、在2、3、4、7、8、10、12、14、16和18位中的未修饰核糖核苷酸和在5位中的标准脱氧腺苷核苷酸；RAC1_28_S2001反义链包括在1、9、11、13、15、17和19位(5’>3’)中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸、在2、3、4、6、7、8、10、12、14、16和18位中的未修饰核糖核苷酸和在5位中的PT脱氧腺苷核苷酸类似物。相较于RAC1_28_S1908(腺苷(rA)在5位中)或RAC1_28_S2025(标准DNA在5位中)，吡唑并三嗪修饰的RAC1_28_S1917和RAC1_28_S2001显示降低的反义链(AS_SMx3，反义种子匹配3拷贝)脱靶活性和更好中靶活性(AS_CM，反义完全匹配)。
图8A和8B显示人血浆单核细胞(PMNC)中反应于暴露于dsRNA EGFP化合物EGFP_1_S500、EGFP_1_S1957、EGFP_1_S1910、EGFP_1_S1911和EGFP_1_S1913(以上对于图1A、1B和2A所述)的干扰素反应性mRNA的水平。白色柱是指IFIT1的水平，暗灰色柱是指MX1的水平，如下文在实施例7中所述。多IC对照值是：1.7ug：IFIT1-91，MX1-296；0.56ug：IFIT1-73，MX1-296；0.19ug：IFIT1-41，MX1-339。
图9显示相较于无PT核苷酸类似物的靶向Rac1的dsRNA分子(RAC1_28_S1908和RAC1_28_S2025)，在反义链中具有吡唑并三嗪RNA核苷酸类似物的靶向Rac1的dsRNA分子(RAC1_28_S1917和RAC1_28_S2001)的脱靶活性降低和中靶活性增加。RAC1_28_S1917、RAC1_28_S1908、RAC1_28_S2025、RAC1_28_S2001共有具有在2、4、6、7、8、9、11、12、14、15、17和19位(5’>3’)中的未修饰核糖核苷酸、在1、3、5、10、13、16和18位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸和3’末端磷酸酯的相同正义链。反义链的修饰提供于上文对于图5A和7的描述中。
图10显示具有吡唑并三嗪RNA核苷酸类似物的靶向KRAS的dsRNA分子的脱靶活性降低和中靶活性增加。测试KRAS_2_2101、KRAS_2_2087、KRAS_2_2176和KRAS_2_2179。所有dsRNA都共有相同正义链，其包括在1、3、4、5、6、8、9、10、11、12、14、15、17和19位中的未修饰核糖核苷酸、在2、7、13、16和18位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸和在3’末端的磷酸酯部分。KRAS_2_2101和KRAS_2_2087反义链包括在2、5、7、8、9、10、11、12、13、14、16和18位中的未修饰核糖核苷酸、在1、6、15、17和19位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸和在3’末端的磷酸酯部分。KRAS_2_2101反义链进一步包括在3位的未修饰核糖核苷酸和在4位的吡唑并三嗪脱氧腺苷核苷酸类似物。KRAS_2_2087反义链进一步包括在3位的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸和在4位的未修饰的核糖腺苷。KRAS_2_2176和KRAS_2_2179反义链包括在3、5、7、8、9、10、11、12、13、14、16和18位中的未修饰核糖核苷酸、在1、6、15、17和19位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸和在3’末端的磷酸酯部分。KRAS_2_2176进一步包括在2位中的未修饰核糖核苷酸和在4位中的吡唑并三嗪核糖腺苷核苷酸类似物，而KRAS_2_2179进一步包括在4位中的未修饰核糖核苷酸和在2位中的吡唑并三嗪核糖腺苷核苷酸类似物。
图11显示相较于在相同位置中具有核糖腺苷的dsRNA，在反义链的种子区域(4位)中具有吡唑并三嗪的dsRNA的靶标特异性改良。由方块连接的线条反映中靶活性。由菱形连接的线条反映脱靶活性。测试的dsRNA分子包括KRAS_2_2101和KRAS_2_2087。KRAS_2_2101和KRAS_2_2087共有相同正义链，其包括在1、3、4、5、6、8、9、10、11、12、14、15、17和19位中的未修饰核糖核苷酸、在2、7、13、16和18位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸和在3’末端的磷酸酯部分。KRAS_2_2101和KRAS_2_2087反义链包括在2、5、7、8、9、10、11、12、13、14、16和18位中的未修饰核糖核苷酸、在1、6、15、17和19位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸和在3’末端的磷酸酯部分。KRAS_2_2101反义链进一步包括在3位的未修饰核糖核苷酸和在4位的吡唑并三嗪脱氧腺苷核苷酸类似物。KRAS_2_2087反义链进一步包括在3位的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸和在4位的未修饰的核糖腺苷。
图12显示相较于在相同位置中具有核糖腺苷的dsRNA分子，在反义链的1位中具有吡唑并三嗪RNA的dsRNA分子的敲低活性改良。PLK1_25_S2054和PLK1_25_S2177共有相同正义链，其包括在1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、13、14、15、17、18和19位中的未修饰核糖核苷酸、在7、12和16位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸、共价连接于5’末端的氨基C6加帽部分和在3’末端的磷酸酯部分。PLK1_25_S2054和PLK1_25_S2177的反义链包括在2、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、16和18位中的未修饰核糖核苷酸、在3、7、15、17和19位中的2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸和在3’末端的磷酸酯部分。PLK1_25_S2054反义链在1位进一步包括未修饰的核糖腺苷且PLK1_25_S2177反义链在1位进一步包括吡唑并三嗪核糖腺苷核苷酸类似物。
现将描述的化合物、方法、材料和实例仅具有说明性且不意图具有限制性；与本文所述的材料和方法类似或等效的材料和方法可用于实施或测试本发明。本发明的其它特征和优势将根据以下详细描述以及根据权利要求而显而易知。
发明详述
本文公开调节靶标基因的表达的包括至少一个吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物的双链核酸分子，特别是小干扰RNA(siRNA)，具体来说是修饰的dsRNA分子；以及这些修饰的dsRNA分子制备药物组合物和治疗罹患各种医学病状的受试者的用途。当相较于未修饰或类似双链核糖核酸化合物时，本文公开的双链核糖核酸分子展现以下一者或多者：中靶活性增加、脱靶活性降低、核酸酶稳定性增加(核酸外切酶和/或核酸内切酶)、和免疫原性降低。双链核糖核酸分子包括位置修饰，其包括在正义链上、在反义链上或在正义链与反义链两者上存在至少一个吡唑并三嗪(PT)腺苷核苷酸类似物或吡唑并三嗪(PT)鸟苷核苷酸类似物，由此相较于未修饰分子或排除PT核苷酸类似物的类似修饰的分子，对分子赋予包括以下一者或多者的有益性质：靶标基因表达的敲低活性增加、靶标蛋白质的水平降低、对核酸内切酶和/或核酸外切酶的稳定性增加、脱靶效应降低和/或免疫调节效应降低。
本文公开的双链核糖核酸分子是以化合物本身形式(即以裸露dsRNA形式)或以药学上可接受的盐形式施用，且是单独或作为药物组合物中的活性成分施用。双链核糖核酸分子、其药学上可接受的盐和包含双链核糖核酸分子或其药学上可接受的盐的组合物能够下调、敲低、减弱、降低或抑制靶标基因表达和/或降低相关蛋白质水平，且适用于治疗罹患其中靶标基因表达和/或相关蛋白质水平增加具有不利后果的疾病或病状和/或与所述疾病或病状相关的症状或处于感染疾病或病状的风险下的受试者。
因此，在某些方面，本文提供适用于下调靶标基因表达的修饰的dsRNA分子和包含所述修饰的dsRNA分子的药物组合物。如本文所用，靶标基因是哺乳动物基因或非哺乳动物基因。
定义
应注意的是，除非内容另外明确规定，否则如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。当本发明的方面或实施方案以马库什(Markush)群组或其它替代性分组描述时，本领域技术人员将认识到本发明也由此以所述群组的任何个别成员或成员子组加以描述。
当提及dsRNA时，“化合物”和“分子”在本文中可互换使用。
如本文所用的术语“抑制”是指在足以达成所需生物或生理作用的程度上降低基因的表达或所述基因的产物的活性。抑制是完全的或部分的。
“siNA抑制剂”、“dsRNA抑制剂”、“dsRNA分子”是能够在足以达成所需生物或生理作用的程度上降低基因的表达或所述基因的产物的活性的化合物。如本文所用的术语“siNA抑制剂”是指siRNA、shRNA、合成shRNA、miRNA的一者或多者。抑制也可称为下调，或对于RNAi而言，称为沉默。dsRNA分子包括也称为过客链(passenger strand)的正义链，其与靶标RNA共有同源性；和也称为引导链的反义链，其完全或部分互补于所述正义链。
如本文所用，术语“抑制”靶标基因或“下调基因表达”是指抑制基因表达(转录或翻译)或多肽活性。靶标RNA序列的多核苷酸序列是指mRNA靶标、RNA靶标或其与所述靶标mRNA或RNA优选具有至少70％同一性、更优选80％同一性、甚至更优选90％或95％同一性的任何同源序列。因此，本文涵盖已经受如本文所述的突变、改变或修饰的多核苷酸序列。术语“mRNA多核苷酸序列”和“mRNA”可互换使用。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用且指包含脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的核苷酸序列。所述术语应理解成包括RNA或DNA的由核苷酸类似物制得的类似物作为等效物。在整篇本公开中，mRNA序列被阐述成代表相应基因。
“寡核苷酸”或“寡聚物”是指约2至约50个核苷酸的核糖核苷酸序列。各RNA核苷酸可独立地是天然的或合成的，和/或修饰的或未修饰的。修饰包括寡核苷酸中的糖部分、碱基部分和/或核苷酸之间的键联的变化。如本文所用的寡核苷酸或寡聚物可为RNA和DNA的嵌合体。
如本文所用，术语“dsRNA”涵盖其中多达20个核糖核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核糖核苷酸已被非常规部分(包括DNA、2’5’连接的核糖核苷酸和2’5’连接的脱氧核糖核苷酸)取代的分子。实质上互补是指与另一序列的互补性大于约84％。举例来说，在由19个碱基对组成的双链体区域中，一个错配导致94.7％互补性，两个错配导致约89.5％互补性且3个错配导致约84.2％互补性，从而致使所述双链体区域是实质上互补的。因此，实质上相同是指与另一序列的同一性大于约84％。
“核苷酸”意图涵盖可为天然的或合成的以及修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。核苷酸包括合成的、天然存在的和非天然存在的已知核苷酸类似物。所述类似物的实例不加限制地包括硫代磷酸酯、亚磷酰胺、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2'-O-甲基(2’-OMe)糖修饰的核糖核苷酸、和肽-核酸(PNA)。修饰包括寡核糖核苷酸中的糖部分、碱基部分和/或核糖核苷酸之间的键联的变化。如本文所用，术语“核糖核苷酸”涵盖天然的和合成的、未修饰的和修饰的核糖核苷酸和合成的、天然存在的和非天然存在的核糖核苷酸类似物。修饰包括寡核苷酸中的糖部分、碱基部分和/或核糖核苷酸之间的键联的变化。
术语“脱氧核糖核苷酸”和“脱氧核苷酸”可互换使用。
本文公开的双链核糖核酸分子在正义链中、在反义链中或在正义链与反义链两者中包括至少一个替代嘌呤核苷酸(腺苷或鸟苷)的吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物。在优选实施方案中，双链核酸包括至少一个通式II的PT核苷酸类似物：
其中
R1和R4各自独立地选自H、卤素、-CN、-SCN、-NO2、-O-烃基、-S-烃基、-CO-H、-CO-烃基、-NR8R9、杂芳基、或任选被一个或多个各自独立地是卤素、-CN、-SCN或-NO2的基团取代的烃基，其中R8和R9各自独立地是H或烃基，或R8和R9连同它们所连接的氮原子一起形成任选含有1-2个选自氧、氮或硫的其它杂原子的饱和或不饱和杂环；
R2是H或不存在；
R3是O或-NR10R10’，其中R10和R10’各自独立地是H、烃基或-CO-烃基；
R5是H、卤素、-O-或-OR11；
R6是-O-或-OR11；
R7是OR11、单磷酸酯部分或磷酸酯连接部分；
各R11独立地是H、(C1-C8)烷基、(C1-C8)亚烷基-OR12、(C1-C8)亚烷基-SR12或(C1-C8)亚烷基-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是H或(C1-C8)烷基；且
点线代表4位碳原子与3位氮原子或基团R3之间的潜在双键，前提是当R2是H时，在4位碳原子与R3之间存在双键，且当R2不存在时，在4位碳原子与3位氮原子之间存在双键。
“腺嘌呤PT核苷酸类似物”或“PT腺嘌呤类似物”是指其中腺嘌呤碱基已被如本文所述的吡唑并三嗪碱基替换的核苷酸，且意图涵盖腺苷(其中核糖可在2'位未被修饰(即2’OH)或在2'位被修饰(例如2’OCH3、2’MOE等))和脱氧腺苷(其中核糖的2'位可未被修饰(即2’H)或被修饰(例如2’F等))吡唑并三嗪核苷酸类似物。
“鸟嘌呤PT核苷酸类似物”或“PT鸟嘌呤类似物”是指其中鸟嘌呤碱基已被如本文所述的吡唑并三嗪碱基替换的核苷酸，且意图涵盖鸟苷(其中核糖可在2'位未被修饰(即2’OH)或在2'位被修饰(例如2’OCH3、2’MOE等))和脱氧鸟苷(其中核糖的2'位可未被修饰(即2’H)或被修饰(例如2’F等))吡唑并三嗪核苷酸类似物。
如本文所用，术语“卤素”包括氟基、氯基、溴基和碘基，且优选是氟基、氯基或溴基。
在不同基团R1、R3和R4的任何定义中的术语“烃基”是指仅含有碳原子和氢原子的可为饱和或不饱和、直链或支链、环状或无环、或芳族的基团，且包括(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C3-C10)环烷基、(C3-C10)环烯基、(C6-C14)芳基、(C1-C8)烷基(C6-C14)芳基和(C6-C14)芳基(C1-C8)烷基。
术语“(C1-C8)烷基”通常是指具有1-8个碳原子的直链或支链烃基团且包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2,2-二甲基丙基、正己基、正庚基、正辛基等。优选的是(C1-C4)烷基，最优选的是甲基和乙基。术语“(C2-C8)烯基”和“(C2-C8)炔基”通常是指具有2-8个碳原子且分别具有1个双键或三键的直链和支链烃基团，且包括乙烯基、3-丁烯-1-基,2-乙烯基丁基、3-辛烯-1-基等；和丙炔基、2-丁炔-1-基、3-戊炔-1-基等。(C2-C6)烯基和炔基是优选的，更优选是(C2-C4)烯基和炔基。
术语“(C1-C8)亚烷基”通常是指具有1-8个碳原子的二价直链或支链烃基团且包括例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、2-甲基亚丙基、亚戊基、2-甲基亚丁基、亚己基、2-甲基亚戊基、3-甲基亚戊基、2,3-二甲基亚丁基、亚庚基、亚辛基等。优选的是(C1-C4)亚烷基，更优选的是(C1-C2)亚烷基。
如本文所用的术语“(C3-C10)环烷基”是指可例如被一个或多个(C1-C8)烷基取代的具有3-10个碳原子的单环或双环饱和烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、金刚烷基、双环[3.2.1]辛基、双环[2.2.1]庚基等。
如本文所用的术语“(C3-C10)环烯基”是指可例如被一个或多个(C1-C8)烷基取代的具有3-10个碳原子和一个双键的单环或双环烃基，如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基、1,2,3,3a,4,5-六氢并环戊二烯基、1,2,3,3a,4,6a-六氢并环戊二烯基、2,3,3a,4,5,6-六氢-1H-茚基、2,3,3a,4,5,7a-六氢-1H-茚基、2,3,3a,4,7,7a-六氢-1H-茚基、3a,4,5,6,7,7a-六氢-1H-茚基、1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氢萘基、1,2,3,4,4a,5,8,8a-八氢萘基等。
术语“(C6-C14)芳基”表示由单环或通过共价键稠合或连接的多环组成的具有6-14个碳原子的芳族碳环基团，如但不限于苯基、萘基、菲基和联苯。芳基可任选被一个或多个各自独立地选自卤素(例如F、Cl、Br或I)、(C1-C8)烷基、-O-(C1-C8)烷基、-COO(C1-C8)烷基、-CN或NO2的基团取代。
术语“(C6-C14)芳基(C1-C8)烷基”表示如苯甲基、苯乙基等的芳基烷基，且术语“(C1-C8)烷基(C6-C14)芳基”表示如甲基苯基、乙基苯基、二甲苯基等的烷基芳基。
术语“杂芳基”是指源于含有1至3个，优选1-2个选自N、O或S的杂原子的单环或多环杂芳族环的基团。当杂芳基是单环时，它优选是具有5-6元环的基团，如但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、噻嗪基、吡唑基、吡嗪基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、吡啶基、嘧啶基、1,2,3-三嗪基、1,3,4-三嗪基和1,3,5-三嗪基。多环杂芳基优选主要由两个环组成，如但不限于苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、吡啶并[1,2-a]嘧啶基和1,3-苯并二氧杂环己烯基。杂芳基可被取代。应了解的是，当多环杂芳基被取代时，取代可在任何碳环和/或杂环中。
在某些实施方案中，本文公开的PT核苷酸类似物是如上定义的通式II化合物，其中R1和R4各自独立地是H、卤素、-CN、-SCN、-NO2、-O-烃基、-S-烃基、-CO-H、-CO-烃基、-NR8R9、杂芳基或烃基；R8和R9各自独立地是H或烃基；且所述烃基各自独立地是(C1-C8)烷基，优选是(C1-C4)烷基，更优选是甲基或乙基。在特定实施方案中，R1和R4各自独立地是H、卤素、-O-烃基、-S-烃基、-CO-H、-CO-烃基、-NR8R9或烃基；R8和R9各自独立地是H或烃基；且所述烃基各自独立地是(C1-C4)烷基，优选是甲基或乙基。
在某些实施方案中，本文公开的PT核苷酸类似物是如上定义的通式II化合物，其中R3是O或–NR10R10’；其中R10和R10’各自独立地是H、烃基或-CO-烃基；且所述烃基是(C1-C8)烷基，优选是(C1-C4)烷基，最优选是甲基或乙基。优选地，R10或R10’的至少一者是H。
在某些实施方案中，本文公开的PT核苷酸类似物是如上定义的通式II化合物，其中R5是H、卤素或-OR11；且R11是H、(C1-C4)烷基(优选是(C1-C2)烷基)、(C1-C4)亚烷基-O R12(优选是(C1-C2)亚烷基-OR12)、(C1-C4)亚烷基-SR12(优选是(C1-C2)亚烷基-SR12)、(C1-C4)亚烷基-NR12R13(优选是(C1-C2)亚烷基-NR12R13)，其中R12和R13各自独立地是H或(C1-C4)烷基，优选是(C1-C2)烷基。在特定所述实施方案中，R5是H、卤素或-OR11；且R11是H、(C1-C2)烷基、(C1-C2)亚烷基-OH、(C1-C2)亚烷基-SH或(C1-C2)亚烷基-NH2。
在某些实施方案中，本文公开的PT核苷酸类似物是如上定义的通式II化合物，其中R6是-O-或-OR11；且R11是H、(C1-C4)烷基(优选是(C1-C2)烷基)、(C1-C4)亚烷基-OR12(优选是(C1-C2)亚烷基-OR12)、(C1-C4)亚烷基-SR12(优选是(C1-C2)亚烷基-SR12)、或(C1-C4)亚烷基-NR12R13(优选是(C1-C2)亚烷基-NR12R13)，其中R12和R13各自独立地是H或(C1-C4)烷基，优选是(C1-C2)烷基。在特定所述实施方案中，R6是-O-或-OR11；且R11是H、(C1-C2)烷基、(C1-C2)亚烷基-OH、(C1-C2)亚烷基-SH或(C1-C2)亚烷基-NH2。
在特定实施方案中，本文公开的PT核苷酸类似物是如上定义的通式II化合物，其中R1和R4各自独立地是H、卤素、(C1-C4)烷基、-O-(C1-C4)烷基、-S-(C1-C4)烷基、-CO-H、-CO-(C1-C4)烷基或-NR8R9，其中R8和R9各自独立地是H或(C1-C4)烷基；R3是O或-NHR10，其中R10是H、(C1-C4)烷基或-CO-(C1-C4)烷基；R5是H、卤素或-OR11，其中R11是H、(C1-C2)烷基、(C1-C2)亚烷基-OH、(C1-C2)亚烷基-SH或(C1-C2)亚烷基-NH2；且R6是-O-或-OR11，其中R11是H、(C1-C2)烷基、(C1-C2)亚烷基-OH、(C1-C2)亚烷基-SH或(C1-C2)亚烷基-NH2。在更特定实施方案中，R1和R4各自独立地是H、卤素、(C1-C2)烷基、-O-(C1-C2)烷基、-S-(C1-C2)烷基、-CO-H、-CO-(C1-C2)烷基或-NR8R9，其中R8和R9各自独立地是H或(C1-C2)烷基；且R3是O或-NHR10，其中R10是H、(C1-C2)烷基或-CO-(C1-C2)烷基。
如本文所用的术语“胺保护基”是指可易于连接于胺基团(形成保护的胺)的化学部分，其被添加来保护所述胺基团免遭非所需化学反应且接着在稍后时间点被移除以暴露原始胺基团。胺保护基的实例可见于如Green和Wuts(1991,Protective Groups in Organic Synthesis,Wiley,New York,第2版)以及Bodansky(1993,Principles of PeptideSynthesis,Springer,Berlin)的参考书目中。胺保护基的实例包括(不限于)乙酰基、苯甲酰基、苯甲氧甲酰基、对甲氧基苯甲基羰基、甲氧基羰基、叔丁基氧基羰基、9-芴基甲基氧基羰基(FMOC)、苯甲基、氨基甲酸酯基团、对甲氧基苯甲基、3,4-二甲氧基苯甲基(DMPM)、对甲氧基苯基(PMP)、单甲氧基三苯甲基(MMT)、二甲氧基三苯甲基(DMT)和甲苯磺酰基。
术语“羟基保护基”，也称为“醇保护基”，是指当需要时可易于连接于羟基(且形成保护的羟基)以保护所述羟基免遭非所需化学反应且接着在稍后时间点自所述保护的羟基移除以暴露原始羟基的化学部分。羟基保护基的实例在本领域中是熟知的且可见于如Green和Wuts(1991,Protective Groups in Organic Synthesis,Wiley,New York,第2版)以及Bodansky(1993,Principles of Peptide Synthesis,Springer,Berlin)的参考书目中。羟基保护基的非限制性实例包括DMT、叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、三异丙基硅烷基氧基甲基(TOM)、三甲基硅烷基(TMS)、三异丙基硅烷基(TIPS)、乙酰基、苯甲基和苯甲酰基。
如本文所用的术语“磷酸酯部分”是指具有通式-[O-P(O)(R')-O]2-的单磷酸酯部分、具有通式-[O-P(O)(R')-O-P(O)(R')-O]3-的二磷酸酯部分、或具有通式-[O-P(O)(R')-O-P(O)(R')-O-P(O)(R')-O]4-的三磷酸酯部分，其中R'各自独立地是O-、S-、BH3 -或N-，优选是指其中(i)R'各自是O-；或(ii)一个R'(优选是在α位连接于磷酸酯原子的R')是S-或BH3 -，而另一R'是O-的所述单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯部分，以及是指其任何质子化形式。优选的是如上定义的单磷酸酯部分，如-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-和-[O-PO2(BH3)]2-，更优选是-[O-PO3]2-。
如本文所用的术语“磷酸酯连接部分”是指具有通式-[O-P(O)(R')]--的部分，其中R'是O-、S-、BH3 -或N-，优选是O-、S-或BH3 -，更优选是O-，以及是指其质子化形式。
在优选实施方案中，PT核苷酸类似物包括如下式IIa的腺嘌呤PT核苷酸类似物或式IIb的鸟嘌呤PT核苷酸类似物：
在一些优选实施方案中，吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物是式IIa的腺苷PT核苷酸类似物，其中R1是H，R10是H；R4是H；R5是-OR11，其中R11是H、(C1-C8)烷基、(C1-C8)亚烷基-OR12、(C1-C8)亚烷基-SR12或(C1-C8)亚烷基-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是H或(C1-C8)烷基；R6是-O-或–OH；且R7是OH或磷酸酯部分。在一些实施方案中，R11是H、CH3或(CH2)2-OCH3。在一些实施方案中，R11是H(即R5是羟基；2’OH)。在一些实施方案中，R11是CH3(即R5是甲氧基，2’OMe)。在一些实施方案中，R11是(CH2)2-OCH3(即R5是甲氧基乙氧基；2’MOE)。优选地，R7是使PT类似物连接于寡核苷酸(即dsRNA分子的正义链或反义链)中的邻近核苷酸的磷酸酯部分。或者，当PT类似物在寡核苷酸(即dsRNA分子的正义链或反义链)的5’末端位置时，R7是OH。
在一些优选实施方案中，吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物是式IIa脱氧腺苷PT核苷酸类似物，其中R1是H，R10是H；R4是H；R5是H或卤素；R6是-O-或–OH；且R7是OH或磷酸酯部分。在一些实施方案中，R5是H。在一些实施方案中，R5是卤素，优选是F。
在一些优选实施方案中，吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物是式IIb的鸟苷PT核苷酸类似物，其中R4、R8和R9各自是H，R5是-OR11，其中R11是H、(C1-C8)烷基、(C1-C8)亚烷基-OR12、(C1-C8)亚烷基-SR12或(C1-C8)亚烷基-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是H或(C1-C8)烷基；R6是-O-或–OH；且R7是OH或磷酸酯部分。在一些实施方案中，R11是H、CH3或(CH2)2-OCH3。在一些实施方案中，R11是H(即R5是羟基；2’OH)。在一些实施方案中，R11是CH3(即R5是甲氧基，2’OMe)。在一些实施方案中，R11是(CH2)2-OCH3(即R5是甲氧基乙氧基；2’MOE)。
在一些优选实施方案中，吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物是式IIb的脱氧鸟苷PT核苷酸类似物，其中R4、R8和R9各自是H，R5是H或卤素；R6是-O-或–OH；且R7是OH或磷酸酯部分。在一些实施方案中，R5是H。在一些实施方案中，R5是卤素，优选是F。
在一些实施方案中，dsRNA分子包括至少一个选自在表2中阐述为化合物3-32的腺苷或脱氧腺苷PT核苷酸类似物之一的腺嘌呤PT核苷酸类似物。在某些实施方案中，本文公开的核苷酸类似物是如上定义的通式IIa腺嘌呤类似物，其中R1和R4各自独立地是H、卤素、(C1-C2)烷基、-O-(C1-C2)烷基、-S-(C1-C2)烷基、-CO-H、-CO-(C1-C2)烷基或-NR8R9，其中R8和R9各自独立地是H或(C1-C2)烷基，优选是H；R2不存在；R3是–NH2；R5是H、卤素、-O-或-OR11；R6是-O-或-OR11；R7是-OR11、磷酸酯部分或磷酸酯连接部分；且R11各自独立地是H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)亚烷基-OH、(C1-C4)亚烷基-OCH3、(C1-C4)亚烷基-SH、(C1-C4)亚烷基-SCH3或(C1-C4)亚烷基-NH2。说明书中描述的所述腺嘌呤PT核苷酸类似物的完整化学结构描绘于下文表2中。
在具体实施方案中，dsRNA分子包括至少一个通式IIa的PT脱氧腺苷类似物，其中(i)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是H；R6是–O-；R7是-OH；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物3和4)；(ii)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是H；R6是-OH；R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物5、5a、5b、或6、6a和6b)；(iii)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是H；R6是–O-，R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物7、7a、7b、或8、8a和8b)
在具体实施方案中，dsRNA分子包括至少一个通式IIa的腺苷类似物，其中(iv)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是-OH；R6是–O-；R7是-OH；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物9和10)；(v)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是-OH；R6是-OH；R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物11、11a、11b、或12、12a和12b)；(vi)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是-OH；R6是-O-，R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物13,13a,13b,或14,14a和14b)；
在具体实施方案中，dsRNA分子包括至少一个通式IIa的腺苷类似物，其中(vii)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是-OCH3；R6是–O-；R7是-OH；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物14和16)；(viii)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是-OCH3；R6是-OH；R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物17、17a、17b、或18、18a和18b)；(ix)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是-OCH3；R6是-O-，R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物19、19a、19b、或20、20a和20b)；
在具体实施方案中，dsRNA分子包括至少一个通式IIa的腺苷类似物，其中(x)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是O(CH2)2OCH3；R6是–O-；R7是-OH；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物21和22)；(xi)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是O(CH2)2OCH3；R6是-OH；R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物23、23a、23b、或24、24a和24b)；(xii)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是O(CH2)2OCH3；R6是–O-，R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物25、25a、25b、或26、26a和26b)；
在具体实施方案中，dsRNA分子包括至少一个通式IIa的脱氧腺苷类似物，其中(xiii)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是F；R6是–O-；R7是-OH；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物27和28)；(xiv)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是F；R6是-OH；R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物29、29a、29b、或30、30a和30b)；(xv)R1和R4是H；R2不存在；R3是-NHR10；R5是F；R6是–O-，R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R10是H或苯甲酰基(分别化合物31、31a、31b或32、32a和32b)。
表2：鉴定为化合物3-32的腺苷和脱氧腺苷PT核苷酸类似物
*以上化合物中的-[O-PO3]2-可被另一磷酸酯部分，包括例如磷酸酯连接部分、硫代磷酸三酯部分[-[O-PO2S]2-](a)或-[O-PO2(BH3)]2-(b)取代。磷酸酯连接部分是-[O-P(O)(R')]--，其中R'是O-、S-、BH3-或N-，优选是O-、S-或BH3-，更优选是O-，以及是所述连接部分的质子化形式。
在一些实施方案中，dsRNA分子包括至少一个选自在表3中阐述为化合物33-62的鸟苷或脱氧鸟苷PT核苷酸类似物之一的鸟嘌呤PT核苷酸类似物。在某些实施方案中，核苷类似物是如上定义的通式IIb鸟嘌呤类似物，其中R1是–NHR9；R2是H；R3是O；R4是H；R9是H或苯甲酰基；R5是H、卤素、-O-或-OR11；R6是-O-或-OR11；R7是-OR11、磷酸酯部分或磷酸酯连接部分；且R11各自独立地是H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)亚烷基-OH、(C1-C4)亚烷基-OCH3、(C1-C4)亚烷基-SH、(C1-C4)亚烷基-SCH3或(C1-C4)亚烷基-NH2。说明书中描述的具体所述鸟嘌呤PT核苷酸类似物的完整化学结构描绘于下文表3中。
在具体实施方案中，dsRNA分子包括至少一个通式IIb的脱氧鸟苷PT核苷酸类似物，其中(i)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是H；R6是–O-；R7是-OH；且R9是H或苯甲酰基(分别化合物33和34)；(ii)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是H；R6是-OH；R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R9是H或苯甲酰基(分别化合物35、35a、35b、36、或36a和36b)；(iii)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是H；R6是–O-，R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R9是H或苯甲酰基(分别化合物37、37a、37b、或38、38a和38b)
在具体实施方案中，dsRNA分子包括至少一个通式IIb的鸟苷PT类似物，其中(iv)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是OH；R6是–O-；R7是-OH；且R9是H或苯甲酰基(分别化合物39和40)；(v)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是OH；R6是-OH；R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R9是H或苯甲酰基(分别化合物41、41a、41b、或42、42a和42b)；(vi)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是OH；R6是–O-，R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R9是H或苯甲酰基(分别化合物43,43a,43b,或44,44a和44b)；
在具体实施方案中，dsRNA分子包括至少一个通式IIb的鸟苷PT类似物，其中(vii)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是OCH3；R6是–O-；R7是-OH；且R9是H或苯甲酰基(分别化合物45和46)；(viii)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是OCH3；R6是-OH；R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R9是H或苯甲酰基(分别化合物47、47a、47b、或48、48a和48b)；(ix)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是OCH3；R6是–O-，R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R9是H或苯甲酰基(分别化合物49、49a、或50、50a和50b)；
在具体实施方案中，dsRNA分子包括至少一个通式IIb的鸟苷PT类似物，其中(x)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是O(CH2)2OCH3；R6是–O-；R7是-OH；且R9是H或苯甲酰基(分别化合物51和52)；(xi)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是O(CH2)2OCH3；R6是-OH；R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R9是H或苯甲酰基(分别化合物53、53a、53b、或54、54a和54b)；(xii)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是O(CH2)2OCH3；R6是–O-，R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R9是H或苯甲酰基(化合物55、55a、55b、或56、56a和56b)；
在具体实施方案中，dsRNA分子包括至少一个通式IIb的鸟苷PT类似物，其中(xiii)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是F；R6是–O-；R7是-OH；且R9是H或苯甲酰基(分别化合物57和58)；(xvi)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是F；R6是-OH；R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R9是H或苯甲酰基(分别化合物59、59a、59b、或60、60a和60b)；(xv)R1是NHR9；R2和R4是H；R3是O；R5是F；R6是–O-，R7是-[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-或-[O-PO2(BH3)]2-；且R9是H或苯甲酰基(分别化合物61、61a、61c、或62、62a和62b)。
表3：鉴定为化合物33-62的鸟苷和脱氧鸟苷PT核苷酸类似物
*以上化合物中的-[O-PO3]2-可被另一磷酸酯部分，包括例如磷酸酯连接部分、硫代磷酸三酯部分[-[O-PO2S]2-](a)或-[O-PO2(BH3)]2-(b)取代。磷酸酯连接部分是-[O-P(O)(R')]--，其中R'是O-、S-、BH3-或N-，优选是O-、S-或BH3-，更优选是O-，以及是所述连接部分的质子化形式。
在dsRNA分子的一些实施方案中，正义链包含至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链包含至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物。在一些实施方案中，正义链和反义链各自包含至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物。在各种实施方案中，正义链的5’末端包含选自化合物3、7、9、13、15、19、21、25、27或31的通式IIa的PT类似物。在各种实施方案中，反义链的5’末端包含选自化合物3、7、9、13、15、19、21、25、27或31的通式IIa的PT类似物。在各种实施方案中，正义链的5’末端包含选自化合物33、37、39、43、45、49、51、55、57或61的通式IIb的PT类似物。
在各种实施方案中，正义链的3’末端包含选自化合物5、11、17、23或29的通式IIa的PT类似物。在各种实施方案中，反义链的3’位包含选自化合物5、11、17、23或29的通式IIa的PT类似物。在各种实施方案中，正义链的3’位包含选自化合物35、41、47、53或59的通式IIb的PT类似物。在各种实施方案中，反义链的3’位包含选自化合物35、41、47、53或59的通式IIb的PT类似物。
在各种实施方案中，正义链在内部位置中包含选自化合物7、13、19、25或31的通式IIa的PT类似物。在各种实施方案中，反义链在内部位置中包含选自化合物7、13、19、25或31的通式IIa的PT类似物。在各种实施方案中，正义链在内部位置中包含选自化合物37、43、49、55或61的通式IIb的PT类似物。在各种实施方案中，反义链在内部位置中包含选自化合物37、43、49、55或61的通式IIb的PT类似物。在一些实施方案中，内部位置包括正义链的18位。
本文公开的各种核苷类似物可根据本领域中已知的任何适合技术或程序合成，且优选包括在合成步骤期间存在的胺和/或羟基保护基。
在一些实施方案中，dsRNA包括一个或多个修饰的核苷酸，所述核苷酸选自具有天然存在或合成修饰的碱基者。天然存在的碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷酸的修饰的碱基包括肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤和其它烷基腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、脱氧假尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、核糖-2-硫代尿苷、核糖-4-硫代尿苷、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-巯基烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其它8-取代的腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其它取代的鸟嘌呤、其它氮杂和去氮杂腺嘌呤、其它氮杂和去氮杂鸟嘌呤、5-甲基核糖尿苷、5-三氟甲基尿嘧啶、5-甲基核糖胞嘧啶和5-三氟胞嘧啶。在一些实施方案中，寡聚物中的一个或多个核苷酸被肌苷取代。
在一些实施方案中，双链分子进一步包含至少一个选自由具有糖修饰、碱基修饰或核苷酸间键联修饰的核糖核苷酸组成的组的修饰的核糖核苷酸，且可含有DNA和修饰的核苷酸，如LNA(锁定核酸)、ENA(亚乙基桥接的核酸)、L-DNA或L-RNA、PNA(肽核酸)、阿拉伯糖苷、膦酰基羧酸酯或膦基羧酸酯核苷酸(PACE核苷酸)或具有6碳糖的核苷酸。
修饰的脱氧核糖核苷酸包括例如5’OMe DNA(5-甲基-脱氧核糖鸟苷-3'-磷酸酯)、PACE(3'膦酰基乙酸脱氧核糖腺苷、3'膦酰基乙酸脱氧核糖胞苷、3'膦酰基乙酸脱氧核糖鸟苷、3'膦酰基乙酸脱氧核糖胸苷)。
桥接的核酸包括LNA(3'单磷酸2'-O,4'-C-亚甲基桥接的核酸腺苷、3'单磷酸2'-O,4'-C-亚甲基桥接的核酸5-甲基-胞苷、3'单磷酸2'-O,4'-C-亚甲基桥接的核酸鸟苷、3'单磷酸5-甲基-尿苷(或胸苷))；和ENA(3'单磷酸2'-O,4'-C-亚乙基桥接的核酸腺苷、3'单磷酸2'-O,4'-C-亚乙基桥接的核酸5-甲基-胞苷、3'单磷酸2'-O,4'-C-亚乙基桥接的核酸鸟苷、3'单磷酸5-甲基-尿苷(或胸苷))。
核苷酸/寡核苷酸的所有类似物或修饰都是如本文所公开加以采用，前提是所述类似物或修饰不实质上不利影响所述核苷酸/寡核苷酸的性质，例如功能。可接受的修饰包括糖部分的修饰、碱基部分的修饰、核苷酸间键联的修饰及其组合。
糖修饰包括糖残基的2’部分上的修饰且涵盖氨基、氟基、烷氧基(例如甲氧基)、烷基、氨基、氟基、氯基、溴基、CN、CF、咪唑、羧酸酯基、硫代酸酯基、C1-C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF3、OCN、O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2、N3；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基或取代的硅烷基，如尤其在欧洲专利EP 0 586 520 B1或EP 0 618 925 B1中所述。
在一个实施方案中，修饰的分子包含至少一个在糖部分上包含2’修饰(“2’糖修饰”)的核糖核苷酸。在某些实施方案中，糖修饰的部分包括2’O-烷基或2’-氟基或2’O-烯丙基或任何其它2’修饰。在一些实施方案中，优选2’O-烷基是2’O-甲基(甲氧基)糖修饰。其它稳定化修饰也是可能的(例如末端修饰)。
在一些实施方案中，寡核苷酸的骨架被修饰且包含磷酸-D-核糖实体，但也可含有硫代磷酸-D-核糖实体、三酯、硫代酸酯、2’-5’桥接的骨架(也可被称为2’5’连接的核苷酸或5’-2’)、PACE等。
如本文所用，术语“非配对核苷酸类似物”是指核苷酸类似物，其包含包括但不限于以下的非碱基配对部分：6脱氨基腺苷(水粉蕈素(Nebularine))、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me核糖U、N3-Me核糖T、N3-Me dC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-Me dC。在一些实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物是核糖核苷酸。在其它实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物是脱氧核糖核苷酸。此外，可制备多核苷酸的类似物，其中一个或多个核苷酸的结构被根本上改变且更好地适合作为治疗或实验试剂。核苷酸类似物的一实例是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸酯骨架被类似于肽中所见的骨架的聚酰胺骨架替换。已显示PNA类似物对酶促降解具有抗性且具有增强的体内和体外稳定性。其它修饰包括聚合物骨架、环状骨架、无环骨架、硫代磷酸-D-核糖骨架、三酯骨架、硫代酸酯骨架、2’-5’桥接的骨架、人工核酸、吗啉代核酸、二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、阿拉伯糖苷和镜像核苷(例如替代β-D-脱氧核糖核苷的β-L-脱氧核糖核苷)。包含LNA核苷酸的siRNA化合物的实例公开于Elmen等,(NAR 2005,33(1):439-447)中。
“TNA”是指(L)-α-呋喃苏糖基核苷酸。TNA亚磷酰胺是通过(3'-->2')磷酸二酯键连接于邻近TNA、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。TNA包含四碳糖(Schoning等Science 2000.290:1347-51)。在一些实施方案中，除TNA之外，siRNA化合物也进一步包含至少一个选自由具有糖修饰、碱基修饰或核苷酸间键联修饰的核糖核苷酸组成的组的修饰的核糖核苷酸，且可含有DNA、镜像核苷酸(L-DNA、L-RNA)和修饰的核苷酸，如LNA(锁定核酸)、ENA(亚乙基桥接的核酸)、PNA(肽核酸)、阿拉伯糖苷、膦酰基羧酸酯或膦基羧酸酯核苷酸(PACE核苷酸)或具有6碳糖的核苷酸。
其它修饰包括也称为加帽部分的3’末端修饰。所述末端修饰选自核苷酸、修饰的核苷酸、脂质、肽、糖和反向无碱基部分。所述修饰被例如合并在正义链和/或反义链的3’末端。
有时在本文中称为“无碱基核苷酸”或“无碱基核苷酸类似物”者应更适当地称为假核苷酸或非常规部分。核苷酸是核酸的单体单元，由核糖或脱氧核糖、磷酸和碱基(DNA中的腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；RNA中的腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶)组成。修饰的核苷酸在糖、磷酸和/或碱基的一者或多者中包含修饰。无碱基假核苷酸缺乏碱基，且因此严格来说不是核苷酸。
如本文所用的术语“加帽部分”包括无碱基核糖部分、无碱基脱氧核糖部分、包括2’O烷基修饰的修饰形式无碱基核糖和无碱基脱氧核糖部分；反向无碱基核糖和无碱基脱氧核糖部分及其修饰形式；C6-亚氨基-Pi；镜像核苷酸，包括L-DNA和L-RNA；5’O-Me核苷酸；和核苷酸类似物，包括4',5'-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃赤藓糖基)核苷酸；4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5'-氨基-烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；12-氨基十二基磷酸酯；羟基丙基磷酸酯；1,5-失水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；戊呋喃苏糖基核苷酸；无环3',4'-断核苷酸；3,4-二羟基丁基核苷酸；3,5-二羟基戊基核苷酸、5'-5'-反向无碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；5'-氨基；以及桥接或非桥接甲基膦酸酯和5'-巯基部分。
某些优选加帽部分是无碱基核糖或无碱基脱氧核糖部分；反向无碱基核糖或无碱基脱氧核糖部分；C6-氨基-Pi；镜像核苷酸，包括L-DNA和L-RNA。在一些实施方案中，分子是用一个或多个反向核苷酸，例如反向胸苷或反向腺苷合成(参见例如Takei,等,2002,JBC277(26):23800-06)。在一些实施方案中，反向无碱基脱氧核糖部分被共价连接于正义链(N’)y的5’末端。
“末端官能团”包括卤素、醇、胺、羧酸、酯、酰胺、醛、酮、醚基团。
如本文所用的术语“非常规部分”是指无碱基核糖部分、无碱基脱氧核糖部分、脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、非碱基配对核苷酸类似物和通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键接合于邻近核苷酸的核苷酸；苏糖核酸(TNA)部分；桥接的核酸，包括锁定核酸(LNA)和亚乙基桥接的核酸(ENA)。
无碱基脱氧核糖部分包括例如无碱基脱氧核糖-3’-磷酸酯；1,2-二脱氧-D-呋喃核糖-3-磷酸酯；1,4-脱水-2-脱氧-D-核糖醇-3-磷酸酯。反向无碱基脱氧核糖部分包括反向脱氧核糖无碱基；3’,5’反向脱氧无碱基5’-磷酸酯。
“镜像”核苷酸是与天然存在或通常采用的核苷酸具有逆转手性的核苷酸，即是天然存在的(D-核苷酸)的镜像(L-核苷酸)，也被称为L-RNA(在镜像核糖核苷酸的情况下)和“镜像异构体”。镜像核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸且可进一步包含至少一个糖、碱基和/或骨架修饰。参见美国专利号6,586,238。此外，美国专利号6,602,858公开包含至少一个L-核苷酸取代的核酸催化剂。镜像核苷酸包括例如L-DNA(L-脱氧核糖腺苷-3’-磷酸酯(镜像dA)；L-脱氧核糖胞苷-3’-磷酸酯(镜像dC)；L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸酯(镜像dG)；L-脱氧核糖胸苷-3’-磷酸酯(镜像dT)和L-RNA(L-核糖腺苷-3’-磷酸酯(镜像rA)；L-核糖胞苷-3’-磷酸酯(镜像rC)；L-核糖鸟苷-3’-磷酸酯(镜像rG)；L-核糖尿苷-3’-磷酸酯(镜像dU)。
根据一个方面，本文提供包含未修饰核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸和/或非常规部分和至少一个PT核苷酸类似物的化学修饰的dsRNA分子。在一些实施方案中，化学修饰的dsRNA包含至少一个选自由糖修饰、碱基修饰和核苷酸间键联修饰组成的组的修饰的核苷酸，且可含有修饰的核苷酸，如LNA(锁定核酸)，包括ENA(亚乙基桥接的核酸)；PNA(肽核酸)；阿拉伯糖苷；PACE(膦酰基乙酸酯及其衍生物)或具有六碳糖的核苷酸或选自以下的非常规部分：无碱基核糖部分、无碱基脱氧核糖部分、修饰或未修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸和通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键接合于邻近核苷酸的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核糖核苷酸是2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链中的一些或所有嘧啶包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链中的一些或所有嘌呤包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在优选实施方案中，反义链在核酸酶敏感位置中包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，正义链在核酸酶敏感位置中包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，正义链[例如结构A1中的(N’)y或结构A2中的N2-(N’)y]包含一个或多个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，正义链[例如结构A1中的(N’)y或结构A2中的N2-(N’)y]包含一个或多个脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，在化合物的3’末端，siRNA是钝端，即在由正义链或过客链的3'末端和反义链或引导链的5'末端界定的末端上，dsRNA或siRNA是钝端。
在其它实施方案中，两个链的至少一者具有在3'末端共价连接的具有至少一个核苷酸、核苷酸类似物或非核苷酸部分的3’悬突；在一些实施方案中，所述悬突包含至少一个脱氧核糖核苷酸。至少一个链任选在3'末端包含具有至少一个核苷酸或核苷酸类似物(例如PT核苷酸类似物)的悬突。悬突由约1至约5个核苷酸、核苷酸类似物、非核苷酸部分或其组合组成。
在各种实施方案中，悬突独立地选自核苷酸、非核苷酸及其组合。在某些实施方案中，如果存在，那么各悬突独立地选自核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、PT核苷酸类似物、无碱基脱氧核糖部分、无碱基脱氧核糖部分、C3-氨基-Pi、C4-氨基-Pi、C5-氨基-Pi、C6-氨基-Pi、镜像核苷酸。
在一些实施方案中，Z和/或Z'各自独立地包括C2、C3、C4、C5或C6烷基部分，任选包括C3[丙烷，-(CH2)3-]部分或其衍生物，包括丙醇(C3-OH)、丙二醇、和丙二醇的磷酸二酯衍生物(“C3Pi”)。在优选实施方案中，Z和/或Z'各自包括两个烃部分且在一些实例中，是C3Pi-C3OH或C3Pi-C3Pi。各C3是通过共价键，优选基于磷酸的键共价缀合于邻近C3。在一些实施方案中，基于磷酸的键是硫代磷酸酯、膦酰基乙酸酯或磷酸二酯键。
在一具体实施方案中，x＝y＝19且Z包括C3-C3。在一些实施方案中，C3-C3悬突是通过共价键，例如磷酸二酯键共价连接于(N)x或(N’)y的3’末端。在一些实施方案中，第一C3与第二C3之间的键是磷酸二酯键。在一些实施方案中，3’非核苷酸悬突是C3Pi-C3Pi。在一些实施方案中，3’非核苷酸悬突是C3Pi-C3Ps。在一些实施方案中，3’非核苷酸悬突是C3Pi-C3OH(OH是羟基)。在一些实施方案中，3’非核苷酸悬突是C3Pi-C3OH。
在各种实施方案中，烷基部分包括烷基衍生物，包括包含末端羟基、末端氨基或末端磷酸酯基团的C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基部分。在一些实施方案中，烷基部分是C3烷基或C3烷基衍生物部分。在一些实施方案中，C3烷基部分包括丙醇、丙基磷酸酯、丙基硫代磷酸酯或其组合。
C3烷基部分是通过磷酸二酯键共价连接于(N’)y的3’末端和/或(N)x的3’末端。在一些实施方案中，烷基部分包括丙醇、丙基磷酸酯或丙基硫代磷酸酯。
示例性3’末端C3非核苷酸部分的结构如下：
在一些实施方案中，Z和Z’各自独立地选自丙醇、丙基磷酸酯、丙基硫代磷酸酯、其组合或其多者，具体来说2或3个共价连接的丙醇、丙基磷酸酯、丙基硫代磷酸酯或其组合。在一些实施方案中，当3’末端核苷酸包括2’5’连接的核苷酸时，C3部分可通过磷酸二酯键或其它键连接于糖的2’位。
在一些实施方案中，Z和Z’各自独立地选自丙基磷酸酯、丙基硫代磷酸酯、丙基磷酸-丙醇；丙基磷酸-丙基硫代磷酸酯；丙基磷酸-丙基磷酸酯；(丙基磷酸酯)3、(丙基磷酸酯)2-丙醇、(丙基磷酸酯)2-丙基硫代磷酸酯。任何丙烷或丙醇缀合的部分可包括在Z或Z’中。
在其它实施方案中，Z和/或Z'各自包括无碱基部分和未修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的组合或烃部分和未修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的组合或无碱基部分(脱氧核糖或核糖)和烃部分的组合。在所述实施方案中，Z和/或Z’各自包括C3Pi-rAb或C3Pi-dAb。
RNA双链体的长度是约15至约49个核糖核苷酸、或约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个、优选18-40、18-27、18-25或19至23个核糖核苷酸。在一些实施方案中，各链(寡聚物)的长度独立地选自由约18至约40个核苷酸、优选18至27、18至25、19-23个且更优选19个核糖核苷酸组成的组。
在一些实施方案中，dsRNA的反义链与靶标核酸之间的互补性是完美的。在其它实施方案中，修饰的siRNA化合物的反义链与靶标核酸是实质上互补的，即在所述反义链与所述靶标核酸之间具有一个、两个或多达三个错配。在一些实施方案中，反义链在5’末端核苷酸处与靶标mRNA错配。
在某些实施方案中，dsRNA分子的反义链与正义链之间的互补性是完美的。在一些实施方案中，各链是实质上互补的，即在所述反义链与所述正义链之间具有一个、两个或多达三个错配。在一些实施方案中，反义链完全互补于正义链。
在一些实施方案中，当相较于其中包括5'末端核苷酸的反义链完全互补于靶标mRNA中的连续序列的dsRNA分子时，本文公开的修饰的dsRNA分子展现活性增强。
本文公开的化学修饰有益地应用于适用于抑制或减弱哺乳动物和非哺乳动物基因表达的双链RNA。
dsRNA寡核苷酸
在一个方面中，提供双链核糖核酸分子，其中：
(a)所述核糖核酸分子包括正义链和反义链，其中各链的长度独立地是15至49个核苷酸；
(b)所述正义链和/或所述反义链包括至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物；
(c)所述反义链的15至49个核苷酸的序列互补于靶标基因的mRNA的序列；且
(d)所述正义链的15至49个核苷酸的序列互补于所述反义链且包括靶标基因的mRNA的15至49个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，反义链完全互补于靶标基因的mRNA的序列，且正义链和反义链完全互补。因此，本文提供一种以下在结构A1中阐述的双链核糖核酸分子：
(A1) 5’ (N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y-z” 5’ (正义链)
其中N和N’各自是可未修饰或修饰的核糖核苷酸、或非常规部分；
其中N或N’的至少一者包括吡唑并三嗪核苷酸类似物；
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续N或N’是通过共价键接合于下一N或N’的寡核苷酸；
其中Z和Z’各自独立地存在或不存在，但如果存在，那么独立地包括在它所存在于其中的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合、或维生素或药物部分；
其中z”可存在或不存在，但如果存在，那么是在(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分、维生素或药物部分；
其中x和y各自独立地是在15与49之间的整数；且
其中(N’)y的序列互补于(N)x的序列且其中(N)x的至少一部分互补于靶标RNA中的连续序列；前提是并非各N和N’都是脱氧核糖核苷酸。
在一些实施方案中，接合各连续N或N’的共价键是磷酸二酯键。
在一些实施方案中，x＝y且x和y各自是19、20、21、22或23。在各种实施方案中，x＝y＝19。
在一些实施方案中，正义链包含至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链包含至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物。在一些实施方案中，正义链和反义链各自包含至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物。
在一些实施方案中，正义链中的所有腺苷核苷酸都被腺苷和/或脱氧腺苷吡唑并三嗪核苷酸类似物取代。在一些实施方案中，反义链中的所有腺苷核苷酸都被腺苷和/或脱氧腺苷吡唑并三嗪核苷酸类似物取代。在一些实施方案中，正义链中和反义链中的所有腺苷核苷酸都被腺苷和/或脱氧腺苷吡唑并三嗪核苷酸类似物取代。
在一些实施方案中，正义链中的所有鸟苷核苷酸都被鸟苷和/或脱氧鸟苷吡唑并三嗪核苷酸类似物取代。在一些实施方案中，反义链中的所有鸟苷核苷酸都被鸟苷和/或脱氧鸟苷吡唑并三嗪核苷酸类似物取代。在一些实施方案中，正义链中和反义链中的所有鸟苷核苷酸都被鸟苷和/或脱氧鸟苷吡唑并三嗪核苷酸类似物取代。
在各种实施方案中，双链核糖核酸分子在引导链(反义链)的5’末端核苷酸处包含与靶标mRNA的错配。因此，在各种实施方案中，提供一种具有以下结构A2的双链核糖核酸分子：
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’(反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y-z” 5’(正义链)
其中N2、N和N’各自是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中N1、N2、N或N’的至少一者包括吡唑并三嗪核苷酸类似物；
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续N或N’是通过共价键接合于邻近N或N’的寡核苷酸；
其中x和y各自独立地是在17与24之间的整数；
其中(N’)y的序列互补于(N)x的序列且(N)x包含互补于靶标RNA中的连续序列的反义序列；
其中N1共价结合于(N)x且与所述靶标RNA错配或是与所述靶标RNA互补的DNA部分；
其中N1是选自由天然或修饰的尿苷、脱氧核糖尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷、脱氧腺苷、腺苷吡唑并三嗪核酸类似物、脱氧腺苷吡唑并三嗪核酸类似物组成的组的部分；
其中z”可存在或不存在，但如果存在，那么是在N2-(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分、维生素或药物部分；且
其中Z和Z’各自独立地存在或不存在，但如果存在，那么独立地是在它所存在于其中的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸、连续非核苷酸部分或其组合、或维生素或药物部分；前提是并非各N和N’都是脱氧核糖核苷酸。
在各种实施方案中，双链核糖核酸在正义链、反义链或正义链和反义链中包含至少一个腺苷核糖核苷酸被式IIa的脱氧核糖腺苷PT核苷酸类似物或腺苷PT核苷酸类似物取代，且进一步包含以下修饰的一者或多者：
在反义链[(N)x或N1-(N)x)]的5’末端的5、6、7、8或9位的至少一者中的苏糖核酸部分、2’5’连接的核苷酸或镜像核苷酸；
在正义链[(N’)y或N2-(N’)y)]的5’末端的9或10位的至少一者中的苏糖核酸部分、2’5’连接的核苷酸或假尿苷；
在正义链[(N’)y或N2-(N’)y)]的3’末端或倒数第二位置的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个苏糖核酸部分或2’5’连接的核苷酸。
在结构A1或A2的一些实施方案中，(N’)y的序列完全互补于(N)x的序列。在(A1)和A2的各种实施方案中，N2-(N’)y的序列完全互补于N1-(N)x的序列。在一些实施方案中，(N)x包含完全互补于靶标RNA中的约17至约24个连续核苷酸的反义序列。
在一些实施方案中，N1选自脱氧腺苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷，且其中靶标RNA中的配对核苷酸中的核苷酸是尿苷。在优选实施方案中，N1选自脱氧腺苷或脱氧尿苷。在一些实施方案中，N1和N2在尿苷或脱氧尿苷与腺苷或脱氧腺苷之间形成碱基对。在其它实施方案中，N1和N2在脱氧尿苷与腺苷之间形成碱基对。
下表表4提供N1和相应N2的实例。
表4
表4的代号：dA-脱氧腺苷；rA-腺苷，ptrA-腺苷PT核苷酸类似物，ptdA-脱氧腺苷PT核苷酸类似物，rC-胞苷，rG-鸟苷，U-尿苷，dU-脱氧尿苷，dT-胸苷，rT-核糖胸苷(5’甲基尿苷)
在(A2)的一些实施方案中，N1包括尿苷或腺苷。在某些实施方案中，N2包括2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，N1包括2’OMe糖修饰的核糖尿苷且N2包括腺苷或修饰的腺苷。在一些实施方案中，N1包括腺苷且N2包括核糖尿苷或修饰的核糖尿苷。在一些实施方案中，Z和Z’不存在。在其它实施方案中，存在Z或Z’之一。
在一些实施方案中，N和N’各自是未修饰核糖核苷酸。在一些实施方案中，N或N’的至少一者包括化学修饰的核糖核苷酸或非常规部分。在一些实施方案中，非常规部分选自镜像核苷酸、无碱基核糖部分和无碱基脱氧核糖部分。在一些实施方案中，非常规部分是镜像核苷酸，优选是L-DNA部分。在一些实施方案中，N或N’的至少一者包括2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中，(N’)y的序列完全互补于(N)x的序列。在其它实施方案中，(N’)y的序列实质上互补于(N)x的序列。
结构A1和A2适用于与哺乳动物或非哺乳动物基因进行任何寡核苷酸配对(正义链和反义链)。在一些实施方案中，哺乳动物基因是人基因。
在一些实施方案中，当相较于对照化合物，即其中反义寡核苷酸完全互补(包括5’末端核苷酸碱基配对，例如A-U、U-A、C-G、G-C)于靶标mRNA中的核苷酸序列的siRNA化合物时，具有结构A2的修饰的siRNA化合物展现有益性质，包括活性增强(例如IC50降低、敲低增加、残余mRNA降低)。在一些实施方案中，当相较于对照化合物时，活性增强至少5％、至少10％、至少20％、至少25％或25％以上。
在另一方面，提供一种产生由正义链和反义链组成的双链RNA分子的方法，其包括以下步骤
a)选择靶标RNA中的连续18至40个核苷酸的序列且合成包含与所述靶标mRNA的所述连续18至40个核苷酸的序列的互补性的反义链，其中所述反义链的5’末端核苷酸被尿苷、修饰的尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷、修饰的腺苷、脱氧腺苷或修饰的脱氧腺苷取代；
b)合成18至40个核苷酸的与所述反义链具有互补性的正义链，其中所述正义链的3’末端核苷酸与所述引导链的所述5’末端核苷酸形成沃森克里克碱基对；以及
c)使所述反义链和所述正义链退火；由此产生双链RNA分子。
在一些实施方案中，在反义链的5’末端核苷酸与靶标mRNA的3’末端核苷酸之间未产生rG:rU摆动。
根据一个实施方案，提供一种产生由正义链和反义链组成的，当相较于未修饰或类似修饰的双链RNA分子时，展现RNAi活性增强的双链RNA分子的方法，其包括以下步骤
a)选择靶标mRNA中的连续18至40个核苷酸的序列且合成包含所述靶标mRNA的所述连续18至40个核苷酸的序列的正义链，其中3’末端核苷酸被腺苷、修饰的腺苷、脱氧腺苷或修饰的脱氧腺苷取代；
b)合成18至40个核苷酸的与所述正义链具有互补性的反义链，其中5’末端核苷酸包含核糖尿苷、修饰的核糖尿苷、脱氧核糖尿苷或修饰的脱氧核糖尿苷且与所述过客链的所述3’末端核苷酸碱基配对；
c)使所述正义链退火于所述反义链；由此产生具有增强的RNAi活性的双链RNA分子。
在一些实施方案中，当相较于未修饰的siRNA双链体，即与靶标mRNA完全匹配的双链体时，修饰的双链RNA分子展现RNAi活性增强。
根据另一方面，本文提供一种产生由正义链和反义链组成的，当相较于未修饰的双链RNA分子时展现RNAi活性增强的修饰的双链RNA分子的方法，其包括以下步骤
a)选择靶标mRNA中的连续18至40个核苷酸的序列且合成包含所述靶标mRNA的所述连续18至40个核苷酸的序列的正义链，其中3’末端核苷酸被腺苷、修饰的腺苷、脱氧腺苷或修饰的脱氧腺苷取代；
b)合成18至40个核苷酸的与所述正义链具有互补性的反义链，其中5’末端核苷酸包含核糖尿苷、修饰的核糖尿苷、脱氧核糖尿苷或修饰的脱氧核糖尿苷且与所述正义链的所述3’末端核苷酸碱基配对；
c)使所述正义链退火于所述反义链；由此产生具有增强的RNAi活性的双链RNA分子。
在一些实施方案中，步骤a)包括选择靶标细胞中的靶标RNA中的连续18至25个核苷酸、或18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的序列，其中3’末端核苷酸不同于腺苷。
在一些实施方案中，Z和Z’不存在。在其它实施方案中，存在Z或Z’之一。在各种实施方案中，Z和Z’独立地选自核苷酸、非核苷酸及其组合。在某些实施方案中，如果存在，那么Z和Z’各自独立地选自核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、无碱基脱氧核糖部分、无碱基脱氧核糖部分、C3-氨基-Pi、C4-氨基-Pi、C5-氨基-Pi、C6-氨基-Pi、镜像核苷酸。在一些实施方案中，存在Z。在一些优选实施方案中，Z或Z’的至少一者是如本文所述的吡唑并三嗪核苷酸类似物。在其它实施方案中，存在Z'。在其它实施方案中，Z与Z'两者均存在。在一些实施方案中，Z和Z'存在且相同。在其它实施方案中，Z和Z'存在且不同。在一些实施方案中，Z和Z'独立地是1、2、3、4或5个非核苷酸部分或2、3、4或5个非核苷酸部分与核苷酸的组合。在一些实施方案中，Z和/或Z’各自包括通过磷酸二酯键共价连接于siRNA链的3’末端的2个非核苷酸部分。在一些实施方案中，Z和Z’存在且各自独立地包括一个或多个烷基部分和/或其衍生物。在一些实施方案中，N2包括核糖腺苷且N1包括尿苷(核糖尿苷)。
非核苷酸部分选自由无碱基部分、反向无碱基部分、烷基部分或其衍生物以及无机磷酸酯组成的组。在一些实施方案中，非核苷酸部分是烷基部分或其衍生物。在一些实施方案中，烷基部分包含末端官能团，包括醇、末端胺、末端磷酸酯或末端硫代磷酸酯部分。
在一些实施方案中，Z存在且包括一个或多个选自由无碱基部分、反向无碱基部分、烃部分或其衍生物以及无机磷酸酯组成的组的非核苷酸部分。在一些实施方案中，Z存在且包括一个或多个烷基部分和/或其衍生物。
在其它实施方案中，Z'存在且包括一个或多个选自由无碱基部分、反向无碱基部分、烃部分和无机磷酸酯组成的组的非核苷酸部分。在一些实施方案中，Z’存在且包括一个或多个烷基部分和/或其衍生物。
在其它实施方案中，x＝y＝18且Z或Z'存在并独立地包括两个非核苷酸部分，例如C3Pi–C3Pi或C3Pi-C3OH。
在其它实施方案中，x＝y＝18且Z和Z'存在并各自独立地包括两个非核苷酸部分，例如C3Pi–C3Pi或C3Pi-C3OH。
在一些实施方案中，Z和Z'各自包括无碱基部分，例如脱氧核糖无碱基部分(在本文中称为“dAb”)或核糖无碱基部分(在本文中称为“rAb”)。在一些实施方案中，Z和/或Z'各自包括两个共价连接的无碱基部分且是例如dAb-dAb或rAb-rAb或dAb-rAb或rAb-dAb。各部分是通过共价键，优选基于磷酸的键共价缀合于邻近部分。在一些实施方案中，基于磷酸的键是硫代磷酸酯、膦酰基乙酸酯或磷酸二酯键。
在(A1)的一具体实施方案中，x＝y＝19且Z包括C3Pi-C3OH或C3Pi-C3Pi。在一具体实施方案中，x＝y＝19且Z’包括C3Pi-C3OH或C3Pi-C3Pi。在一些实施方案中，C3-C3悬突是通过共价键，例如磷酸二酯键共价连接于(N)x或(N’)y的3’末端。在一些实施方案中，第一C3与第二C3之间的键是磷酸二酯键。
在(A2)的一具体实施方案中，x＝y＝18且Z包括C3Pi-C3OH或C3Pi-C3Pi。在一具体实施方案中，x＝y＝18且Z’包括C3Pi-C3OH或C3Pi-C3Pi。在一些实施方案中，C3-C3悬突是通过共价键，例如磷酸二酯键共价连接于N1-(N)x或N2-(N’)y的3’末端。在一些实施方案中，第一C3与第二C3之间的键是磷酸二酯键。
在各种实施方案中，烷基部分是包含末端羟基、末端氨基、末端磷酸酯基团的C3烷基至C6烷基部分。在一些实施方案中，烷基部分是C3烷基部分。在一些实施方案中，C3烷基部分包括丙醇、丙基磷酸酯、丙基硫代磷酸酯或其组合。
C3烷基部分是通过磷酸二酯键共价连接于(N’)y的3’末端和/或(N)x的3’末端。在一些实施方案中，烷基部分包括丙醇、丙基磷酸酯或丙基硫代磷酸酯。
在其它实施方案中，Z和/或Z'各自包括无碱基部分和未修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的组合或烃部分和未修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的组合或无碱基部分(脱氧核糖或核糖)和烃部分的组合。在所述实施方案中，Z和/或Z’各自包括C3-rAb或C3-dAb。在一些实施方案中，Z或Z’之一包括维生素或药物部分。
在(A2)的优选实施方案中，x＝y＝18，Z’不存在，Z存在且包括通过磷酸二酯键共价连接于彼此的两个烷基部分，N2包括核糖腺苷且N1包括尿苷。
在一些实施方案中，N和N’包括未修饰的核苷酸。在一些实施方案中，N或N’的至少一者包括化学修饰的核糖核苷酸或非常规部分。在一些实施方案中，非常规部分选自由镜像核苷酸、无碱基核糖部分、无碱基脱氧核糖部分、脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、非碱基配对核苷酸类似物、桥接的核酸和通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键接合于邻近核苷酸的核苷酸组成的组。在一些实施方案中，非常规部分是镜像核苷酸，优选是L-DNA部分。在一些实施方案中，N或N’的至少一者是在糖、碱基或接头的一者或多者处被修饰。在某些实施方案中，N或N’的至少一者包括2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。
在优选实施方案中，化学修饰的核糖核苷酸是沿正义链和/或反义链修饰来定位且在双链化合后实现所需性质，包括中靶活性增加和/或脱靶活性降低和/或对核酸酶的稳定性增加。
在具有结构A1和A2的双链核酸分子的一些实施方案中，在(N)x或N1-(N)x的5’末端的5、6、7、8或9位的至少一者中的N选自苏糖核酸(TNA)部分、2’5’连接的核苷酸、镜像核苷酸或其组合。
在(A1)的一些实施方案中，x＝19且(N)x在5位中、在6位中、在7位中、在8位中、在9位中、在5-6位中、在6-7位中、在7-8位中、在8-9位中、在5-7位中、在6-8位中、在7-9位中、在5-8位中、在6-9位中或在5-9位中包含TNA部分。在结构A2的一些实施方案中，x＝18且(A2)的N1-(N)x在5位中、在6位中、在7位中、在8位中、在9位中、在5-6位中、在6-7位中、在7-8位中、在8-9位中、在5-7位中、在6-8位中、在7-9位中、在5-8位中、在6-9位中或在5-9位中包含TNA部分。N1被计数为反义(引导)链的1位(5’>3’)。
在(A1)的一些实施方案中，x＝19且(N)x在5位中、在6位中、在7位中、在8位中、在9位中、在5-6位中、在6-7位中、在7-8位中、在8-9位中、在5-7位中、在6-8位中、在7-9位中、在5-8位中、在6-9位中或在5-9位中包含2’-5’核苷酸。在优选实施方案中，(N)x在5位中、在7位中、在8位中、在9位中、在6-7位中、在7-8位中或在8-9位中包含2’-5’核苷酸。在(A2)的一些实施方案中，x＝18且N1-(N)x在5位中、在6位中、在7位中、在8位中、在9位中、在5-6位中、在6-7位中、在7-8位中、在8-9位中、在5-7位中、在6-8位中、在7-9位中、在5-8位中、在6-9位中或在5-9位中包含2’-5’核苷酸。在优选实施方案中，N1-(N)x在5位中、在7位中、在8位中、在9位中、在6-7位中、在7-8位中或在8-9位中包含2’-5’核苷酸。
在结构A1的一些实施方案中，x＝19且(N)x在5位中、在6位中、在7位中、在8位中、在9位中、在5-6位中、在6-7位中、在7-8位中、在8-9位中、在5-7位中、在6-8位中、在7-9位中、在5-8位中、在6-9位中或在5-9位中包含镜像核苷酸。在一些实施方案中，(A1)的(N)x或(A2)的N1-(N)x在5位中、在6位中、在7位中、在8位中、在9位中、在5-6位中、在6-7位中、在7-8位中、在8-9位中、在5-7位中、在6-8位中、在7-9位中、在5-8位中、在6-9位中或在5-9位中包含镜像核苷酸。
在双链核糖核酸分子的一些实施方案中，在结构A1中的(N’)y或结构A2中的N2-(N’)y的5’末端的9或10位的至少一者中的N’选自苏糖核酸(TNA)部分、2’5’连接的核苷酸、镜像核苷酸或其组合。在不希望受理论束缚下，在正义(过客)链中的9或10位的一者或两者处具有苏糖核酸(TNA)部分、2’5’连接的核苷酸或假尿苷的双链核酸分子赋予中靶活性增加和/或核酸酶稳定性增加。
在(A1)的一些实施方案中，(N’)y在9位中或在10位中或在9-10位中包含苏糖核酸(TNA)部分。在(A2)的一些实施方案中，N2-(N’)y在9位中或在10位中或在9-10位中包含苏糖核酸(TNA)部分。
在(A1)的一些实施方案中，(N’)y在9位中或在10位中或在9-10位中包含2’5’连接的核苷酸。在(A2)的一些实施方案中，N2-(N’)y在9位中或在10位中或在9-10位中包含2’5’连接的核苷酸。
在(A1)的一些实施方案中，(N’)y在9位中或在10位中或在9-10位中包含镜像核苷酸。在(A2)的一些实施方案中，N2-(N’)y在9位中或在10位中或在9-10位中包含假尿苷。
在双链核糖核酸分子的一些实施方案中，N’在结构A1中的(N’)y或结构A2中的N2-(N’)y的4个、5个或6个最3’末端位置包含2’5’连接的核苷酸。在不希望受理论束缚下，在正义(过客)链的3’末端具有多个2’5’连接的核苷酸的双链核酸分子赋予双链体对核酸酶的稳定性增加和/或正义(过客)链的脱靶效应降低。
在(A1)的一些实施方案中，(N’)y在四个最3’末端位置中包含2’5’连接的核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝19且(N’)y在16、17、18和19位中包含2’5’连接的核苷酸。
在结构(A2)的一些实施方案中，N2-(N’)y在四个最3’末端位置中包含2’5’连接的核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝18且N2-(N’)y在16、17、18和19位中包含2’5’连接的核苷酸。
在(A1)的一些实施方案中，(N’)y在五个最3’末端位置中包含2’5’连接的核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝19且(N’)y在15、16、17、18和19位中包含2’5’连接的核苷酸。
在(A2)的一些实施方案中，N2-(N’)y在五个最3’末端位置中包含2’5’连接的核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝18且N2-(N’)y在15、16、17、18和19位中包含2’5’连接的核苷酸。
在(A1)的一些实施方案中，(N’)y在六个最3’末端位置中包含2’5’连接的核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝19且(N’)y在14、15、16、17、18和19位中包含2’5’连接的核苷酸。
在(A2)的一些实施方案中，N2-(N’)y在六个最3’末端位置中包含2’5’连接的核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝19且N2-(N’)y在14、15、16、17、18和19位中包含2’5’连接的核苷酸。
在一些实施方案中，双链核糖核酸分子是siRNA、siNA或miRNA。
双链核糖核酸化合物可进一步在正义链和/或反义链中包含以上提及的修饰和2’OMe糖修饰的核糖核苷酸(包括2’OMe糖修饰的嘧啶和/或嘌呤)的组合。在某些实施方案中，(N)x和(N’)y完全互补。在其它实施方案中，(N)x和(N’)y是实质上互补的。在某些实施方案中，(N)x完全互补于靶标序列。在其它实施方案中，(N)x实质上互补于靶标序列。根据某些优选实施方案，本文提供一种包含一个或多个修饰的核苷酸的修饰的siRNA化合物，其中所述修饰的核苷酸在糖部分中、在碱基部分中或在核苷酸间键联部分中具有修饰。
在根据结构A1和A2的化合物的某些实施方案中，(N)x和(N’)y的各者中的替代性核糖核苷酸是2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，在(N)x中，核苷酸未被修饰或(N)x包含替代性2’OMe糖修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸；且位于N1-(N)x的中间位置处的核糖核苷酸被修饰或未被修饰，优选未被修饰；其中(N’)y包含未修饰的核糖核苷酸，其进一步在末端或倒数第二位置包含一个修饰的核苷酸。
在(A1)的特定实施方案中，x＝y＝19，N1包括未修饰核糖核苷酸，(N)x包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸且位于N1-(N)x的中间处的核糖核苷酸未被修饰。在某些实施方案中，x＝y＝19；在(N)x中，核苷酸在修饰的核糖核苷酸与未修饰的核糖核苷酸之间交替，各修饰的核糖核苷酸是2’OMe糖修饰的核糖核苷酸且位于N1-(N)x的中间位置处的核糖核苷酸未被修饰；N2是通过2’-5’磷酸二酯键接合于(N’)y的3’末端且在(N’)y的3’末端的至少三个核苷酸是2’-5’核苷酸(通过2’5’磷酸二酯键共价连接)。在其它优选实施方案中，x＝y＝19；在(N)x中，核苷酸在修饰的核糖核苷酸与未修饰核糖核苷酸之间交替，各修饰的核糖核苷酸是2’OMe糖修饰的核糖核苷酸且位于N1-(N)x的中间处的核糖核苷酸未被修饰；且在(N’)y的3’末端的五个连续核苷酸是2’5’核糖核苷酸(通过四个2’-5’磷酸二酯键接合)。在一些实施方案中，一个或多个2’5’核糖核苷酸包含3’-OMe糖修饰。
在某些优选实施方案中，x＝y＝19，且在(N’)y中，在至少一个位置中的核苷酸包括镜像核苷酸、脱氧核糖核苷酸和通过2’-5’核苷酸间键接合于邻近核苷酸的核苷酸。
在某些实施方案中，x＝y＝19且(N’)y包含镜像核苷酸。在各种实施方案中，镜像核苷酸是L-DNA核苷酸。在某些实施方案中，L-DNA是L-脱氧核糖胞苷。在一些实施方案中，(N’)y在18位中包含L-DNA。在一些实施方案中，(N’)y在15、16、17、18和19位(5’>3’)中包含2’5’核糖核苷酸。在各种实施方案中，(N)x在5、6、7、8或9位(5’>3’)的一者或多者处进一步包含TNA、L-DNA或2’5’核糖核苷酸。在其中x＝y＝20的其它实施方案中，以上论述的针对(N’)y的修饰在17、18、19、20位上，而不是在14、15、16、17位上。举例来说，在16和17位的一者或两者处的修饰是在20聚体的18或19位的一者或两者上。对于20和22聚体而言，18聚体中的所有修饰都加以类似地调整。
在某些实施方案中，(N’)y在2位中包含L-DNA且在15-19位中包含2’-5’核苷酸间键。
在一些实施方案中，本文公开的修饰的dsRNA分子的链在3’和5’末端均不磷酸化。在其它实施方案中，正义链和反义链在3’末端被磷酸化。在另一实施方案中，使用可裂解或非可裂解的磷酸酯基团使反义链在末端5’末端位置磷酸化。在另一实施方案中，使用可裂解或非可裂解的磷酸酯基团使反义链和正义链的任一者或两者在3’末端位置磷酸化。
结构A1适用于与哺乳动物或非哺乳动物基因，即微生物或病毒基因进行任何寡核苷酸配对(正义链和反义链)。在一些实施方案中，哺乳动物基因是人基因。寡核苷酸序列对的实例提供于颁予本公开的共同受让人且以引用的方式整体并入本文的PCT专利公布号WO 2006/023544、WO 2007/084684、WO 2008/050329、WO 2007/141796、WO 2009/044392、WO 2008/106102、WO 2008/152636、WO 2009/001359、WO/2009/090639中。
除非另外指示，否则在本文论述的结构的优选实施方案中，各连续N与N’之间的共价键是磷酸二酯键。除非另外指示，否则在本文论述的结构的优选实施方案中，N1与(N)x之间以及N2与(N’)y之间的共价键是磷酸二酯键。在一些实施方案中，至少一个共价键是硫代磷酸酯键。
对于以上所有结构，在一些实施方案中，(N)x的寡核苷酸序列完全互补于(N’)y的寡核苷酸序列。在其它实施方案中，反义链和正义链是实质上互补的。在某些实施方案中，(N)x完全互补于哺乳动物mRNA或微生物RNA或病毒RNA的一部分。在其它实施方案中，(N)x实质上互补于哺乳动物mRNA或微生物RNA或病毒RNA的一部分。
在一些实施方案中，当相较于其中N1互补于靶标mRNA中的核苷酸的dsRNA化合物时，具有结构(A2)的修饰的dsRNA化合物展现有益性质，包括至少活性增强。
进一步提供一种包含有效下调哺乳动物或非哺乳动物基因表达的量的本文公开的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物、及其治疗本文公开的任一疾病和病症的用途。在一些实施方案中，哺乳动物基因是人基因。在一些实施方案中，非哺乳动物基因与哺乳动物疾病，优选人疾病有关。
进一步提供用于治疗或预防有需要的受试者的本文公开的任一疾病或病状的发生或严重性或用于降低本文公开的疾病或病状的风险或严重性的方法，其中所述疾病或病状和/或与其相关的症状或风险与哺乳动物或非哺乳动物基因的表达相关，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文公开的核酸化合物或其药学上可接受的盐。在一优选实施方案中，受试者是人受试者。本文提供用于疗法的双链核酸分子。
在另一方面，提供用于下调靶标基因表达的根据本文所述的任何实施方案的双链核糖核酸分子和包含所述分子的组合物，其中所述靶标基因是哺乳动物或非哺乳动物靶标基因。
进一步提供根据本文所述的任何实施方案的双链核糖核酸分子或包含所述分子的组合物制造用于疗法中的药剂的用途。
siRNA合成
使用公开和专有算法，产生潜在双链RNA分子的正义和反义序列。
根据以上说明书的dsRNA分子是基本上如本文所述加以制备。修饰的核酸分子是通过本领域中熟知的用于合成核糖核酸(或脱氧核糖核酸)寡核苷酸的任何方法来合成。合成通常在可商购获得的合成仪(尤其可自Applied Biosystems获得)中进行。寡核苷酸合成例如描述于Beaucage和Iyer,Tetrahedron 1992；48:2223-2311；Beaucage和Iyer,Tetrahedron 1993；49:6123-6194以及Caruthers等,Methods Enzymol.1987；154:287-313中；硫代酸酯的合成尤其描述于Eckstein,Ann.Rev.Biochem.1985；54:367-402中，RNA分子的合成描述于Sproat,Humana Press 2005(由Herdewijn P.编)；Kap.2:17-31中且相应下游过程尤其描述于Pingoud等,IRL Press 1989(由Oliver R.W.A.编)；Kap.7:183-208中。
其它合成程序在本领域中是已知的，例如Usman等,1987,J.Am.Chem.Soc.,109,7845；Scaringe等,1990,NAR.,18,5433；Wincott等,1995,NAR.23,2677-2684；和Wincott等,1997,Methods Mol.Bio.,74,59中所述的程序可利用常见核酸保护和偶联基团，如在5′末端的二甲氧基三苯甲基和在3′末端的亚磷酰胺。根据需要并入修饰的(例如2′-O-甲基化)核苷酸和未修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，单独合成本文公开的寡核苷酸且例如通过连接(Moore等,1992,Science 256,9923；Draper等,国际专利公布号WO93/23569；Shabarova等,1991,NAR 19,4247；Bellon等,1997,Nucleosides&Nucleotides,16,951；Bellon等,1997,BioconjugateChem.8,204)，或通过在合成和/或脱保护之后杂交来在合成后接合在一起。
可使用本领域中熟知的方法(例如参见美国专利号6,121,426)连接各对化学合成的重叠片段。各链是单独合成且接着在管中彼此退火。接着，通过HPLC使双链siRNA与未退火的单链寡核苷酸(例如由于它们的一者过量)分离。关于本文公开的修饰的dsRNA分子，可合成两个或更多个所述序列且连接在一起以供使用。
在各种实施方案中，一些dsRNA分子具有在反义链的5'末端共价结合的与靶标mRNA中的核苷酸错配的末端部分。在结构(A2)的一些实施方案中，反义链中的N1(5’末端核苷酸)和/或正义链的N2(3’末端核苷酸)被取代以产生修饰的双链RNA化合物。在各种实施方案中，在反义链的5'末端的部分选自由核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、修饰的核糖尿苷、修饰的脱氧核糖尿苷、脱氧核糖胸苷、修饰的脱氧核糖胸苷、核糖胞嘧啶、腺嘌呤PT类似物组成的组，且在正义链的3'末端的部分选自核糖核苷酸或修饰的核糖核苷酸或非常规部分。公开的结构有益地应用于适用于抑制或减弱哺乳动物和非哺乳动物基因表达的双链RNA。
在一个实施方案中，提供下调哺乳动物或非哺乳动物靶标基因的表达的双链核糖核酸(例如dsRNA或siRNA)。双链核糖核酸分子在正义链和/或反义链上包含至少一个TNA。在一些实施方案中，正义链包含源于靶标RNA序列的核苷酸序列，且反义链互补于正义链。一般来说，与靶标mRNA序列的某一偏差被容许而不损害siRNA活性(参见例如Czauderna等,2003,NAR 31(11),2705-2716)。本发明的dsRNA在转录后水平上在破坏或不破坏mRNA下抑制基因表达。在不受理论束缚下，dsRNA可靶向mRNA用于特异性裂解和降解和/或可抑制自靶向的信息翻译。
在一个方面，提供核糖核酸分子，其中a)所述核糖核酸分子包括正义链和反义链；b)各链的长度独立地是15至49个核苷酸；(c)所述反义链的15至49个核苷酸的序列互补于靶标RNA的序列；d)所述正义链或所述反义链的至少一者包括TNA部分；且e)所述正义链的15至49个核苷酸的序列互补于所述反义链的序列且包括靶标RNA的15至49个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，反义链和反义链具有相同长度。在一些实施方案中，反义链和正义链的长度是18-25或18-23或18-21或19-21或19个核苷酸。
在一些实施方案中，反义链在5’末端的5、6、7、8或9位的至少一者中包括苏糖核酸部分；和/或正义链在5’末端的9或10位的至少一者中包括苏糖核酸部分；和/或正义链在3’末端或倒数第二位置包括1至10个苏糖核酸部分。
在一些实施方案中，反义链在5’末端的5、6、7、8或9位的至少一者中包括苏糖核酸部分；且正义链在5’末端的9或10位的至少一者中包括苏糖核酸部分、2’5’连接的核苷酸或假尿苷；且正义链在3’末端或倒数第二位置包括1至10个苏糖核酸部分。
在一些实施方案中，反义链在5’末端的5、6、7、8或9位的至少一者中包括苏糖核酸部分；且正义链在5’末端的9或10位的至少一者中包括苏糖核酸部分、2’5’连接的核苷酸或假尿苷；且正义链在3’末端或倒数第二位置包括4至6个2’5’连接的核苷酸。
在一些实施方案中，反义链在5’末端的5、6、7、8或9位的至少一者中包括苏糖核酸部分、2’5’连接的核苷酸或镜像核苷酸；且正义链在5’末端的9或10位的至少一者中包括苏糖核酸部分；和/或正义链在3’末端或倒数第二位置包括1至10个苏糖核酸部分或4-6个2’5’连接的核苷酸。
药物组合物
尽管有可能的是本文公开的核酸分子以化合物本身形式(即以裸露dsRNA形式)或以化合物本身的药学上可接受的盐形式施用，但优选的是以药物组合物形式呈现它们。因此，本文提供一种包含一种或多种本文公开的修饰的dsRNA分子；以及药学上可接受的载体的药物组合物。此外，本文提供一种包含一种或多种呈药学上可接受的盐形式的本文公开的修饰的dsRNA分子；以及药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含两种或更多种本文公开的修饰的dsRNA分子或其药学上可接受的盐。
进一步提供包含有效抑制/下调靶标基因表达的量的至少一种共价或非共价结合于一种或多种本文公开的核酸分子的本文公开的核糖核酸分子；以及药学上可接受的载体的药物组合物。分子可由内源性细胞复合物在细胞内加工以产生一种或多种本文公开的核酸分子(例如38聚体双链体可被加工成两个19聚体双链体)。
进一步提供包含药学上可接受的载体和有效下调靶标基因在细胞中的表达的量的一种或多种本文公开的核酸化合物，例如包含序列实质上互补于靶标RNA中的连续序列的反义链的双链RNA化合物的药物组合物
在一些实施方案中，靶标基因是哺乳动物基因。在一些实施方案中，靶标基因是非哺乳动物基因。
在一些实施方案中，本文公开的修饰的dsRNA分子或其药学上可接受的盐是药物组合物中的主要活性组分。在其它实施方案中，本文公开的修饰的dsRNA分子或其药学上可接受的盐是含有两种或更多种治疗剂的药物组合物的一种活性组分。在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含一种或多种下调一种或多种靶标基因的dsRNA分子。
进一步提供一种制备药物组合物的方法，其包括：提供一种或多种本文公开的修饰的dsRNA分子或其药学上可接受的盐；以及混合所述化合物与药学上可接受的载体。
在一优选实施方案中，用于制备药物组合物的本文公开的修饰的dsRNA分子或其药学上可接受的盐是以药学上有效剂量与载体混合。在一些实施方案中，本文公开的修饰的dsRNA分子可缀合于类固醇或脂质或另一适合分子，例如缀合于胆固醇、维生素A、维生素E等。
也提供包括如本文提供的核酸分子或其药学上可接受的盐的用于向患者施用或分配所述核酸分子的试剂盒、容器和制剂。试剂盒可包括至少一个容器和至少一个标签。适合容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由如玻璃、金属或塑料的多种材料形成。在一个实施方案中，容器容纳如本文公开的核酸分子。试剂盒可进一步包括相关指示和/或说明书；也可包括用于所述目的的试剂和其它组合物或工具。
容器可或者容纳包含有效治疗、诊断、预测或防治病状的活性剂的组合物且可具有无菌入口(例如容器可为具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的活性剂可为如本文公开的单链或双链核酸分子或其药学上可接受的盐。
试剂盒可进一步包括第二容器，其包括药学上可接受的缓冲液且可进一步包括就商业和使用者观点来看合乎需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、搅拌器、针、注射器和/或具有使用指示和/或使用说明的药品说明书。
容纳核酸分子的容器可包括有标签的包装，且所述标签可携有呈由例如食品和药物管理局的政府机构指定的形式的告示，所述告示反映制造、使用或销售其中供人施用的核酸分子由所述机构根据联邦法律加以核准。
dsRNA分子可自两个单独寡核苷酸链装配，其中一个链是正义链且另一链是反义链，其中所述反义链和所述正义链是自身互补的(即各链包括互补于另一链中的核苷酸序列的核苷酸序列)；如其中所述反义链和所述正义链形成具有如本文对于如所提供的核酸分子所述的任何长度和结构的双链体或双链结构，例如其中双链区域(双链体区域)是约17至约40个碱基对(例如约17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基对)；所述反义链包括互补于靶标核酸分子或其一部分中的核苷酸序列的核苷酸序列且所述正义链包括对应于所述靶标核酸序列或其一部分的核苷酸序列(例如本文核酸分子的约17至约40个或40个以上核苷酸互补于所述靶标核酸或其一部分)。
在某些方面和实施方案中，本文提供的双链核酸分子(例如siNA分子)可为“RISC长度”分子或可为如以下更详细所述的Dicer底物。
已广泛报道对应于已知基因的siRNA的选择和合成(参见例如Ui-Tei等,J Biomed Biotech.2006；2006:65052；Chalk等,BBRC.2004,319(1):264-74；Sioud和Leirdal,Met.Mol Biol.；2004,252:457-69；Levenkova等,Bioinform.2004,20(3):430-2；Ui-Tei等,NAR.2004,32(3):936-48；De Paula等,RNA 2007,13:431-56)。
对于使用和产生修饰的siRNA的实例，参见例如Braasch等,Biochem.2003,42(26):7967-75；Chiu等,RNA,2003,9(9):1034-48；PCT公布WO 2004/015107(atugen AG)和WO 02/44321(Tuschl等)。美国专利号5,898,031和6,107,094描述化学修饰的寡聚物。美国专利公布号2005/0080246和2005/0042647分别涉及具有替代性基序的寡聚化合物和具有化学修饰的核苷间键联的核酸分子。
已公开其它修饰。显示包括5'-磷酸酯部分会增强siRNA在果蝇胚胎中的活性(Boutla,等,Curr.Biol.2001,11:1776-1780)且为siRNA在人HeLa细胞中起作用所需(Schwarz等,Mol.Cell,2002,10:537-48)。Amarzguioui等(NAR,2003,31(2):589-95)显示siRNA活性取决于2’-O甲基修饰的定位。Holen等(NAR.2003,31(9):2401-07)报道相较于野生型，具有少数2’-O甲基修饰的核苷的siRNA产生良好活性，但当2’-O甲基修饰的核苷的数目增加时，活性降低。Chiu和Rana(RNA.2003,9:1034-48)描述相对于未修饰的siRNA，在正义链或反义链(完全修饰的链)中并入2’-O甲基修饰的核苷严重降低siRNA活性。报道在反义链上的5'末端放置2’-O甲基会严重限制活性，而在反义链的3'末端以及在正义链的两个末端进行放置被容许(Czauderna等,NAR.2003,31(11):2705-16；WO 2004/015107)。本文公开的分子提供优势，因为它们是稳定且具有活性的，且适用于制备用于治疗各种疾病的药物组合物。
属于本公开的共同受让人且据此以引用的方式整体并入本文的PCT专利公布号WO 2008/104978、WO 2009/044392、WO 2011/066475和WO 2011/084193公开dsRNA结构。
属于本公开的共同受让人的PCT公布号WO 2008/050329和US号11/978,089涉及促细胞凋亡基因的抑制剂，且以引用的方式整体并入本文。
PCT专利公布号WO 2004/111191和WO 2005/001043涉及用于增强RNAi的方法。
本文提供一种使靶标基因的表达相较于对照下调至少20％、30％、40％或50％的方法，其包括使所述靶标基因的mRNA转录物与一种或多种本文公开的化合物接触。
本文另外提供一种使靶标基因在哺乳动物中的表达相较于对照下调至少20％、30％、40％或50％的方法，其包括向所述哺乳动物施用一种或多种本文公开的dsRNA分子。在一优选实施方案中，哺乳动物为人类。
在各种实施方案中，根据结构(A1)或结构(A2)的双链核酸分子下调靶标基因的表达，借此下调靶标基因的表达选自包含以下的组：下调基因功能(此尤其例如通过用天然基因/多肽的已知相互作用物进行酶促测定或结合测定来考查)、下调基因的多肽产物(此尤其例如通过蛋白质印迹、ELISA或免疫沉淀来考查)和下调基因的mRNA表达(此尤其例如通过RNA印迹、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交来考查)。
剂量
本文提供的化合物和组合物的待施用的适用剂量和特定施用模式将视如以下的因素而变化：细胞类型、或对于体内使用而言年龄、重量和特定受试者及其待治疗的区域、所用的特定核酸和递送方法、设想的治疗或诊断用途以及制剂形式，例如裸露dsRNA、混悬液、乳液、胶束或脂质体，如将易于为本领域技术人员显而易知。通常，剂量是在较低水平下施用且增加直至达成所需作用。
当脂质用于递送核酸时，施用的脂质化合物的量可变化且通常取决于所施用的核酸的量。举例来说，脂质化合物与核酸的重量比优选是约1:1至约30:1，其中约5:1至约10:1的重量比是更优选的。
出于本文目的的“治疗有效剂量”是根据如本领域中已知的考虑因素来确定。剂量必须有效达成改良，包括但不限于存活率改良或更快速康复、或症状改善或减轻或消除和如由本领域技术人员选作适当量度的其它指标。本文公开的dsRNA分子或药物组合物可以单次剂量或以多次剂量施用。
核酸分子的适合剂量单位可在每天每千克接受者体重0.001至0.25毫克的范围内、或在每天每千克体重0.01至20微克的范围内、或在每天每千克体重0.01至10微克的范围内、或在每天每千克体重0.10至5微克的范围内、或在每天每千克体重0.1至2.5微克的范围内。
可引入适量核酸分子，且这些量可使用标准方法凭经验确定。细胞环境中的个别核酸分子物质的有效浓度可为约1飞摩尔浓度、约50飞摩尔浓度、100飞摩尔浓度、1皮摩尔浓度、1.5皮摩尔浓度、2.5皮摩尔浓度、5皮摩尔浓度、10皮摩尔浓度、25皮摩尔浓度、50皮摩尔浓度、100皮摩尔浓度、500皮摩尔浓度、1纳摩尔浓度、2.5纳摩尔浓度、5纳摩尔浓度、10纳摩尔浓度、25纳摩尔浓度、50纳摩尔浓度、100纳摩尔浓度、500纳摩尔浓度、1微摩尔浓度、2.5微摩尔浓度、5微摩尔浓度、10微摩尔浓度、100微摩尔浓度或100微摩尔浓度以上。
适用于哺乳动物的剂量可为每千克体重0.01ug至1g(例如每千克0.1ug、0.25ug、0.5ug、0.75ug、1ug、2.5ug、5ug、10ug、25ug、50ug、100ug、250ug、500ug、1mg、2.5mg、5mg、10mg、25mg、50mg、100mg、250mg或500mg)。
数量级为每天每千克体重约0.1mg至约140mg的剂量水平适用于治疗以上指示的病状(每天每名受试者约0.5mg至约7g)。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量视所治疗宿主和特定施用模式而变化。剂量单位形式通常含有约0.1mg至约500mg之间的活性成分。剂量单位可调整用于局部递送，例如用于玻璃体内递送或用于经鼓室递送。
应了解的是用于任何特定受试者的具体剂量水平取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、膳食、施用时间、施用途径以及排泄速率、药物组合和经受疗法的特定疾病的严重性。
包括本文公开的核糖核酸分子的药物组合物可每日一次、每日四次、每日三次、每日两次、每日一次，或在任何间隔下且持续在医学上适当的任何持续时间施用。然而，治疗剂也可以含有在适当间隔下整天施用的两次、三次、四次、五次、六次或六次以上亚剂量的剂量单位来给药。在那个情况下，各亚剂量中含有的核酸分子可相应地较少以实现总体每日剂量单位。剂量单位也可被混配成历经数天的单次剂量，例如使用历经数天时期提供持续和一致dsRNA释放的常规持续释放制剂。持续释放制剂在本领域中是熟知的。剂量单位可含有相应多次每日剂量。组合物可以多个核酸单位的总和共同含有足够剂量的方式加以混配。
递送
本文公开的修饰的dsRNA分子是以化合物本身形式(即以裸露siRNA形式)或以药学上可接受的盐形式施用，且单独或作为与一种或多种药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和媒介物组合的活性成分进行施用。在一些实施方案中，dsRNA分子是通过直接施用与载体或稀释剂一起制备的裸露分子来递送至靶标组织中。
术语“裸露siRNA”是指不含任何用于协助、促进或有助于进入细胞中的递送媒介物，包括病毒序列、病毒粒子、脂质体制剂、脂质转染剂或沉淀剂等的siRNA分子。举例来说，PBS中的siRNA是“裸露siRNA”。
药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和媒介物以及植入载体通常是指不与本文公开的活性修饰的dsRNA分子反应的惰性无毒固体或液体填充剂、稀释剂或囊封物质且它们包括脂质体和微球体。举例来说，本文公开的dsRNA分子可与聚乙烯亚胺(PEI)、PEI衍生物(例如分支PEI的油酸和硬脂酸改性衍生物)、壳聚糖或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)一起配制。在例如脂质体、微球体或纳米球体和纳米粒子中配制组合物可增强稳定性且有益于吸收。
另外，组合物可包括人工氧载体，如全氟化碳(PFC)，例如全氟溴辛烷(潘氟隆(perflubron))。
适用于与本文公开的dsRNA分子联合的递送系统的实例包括美国专利号5,225,182；5,169,383；5,167,616；4,959,217；4,925,678；4,487,603；4,486,194；4,447,233；4,447,224；4,439,196和4,475,196。许多所述植入物、递送系统和模块为本领域技术人员所熟知。在一个具体实施方案中，选择表面和经皮制剂。
因此，在一些实施方案中，本文公开的dsRNA分子是以脂质体制剂和脂质转染剂制剂等形式递送且可通过为本领域技术人员所熟知的方法制备。所述方法例如描述于以引用的方式并入本文的美国专利号5,593,972、5,589,466和5,580,859中。
已开发尤其旨在增强和改进siRNA向哺乳动物细胞中的递送的递送系统(参见例如Shen等FEBS Let.539:111-114(2003)；Xia等,Nat.Biotech.20:1006-1010(2002)；Reich等,Mol.Vision 9:210-216(2003)；Sorensen等,J.Mol.Biol.327:761-766(2003)；Lewis等,Nat.Gen.32:107-108(2002)和Simeoni等,NAR 31,11:2717-2724(2003))。siRNA已成功用于抑制灵长类动物中的基因表达。
用于改进本文公开的化合物的递送的其它制剂可包括非配制化合物、共价结合于胆固醇的化合物和结合于靶向性抗体的化合物(Song等,Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAsvia cell-surface receptors,Nat Biotechnol.2005.23(6):709-17)。胆固醇缀合的siRNA(和其它类固醇和脂质缀合的siRNA)可用于递送(参见例如Soutschek等Nature.2004.432:173-177；以及Lorenz等Bioorg.Med.Chem.Lett.2004.14:4975-4977)。
裸露siRNA或包含本文公开的化学修饰的dsRNA的药物组合物是根据良好医学规范，在考虑个别患者的临床病状、待治疗的疾病、施用部位和方法、施用时程、患者年龄、性别、体重和医学从业者已知的其它因素下来施用和给药。
本文公开的修饰的dsRNA分子可通过任何常规施用途径来施用。修饰的dsRNA分子是经口、皮下或胃肠外施用，包括静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜內、眼内、经眼、经耳、经鼓室和鼻内施用、气管内滴注和气管内吸入以及输注技术。化合物的植入物也是适用的。
制备液体形式用于侵袭性施用(例如注射)或用于表面或局部或非侵袭性施用。术语注射包括皮下、经皮、静脉内、肌肉内、鞘内、眼内、经鼓室和其它胃肠外施用途径。液体组合物包括具有和不具有有机共溶剂的水溶液、水性或油性混悬液、具有可食用油的乳液以及类似药用媒介物。在一特定实施方案中，施用包括静脉内施用。
在一些实施方案中，配制本文公开的化合物用于非侵袭性施用。在一些实施方案中，本文公开的化合物被配制成用于向耳进行表面施用的滴耳剂。在一些实施方案中，本文公开的dsRNA分子被配制成用于向眼表面进行表面施用的滴眼剂。关于施用本文公开的dsRNA分子的其它信息可见于Tolentino等,Retina 2004.24:132-138；以及Reich等,Molecular Vision,2003.9:210-216中。此外，在某些实施方案中，使本文公开的组合物形成为例如用于鼻内施用的气雾剂。在某些实施方案中，使本文公开的组合物形成为例如用于鼻内滴注的滴鼻剂。在一些实施方案中，组合物被配制成滴耳剂。
本文公开的治疗组合物是优选通过吸入含有这些组合物/化合物的气溶胶，或通过鼻内或气管内滴注所述组合物来向肺中施用。对于关于经肺递送药物组合物的其它信息，参见Weiss等,Human GeneTherapy 1999.10:2287-2293；Densmore等,Molecular therapy 1999.1:180-188；Gautam等,Molecular Therapy 2001.3:551-556；以及Shahiwala和Misra,AAPS PharmSciTech 2004.24；6(3):E482-6。另外，siRNA的呼吸道制剂描述于美国专利申请公布号2004/0063654中。siRNA的呼吸道制剂描述于美国专利申请公布号2004/0063654中。
在某些实施方案中，经口组合物(如片剂、混悬液、溶液)可有效用于局部递送至口腔中，如适于嗽口以治疗口腔粘膜炎的经口组合物。
在一特定实施方案中，配制本文公开的修饰的dsRNA分子用于静脉内施用来向肾递送以治疗肾病症，例如急性肾衰竭(ARF)、移植物功能恢复延迟(DGF)和糖尿病性视网膜病变。应注意的是向肾近端小管中的靶标细胞递送修饰的dsRNA分子特别有效治疗ARF和DGF。
向脑中递送化合物是通过若干方法来达成，如尤其神经外科植入、血脑屏障破坏、脂质介导的转运、载体介导的流入或流出、血浆蛋白质介导的转运、受体介导的转胞吞、吸收性介导的转胞吞、在血脑屏障处的神经肽转运、和用于药物靶向的遗传工程化“特洛伊木马(Trojan horse)”。以上方法是例如如“Brain Drug Targeting:the future ofbrain drug development”,W.M.Pardridge,Cambridge University Press,Cambridge,UK(2001)中所述来执行。
此外，在某些实施方案中，使本文公开的用于治疗的组合物形成为例如用于鼻内施用的气雾剂。
已用如加兰他敏(galantamine)以及加兰他敏的各种盐和衍生物的乙酰胆碱酯酶抑制剂实现鼻内递送来治疗CNS疾病，例如如美国专利申请公布号2006003989和PCT申请公布号WO 2004/002402和WO 2005/102275中所述。例如通过鼻内滴注滴鼻剂来鼻内递送核酸以治疗CNS疾病已例如描述于PCT申请公布号WO 2007/107789中。
治疗方法
在一个方面，本文提供一种治疗处于与靶标基因表达相关的病症的风险下或罹患与靶标基因表达相关的病症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文公开的修饰的dsRNA分子或其药学上可接受的盐。在优选实施方案中，所治疗的受试者是温血动物且具体来说是包括人的哺乳动物。进一步提供本文公开的dsRNA分子或其药学上可接受的盐制造用于疗法中的药剂的用途。
“治疗受试者”是指向所述受试者施用有效改善与疾病相关的症状，减轻严重性或治愈所述疾病，减缓所述疾病的进展，防止所述疾病发生或延迟所述疾病发作的治疗物质。“治疗”是指治疗性治疗与防治性或预防性措施两者，其中目标在于预防病症，延迟所述病症发作或减轻病症的症状。需要治疗者包括已经受疾病或病状者、倾向于患有疾病或病状者、和其中疾病或病状待预防者。本文公开的化合物是在疾病或病状发作之前、期间或之后施用。
“治疗有效剂量”是指化合物或药物组合物有效达成受试者或他的生理系统的改良的量，所述改良包括但不限于存活率改良、更快速康复、症状改善或消除、病症发作延迟、疾病进展减缓和由本领域技术人员酌情选择的其它指标。
“呼吸病症”是指呼吸系统的病状、疾病或综合征，包括但不限于所有类型的肺病症，尤其包括慢性阻塞性肺病(COPD)、气肿、慢性支气管炎、哮喘和肺癌。气肿和慢性支气管炎可作为COPD的一部分或独立发生。在各种实施方案中，提供适用于预防或治疗有需要的受试者的原发性移植物失败、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、肺再植入反应和/或在器官移植之后的原发性移植物功能障碍(PGD)(特别是在肺移值中)的方法和组合物。
“微血管病症”是指影响微观毛细管和淋巴的任何病状，特别是血管痉挛疾病、血管炎疾病和淋巴闭塞性疾病。微血管病症的实例尤其包括：眼病症，如一时性黑蒙(Amaurosis Fugax)(栓塞性或继发于SLE)、apla综合征、Prot CS和ATIII缺乏症、由静脉内药物使用引起的微血管病变、异常蛋白血症、颞动脉炎、缺血性视神经病变(ION)、非动脉炎性缺血性视神经病变(NAION)、前部缺血性视神经病变(AION)、视神经炎(原发性或继发于自体免疫性疾病)、青光眼、冯希佩尔-林道(von Hippel Lindau)综合征、角膜疾病、角膜移植物排斥白内障、伊尔斯氏病(Eales'disease)、霜样树枝状血管炎、环状捆扎手术、葡萄膜炎(包括扁平部睫状体炎)、脉络膜黑素瘤、脉络膜血管瘤、视神经形成不全；视网膜病状，如视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、早产视网膜病变、HIV视网膜病变、普尔夏视网膜病变(Purtscherretinopathy)、全身性血管炎和自体免疫性疾病的视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变、放射视网膜病变、分支视网膜动脉或静脉阻塞、特发性视网膜血管炎、动脉瘤、视神经网膜炎、视网膜栓塞、急性视网膜坏死、鸟枪弹样视网膜脉络膜病变(Birdshotretinochoroidopathy)、长期存在的视网膜脱离；全身性病状，如糖尿病、糖尿病性视网膜病变(DR)、糖尿病相关的微血管病变(如本文所详述)、高粘稠度综合征、主动脉弓综合征和眼缺血性综合征、颈内动脉海绵窦瘘、多发性硬化症、全身性红斑狼疮、具有SS-A自体抗体的小动脉炎、急性多灶性出血性血管炎、由感染所致的血管炎、由白塞氏病(disease)所致的血管炎、类肉瘤病、凝血病变、神经病变、肾病变、肾微血管疾病和尤其缺血性微血管病状。
微血管病症可包括新血管组成部分。术语“新血管病症”是指其中血管形成(新血管化)对患者有害的那些病状。眼新血管化的实例包括：视网膜疾病(糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黃斑水肿、慢性青光眼、视网膜脱离和镰状细胞视网膜病变)；虹膜发红；增生性玻璃体-视网膜病变；炎症性疾病；慢性葡萄膜炎；赘瘤(成视网膜细胞瘤、假神经胶质瘤和黑素瘤)；福斯氏异色虹膜睫状体炎(Fuchs'heterochromic iridocyclitis)；新血管青光眼；角膜新血管化(炎症性、移植和虹膜发育不全)；在组合玻璃体切除术和晶状体切除术之后的新血管化；血管疾病(视网膜缺血、脉络膜血管供血不足、脉络膜血栓形成和颈动脉缺血)；视神经新血管化；和归因于眼穿透或挫伤性眼损伤的新血管化。在各种实施方案中，所有这些新血管病状都是使用本文公开的化合物和药物组合物治疗。
“眼疾病”是指眼的病状、疾病或综合征，包括但不限于涉及脉络膜新血管化(CNV)的任何病状、湿性和干性AMD、眼组织胞浆菌病综合征、血管样纹、布鲁赫氏膜(Bruch’s membrane)的破坏、近视变性、眼肿瘤、视网膜退化性疾病和视网膜静脉阻塞(RVO)。在各种实施方案中，根据本文公开的定义视为微血管病症或眼疾病或两者的本文公开的病状(如DR)是根据本文公开的方法来治疗。
纤维化病症包括肝纤维化、肺纤维化、心脏纤维化、肾纤维化、骨髓纤维化、眼纤维化和子宫纤维化；全身性纤维化和由损伤或手术所致的纤维化。纤维化病症包括肝纤维化、肝损坏和肝硬化；包括肺纤维化(包括IPF特发性肺纤维化)的肺纤维化、导致肾纤维化的任何病状(例如CKD，包括ESRD)、腹膜纤维化、原纤维生成、其它器官的纤维化疾病、与所有可能类型的皮肤损伤(偶然性和医源性(手术))相关的异常疤痕(疤痕疙瘩)；硬皮病；心脏纤维化、青光眼滤过手术失败；和肠粘连。
更具体来说，本文提供适用于治疗罹患或易患以下疾病的受试者的方法和组合物：成人呼吸窘迫综合征(ARDS)；慢性阻塞性肺病(COPD)；急性肺损伤(ALI)；气肿；糖尿病性神经病变、肾病变和视网膜病变；糖尿病性黃斑水肿(DME)和其它糖尿病性病状；青光眼；年龄相关的黄斑变性(AMD)；骨髓移植(BMT)视网膜病变；缺血性病状；眼缺血性综合征(OIS)；肾病症：急性肾衰竭(ARF)、移植物功能恢复延迟(DGF)、移植物排斥；听觉病症(包括听觉损失)；脊髓损伤；口腔粘膜炎；干眼综合征和褥疮；由缺血性或缺氧性病状(如高血压、高血压性脑血管疾病、血管缩窄或堵塞-如发生在血栓或栓子情况下、血管瘤、血质不调、任何形式的心脏功能损害，包括心脏停止或衰竭、全身性低血压)引起的神经病症；CNS的中风、疾病、病症和损伤，包括不限于癫痫、脊髓损伤、脑损伤和神经退化性病症，包括不限于帕金森氏病(Parkinson’s disease)、肌萎缩性侧索硬化(ALS，卢格里格氏病(Lou Gehrig's Disease))、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、亨廷顿氏病和任何其它疾病诱发的痴呆(例如像HIV相关的痴呆)；美尼尔氏病；由暴露于毒性剂引起的神经病症。
本文提供适用于治疗癌症的核酸化合物、药物组合物和方法。术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长不受调控的生理病状。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。所述癌症的其它实例包括肾癌或肾脏癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胃肠基质肿瘤(GIST)、胰腺癌、头颈部癌、成胶质细胞瘤、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、泡膜细胞瘤、男性细胞瘤(arrhenoblastomas)、肝细胞瘤、血液学恶性肿瘤(包括非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)、多发性骨髓瘤和急性血液学恶性肿瘤)、子宫内膜或子宫癌、子宫内膜异位、纤维肉瘤、绒毛膜癌、唾液腺癌、阴门癌、甲状腺癌、食道癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、黑素瘤、皮肤癌、许旺氏细胞瘤(Schwannoma)、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、甲状腺癌、维尔姆氏肿瘤(Wilm's tumor)以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级成免疫细胞性NHL；高级成淋巴细胞性NHL；高级小非分裂细胞NHL；巨大肿块疾病NHL；套膜细胞淋巴瘤；AIDS相关的淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia))；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成骨髓细胞性白血病；和移植后淋巴组织增生性病症(PTLD)以及与瘢痣病、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯氏综合征(Meigs'syndrome)相关的异常血管增生。如本文所用的“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性或良性)以及所有癌前和癌性细胞和组织。
另外，提供一种使靶标基因的表达相较于对照下调至少20％、30％、40％或50％的方法，其包括使靶标mRNA与一种或多种本文公开的修饰的dsRNA分子接触。在各种实施方案中，修饰的dsRNA分子使靶标基因下调，借此下调选自包含以下的组：下调基因功能、下调多肽和下调mRNA表达。
本文提供一种使靶标基因的表达相较于对照抑制至少20％、30％或40％，优选50％、60％或70％，更优选75％、80％或90％的方法，其包括使所述靶标基因的mRNA转录物与一种或多种本文公开的dsRNA分子接触。
在一个实施方案中，本文公开的修饰的dsRNA分子抑制靶标基因多肽，借此抑制选自包含以下的组：抑制功能(此例如尤其通过用天然基因/多肽的已知相互作用物进行酶促测定或结合测定来考查)、抑制靶标蛋白质(此尤其例如通过蛋白质印迹、ELISA或免疫沉淀来考查)和抑制靶标mRNA表达(此尤其例如通过RNA印迹、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交来考查)。
在其它实施方案中，提供一种治疗罹患或易患伴有哺乳动物或非哺乳动物靶标基因的水平升高的任何疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括以治疗有效剂量向所述受试者施用本文公开的修饰的dsRNA分子或其药学上可接受的盐，由此治疗所述受试者。
本文提供用于疗法中，特别是供在下调哺乳动物或非哺乳动物靶标基因的表达是有益的情况下使用的双链核酸分子。
就“暴露于毒性剂”而言，其是指使所述毒性剂可为哺乳动物所用，或与哺乳动物接触。毒性剂可对神经系统有毒。暴露于毒性剂可通过直接施用，例如通过摄取或施用食物、药品或治疗剂(例如化学治疗剂)，因偶然性污染或通过环境暴露(例如空气或水性暴露)来发生。
在其它实施方案中，本文公开的化学修饰的dsRNA分子和方法适用于治疗或预防受试者的其它疾病和病状的发生或严重性。这些疾病和病状包括但不限于中风和中风样状况(例如脑、肾、心脏衰竭)、神经元细胞死亡、在或不在再灌注情况下的脑损伤、脊髓损伤、慢性退化性疾病，例如神经退化性疾病，包括阿茲海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多发性硬化症、脊髓延髓萎缩、朊病毒疾病和由创伤性脑损伤(TBI)所致的细胞凋亡。在另一实施方案中，本文公开的化合物和方法涉及提供神经保护和/或脑保护。
不加限制地，哺乳动物靶标基因选自由以下组成的组：p53(TP53)、TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2(胱天蛋白酶(Caspase)2)、NOX3、HRK；C1QBP、BNIP3、MAPK8；Rac1、GSK3B、CD38、STEAP4、BMP2a；GJA1、TYROBP、CTGF、SPP1、RTN4R、ANXA2、RHOA、DUOX1、SLC5A1、SLC2A2、AKR1B1、SORD、SLC2A1、MME、NRF2、SRM、REDD2(RTP801L)、REDD1(RTP801)、NOX4、MYC、PLK1、ESPL1、HTRA2、KEAP1、p66、ZNHIT1、LGALS3、CYBB(NOX2)、NOX1、NOXO1、ADRB1、HI 95、ARF1、ASPP1、SOX9、FAS、FASLG、人MLL、AF9、CTSD、CAPNS1、CD80、CD86、HES1、HES5、HEY1、HEY2、CDKN1B(p27)、ID1、ID2、ID3、CDKN2A、胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶14、Apaf-1、Nod1、Nod2、Ipaf、DEFCAP、RAIDD、RICK、Bcl10、ASC、TUCAN、ARC、CLARP、FADD、DEDD、DEDD2、隐热蛋白(Cryopirin)、PYC1、热蛋白(Pyrin)、TRADD、UNC5a、UNC5b、UNC5c、ZUD、p84N5、LRDD、CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK9、PITSLREA、CHK2、LATS1、Prk、MAP4K1、MAP4K2、STK4、SLK、GSK3α、GSK3β、MEKK1、MAP3K5(Ask1)、MAP3K7、MAP3K8、MAP3K9、MAP3K10、MAP3K11、MAP3K12、DRP-1、MKK6、p38、JNK3、DAPK1、DRAK1、DRAK2、IRAK、RIP、RIP3、RIP5、PKR、IRE1、MSK1、PKCα、PKCβ、PKCδ、PKCε、PKCη、PKCμ、PKCθ、PKCξ、CAMK2A、HIPK2、LKB1、BTK、c-Src、FYN、Lck、ABL2、ZAP70、TrkA、TrkC、MYLK、FGFR2、EphA2、AATYK、c-Met、RET、PRKAA2、PLA2G2A、SMPD1、SMPD2、SPP1、FAN、PLCG2、IP6K2、PTEN、SHIP、AIF、AMID、细胞色素c、Smac、HtrA2、TSAP6、DAP-1、FEM-、DAP-3、粒酶B、DIO-1、DAXX、CAD、CIDE-A、CIDE-B、Fsp27、Ape1、ERCC2、ERCC3、BAP31、Bit1、AES、亨廷顿蛋白(Huntingtin)、HIP1、hSir2、PHAP1、GADD45b、GADD34、RAD21、MSH6、ADAR、MBD4、WW45、ATM、mTOR、TIP49、双泛素(diubiquitin)/FAT10、FAF1、p193、Scythe/BAT3、Amida、IGFBP-3、TDAG51、MCG10、PACT、p52/RAP、ALG2、ALG3、早老素(presenelin)-1、PSAP、AIP1/Alix、ES18、mda-7、p14ARF、ANT1、p33ING1、p33ING2、p53AIP1、p53DINP1、MGC35083、NRAGE、GRIM19、载脂蛋白(lipocalin)2、生殖糖蛋白(glycodelin)A、NADE、Porimin、STAG1、DAB2、半乳糖凝集素(Galectin)-7、半乳糖凝集素-9、SPRC、FLJ21908、WWOX、XK、DKK-1、Fzd1、Fzd2、SARP2、轴抑制蛋白(axin)1、RGS3、DVL1、NFkB2、IkBα、NF-ATC1、NF-ATC2、NF-ATC4、zf3/ZNF319、Egr1、Egr2、Egr3、Sp1、TIEG、WT1、Zac1、Icaros、ZNF148、ZK1/ZNF443、ZNF274、WIG1、HIVEP1、HIVEP3、Fliz1、ZPR9、GATA3、TR3、PPARG、CSMF、RXRa、RARa、RARb、RARg、T3Ra、Erβ、VDR、GR/GCCR、p53、p73α、p63(人[taα、taβ、taγ、daα、aβ、daγ]、53BP2、ASPP1、E2F1、E2F2、E2F3、HIF1α、TCF4、c-Myc、Max、Mad、MITF、Id2、Id3、Id4、c-Jun、c-Fos、ATF3、NF-IL6、CHOP、NRF1、c-Maf、Bach2、Msx2、Csx、Hoxa5、Ets-1、PU1/Spi1、Ets-2、ELK1、TEL1、c-Myb、TBX5、IRF1、IRF3、IRF4、IRF9、AP-2α、FKHR、FOXO1A、FKHRL1、FOXO3a、AFX1、MLLT7、Tip60、BTG1、AUF1、HNRPD、TIA1、NDG1、PCBP4、MCG10、FXR2、TNFR2、LTbR、CD40、CD27、CD30、4-1BB、TNFRSF19、XEDAR、Fn14、OPG、DcR3、FAS、TNFR1、WSL-1、p75NTR、DR4、DR5、DR6、EDAR、TNFα、FAS配体、TRAIL、淋巴细胞毒素(Lymphotoxin)α、淋巴细胞毒素β、4-1BBL、RANKL、TL1、TWEAK、LIGHT、APRIL、IL-1-α、IL-1-β、IL-18、FGF8、IL-2、IL-21、IL-5、IL-4、IL-6、LIF、IL-12、IL-7、IL-10、IL-19、IL-24、IFNα、IFNβ、IFNγ、M-CSF、催乳素(Prolactinm)、TLR2、TLR3、TLR4、MyD88、TRIF、RIG-1、CD14、TCRα、CD3γ、CD8、CD4、CD7、CD19、CD28、CTLA4、SEMA3A、SEMA3B、HLA-A、HLA-B、HLA-L、HLA-Dmα、CD22、CD33、CALL、DCC、ICAM1、ICAM3、CD66a、PVR、CD47、CD2、Thy-1、SIRPa1、CD5、E-钙粘着蛋白(E-cadherin)、ITGAM、ITGAV、CD18、ITGB3、CD9、IgE Fc Rβ、CD82、CD81、PERP、CD24、CD69、KLRD1、半乳糖凝集素1、B4GALT1、C1qα、C5R1、MIP1α、MIP1β、RANTES、SDF1、XCL1、CCCKR5、OIAS/OAS1、INDO、MxA、IFI16、AIM2、iNOS、HB-EGF、HGF、MIF、TRAF3、TRAF4、TRAF6、PAR-4、IKKγ、FIP2、TXBP151、FLASH、TRF1、IEX-1S、Dok1、BLNK、CIN85、Bif-1、HEF1、Vav1、RasGRP1、POSH、Rac1、RhoA、RhoB、RhoC、ALG4、SPP1、TRIP、SIVA、TRABID、TSC-22、BRCA1、BARD1、53BP1、MDC1、Mdm4、Siah-1、Siah-2、RoRet、TRIM35、PML、RFWD1、DIP1、Socs1、PARC、USP7、CYLD、TTR、SERPINH1(HSP47)。其它适用靶标基因是微生物来源的基因，包括病毒、细菌、真菌和支原体基因。
组合疗法
治疗本文公开的疾病的方法包括与另一抑制剂、改良所述修饰的核酸分子的药理学性质的物质、或已知有效治疗罹患或易患任何上文提及的疾病和病症的受试者的另一化合物联合或组合施用本文公开的修饰的双链核酸分子。
在另一实施方案中，提供包含本文公开的治疗性修饰的核糖核酸分子连同至少一种其它治疗活性剂一起的组合的药物组合物。就“与...联合”或“与...组合”而言，其是指在...之前、同时或在...之后。因此，所述组合的个别组分是与同一或单独药物制剂依序或同时施用。
包含与本文所述的修饰的核酸分子和疗法联合的用于治疗微血管病症、眼疾病和病状(例如黄斑变性)、听觉损害(包括听觉损失)、呼吸病症、肾病症、器官移植、神经退化性病症(例如脊髓损伤)、血管生成和细胞凋亡相关病状的已知治疗剂的组合疗法被视为本发明的一部分。
因此，在另一实施方案中，另一药学有效化合物是与本文公开的药物组合物联合施用。此外，本文公开的修饰的核糖核酸分子与第二治疗活性化合物一起用于制备用作辅助疗法的药剂以治疗所述病状。用于与本文公开的化学修饰的核酸分子组合的已知第二治疗剂的适当剂量易于为本领域技术人员所了解。
在一些实施方案中，提供以上提及的组合来以单一药物制剂形式使用。
包含本文公开的任一药学活性dsRNA的药物组合物的施用是通过许多已知施用途径的任一者来进行，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或脑内，如由熟练从业者所确定。使用专门制剂，有可能经口或通过吸入或通过鼻内滴注来施用组合物。在一些实施方案中，配制本文公开的dsRNA分子用于表面施用，包括配制成滴耳剂、滴眼剂、皮肤制剂、经皮制剂等。
就“与...联合”而言，其是指在施用本文公开的分子或药物组合物之前、同时或之后施用另一药学有效化合物。因此，以上提及的所述组合的个别组分可与同一或单独药物制剂依序或同时施用。和本发明的修饰的siRNA化合物的情况一样，第二治疗剂可通过任何适合途径，例如通过经口、经颊、吸入、舌下、经直肠、经阴道、经尿道、经鼻、经耳、经眼、表面、透皮肤(即经皮)或胃肠外(包括静脉内、肌肉内、皮下和冠状动脉内)施用来施用。
在一些实施方案中，本文公开的修饰的核糖核酸分子和第二治疗剂(dsRNA或其它)是通过相同途径，在提供为单一组合物或两种或更多种不同药物组合物下施用。然而，在其它实施方案中，对本文公开的修饰的核酸分子和第二治疗剂使用不同施用途径是可能的或优选的。本领域技术人员了解单独或组合的各治疗剂的最佳施用模式。
在各种实施方案中，本文公开的修饰的核糖核酸分子是药物组合物中的主要活性组分。
在另一方面，提供用于治疗疾病和本文提及的任何疾病和病状的包含两种或更多种dsRNA分子的药物组合物。在一些实施方案中，两种或更多种dsRNA分子或包含所述分子的制剂是以产生相等或另外有益活性的量以药物组合物形式混合。在某些实施方案中，两种或更多种siRNA分子是共价或非共价结合的，或通过长度在2-100、优选2-50或2-30个核苷酸的范围内的核酸接头接合在一起。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物进一步包含一种或多种靶向一种或多种其它基因的其它dsRNA分子。在一些实施方案中，同时抑制所述其它基因会提供用于治疗本文公开的疾病的累加或协同作用。
本发明的治疗方案是根据施用模式、施用时机和剂量来执行，以使患者自本文公开的病状的不利后果的功能性康复得以改良或以便延迟病症发作。本发明的治疗方案是根据施用模式、施用时机和剂量来执行，以使患者自本文公开的病状的不利后果的功能性康复得以改良或以便延迟病症发作。可与载体组合以产生单一剂型的活性成分的量视所治疗宿主和特定施用模式而变化。剂量单位形式通常含有约0.1mg至约500mg之间的活性成分。剂量单位可调整用于局部递送，例如用于玻璃体内递送或用于经鼓室递送。
RNA干扰和siNA分子
RNA干扰是指动物中由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默过程(Zamore等,2000,Cell,101,25-33；Fire等,1998,Nature,391,806；Hamilton等,1999,Science,286,950-951；Lin等,1999,Nature,402,128-129；Sharp,1999,Genes&Dev.,13:139-141；以及Strauss,1999,Science,286,886)。植物中的相应过程(Heifetz等,国际PCT公布号WO 99/61631)常被称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默。转录后基因沉默过程被认为是用于防止外来基因表达的进化保守细胞防御机制(Fire等,1999,Trends Genet.,15,358)。免遭外来基因表达的所述保护可能已响应于源于病毒性感染或转位子元件通过特异性破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA的细胞反应随机整合至宿主基因组中的双链RNA(dsRNA)产生而进化。细胞中存在dsRNA会通过尚待完全表征的机制触发RNAi反应。这个机制似乎不同于涉及双链RNA特异性核糖核酸酶的其它已知机制，如由dsRNA介导的蛋白质激酶PKR和2',5'-寡腺苷酸合成酶活化，从而导致mRNA由核糖核酸酶L非特异性裂解所致的干扰素反应(参见例如美国专利号6,107,094；5,898,031；Clemens等,1997,J.Interferon&Cytokine Res.,17,503-524；Adah等,2001,Curr.Med.Chem.,8,1189)。
细胞中存在长dsRNA会刺激被称为“dicer”的核糖核酸酶III酶的活性(Bass,2000,Cell,101,235；Zamore等,2000,Cell,101,25-33；Hammond等,2000,Nature,404,293)。Dicer涉及于dsRNA被加工成称为siNA或siRNA的短dsRNA片中(Zamore等,2000,Cell,101,25-33；Bass,2000,Cell,101,235；Berstein等,2001,Nature,409,363)。由dicer活性获得的短干扰RNA在长度方面通常是约21至约23个核苷酸且包括约19个碱基对的双链体(Zamore等,2000,Cell,101,25-33；Elbashir等,2001,Genes Dev.,15,188)。Dicer也已牵涉于自具有保守结构的前体RNA切除牵涉于翻译控制中的21-和22-核苷酸小时序RNA(stRNA)中(Hutvagner等,2001,Science,293,834)。RNAi反应也以通常被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物为特征，所述复合物介导序列互补于siRNA双链体的反义链的单链RNA的裂解。靶标RNA的裂解发生在互补于siRNA双链体的反义链的区域中间(Elbashir等,2001,Genes Dev.,15,188)。
已在多种系统中研究RNAi。Fire等,1998,Nature,391,806最先在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中观察到RNAi。Bahramian和Zarbl,1999,Molecular and Cellular Biology,19,274-283以及Wianny和Goetz,1999,Nature Cell Biol.,2,70描述哺乳动物系统中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等,2000,Nature,404,293描述用dsRNA转染的果蝇细胞中的RNAi。Elbashir等,2001,Nature,411,494以及Tuschl等,国际PCT公布号WO 01/75164描述通过在培养的哺乳动物细胞(包括人胚肾和HeLa细胞)中引入合成21-核苷酸RNA的双链体诱导的RNAi。在果蝇胚胎溶解产物中的研究(Elbashir等,2001,EMBO J.,20,6877以及Tuschl等,国际PCT公布号WO 01/75164)已揭示为介导高效RNAi活性所必需的某些siRNA长度、结构、化学组成和序列的要求。
核酸分子(例如具有如本文公开的结构特征)可通过以序列特异性方式介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默来抑制或下调基因表达或病毒复制；参见例如Zamore等,2000,Cell,101,25-33；Bass,2001,Nature,411,428-429；Elbashir等,2001,Nature,411,494-498；以及Kreutzer等,国际PCT公布号WO 00/44895；Zernicka-Goetz等,国际PCT公布号WO 01/36646；Fire,国际PCT公布号WO 99/32619；Mello和Fire,国际PCT公布号WO 01/29058；Li等,国际PCT公布号WO00/44914；Hutvagner和Zamore,2002,Science,297,2056-60；McManus等,2002,RNA,8,842-850。
本发明已以说明性方式描述，且应了解的是所用术语意图具有描述而非限制的用词性质。
鉴于以上教导，本发明的修改和变化是可能的。因此，应了解的是在随附权利要求的范围内，本发明可不同于如具体所述加以实施。
以下参照实施例详细说明本发明，但不应解释为局限于此。
对本文任何文件的引用都不意图认可所述文件是本申请的任何权利要求的可专利性的相关先前技术或所考虑的材料。关于任何文件的内容或日期的任何陈述都是基于在提交时可为申请人所用的信息且不构成认可关于所述陈述的正确性。
实施例
在不进一步详细描述下，据信本领域技术人员可在使用先前描述下在本发明的最大程度上利用本发明。因此，以下优选具体实施方案应解释为仅具有说明性，而不以任何方式限制所要求的本发明。
本文未具体描述的本领域中已知的标准分子生物学方案基本上如以下之中加以大体上遵循：Sambrook等,Molecular cloning:A laboratory manual,Cold Springs Harbor Laboratory,New-York(1989,1992)；以及Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1988)；以及Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；以及Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley&Sons,New York(1988)；以及Watson等,Recombinant DNA,Scientific American Books,New York；以及Birren等(编者)Genome Analysis:A Laboratory Manual Series,第1-4卷Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)以及如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中阐述的方法，且所述文献和专利以引用的方式并入本文。大体上如PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications,AcademicPress,San Diego,CA(1990)中来进行聚合酶链反应(PCR)。原位(细胞中)PCR与流动式细胞测量术组合适用于检测含有特定DNA和mRNA序列的细胞(Testoni等,Blood 1996,87:3822.)。进行RT-PCR的方法也是在本领域中熟知的。
实施例1.产生用于dsRNA靶向基因的正义链和反义链序列以及 产生修饰的核酸分子
使用专有算法和靶标基因的已知序列，产生潜在dsRNA的18和19聚体序列。使用这个方法产生的反义链序列完全或实质上互补于靶标mRNA序列的一部分。在一些实施方案中，反义序列完全互补于相应连续mRNA序列的一部分。为产生一些本文公开的修饰的核酸分子，取代在反义链(N)x的5’末端位置(5’末端)的核苷酸(1位；N1)以产生具有一般性结构(A2)的实施方案的双链核酸分子。在其它实例中，取代在反义链(N)x的5’末端的核苷酸和在正义链(N’)y的3’末端位置(3’末端)的核苷酸以产生具有结构A2的实施方案的双链核酸分子。
一般来说，选择用于体外测试的具有特定序列的双链核酸分子对人和第二物种(如大鼠、小鼠非人灵长类动物或兔)基因具有特异性。
示例性化合物靶向Rac1(智人ras相关的C3肉毒毒素底物1(rho家族，小GTP结合蛋白Rac1))，转录物变体Rac1，mRNA)gi|156071503|ref|NM_006908.4|SEQ ID NO:1；水母EGFP(增强的绿色荧光蛋白)，SEQ ID NO:2；智人v-Ki-ras2柯尔斯顿大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)，转录物变体a，mRNA gi|34485724|ref|NM_033360.2|SEQ ID NO:3；智人v-Ki-ras2柯尔斯顿大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)，转录物变体b，mRNA gi|34485723|ref|NM_004985.3|SEQ ID NO:4；和智人polo样激酶1(果蝇)(PLK1)，mRNAgi|34147632|ref|NM_005030.3|SEQ ID NO:5。本文阐述的实例中利用的dsRNA分子和靶标基因仅具有示例性。本文所述的修饰可适用于靶向任何基因的dsRNA分子。
哺乳动物和非哺乳动物靶标基因的靶标RNA序列的多核苷酸序列可例如在NCBI网站[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]上获得。
实施例2：体外测试修饰的dsRNA分子
在寡核苷酸合成中使用PT亚磷酰胺
通式I吡唑并三唑基核苷类似物以及包含它们的单链寡核苷酸和双链DNA寡核苷酸公开于2012年5月31日提交且颁予本申请的共同受让人Bio-Lab Ltd.,Israel的题为：“吡唑并三唑基核苷类似物和包含它们的寡核苷酸(Pyrazolotriazolyl nucleoside analogues and oligonucleotides comprising them)”的美国临时申请号61/653,528中。
使用建立的固相合成方法，在进行一些修改以使偶联产率最优化下进行本文公开的dsRNA寡核苷酸的合成，所述dsRNA寡核苷酸包括嵌合寡核苷酸，包括RNA、修饰的RNA(即2’-O甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’MOE))和吡唑并三唑基(PT)核苷。
将PT亚磷酰胺并入寡核苷酸中，特别是并入适用于产生包括siRNA和siNA的双链RNA核酸分子的反义链和正义链中。申请人已显示相较于无PT核苷酸类似物的类似修饰的dsRNA分子，包含至少一个PT核苷酸类似物的dsRNA会赋予血清和细胞提取物稳定性以及靶标特异性。
下文表A提供适用于产生dsRNA分子的正义链和反义链。表B-D分别提供对照dsRNA分子、具有至少一个PT核糖核苷酸类似物的dsRNA分子和具有至少一个PT脱氧核苷酸类似物的dsRNA分子。表E提供正义链和反义链的代号。
表A：用于产生dsRNA分子的正义链和反义链的核苷酸序列
表B：对照dsRNA分子
表C：用于产生具有至少一个RNA吡唑并三嗪(ptr)核苷酸类似物的dsRNA分子的合成正义链和反义链
表D：用于产生具有至少一个DNA吡唑并三嗪(ptd)核苷酸类似物的dsRNA分子的合成正义链和反义链
表E：如上文各表中所用的吡唑并三嗪核苷酸类似物、未修饰和修饰的核苷酸/非常规部分的代号。
实施例3：在GFP转染的RAT1细胞中进行dsRNA转染之后对 GFP(绿色荧光蛋白)表达的FACS分析
在6孔板的各孔中，使1.5x105个稳定表达GFP基因的Rat1细胞在1.5mL生长培养基中生长且在37±1℃、5％CO2下孵育约24小时以达成约30-50％汇合。接着使用2000用靶向GFP的dsRNA转染细胞以达到最终转染浓度在0.1-40nM之间的范围内。约48-72小时后，收集细胞且通过FACScaliburTM测量GFP强度并通过CellQuestTM软件进行分析。
使用EZ-RNA试剂盒[Biological Industries(#20-410-100)分离来自收集的细胞的RNA且如下进行反转录：合成cDNA且通过实时qPCR测定GFP mRNA水平并相对于各样本的亲环蛋白(Cyclophilin)A(CYNA，PPIA)mRNA的水平加以标准化。基于dsRNA处理的样本相对于非转染对照样本的GFP mRNA量的比率测定dsRNA活性。
实施例4：psiCHECK TM -2系统中的dsRNA的活性。
制备若干基于psiCHECKTM-2(Promega)的构建体以评估对照和测试dsRNA分子的潜在活性和脱靶活性。psiCHECKTM构建体含有匹配的互补引导链(GS-CM)的单一拷贝或互补于引导(反义；AS)链种子区域(GS-SM)的序列的三个拷贝，所述三个拷贝在它们之间的最优距离下克隆(用于在最严格条件下测试潜在种子介导的脱靶效应)，或“完全感测器”psiCHECKTM构建体含有引导链的“完全感测器”序列的四个串联拷贝，所述序列包括种子区域(AS链的2–8位)、继之以4个非靶标核苷酸的间隔子、且接着继之以AS链的中心区域(13–17位)。psiCHECKTM构建体的DNA测序提供于下文表F中。
表F。
将1.3-1.5x106个人HeLa细胞接种于10cm皮氏培养皿中。在37±1℃、5％CO2孵育器中孵育细胞24小时。在接种后一天用8mL新鲜生长培养基替换生长培养基，且根据制造商方案使用LipofectamineTM2000试剂用一种以上提及的质粒转染各板并在37±1℃和5％CO2下孵育5小时。
在孵育之后，将细胞于80μL生长培养基中在每孔5x103个细胞的最终浓度下再涂铺于96孔板中。十六(16)小时后，使用LipofectamineTM2000，在于100μL最终体积中0.01nM至100nM的范围内的最终浓度下，用dsRNA分子转染细胞。在37±1℃下孵育细胞48小时且如下所述测量海肾和荧光虫荧光素酶活性。
实施例5：测定转染的细胞中的双重荧光素酶活性
psiCHECKTM-2载体使得能够监测融合于海肾荧光素酶报道体基因的靶标序列的表达变化。将dsRNA靶标序列克隆至海肾荧光素酶的3'未翻译区域(3'-UTR)中。因此，测量海肾荧光素酶活性的降低提供一种监测dsRNA的作用的便利方式。此外，psiCHECKTM-2载体含有在不同启动子下转录的第二报道体基因荧光虫荧光素酶，此允许使海肾荧光素酶表达标准化。
在dsRNA转染之后48小时，根据制造商程序，使用Dual-Lucif测定试剂盒(Promega，目录号E1960)测量各dsRNA转染的样本中的海肾和荧光虫荧光素酶活性。海肾荧光素酶活性除以各样本的荧光虫荧光素酶活性值(标准化)。海肾荧光素酶活性最终表示为相对于在用相应psiCHECKTM-2质粒，在不存在dsRNA下转染的细胞中获得的标准化值，测试样本中的标准化活性值的百分比。
图2A、2B、5B和12显示本文所述的若干dsRNA的中靶敲低活性。
图6、7、9和10显示本文所述的各种dsRNA的中靶(AS-CM)和脱靶(AS_SMx3)敲低活性。
图11显示相较于在1位中具有腺苷的类似修饰的dsRNA，在反义(引导)链的1位中具有PT核苷酸类似物的dsRNA分子的特异性增加。
如下确定IC50值：
将约1-2x105个内源性表达靶标基因的人或大鼠细胞接种于1.5mL生长培养基中以达到30-50％汇合。使用LipofectamineTM2000试剂，用双链RNA分子转染细胞以达到在0.0029-100nM之间的最终转染浓度。作为阴性对照，用LipofectamineTM2000试剂或用合成随机化序列非靶向性siRNA在20-100nM的最终浓度下处理细胞。Cy3标记的dsRNA转染的细胞用作转染效率的阳性对照。
在37±1℃、5％CO2下孵育细胞48小时。收集dsRNA转染的细胞且使用EZ-RNA试剂盒(Biological Industries(#20-410-100)分离RNA反转录：进行cDNA合成且通过实时qPCR测定靶标基因mRNA水平并相对于各样本的亲环蛋白A(CYNA，PPIA)mRNA的水平加以标准化。
通过使用用各种最终dsRNA浓度获得的活性结果构建剂量-反应曲线来确定测试的RNAi活性的IC50值。通过相对于转染的dsRNA浓度的对数绘制残余靶标mRNA的量来构建剂量反应曲线。通过使最佳S形曲线与测量数据拟合来计算曲线。
使用表达内源性基因的细胞中的靶标基因的qPCR分析来确定使用特定dsRNA达成的基因表达抑制百分比。
实施例6：血浆和核酸外切酶稳定性测定
血浆稳定性
如下测试本文公开的dsRNA分子在人、大鼠或小鼠血清或人组织提取物中的双链体稳定性：
在37℃下在100％人血清(Sigma目录号H4522)中孵育最终浓度为7uM的dsRNA分子。(100uM siRNA储备物于人血清(1:14.29)或来自各种组织类型的人组织提取物中稀释。)。在不同时间点(例如0、30分钟、1小时、3小时、6小时、8小时、10小时、16小时和24小时)添加五μL(5μL)至15μL 1.5xTBE加载缓冲液中。将样本立刻冷冻在液氮中且保持在-20℃下。
将各样本加载于根据本领域中已知的方法制备的非变性20％丙烯酰胺凝胶上。在紫外光下用溴化乙锭观察dsRNA分子。
图1A、1B和5A显示dsRNA分子在大鼠或小鼠血浆中随时间的稳定性。
核酸外切酶稳定性测定
为研究3’非核苷酸部分对核酸分子的稳定化作用，在自不同细胞类型制备的胞质提取物中孵育正义链、反义链和退火的dsRNA双链体。
提取物：HCT116胞质提取物(12mg/ml)。
提取缓冲液：25mM Hepes(pH＝7.3)，在37℃下；8mM MgCl；150mM NaCl，其中在使用之前即刻新鲜添加1mM DTT。
方法：使3.5ml测试dsRNA(100mM)与含有120mg HCT116胞质提取物的46.5ml混合。46.5ml由12ml HCT116提取物和34.5ml补充有DTT和蛋白酶抑制剂混合物/100(Calbiochem,setIII-539134)的提取缓冲液组成。孵育管中的最终dsRNA浓度是7mM。在37℃下孵育样本，且在指示的时间点将5ml移至新鲜管中，与15ml1XTBE-50％甘油加载缓冲液混合，且快速冷冻在液体N2中。加载缓冲液中的最终siRNA浓度是1.75mM(21ng siRNA/ml)。对于通过天然PAGE和EtBr染色进行分析，每个泳道加载50ng。对于RNA印迹分析，每个泳道加载1ng测试dsRNA。
图3A、4A和4B显示dsRNA分子在细胞提取物中随时间的稳定性。
实施例7：对dsRNA分子的先天性免疫反应：
在室温下使新鲜人血液(在室温下)与无菌0.9％NaCl在1:1比率下混合，且温和加载(1:2比率)在菲科尔(Ficoll)(Lymphoprep，Axis-Shield目录号1114547)上。在摇摆离心机中在室温(22℃，800g)下离心样本30分钟，用RPMI1640培养基洗涤且离心(室温，250g)10分钟。对细胞计数且在最终浓度1.5x106个细胞/ml下接种在生长培养基(RPMI1640+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺+1％青霉素-链霉素)中并在dsRNA处理之前在37℃下孵育1小时。接着根据制造商说明书，使用LipofectamineTM2000试剂(Invitrogen)用测试dsRNA在不同浓度下处理细胞且在37℃下在5％CO2孵育器中孵育24小时。
作为干扰素(IFN)反应的阳性对照，细胞用聚肌苷酸:多胞苷酸(多(I:C))(即作为TLR3配体的双链RNA(dsRNA)合成类似物)(InvivoGen目录号tlrl-pic)在最终浓度0.25-5.0μg/mL下；或TLR 7/8配体噻唑喹诺酮(CLO75)(InvivoGen目录号tlrl-c75)在最终浓度0.075-2μg/mL下处理。用LipofectamineTM2000试剂处理的细胞用作IFN反应的阴性(参照)对照。
在孵育之后约24小时，收集细胞且将上清液转移至新管中。将样本立刻冷冻在液氮中且根据制造商说明书，使用IL-6，DuoSetELISA试剂盒(R&D System DY2060)和TNF-α，DuoSet ELISA试剂盒(R&D System DY210)测试IL-6和TNF-α细胞因子的分泌。自细胞沉淀物提取RNA且通过qPCR测量人基因IFIT1(干扰素诱导的具有三十四肽重复序列1的蛋白质)和MX1(粘病毒(流感病毒)抗性1，干扰素诱导性蛋白质p78)的mRNA水平。将测量的mRNA量相对于参照基因肽基脯氨酰基异构酶A(亲环蛋白A；CycloA)的mRNA量加以标准化。通过比较来自处理的细胞的IFIT1和MX1基因的mRNA的量与它们的来自非处理的细胞的量来评估对IFN信号传导的诱导。qPCR结果是通过QC标准的结果，即标准曲线斜率值在间隔[-4,-3]中，R2>0.99，无引物二聚体。未通过QC要求的结果被取消分析资格。
图8A和8B显示并有本文所述的吡唑并三嗪核苷酸类似物的dsRNA分子不诱导干扰素反应性基因MX1或IFIT1。
实施例8：双链体解链温度(Tm)
所有热变性研究都是使用光程长度1cm的石英比色皿在用于数据收集和分析的与电脑对接的Cary 300紫外/可见分光光度计上进行。将O.D 0.2-0.4的双链体siRNA放置在比色皿中且相同缓冲溶液用作参照。在1℃/min的速率下使温度自20℃至80℃增加和降低。一般来说，当核糖核苷酸被吡唑并三嗪核苷酸类似物置换时，双链体的Tm降低。表G显示若干对照和测试dsRNA分子的Tm。
表G
尽管以上实施例已说明执行本发明的实施方案的特定方式，但实际上本领域技术人员将了解执行本发明的实施方案的未在本文中明确显示的替代性方式。应了解的是本公开应被视为本发明的原理的例示而不意图将本发明限于所说明的实施方案。
本领域技术人员将仅使用常规实验就会认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的等效物。所述等效物意图由以下权利要求涵盖。

Claims (55)

1.一种具有以下一般性结构A1的双链核酸分子：
(A1)  5’ (N)x-Z 3’(反义链)
3’ Z’-(N’)y-z” 5’(正义链)
其中N和N’各自是未修饰核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸或非常规部分，且N或N’的至少一者包括吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物；
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续N或N’是通过共价键接合于下一N或N’的寡核苷酸；
其中Z和Z’各自独立地存在或不存在，但如果存在，那么独立地包括在它所存在于其中的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸、PT核苷酸类似物或非核苷酸部分或其组合、或维生素或药物部分；
其中z”可存在或不存在，但如果存在，那么是在(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分；
其中x和y各自独立地是在15与40之间的整数；且
其中(N’)y的序列互补于(N)x的序列且其中(N)x的至少一部分序列互补于靶标RNA中的连续序列；前提是并非各N和N’都是脱氧核糖核苷酸。
2.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中(N’)y的序列完全互补于(N)x的序列。
3.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中所述反义序列在5’末端N处包含与所述靶标RNA的错配。
4.如权利要求3所述的双链核酸分子，其具有以下一般性结构A2：
(A2)  5’ N1-(N)x-Z 3’(反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y-z” 5’(正义链)
其中N2、N和N’各自是未修饰核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸或非常规部分，且N1、N2N或N’的至少一者包括吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物；
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续N或N’是通过共价键接合于邻近N或N’的寡核苷酸；
其中x和y各自独立地是在17与39之间的整数；
其中N1共价结合于(N)x且与所述靶标RNA错配或是与所述靶标RNA互补的DNA部分；
其中N1是选自由天然尿苷、修饰的尿苷、脱氧核糖尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷、脱氧腺苷、吡唑并三嗪腺苷类似物或吡唑并三嗪脱氧腺苷类似物组成的组的部分；
其中z”可存在或不存在，但如果存在，那么是在N2-(N’)y的5’末端共价连接的加帽部分；
其中Z和Z’各自独立地存在或不存在，但如果存在，那么独立地是在它所存在于其中的链的3’末端共价连接的1-5个连续核苷酸、PT核苷酸类似物、连续非核苷酸部分或其组合、或维生素或药物部分；且
其中(N’)y的序列互补于(N)x的序列且(N)x的序列互补于靶标RNA中的连续序列；前提是并非各N和N’都是脱氧核糖核苷酸。
5.如权利要求1至4中任一项所述的双链核酸分子，其中所述吡唑并三嗪(PT)核苷酸类似物具有通式II
其中
R1和R4各自独立地选自H、卤素、-CN、-SCN、-NO2、-O-烃基、-S-烃基、-CO-H、-CO-烃基、-NR8R9、杂芳基、或任选被一个或多个各自独立地是卤素、-CN、-SCN或-NO2的基团取代的烃基，其中R8和R9各自独立地是H或烃基，或R8和R9连同它们所连接的氮原子一起形成任选含有1-2个选自氧、氮或硫的其它杂原子的饱和或不饱和杂环；
R2是H或不存在；
R3是O或-N R10R10’，其中R10和R10’各自独立地是H、烃基或-CO-烃基；
R5是H、卤素、-O-或-OR11；
R6是-O-或-OR11，
R7是OR11、单磷酸酯部分或磷酸酯连接部分；且
R11各自独立地是H、(C1-C8)烷基、(C1-C8)亚烷基-OR12、(C1-C8)亚烷基-SR12或(C1-C8)亚烷基-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是H或(C1-C8)烷基；且
点线代表4位碳原子与3位氮原子或残基R3之间的潜在双键，前提是当R2是H时，在4位碳原子与R3之间存在双键，且当R2不存在时，在4位碳原子与3位氮原子之间存在双键。
6.如权利要求5所述的双链核酸分子，其中所述PT核苷酸类似物包括通式IIa的腺嘌呤PT核苷酸类似物：
其中
R1和R4各自独立地选自H、卤素、-CN、-SCN、-NO2、-O-烃基、-S-烃基、-CO-H、-CO-烃基、-NR8R9、杂芳基、或任选被一个或多个各自独立地是卤素、-CN、-SCN或-NO2的基团取代的烃基，其中R8和R9各自独立地是H或烃基，或R8和R9连同它们所连接的氮原子一起形成任选含有1-2个选自氧、氮或硫的其它杂原子的饱和或不饱和杂环；
R10是H、烃基或-CO-烃基；
R5是H、卤素、-O-或-OR11；
R6是-O-或-OR11，
R7是OR11、单磷酸酯部分或磷酸酯连接部分；且
R11各自独立地是H、(C1-C8)烷基、(C1-C8)亚烷基-OR12、(C1-C8)亚烷基-SR12或(C1-C8)亚烷基-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是H或(C1-C8)烷基。
7.如权利要求6所述的双链核酸分子，其中所述腺嘌呤PT核苷酸类似物包括式IIa PT脱氧腺苷类似物，其中R1、R4、R5和R10各自是H；R6是-O-或-OH；且R7是OH或单磷酸酯部分或磷酸酯连接部分。
8.如权利要求6所述的双链核酸分子，其中所述腺嘌呤PT核苷酸类似物包括式IIa的腺苷PT核苷酸类似物，其中R1、R10和R4各自是H；R5是-OR11，其中R11是H、(C1-C8)烷基、(C1-C8)亚烷基-OR12、(C1-C8)亚烷基-SR12或(C1-C8)亚烷基-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是H或(C1-C8)烷基；R6是-O-或–OH；且R7是OH或单磷酸酯部分或磷酸酯连接部分。
9.如权利要求8所述的双链核酸分子，其中所述腺苷PT核苷酸类似物具有式IIa，其中R11选自由H、CH3和(CH2)2-OCH3组成的组。
10.如权利要求9所述的双链核酸分子，其中所述腺苷PT核苷酸类似物具有式IIa，其中R11是H；且R7是单磷酸酯部分。
11.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中所述PT核苷酸类似物包括通式IIb的鸟嘌呤PT类似物：
其中
R4选自H、卤素、-CN、-SCN、-NO2、-O-烃基、-S-烃基、-CO-H、-CO-烃基、-NR8R9、杂芳基、或任选被一个或多个各自独立地是卤素、-CN、-SCN或-NO2的基团取代的烃基；
R8和R9各自独立地是H或烃基；或R8和R9连同它们所连接的氮原子一起形成任选含有1-2个选自氧、氮或硫的其它杂原子的饱和或不饱和杂环；
R5是H、卤素、-O-或-OR11；
R6是-O-或-OR11，
R7是OR11、单磷酸酯部分或磷酸酯连接部分；且
R11各自独立地是H、(C1-C8)烷基、(C1-C8)亚烷基-OR12、(C1-C8)亚烷基-SR12或(C1-C8)亚烷基-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是H或(C1-C8)烷基。
12.如权利要求11所述的双链核酸分子，其中所述鸟嘌呤PT核苷酸类似物包括式IIb的脱氧鸟苷PT核苷酸类似物，其中R4和R5各自是H；R6是-O-或–OH；且R7是OH或单磷酸酯部分或磷酸酯连接部分。
13.如权利要求11所述的双链核酸分子，其中所述腺嘌呤PT核苷酸类似物包括式IIb的鸟苷PT核苷酸类似物，其中R4是H；R5是-OR11，其中R11是H、(C1-C8)烷基、(C1-C8)亚烷基-OR12、(C1-C8)亚烷基-SR12或(C1-C8)亚烷基-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是H或(C1-C8)烷基；R6是-O-或–OH；且R7是OH或单磷酸酯部分或磷酸酯连接部分。
14.如权利要求11所述的双链核酸分子，其中所述鸟苷PT核苷酸类似物具有式IIb，其中R11选自由H、CH3和(CH2)2-OCH3组成的组。
15.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中x＝y＝19。
16.如权利要求4所述的双链核酸分子，其中x＝y＝18。
17.如权利要求15或16所述的双链核酸分子，其中所述正义链的5’末端包含选自化合物3、7、9、13、15、19、21、25、27或31的通式IIa的PT核苷酸类似物。
18.如权利要求15或16所述的双链核酸分子，其中所述反义链的5’末端包含选自化合物3、7、9、13、15、19、21、25、27或31的通式IIa的PT核苷酸类似物。
19.如权利要求15或16所述的双链核酸分子，其中所述正义链的5’末端包含选自化合物33、37、39、43、45、49、51、55、57或61的通式IIb的PT核苷酸类似物。
20.如权利要求15或16所述的双链核酸分子，其中所述反义链和/或所述正义链的3’末端包含选自化合物5、11、17、23或29的通式IIa的PT核苷酸类似物。
21.如权利要求15或16所述的双链核酸分子，其中所述反义链和/或所述正义链的3’末端包含选自化合物35、41、47、53或59的通式IIb的PT核苷酸类似物。
22.如权利要求15或16所述的双链核酸分子，其中所述正义链和/或所述反义链在内部位置中包含选自化合物7、13、19、25或31的通式IIa的PT核苷酸类似物。
23.如权利要求15或16所述的双链核酸分子，其中所述正义链和/或所述反义链在内部位置中包含选自化合物37、43、49、55或61的通式IIb的PT核苷酸类似物。
24.如权利要求1至23中任一项所述的双链核酸分子，其中接合各连续N或N’的所述共价键是磷酸二酯键。
25.如权利要求1至24中任一项所述的双链核酸分子，其中所述PT核苷酸类似物存在于所述反义链中的1位、3位、4位和5位(5’>3’)的至少一者中。
26.如权利要求4所述的双链核酸分子，其中N1和N2形成沃森-克里克碱基对或其中N1和N2形成非沃森-克里克碱基对。
27.如权利要求26所述的双链核酸分子，其中N1包括脱氧核苷酸或脱氧核苷酸类似物且N2包括核糖核苷酸且沃森-克里克碱基对是在N1与N2之间形成。
28.如权利要求27所述的双链核酸分子，其中N1包括腺嘌呤PT脱氧核苷酸类似物且N2包括尿苷。
29.如权利要求25所述的双链核酸分子，其中在1位(5’>3’)中的所述PT核苷酸类似物是PT核苷酸类似物。
30.如权利要求1至29中任一项所述的双链核酸分子，其中所述反义链包含一个或两个PT核苷酸类似物作为3’悬突。
31.如权利要求1至29中任一项所述的双链核酸分子，其中所述正义链在3’末端位置或3’倒数第二位置中包含PT核苷酸类似物。
32.如权利要求1至31中任一项所述的双链核酸分子，其中所述反义链在5位(5’>3’)中、在6位(5’>3’)中、在7位(5’>3’)中、在8位(5’>3’)中、在9位(5’>3’)中、在5-6位(5’>3’)中、在6-7位(5’>3’)中、在7-8位(5’>3’)中、在8-9位(5’>3’)中、在5-7位(5’>3’)中、在6-8位(5’>3’)中、在7-9位(5’>3’)中、在5-8位(5’>3’)中、或在6-9位(5’>3’)中包含苏糖核酸(TNA)部分。
33.如权利要求1至31中任一项所述的双链核酸分子，其中所述反义链在5位(5’>3’)中、在6位(5’>3’)中、在7位(5’>3’)中、在8位(5’>3’)中、在9位(5’>3’)中、在5-6位(5’>3’)中、在6-7位(5’>3’)中、在7-8位(5’>3’)中、在8-9位(5’>3’)中、在5-7位(5’>3’)中、在6-8位(5’>3’)中、在7-9位(5’>3’)中、在5-8位(5’>3’)中、或在6-9位(5’>3’)中包含2’-5’核苷酸。
34.如权利要求1至31中任一项所述的双链核酸分子，其中所述反义链在5位(5’>3’)中、在6位(5’>3’)中、在7位(5’>3’)中、在8位(5’>3’)中、在9位(5’>3’)中、在5-6位(5’>3’)中、在6-7位(5’>3’)中、在7-8位(5’>3’)中、在8-9位(5’>3’)中、在5-7位(5’>3’)中、在6-8位(5’>3’)中、在7-9位(5’>3’)中、在5-8位(5’>3’)中、或在6-9位(5’>3’)中包含镜像核苷酸。
35.如权利要求1至34中任一项所述的双链核酸分子，其中所述正义链在9位(5’>3’)中、在10位(5’>3’)中或在9-10位(5’>3’)中包含苏糖核酸(TNA)部分或2’5’连接的核苷酸。
36.如权利要求1至34中任一项所述的双链核酸分子，其中所述正义链包含四个、五个或六个在3’末端处或在3’倒数第二位置处结束的连续2’5’连接的核苷酸。
37.如权利要求36所述的双链核酸分子，其中所述正义链在15、16、17和18位(5’>3’)中或在16、17、18和19位(5’>3’)中包含2’5’连接的核苷酸。
38.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸分子，其在所述反义链中、在所述正义链中、或在所述反义链与所述正义链两者中进一步包含至少一个2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸。
39.如权利要求38所述的双链核酸分子，其中所述至少一个2’-O甲基糖修饰的核糖核苷酸包括2’-O甲基糖修饰的嘧啶核糖核苷酸。
40.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸分子，其包含在所述正义链的5’末端共价连接的加帽部分。
41.如权利要求40所述的双链核酸分子，其中所述加帽部分是无碱基部分或反向无碱基部分。
42.如权利要求1至41中任一项所述的双链核酸分子，其包含共价连接于所述反义链的3’末端的Z和/或共价连接于所述正义链的3’末端的Z’。
43.如权利要求42所述的双链核酸分子，其中Z和Z’独立地包括PT核苷酸类似物或非核苷酸部分。
44.如权利要求43所述的双链核酸分子，其中Z和Z’各自独立地包括PT核苷酸类似物、C3OH部分、C3Pi部分、C3PiC3Pi部分或C3PiC3OH部分。
45.如权利要求1至44中任一项所述的双链核酸分子，其用于下调哺乳动物靶标基因表达或非哺乳动物靶标基因表达。
46.如权利要求1至45中任一项所述的双链核酸分子，其用于疗法中。
47.一种组合物，其包含如权利要求1至46中任一项所述的双链核酸分子；以及载体。
48.如权利要求47所述的组合物，其中所述载体是药学上可接受的载体。
49.一种用于治疗或预防受试者的疾病或病状和/或与其相关的症状的发生或严重性和/或用于降低疾病或病状的风险或严重性的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至46中任一项所述的双链核酸分子或如权利要求47或48所述的组合物。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
51.如权利要求49或50所述的方法，其中所述疾病或所述病状和/或与其相关的症状选自由以下组成的组：听力损失、急性肾衰竭(ARF)、在肾移植之后移植物功能恢复延迟(DGF)、青光眼、眼缺血性病状、年龄相关性黄斑变性(AMD)、干眼综合征、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和其它急性肺和呼吸道损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、原发性移植物失败、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、肺再植入反应和/或在器官移植之后的原发性移植物功能障碍(PGD)(特别是在肺移值、器官移植，包括肺、肝、心脏、胰脏和肾移植中)、肾毒性和神经毒性、脊髓损伤、脑损伤、神经退化性疾病或病状、褥疮、口腔粘膜炎、纤维化病状、美尼尔氏病和癌症。
52.一种如权利要求1至46中任一项所述的双链核酸分子或如权利要求47或48所述的组合物的在制造用于疗法的药剂中的用途。
53.如权利要求1至46中任一项所述的双链核酸分子的药学上可接受的盐。
54.一种组合物，其包含如权利要求1至46中任一项所述的双链核酸分子的药学上可接受的盐；以及载体。
55.如权利要求54所述的组合物，其中所述载体是药学上可接受的载体。
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