KR101956450B1 - Rna 특이적 전달용 나노입자 복합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

Rna 특이적 전달용 나노입자 복합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체 및 이의 제조방법을 이용하여 금(Au) 나노입자 및 금 나노입자의 표면에 표면 개질 물질로서 부착된 양이온성 중합체를 포함하는 나노입자 복합체를 제조하여, RNA 간섭 현상을 일으키는 siRNA의 구조적 변형체인 liRNA 또는 tiRNA를 세포로 전달하는데 사용할 수 있다. 또한, 향상된 구조와 기능적 특징을 가지는 liRNA 또는 tiRNA 특이적 전달용 나노입자 복합체가 우수한 유전자 침묵 효과를 가지는 것을 이용하여, RNA 간섭을 기반으로 하는 차세대 질병 치료제에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체 및 이의 제조방법 {Nanoparticle complexes for specific delivery of RNA and preparation method thereof}
본 발명은 liRNA 또는 tiRNA 특이적 전달용 나노입자 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
RNA 간섭(RNA interference; RNAi)은 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 및 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA(double strand RNA)를 세포 등에 도입하여 선택적으로 표적유전자의 mRNA의 분해를 유도하고 표적유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상이다. 이와 같이 RNAi는 선택적으로 표적유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 종래의 비효율적인 상동 재조합에 의한 유전자 파괴방법을 대신하는 간단한 유전자 넉다운(knock down) 방법으로서 상당한 관심을 모으고 있다.
또한, RNA 간섭은 RNA-induced silencing complex(RISC)에 의한 조절을 받는, RNA에 의존적인 유전자 침묵(gene silencing) 과정으로써, 세포에서 특정 유전자의 발현을 저해시키는데 탁월한 효과를 나타내는 것으로 보고되어, 유전자 치료 분야에서 각광을 받고 있다.
반면, siRNA(small interference RNA)는 RNAi를 유도하는 물질로서, 19개에서 23개 정도의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 RNA 이중나선 가닥을 말한다. siRNA를 세포내로 주입시켜, 상기 siRNA와 염기서열이 상보적인, 치료하고자 하는 mRNA를 표적으로 삼아 유전자 발현을 억제하게 된다. 이에, DNA, siRNA, mRNA, 안티센스 올리고핵산 등 각종 핵산 물질의 의약적 용도가 규명됨에 따라 이들 물질을 세포 내로 전달하는 전달체 개발이 중요한 부분이 되었으며, 현재 siRNA의 높은 활성과 정밀한 유전자 선택성으로 인해, siRNA에 기반을 둔 각종 암들 및 바이러스성 질환에 대한 유전자 치료제로 각광을 받고 있다. 그러나 siRNA는 안정성이 낮아 생체 내에서 단시간에 분해되어 버리므로 치료 효율이 급격하게 떨어져 고가의 siRNA의 투여량을 높게 해야 하며, siRNA의 음이온성으로 인하여 같은 음전하를 띠는 세포막을 쉽게 투과하기 힘들어 세포 내로의 전달성이 떨어진다는 문제가 있다. 또한, 유전자 치료의 핵심기술로써 강한 음전하를 띠고 있는 핵산 분자를 어떻게 원하는 조직 내로 전달하느냐에 대한 문제도 있다. 일반적으로 살아있는 세포는 단백질, 또는 올리고뉴클레오타이드 같은 거대 분자에 대한 투과성이 매우 낮다. 일부 저분자량의 물질들만이 매우 낮은 비율로 살아있는 세포의 세포막을 통과하여 세포 내부의 세포질 또는 핵으로 들어갈 수 있기 때문에 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드을 포함하는 거대분자를 전달할 때 제한 요인이 되고 있다.
한편, liRNA(long interfering dsRNA 또는 long interfering RNA)는 기존 siRNA보다 긴 RNA 구조로 인해, 유연한 뼈대의 움직임과 증가된 음전하 특성을 통해 짧은 RNA 구조와 비교하여 양이온성 고분자로 표면 개질된 나노 구조에 향상된 결합능력을 보이며, long dsRNA로써 면역반응(immune response)을 일으켜 암 치료제 연구에 siRNA 보다 더욱 적합하게 사용될 수 있다. 마찬가지로 tiRNA(tripartite interfering RNA 또는 tripodal interfering RNA)의 음전하 특성을 통해 짧은 RNA 구조와 비교하여 양이온성 고분자에 향상된 결합능력을 보이며, 한 번에 세 가지의 타겟(target)을 조절하여, 목표유전자를 효과적으로 억제(target gene silencing)할 수 있다.
이러한 RNA 간섭 효과를 이용하여 유전자의 높은 형질 전환 효율을 유지하면서, 체내에서 안정적인 유전자 전달을 가능하게 하는 전달체의 개발이 요구되고 있고, 다양한 유전자 전달체에 대한 연구(한국 공개 특허 10-2014-0033492)가 진행되고 있으나, 별다른 성과가 나타나지 않고 있는 실정이다.
본 발명자들은 liRNA 또는 tiRNA 특이적 전달용 나노입자 복합체를 제조하여, RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체가 RNA 간섭 현상을 일으키는 siRNA의 구조적 변형체인 liRNA 또는 tiRNA를 세포로 전달하는데 사용될 수 있으며, 우수한 유전자 침묵 효과를 가지는 것을 확인한바, 이에 기초하여 본 발명인 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체 및 이의 제조방법을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 금(Au) 나노입자 및 상기 금 나노입자의 표면에 부착된 양이온성 중합체를 포함하는 liRNA 또는 tiRNA 특이적 전달용 나노입자 복합체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 (1) 티올(thiol)기가 도입된 양이온성 중합체를 준비하는 단계; 및 (2) 상기 티올기가 도입된 양이온성 중합체를 금(Au) 나노입자의 표면에 부착하는 단계를 포함하는 liRNA 또는 tiRNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 제조방법을 제공한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 금(Au) 나노입자 및 상기 금 나노입자의 표면에 표면 개질 물질로서 부착된 양이온성 중합체를 포함하는, liRNA 또는 tiRNA 특이적 전달용 나노입자 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 나노입자 복합체는 상기 나노입자 표면에 타겟 리간드가 부착되어 있을 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 티올(thiol)기가 도입된 양이온성 중합체를 준비하는 단계; 및 (2) 상기 티올기가 도입된 양이온성 중합체를 금(Au) 나노입자의 표면에 부착하는 단계를 포함하는, liRNA 또는 tiRNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 양이온성 중합체는 티올(thiol)기가 도입된 폴리에틸렌이민(PEI; Polyethyleneimine)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 제조방법은 (3) 상기 나노입자 표면에 타겟 리간드를 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 타겟 리간드는 엽산(folic acid) 또는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc; N-Acetylgalactosamine)일 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체 및 이의 제조방법을 이용하여 금(Au) 나노입자 및 금 나노입자의 표면에 표면 개질 물질로서 부착된 양이온성 중합체를 포함하는 나노입자 복합체를 제조하여, RNA 간섭 현상을 일으키는 siRNA의 구조적 변형체인 liRNA 또는 tiRNA를 세포로 전달하는데 사용할 수 있다. 또한, 향상된 구조와 기능적 특징을 가지는 liRNA 또는 tiRNA 특이적 전달용 나노입자 복합체가 우수한 유전자 침묵 효과를 가지는 것을 이용하여, RNA 간섭을 기반으로 하는 차세대 질병 치료제에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 차세대 RNAi 치료제를 위한 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체를 나타낸 것이다.
도 2는 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 시각적인 이미지 및 분광학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 동적 광산란법(DLS)을 이용한 입자 크기 및 제타전위 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 전자투과현미경(TEM) 이미지 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 독성을 확인하기 위해 세포 생존을 측정한 MTT assay 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 사용된 non-classical RNA인 siRNA, liRNA 및 tiRNA의 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 사용된 non-classical RNA인 siRNA, liRNA 및 tiRNA의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 siRNA, liRNA 또는 tiRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체를 나타낸 것이다.
도 9는 siRNA, liRNA 또는 tiRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 겔 지체 분석법(gel retardation assay) 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 siRNA, liRNA 또는 tiRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 원자간힘 현미경(AFM) 이미지 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 siRNA 또는 liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 세포 흡수를 확인하기 위한 Image cytometry 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 siRNA 또는 liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 세포 흡수를 확인하기 위한 공초점 주사 레이져 현미경 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 siRNA 또는 liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 세포 흡수를 확인하기 위한 형광 현미경 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 Hela cell에서 siRNA 또는 liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 유전자 침묵 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 U87MG cell에서 siRNA 또는 liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 유전자 침묵 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 HepG2 cell에서 siRNA 또는 liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 유전자 침묵 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 siRNA 또는 liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 다양한 세포주에서 형질 전환 시 세포 독성 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 HepG2 세포주에서 siRNA 또는 liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 Survivin 단백질 발현 정도를 웨스턴 블롯 결과로 나타낸 것이다.
도 19는 타겟 리간드가 도입되어 특정한 목표 세포에 도달할 수 있도록 하는 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체를 나타낸 것이다.
도 20은 HepG2 cell에서 siRNA 또는 tiRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체와 siRNA 또는 tiRNA가 결합된 GalNAc이 부착된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 유전자 침묵 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 C57BL/6 마우스에서 siRNA 또는 tiRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체와 siRNA 또는 tiRNA가 결합된 GalNAc이 부착된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 생물학적 분배 (biodistribution) 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 C57BL/6 마우스 간에서 siRNA 또는 tiRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 유전자 침묵 효과를 결과로 나타낸 것이다.
도 23은 liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체와 liRNA, 엽산 및 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 KB cell에서의 세포 흡수를 확인하기 위한 형광 현미경 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체 및 이의 제조방법에 대한 것으로, liRNA(long interfering dsRNA 또는 long interfering RNA) 또는 tiRNA(tripartite interfering RNA 또는 tripodal interfering RNA) 특이적 전달용 나노입자 복합체를 제조하여, RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체가 RNA 간섭 현상을 일으키는 siRNA의 구조적 변형체인 liRNA 또는 tiRNA를 세포로 전달하는데 사용될 수 있으며, 우수한 유전자 침묵 효과를 가지는 것을 확인한바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 금(Au) 나노입자 및 상기 금 나노입자의 표면에 표면 개질 물질로서 부착된 양이온성 중합체를 포함하는, liRNA 또는 tiRNA 특이적 전달용 나노입자 복합체를 제공한다.
본 발명에서의 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체는 non-classical한 siRNA의 구조적 변형체를 전달하기 위한 것으로, "non-classical한 siRNA의 구조적 변형체"는 siRNA, liRNA 또는 tiRNA를 포함한다. 보다 구체적으로 small interfering RNA인 siRNAs는 19 내지 21개의 핵산으로 이루어진 이중나선 RNA(duplex RNA) unit이며, long interfering RNA 또는 long interfering dsRNA인 liRNA는 38 뉴클레오타이드 길이의 여러 가닥의 RNA unit overhangs들 사이의 염기쌍(base pairing)을 통한 19bp siRNA의 다합체(multimer)로 구성되며, tripartite interfering RNA 또는 tripodal interfering RNA인 tiRNA는 32 내지 38 뉴클레오타이드 길이의 3가닥의 RNA unit 사이에 상보적인 염기쌍(base pairing)을 통해 이루어지는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 나노입자 복합체는 상기 나노입자 표면에 타겟 리간드가 부착된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 liRNA 또는 tiRNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 제조방법을 제공한다. 보다 구체적으로, (1) 티올(thiol)기가 도입된 양이온성 중합체를 준비하는 단계; 및 (2) 상기 티올기가 도입된 양이온성 중합체를 금(Au) 나노입자의 표면에 부착하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 양이온성 중합체는 티올(thiol)기가 도입된 폴리에틸렌이민(PEI; Polyethyleneimine)일 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 제조방법은 (3) 상기 나노입자 표면에 타겟 리간드를 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 타겟 리간드는 엽산(folic acid) 또는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc; N-Acetylgalactosamine)이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 liRNA 또는 tiRNA 특이적 전달용 나노입자 복합체는 단독으로 존재할 때 20nm 내지 30nm의 입자크기를 가질 수 있고, liRNA 또는 tiRNA와 결합하여서는 100nm 내지 300nm의 입자크기를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는, RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체를 제조하고 그 특성을 확인하기 위해, 티올기가 도입된 양이온성 중합체를 합성(실시예 1-1 참조)하고, RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체를 합성(실시예 1-2 참조)한 후, RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 독성을 평가(실시예 1-3 참조)한 후, siRNA, liRNA 또는 tiRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체를 합성(실시예 1-4 참조)하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는, RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 RNA 전달 효율을 평가하기 위해, Image cytometry를 이용하여 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 세포 흡수(cellular uptake)를 확인(실시예 2-1 참조)하였으며, Confocal microscopy 및 Fluorescence microscopy를 이용한 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 세포 흡수를 확인(실시예 2-2 참조)하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 형질 전환(transfection)을 통한 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 단백질 발현 능력을 평가함으로써, 다양한 세포주(HeLa cell, U87MG cell 및 HepG2 cell)에서의 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 유전자 침묵 효과를 확인(실시예 3-1 참조)하였으며, HepG2 cell에서의 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 Survivin 단백질 발현을 확인(실시예 3-2 참조)하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 타겟 리간드를 이용한 암 표적 시스템 구축하고자, 상기 liRNA 또는 tiRNA 특이적 전달용 나노입자 복합체는 표면에 타겟 리간드로 N-Acetylgalactosamine을 부착하여 HepG2 cell에서의 유전자 침묵효과와 마우스에서의 biodistribution 및 유전자 침묵효과를 확인(실시예 4-1 참조)하였다. 또한 엽산(folic acid)을 부착하여, KB cell에서의 세포 흡수를 확인(실시예 4-2 참조)하였다.
이러한 상기 liRNA 또는 tiRNA 특이적 전달용 나노입자 복합체 및 이의 제조방법을 이용하여, RNA 간섭 현상을 일으키는 siRNA의 구조적 변형체인 liRNA 또는 tiRNA를 세포로 전달하고, 우수한 유전자 침묵 효과를 나타내기 때문에 차세대 질병 치료제의 효과적인 시스템으로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 제조 및 특성 확인
1-1. 티올(thiol)기가 도입된 양이온성 중합체(PEI)의 합성 (thiolated-PEI)
양이온성 중합체에 티올기(thiol group)를 도입하고자, Polyethyleneimine(PEI)과 traut's reagent(2-iminothiolane)를 반응시켰다. 0.1g의 branched PEI(10 KDa)를 PBS buffer(2 mM EDTA)에 녹이고 0.01 g의 traut's reagent를 넣은 후, 상온조건에서 자석 교반기로 4시간 반응시켰다. 그 후, 용액을 gel filtration column (Sephadex G 25, GE Healthcare)에 넣어 반응하지 않은 reagents를 제거하여 티올기가 도입된 PEI를 얻었다. 티올기가 양이온성 중합체(PEI)에 붙었는지 여부는 하기 표 1에 기재된 바와 같이, 화합물의 S 및 N 원소의 비율을 정량적으로 측정(Elementar Vario EL cube)하고, Ellman's test(㎍/mg of PEI)를 통해 확인하였다.
Sample code Thiol content N content(%) S content(%)
PEI (10) - 22.1 -
PEI-Thiol 1 19.9 22.2 0.586
PEI-Thiol 2 58.5 21.4 1.398
PEI-Thiol 3 81.8 20.4 3.260
1-2. RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(AuPEI)의 합성
도 1에 나타낸 바와 같이, 금(Au) 나노입자 표면의 양이온성 중합체 부착은 양이온성 중합체(PEI)에 있는 티올(thiol)기를 통해 이루어진다. 금 나노입자에 양이온성 중합체를 도입하여, RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(AuPEI)를 합성하고자, 0.01 g의 HAuCl4를 상기 실시예 1-1에서 합성한 750 ㎕ (10 ㎎/㎖)의 thiolated-PEI 용액과 함께 1 ㎖의 증류수에 녹이고 상온에서 20분 간 반응시켰다. 그 후 Sodium borohydride (NaBH4) 수용액을 환원제로 1~2 방울을 넣고 상온에서 12시간 동안 교반하고, 반응 후, 투석막(Sigma-Aldrich dialysis membrane with MWCO 12 kDa)을 이용하여, 증류수에서 48~72시간 동안 정제하여 순수한 양이온성 중합체가 도입된 나노입자를 수득하여, RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(AuPEI)를 합성하였다. 이 때, 반응은 one-pot reaction으로 진행하였다. PEI는 양이온성 중합체가 부착된 금 나노입자를 생성하기 위한 환원제 및 안정제로 사용되었고, 티올기(thiol group)는 Au-S간의 self assembly를 통해 양이온성 중합체(PEI)가 나노입자의 표면에 붙는 것을 도왔다.
RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(AuPEI)의 합성 결과는, 도 2에 나타낸 바와 같이, 양이온성 중합체(PEI)의 유무에 따른 금 나노입자의 시각적인 이미지를 통해 확인하였고, UV-vis spetroscopy를 이용하여 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(AuPEI)의 surface plasmon resonance(SPR) peak가 citrate 환원방법을 이용한 일반 금 나노입자의 SPR peak(520 ㎚)보다 red-shifted(527 ㎚)된 것을 통해 확인하였다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, Dynamic light scattering (DLS)를 이용하여 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(AuPEI)의 크기가 23 ㎚ ± 3.5 ㎚ 이고, zeta potential이 +34.5 mV임을 확인하였으며, Zeta potential 값이 + 임을 통해 양이온성 중합체가 금 나노입자 표면에 잘 붙은 것을 확인하였다. Error bar는 같은 샘플을 3번 측정했을 때의 표준편차이다.
마찬가지로 도 4에 나타낸 바와 같이, RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(AuPEI)의 morphology는 transmission electron microscopy(TEM) 이미지를 통해 관찰하였다. 합성된 입자는 구 모양을 띠고 있었고, 입자의 크기도 DLS 측정 결과 값과 유사하게 관찰되었다. 상기 도 4의 이미지는 좌측부터 200 ㎚, 100 ㎚, 10 ㎚의 스케일 바(scale bar)를 갖는다.
1-3. RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(AuPEI)의 독성 평가 확인
상기 실시예 1-2에서 합성한 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(AuPEI)의 독성 평가를 확인하기 위하여, HeLa cells에서 여러 길이의 PEI를 이용하여 양이온성 중합체로 표면 개질된 AuPEI(10 kDa)와 일반적 형태 free polymers PEI(10 kDa)의 중합체 독성(cytocompatibility)을 MTT assay를 통해 비교하였다. 96-well plate (10,000 cells/well)에서 DMEM culture medium(10% FBS)를 이용하여 24시간 동안 세포를 배양하였다. 그 후 serum free DMEM에서 4시간 동안 세포를 AuPEI 또는 일반 중합체(Polyethyleneimine; PEI)와 반응시키고, medium을 DMEM(10% FBS)로 바꾼 후 20시간 동안 incubation 하였다. 다음으로 MTT reagent (50 ㎍)을 넣고 formazan crystals을 녹인 후 microplate reader를 이용해 각 샘플의 흡광도를 570 ㎚에서 관찰하였다. Positive control로는 PEI (25 kDa)를 사용하였다. Cell viability는 MTT assay결과를 통해 결정되었고, 3번 실험의 평균값을 그래프로 나타내었다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 비슷한 농도에서 10 kDa PEI를 사용하였을 때, AuPEI가 free PEI보다 상대적으로 독성이 작음을 확인하였다. AuPEI의 경우 10 ㎍/㎖ 에서 50%의 세포죽음이 관찰되었지만 free PEI는 5 ㎍/㎖에서 50% 세포가 죽었다. 이를 통해 나노입자에 도입된 polymer의 길이에 따라 나노입자의 독성이 조절될 수 있으며, 양이온성 중합체가 도입된 나노입자(AuPEI)가 free polymer보다 낮은 독성으로 인해 효과적인 핵산 전달체로 사용 될 수 있음을 확인하였다.
1-4. siRNA , liRNA 또는 tiRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 합성 ( siRNA - AuPEI / liRNA - AuPEI / tiRNA - AuPEI )
도 6에 나타낸 siRNA 및 non-classical RNA를 사용하여, siRNA, liRNA, 및 tiRNA의 PAGE gel 분석 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7의 lane 1은 10 bp DNA ladder, lane 2는 ssRNA 20mer, lane 3은 siRNA, lane 4는 ssRNA 38, lane 5는 liRNA, lane 6은 tiRNA, lane 7은 100 bp ladder를 나타낸 것이다.
RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 합성에 사용된 RNA의 염기서열은 하기 표 2에 나타내었다.
명칭 염기서열(5'→3') 서열번호
siSurvivin1 sense 5'-UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT)-3' 1
siSurvivin1 antisense 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCAC(dTdT)-3' 2
liSurvivin sense 5'-UGAAAAUGUUGAUCUCCUUUCCUAAGACAUUGCUAAGG-3' 3
liSurvivin antisense 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCACCUUAGCAAUGUCUUAGGA-3' 4
siSurvivin2 sense 5'-AUGCAUGACUUGUGUGUGA(dTdT)-3' 5
siSurvivin2 antisense 5'-UCACACACAAGUCAUGCAU(dTdT)-3' 6
siMet sense 5'-CGAGAUGAAUGUGAAUAUG(dTdT)-3' 7
siMet antisense 5'-CAUAUUCACAUUCAUCUCG(dTdT)-3' 8
siCatenin sense 5'-GUAGCUGAUAUUGAUGGAC(dTdT)-3' 9
siCatenin antisense 5'-GUCCAUCAAUAUCAGCUAC(dTdT)-3' 10
tiSMC strand 1(Survivin, Met, Catenin) 5'-UCACACACAAGUCAUGCAUCGAGAUGAAUGUGAAUAUG-3' 11
tiSMC strand 2
(Survivin, Met, Catenin)		 5'-CAUAUUCACAUUCAUCUCGGUAGCUGAUAUUGAUGGAC-3' 12
tiSMC strand 3
(Survivin, Met, Catenin)		 5'-GUCCAUCAAUAUCAGCUACAUGCAUGACUUGUGUGUGA-3' 13
siApoB1 sense 5'-AGCAAGAAGCACAUAGGAA(dTdT)-3' 14
siApoB1 antisense 5'-UUCCUAUGUGCUUCUUGCU(dTdT)-3' 15
siApoB2 sense 5'-ACAAGUUAGAGUAAAGUCA(dTdT)-3' 16
siApoB2 antisense 5'-UGACUUUACUCUAACUUGU(dTdT)-3' 17
siApoB3 sense 5'-CAGCCUGAACUCAAGAUGA(dTdT)-3' 18
siApoB3 antisense 5'-UCAUCUUGAGUUCAGGCUG(dTdT)-3' 19
tiApoB strand 1(ApoB1, ApoB2, ApoB3) 5'-UUCCUAUGUGCUUCUUGCUACAAGUUAGAGUAAAGUCA-3' 20
tiApoB strand 2(ApoB1, ApoB2, ApoB3) 5'-UGACUUUACUCUAACUUGUCAGCCUGAACUCAAGAUGA-3' 21
tiApoB strand 3(ApoB1, ApoB2, ApoB3) 5'-UCAUCUUGAGUUCAGGCUGAGCAAGAAGCACAUAGGAA-3' 22
상기 표 2에 기재된 염기서열을 이용하여, 도 8에 도시한 siRNA, liRNA 또는 tiRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(siRNA-AuPEI/liRNA-AuPEI/tiRNA-AuPEI)를 합성하였다. RNA 용액(10 μM)과 상기 실시예 1-2에서 제조한 적절한 양의 AuPEI 용액 (0.5 ㎎/㎖)을 섞고 150 mM NaCl 용액으로 희석하였다. 20초 간 vortex 후 상온에서 20분간 반응시켰다. siRNA, liRNA 또는 tiRNA 및 AuPEI 간의 binding ability는 agarose gel elctrophoresis로 관찰하였다. Ethidium bromide가 포함된 2% agarose gel을 TAE(Tris-Acetate-EDTA) buffer에서 준비하고 다양한 RNA/NP(나노입자) 질량비율을 가지는 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체를 합성하였고, siRNA-AuPEI, liRNA-AuPEI 및 tiRNA-AuPEI의 gel retardation assay 결과를 확인하고자, 각 샘플들을 RNA loading dye와 섞고 100V의 전류를 10분간 흘려준 후 UV illuminator로 결과를 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 다양한 RNA/NP 질량비율의 siRNA-AuPEI 나노입자 복합체(좌), 다양한 RNA/NP 질량비율의 liRNA-AuPEI 나노입자 복합체(중) 및 다양한 RNA/NP 질량비율의 tiRNA-AuPEI 나노입자 복합체(우)의 결과를 살펴보았고, C는 naked siRNA(좌)/liRNA(중)/tiRNA(우), Lane 1은 1:0.5 질량비율의 RNA/NP 복합체, Lane 2는 1:1 질량비율의 RNA/NP 복합체, Lane 3은 1:2 질량비율의 RNA/NP 복합체, Lane 4는 1:3 질량비율의 RNA/NP 복합체, Lane 5는 1:5 질량비율의 RNA/NP 복합체를 나타내며, 나노입자가 없는 대조군(control)과 나노입자에 결합을 형성하지 않는 RNA는 전기영동을 통해 분리되고 Ethidium bromide 염색을 통해 시각화된다. liRNA 및 tiRNA의 경우 RNA/NP 질량비율이 1:2인 시점부터 gel상에서 RNA의 이동이 관찰되지 않아, RNA와 AuPEI 표면간의 강한 결합으로 liRNA-AuPEI 및 tiRNA-AuPEI를 형성했음을 알 수 있었다. 반면에 siRNA의 경우 훨씬 높은 RNA/NP 질량비율에서 RNA와 AuPEI가 결합을 형성하여서, liRNA 또는 tiRNA와 비교하였을 때 AuPEI와 훨씬 약한 binding affinity를 보임을 확인하였다. 일반 중합체 혹은 지질을 기반으로 하는 RNA complexing 시스템과 비교하였을 때, RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체는 핵산이 항상 나노입자 표면에 결합한다. 따라서 단단한 duplex 형태의 siRNA는 나노입자 표면과 상호작용하는데 제한이 있을 수 있다. 반면 liRNA 및 tiRNA와 같은 긴 RNA 구조는 유연한 뼈대의 움직임을 통해 짧은 RNA 구조와 비교하여 양이온성 고분자로 표면 개질된 나노구조에 향상된 결합능력을 보인다.
또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, AuPEI와 RNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 liquid tapping mode AFM 이미지를 Multimode Nanoscope(Veeco Inc.)를 사용하여 얻었으며, siRNA-AuPEI, liRNA-AuPEI 또는 tiRNA-AuPEI 나노입자 복합체의 morphology를 확인하였다. 도 10의 A와 B는 AuPEI(10kDa), C와 D는 siRNA-AuPEI (RNA/NP 질량비율 1/1), E와 F는 liRNA-AuPEI (RNA/NP 질량비율 1/1), G와 H는 tiRNA-AuPEI (RNA/NP 질량비율 1/1), 좌측은 스케일 바(scale bar) 500 ㎚, 우측은 250 ㎚를 나타낸 것이다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, Dynamic light scattering (DLS)를 이용하여 RNA가 나노입자 복합체에 결합하면서 입자의 크기가 매우 증가함을 보였는데 RNA가 없는 일반 나노입자 복합체(AuPEI)의 경우 25 ㎚정도의 크기지만 siRNA와 결합을 형성하였을 때(siRNA-AuPEI)는 120 ㎚, liRNA와 결합을 형성하였을 때(liRNA-AuPEI)는 260 ㎚, tiRNA와 결합을 형성하였을 때(tiRNA-AuPEI)는 약 160 nm 정도의 크기를 보였다. 마찬가지로 도 10에 나타낸 바와 같이, AFM을 이용하여 관찰한 Morphology와 size를 확인한 결과, AuPEI는 잘 분산된 구형의 나노구조를 가지고 있지만, RNA-나노입자 복합체는 나노입자 표면의 PEI에 RNA가 붙음으로 훨씬 큰 크기를 가지는 것을 확인하였다.
실시예 2. 세포 흡수(cellular uptake)를 통한 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 RNA 전달 효율 평가
2-1. Image cytometry를 이용한 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 세포 흡수 확인
상기 실시예 1-4에서 합성한 RNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 RNA 전달 효율을 확인하기 위해, Image cytometry를 이용하여 세포 흡수를 확인하였다. 6-well plate에서 DMEM culture medium를 이용하여 HeLa cells을 배양한 후 형광물질인 Cy3가 달린 siRNA 또는 liRNA를 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체인 AuPEI 또는 AuPEI(non-thiolated)와 함께 각각 100 nM 농도와 RNA/NP 질량비율 1/1로 처리하였다. 일정 시간 뒤 미디어 제거 후, serum free DMEM를 넣고 10 ㎍/㎖ of Hoechst 33342 dye를 처리하였다. 15~20분 뒤 Trypsin-EDTA solution을 처리해 cell들을 얻은 후 centrifuge를 이용해 가라앉혔다. 미디어 제거 후 serum free DMEM를 이용하여 re-suspension 시키고 Nucleocounter NC-3000 (Chemometec)를 이용하여 분석하였다. 양성대조군으로는 jetPEI(100 nM, N/P 5)로 transfection한 siRNA 또는 liRNA의 흡수(uptake) 값을 사용하였다. 상기 양성대조군으로 사용한 jetPEI의 N/P 값은 nitrogen to phosphate ratio의 의미로 고분자의 amine(N)과 DNA의 phosphate(P)비율이 5임을 의미하고, PEI를 이용한 실험 시, PEI와 RNA양을 비교하기 위한 실험조건으로 사용된다. 본 발명의 실험 조건에서는 jetPEI N/P 5와 RNA/NP(나노입자) 질량비율 1/1이 동일한 값을 의미한다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 같은 RNA/NP 질량비율(1/1)과 RNA 농도(100 nM)에서, liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 세포 흡수(cellular uptake)가 siRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 세포 흡수(cellular uptake)보다 3배 이상 증가함을 확인하였다.
2-2. Confocal microscopy 및 Fluorescence microscopy를 이용한 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 세포흡수 확인
상기 실시예 1-4에서 합성한 RNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 RNA 전달 효율을 확인하기 위해, Confocal laser scanning microscopy(CLSM) 및 Fluorescent microscopy를 이용하여 세포 흡수를 확인하였다. 세포를 confocal imaging dishes(5×104 cells/dish)에 준비한 후, serum free DMEM에 100 nM 의 Cy3-RNA가 결합된 RNA 특이적 나노입자 복합체(RNA/NP(나노입자)의 질량비율 1:1)를 처리하고 3시간 incubation 하였다. 미디어를 제거하고 세포바깥의 형광을 없애기 위해 trypan(0.02%)이 포함된 PBS 용액을 이용해 세포를 씻어주었다. 세포 내 Cy3-RNA를 Confocal laser scanning microscopy(CLSM) 및 Fluorescence microscope (Olympus IX-81)을 이용하여 분석하였다. RNA는 Cy3(Red), nucleus는 DAPI(Blue) 그리고 cytoplasm을 endosome 488(Green)으로 각각 염색하여 siRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체 및 liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체 (100 nM, RNA/NP 질량비율 1:1)의 세포 흡수 양상을 관찰하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, CLSM 이미지들은 serum free conditions 에서 3시간의 incubation 후 Cy3가 붙은 siRNA-AuPEI 및 liRNA-AuPEI complex (100 nM, RNA/NP 질량비율 1:1)의 cellular internalization을 보여주며, 20× 와 40× 배율에서 DIC mode, Blue channel (Nuclei stain), Green channel (Endosome stain) 그리고 Red channel (Cy3)을 통해 이미지를 촬영하였고 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 internalization을 시각화하기 위해 각 이미지들을 중첩하였으며, 도 13에 나타낸 바와 같이, Fluorescent microscopy 이미지들은 serum free conditions 에서 3시간의 incubation 후 Cy3가 붙은 siRNA-AuPEI 및 liRNA-AuPEI complex (100 nM, RNA/NP 질량비율 1:1)의 cellular internalization을 보여준다. 20×배율에서 DIC mode와 Red channel(Cy3)을 통해 이미지를 촬영하였고 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 internalization을 시각화하기 위해 각 이미지들을 중첩하였다. 도 12 및 도 13의 microscopy 이미지를 통해, liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(liRNA-AuPEI complex)를 처리하였을 때 cytoplasm내의 뚜렷한 red spot을 통해 liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체가 효과적으로 internalization됨을 확인하였다. 반면 siRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(siRNA-AuPEI complex)는 같은 transfection 조건에서 희미한 red spot만 관찰되어 internalization 상대적으로 잘 일어나지 않음을 확인하였다.
실시예 3. 형질 전환(transfection)을 통한 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 단백질 발현 능력 평가
3-1. 다양한 세포주에서의 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 유전자 침묵 효과 확인
여러 cell line에서의 RNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 유전자 침묵 효과를 확인하기 위하여, Hela, U87MG cells 그리고 HepG2 cell을 12 well plate (3×104 cells/well)에 준비하고 24시간 동안 배양하였다. 150 mM NaCl 용액에 상기 실시예 1-4에서 합성한 siRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(siRNA-AuPEI) 및 liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(liRNA-AuPEI)를 준비하여 각 well에 100 ㎕ 씩 처리하였다. 지질 기반의 형질전환은 제조사의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 이용하여 진행하였다. 형질 주입된 세포들을 DMEM(10% FBS) culture medium에서 12시간 동안 배양한 후 Isol-RNA Lysis Reagent kit (5 Prime)를 이용하여 cell lysates로부터 total RNA를 추출하였다. High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 추출된 mRNA를 template로 cDNA를 합성하였다. 그 후 StepOne real-time PCR system (Applied Biosystems)으로 quantitative reverse transcription real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) 을 통해 목표 유전자 발현 levels을 분석하였다. In vitro 세포 실험 모델로 HeLa, U87MG cells을, endogenous 목표 유전자로 Survivin을 사용하였다. siRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(siRNA-AuPEI) 및 liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(liRNA-AuPEI)의 형질전환 효율(transfection efficiency)을 평가하기 위해, 나노입자 복합체를 다양한 농도(10, 30, 50, 70 및 100 nM)와 1:1, 1:2의 RNA/NP 질량비율로 투여하였다.
그 결과, 도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, liRNA를 AuPEI와 함께 사용하였을 때 mRNA level에서 Survivin mRNA 발현이 크게 감소함을 관찰하였다. HeLa와 U87MG cell 모두에서 10 nM의 liRNA를 사용하였을 때 transfection 후 12시간 이내에 50% 이상의 Survivin mRNA level이 감소하였고, 그 이상의 농도에서는 90% 이상의 Survivin mRNA level이 감소하였다. RNA sequence의 specificity 또한 실험으로 확인하였다.
또한, 도 16에 나타낸 바와 같이, HepG2 cell에서는 liRNA가 결합된 RNA 특이적 나노입자 복합체(liRNA-AuPEI)가 L2K 또는 jetPEI와 같은 기존의 transfection reagents들보다 더 뛰어난 유전자 침묵효과를 보임을 확인하였다. L2K 또는 jetPEI를 이용하여 liRNA를 transfection 하였을 때는 50% 이하의 목표 유전자 knock down이 있었지만, liRNA가 결합된 RNA 특이적 나노입자 복합체(liRNA-AuPEI)를 사용하였을 때는 농도에 따른 목표 유전자 knock down과 함께 90% 이상의 knock down을 확인하였다.
또한, 도 17에 나타낸 바와 같이, siRNA-AuPEI 또는 liRNA-AuPEI를 이용하여 얻어진 IC50 값을 통해, 1:1의 RNA/NP 질량 비율을 사용하였을 때 HeLa와 U87MG cell에서는 10 nM 이하, HepG2 cell에서는 25 nM 이하의 IC50 값을 확인하였다.
3-2. HepG2 cell에서의 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 Survivin 단백질 발현 확인
siRNA 또는 liRNA가 결합된 RNA 특이적 나노입자 복합체(siRNA-AuPEI/liRNA-AuPEI)를 이용하여 Survivin 단백질 발현을 확인하였다. 6 well plate에 HepG2 cell을 준비한 후 AuPEI 또는 L2K를 이용하여 100 nM의 RNA를 처리한 후 72 시간 뒤에 세포 단백질들을 추출하였다. BCA protein assay kit (ThermoScientific, USA)를 통해 단백질을 정량 한 후, 20 ug의 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분리하고 PVDF membrane으로 옮겨주었다. 단백질 detection을 위해 제조사의 프로토콜에 따라 β-tubulin (1:400 dilution, mouse mAb, santacruz)과 Survivin (1:1,000 dilution, rabbit mAb, Cell Signaling) primary antibody 및 secondary antibodies(1:10,000 dilution, santacruz)를 사용하였다. Blot은 Clarity ECL substrate(Bio-Rad)를 이용하여 X-ray films(Kodak)에 현상하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, mRNA knock down 실험과 일치하는 결과로, HepG2 cell에서 RNA-AuPEI 복합체들이 강하게 Survivin 단백질 발현 감소를 유발하였다. L2K를 사용하였을 때는 100 nM의 RNA를 사용하여도 단백질 발현 감소가 나타나지 않았다. 이는 HepG2 cells에서 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(AuPEI)의 효율을 분명하게 보여준다.
실시예 4. RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 타겟 리간드를 이용한 암 표적 시스템 구축
도 19에 도식한 타겟 리간드를 통한 나노입자의 표면 개질은 기본적인 나노입자 형태에 영향을 미치지 않으면서, 나노입자가 목표 cells에 도달하도록 도와주어, 운반하는 화물을 지정된 곳으로 전달한다. RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(AuPEI)의 표면 개질을 통한 암 표적 시스템 구축하고자, 나노입자에 특정한 곳을 목표로 하는 ligand를 부착하였다.
4-1. GalNAc이 부착된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 유전자 침묵 및 biodistribution 확인
간 세포 표면에서 발현되는 GalNAc receptor를 목표로 하여, 나노입자 복합체(AuPEI)의 표면에 GalNAc을 conjugation 하였다. (((2-Acetamido-2-deoxy-alpha-D-Galactopyranosyl-oxy)ethoxy)ethoxy)propionic acid (α-GalNAc-TEG-COOH)를 MES buffer (pH 6.0)에 2 mg/ml로 녹인 후, 상온에서 1시간 동안 EDC/NHS를 통해 carboxyl기를 활성화하였다. 그 후 AuPEI NPs를 최적화한 비율로 넣어 α-GalNAc-TEG-COOH의 COOH와 AuPEI NPs의 amino기를 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 dialysis method (Sigma-Aldrich dialysis membrane with MWCO 12 kDa)를 통해 반응하지 않은 ligand를 제거하여 GalNAc이 결합한 AuPEI (AuPEI-GalNAc)를 얻었다. RNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 GalNAc 결합에 따른 유전자 침묵 효과를 확인하기 위하여, GalNAc receptor의 발현량이 많은 간암세포 HepG2 cell을 12 well plate (3×104 cells/well)에 준비하고 24시간 동안 배양하였다. 150 mM NaCl 용액에 상기 실시예 1-4에서 합성한 siRNA mixture (siCatenin, siMet, siSurvivin)가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(siRNA-AuPEI) 및 tiSMC가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(tiRNA-AuPEI)를 준비하여 각 well에 100 ㎕ 씩 처리하였다. 형질 주입된 세포들을 DMEM(10% FBS) culture medium에서 12시간 동안 배양한 후 Isol-RNA Lysis Reagent kit (5 Prime)를 이용하여 cell lysates로부터 total RNA를 추출하였다. High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 추출된 mRNA를 template로 cDNA를 합성하였다. 그 후 StepOne real-time PCR system (Applied Biosystems)으로 quantitative reverse transcription real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) 을 통해 목표 유전자 발현 levels을 분석하였다. siRNA mxiture가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(siRNA-AuPEI, siRNA-AuPEI-GalNAc) 및 tiSMC가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(tiSMC-AuPEI, tiSMC-AuPEI-GalNAc)의 형질전환 효율(transfection efficiency)을 평가하기 위해, 나노입자 복합체를 다양한 농도(10, 30, 50 및 100 nM)와 1:1, 1:2의 RNA/NP 질량비율로 투여하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, tiSMC를 AuPEI와 함께 사용하였을 때 siRNA mixture를 AuPEI와 함께 사용하였을 때보다 beta-Catenin, c-Met과 Survivin mRNA 발현이 크게 감소함을 관찰하였다. 또한, RNA 나노입자 복합체를 비교하였을 때 AuPEI보다 AuPEI-GalNAc를 사용하였을 때 beta-Catenin, c-Met과 Survivin mRNA 발현이 농도에 따라 크게 감소함을 확인하였다.
형광물질 cy5.5가 부착된 siRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(cy5.5-siRNA-AuPEI, cy5.5-siRNA-AuPEI-GalNAc) 및 형광물질 cy5.5가 부착된 tiRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체 (cy5.5-tiRNA-AuPEI, cy5.5-tiRNA-AuPEI-GalNAc)의 biodistribution을 평가하기 위해, 나노입자 복합체를 5% glucose 용액에 준비하여 C57BL/6 mouse에 tail vein injection으로 투여하였다. 투여 3시간 후 주요 장기들을 채취하여 In-Vivo Imaging System FOBI(Neoscience, Korea)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, tiRNA를 AuPEI-GalNAc과 함께 사용하였을 때 간에서 가장 강한 형광세기를 나타내었다. siRNA를 AuPEI-GalNAc과 함께 사용하였을 때는 tiRNA-AuPEI-GalNAc에 비하여 약한 형광세기를 나타내었고, GalNAc modification이 없는 AuPEI를 사용하였을 때는 전체적으로 약한 형광세기를 관찰하였다. 이를 통해, 세포 내 전달에는 tiRNA 구조가 siRNA보다 더 효과적이고, GalNAc ligand를 통해 간세포로의 전달능력이 증가하는 것을 확인하였다.
siRNA mxiture (siApoB1, siApoB2, siApoB3)가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(siRNA-AuPEI-GalNAc) 및 tiApoB가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(tiRNA-AuPEI-GalNAc)의 동물모델에서의 형질전환 효율(transfection efficiency)을 평가하기 위해 나노입자 복합체를 3 mg/kg, 6 mg/kg의 농도로 tail vein injection을 통해 투여하였다. 투여 48시간 후, 간을 채취하여 Isol-RNA Lysis Reagent kit (5 Prime)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 추출된 mRNA를 template로 cDNA를 합성하였다. 그 후 StepOne real-time PCR system (Applied Biosystems)으로 quantitative reverse transcription real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) 을 통해 목표 유전자 발현 levels을 분석하였다.
그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, tiApoB를 6 mg/kg 사용하였을 때 ApoB mRNA 발현이 크게 감소함을 관찰하였다. RNA sequence의 specificity 또한 mut-tiApoB를 사용하여 실험으로 확인하였다.
4-2. KB cell에서 fluorescence microscopy를 이용한 folic acid가 부착된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 세포흡수 확인
이 실험에서는 암 세포 표면에서 발현되는 folate receptor를 목표로 하여, EDC/NHS chemistry를 통해 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(AuPEI)의 표면에 folic acid를 conjugation 하였다. Folic acid (65 ㎎)를 DMSO에 녹인 후 EDC (30 ㎎)와 NHS (37 ㎎)을 넣고 magnetic stirring을 통해 4시간 동안 교반하여 활성화된 folic acid를 AuPEI 용액에 몇 방울 넣고 상온에서 6시간 동안 반응시켰다. 그 후 증류수에서 48시간 동안 dialysis method (Sigma-Aldrich dialysis membrane with MWCO 12 kDa)를 통해 반응하지 않은 folic acid를 제거하여 folic acid가 결합한 AuPEI를 얻었다. Folate receptor 발현량이 많은 KB cell에서 일반 AuPEI와 folate가 붙은 AuPEI를 이용하여 uptake study를 진행하였다.
그 결과, 도 23 나타낸 바와 같이, liRNA가 결합된 RNA 특이적 전달용 나노입자 복합체(liRNA-AuPEI)를 만들어 진행하였을 때 folic acid가 붙은 AuPEI가 일반 AuPEI에 비해 증가한 흡수(uptake)를 보였으며, 이를 통해 folic acid modification이 암 세포에 나노입자의 흡수(uptake)를 도울 수 있음을 보여준다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Nanoparticle complexes for specific delivery of RNA and preparation method thereof <130> MP17-124 <150> KR 10-2016-0057781 <151> 2016-05-11 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siSurvivin sense <400> 1 ugaaaauguu gaucuccuud tdt 23 <210> 2 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siSurvivin antisense <400> 2 aaggagauca acauuuucac dtdt 24 <210> 3 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> liSurvivin sense <400> 3 ugaaaauguu gaucuccuuu ccuaagacau ugcuaagg 38 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> liSurvivin antisense <400> 4 ugaaaauguu gaucuccuud tdt 23 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siSurvivin2 sense <400> 5 augcaugacu ugugugugad tdt 23 <210> 6 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siSurvivin2 antisense <400> 6 ucacacacaa gucaugcaud tdt 23 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siMet sense <400> 7 cgagaugaau gugaauaugd tdt 23 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siMet antisense <400> 8 cauauucaca uucaucucgd tdt 23 <210> 9 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siCatenin sense <400> 9 guagcugaua uugauggacd tdt 23 <210> 10 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siCatenin antisense <400> 10 guccaucaau aucagcuacd tdt 23 <210> 11 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tiSMC strand 1(Survivin, Met, Catenin) <400> 11 ucacacacaa gucaugcauc gagaugaaug ugaauaug 38 <210> 12 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tiSMC strand 2(Survivin, Met, Catenin) <400> 12 cauauucaca uucaucucgg uagcugauau ugauggac 38 <210> 13 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tiSMC strand 3(Survivin, Met, Catenin) <400> 13 guccaucaau aucagcuaca ugcaugacuu guguguga 38 <210> 14 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siApoB1 sense <400> 14 agcaagaagc acauaggaad tdt 23 <210> 15 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siApoB1 antisense <400> 15 uuccuaugug cuucuugcud tdt 23 <210> 16 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siApoB2 sense <400> 16 acaaguuaga guaaagucad tdt 23 <210> 17 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siApoB2 antisense <400> 17 ugacuuuacu cuaacuugud tdt 23 <210> 18 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siApoB3 sense <400> 18 cagccugaac ucaagaugad tdt 23 <210> 19 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siApoB3 antisense <400> 19 ucaucuugag uucaggcugd tdt 23 <210> 20 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tiApoB strand 1(ApoB1, ApoB2, ApoB3) <400> 20 uuccuaugug cuucuugcua caaguuagag uaaaguca 38 <210> 21 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tiApoB strand 2(ApoB1, ApoB2, ApoB3) <400> 21 ugacuuuacu cuaacuuguc agccugaacu caagauga 38 <210> 22 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tiApoB strand 3(ApoB1, ApoB2, ApoB3) <400> 22 ucaucuugag uucaggcuga gcaagaagca cauaggaa 38

Claims (8)

  1. 금(Au) 나노입자 및 상기 금 나노입자의 표면에 부착된 양이온성 중합체를 포함하고, 상기 양이온성 중합체는 티올(thiol)기가 도입된 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine)이며, 상기 나노입자 표면에 타겟 리간드로 엽산(folic acid) 또는 N-아세틸갈락토사민(N-Acetylgalactosamine)이 부착된 것을 특징으로 하는, liRNA(long interfering RNA) 또는 tiRNA(tripodal interfering RNA) 특이적 전달용 나노입자 복합체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. (1) 티올기가 도입된 양이온성 중합체를 준비하는 단계;
    (2) 상기 티올기가 도입된 양이온성 중합체를 금(Au) 나노입자의 표면에 부착하는 단계; 및
    (3) 상기 나노입자 표면에 타겟 리간드로 엽산 또는 N-아세틸갈락토사민을 부착하는 단계를 포함하고,
    상기 양이온성 중합체는 티올기가 도입된 폴리에틸렌이민인 것을 특징으로 하는, liRNA 또는 tiRNA 특이적 전달용 나노입자 복합체의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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Dohmen, C. et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2012, e7*
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