KR20190090836A - 화학 수식 siRNA - Google Patents

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사다하루 히구치
아츠시 우노
히로노리 안도
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나파젠 파마, 인크.
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Abstract

본 발명의 목적은, 센스쇄의 5' 말단에 폴리데옥시아데닐산이 부가되어 있는 화학 수식 siRNA로서, 시조피란과 복합화한 경우에, RNase에 대한 내성이 높고, 게다가 효과적으로 RNAi 활성을 나타내는 화학 수식 siRNA를 제공하는 것이다. 센스쇄의 5' 말단에 폴리데옥시아데닐산이 부가되어 있는 수식 siRNA에 있어서, 센스쇄의 염기 서열에 있어서의 CA, UA 및 UG의 디뉴클레오티드 서열, 및 안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 염기 서열에 있어서의 CA, UA 및 UG의 디뉴클레오티드 서열에 대하여 특정한 화학 수식을 실시함으로써, 상기 과제를 해결할 수 있다.

Description

화학 수식 siRNA
본 발명은 화학 수식 siRNA에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 센스쇄의 5' 말단에 폴리데옥시아데닐산이 부가되어 있는 화학 수식 siRNA로서, 시조피란과 복합화한 경우에, RNase에 대한 내성이 높고, 게다가 효과적으로 RNAi 활성을 나타내는 화학 수식 siRNA에 관한 것이다.
1998년에 발견된 RNA 간섭(RNAi), 그 효과의 크기나 지속성이 종래의 안티센스법에 비교하여 현저하게 우수하고, 획기적인 유전자 발현 저해 방법인 점에서 의약 응용이 기대되어 왔다. 그러나, RNAi 활성을 나타내는 2중쇄 RNA(즉 siRNA)는, 투여로부터 표적 세포에 도입되는 과정 또는 세포 내에서 분해되는 일이 많아, 그의 활성 본체인 RISC 복합체를 세포 내에서 형성하는 것이 곤란하였다.
적합한 알고리즘으로 디자인된 미수식의 siRNA는, 기대되는 RNAi 활성을 달성하기 위해서 생체 내나 세포 내에서의 취약성으로 인해, 예를 들어 혈 중 등에 존재하는 RNase에 의해 매우 용이하게 분해되어, 표적 세포에서 RNAi 효과를 발휘하는 것은 적다. 그래서, 종래부터 RNase 내성이 되는 각종 화학 수식을 siRNA에 실시하는 것이 제안되어 있다(비특허문헌 1 내지 3). 그러나, 핵산 의약으로서 개발되어 있는 siRNA는, 그의 대부분이 전체 염기에 대하여 화학 수식을 실시하고 있으며, 그것에서 기인하여, 서열 설계 당초의 미수식의 siRNA에 기대된 RNAi 활성을 달성할 수 없는 결과로 연결되고 있다. 즉, 적은 화학 수식으로 RNase 내성이 우수하고, 또한 원래 기대된 대로 RNAi 활성을 유도하는 화학 수식 siRNA는 발견되지 못한 것이 현재 상황이다(비특허문헌 4).
한편, siRNA의 딜리버리 기술로서, 폴리데옥시아데닐산이 부가된 siRNA와 시조피란(SPG)의 siRNA/SPG 복합체가 제안되어 있다(특허문헌 1을 참조). 당해 siRNA/SPG 복합체는, 수상 세포 등의 덱틴-1(Dectin-1) 발현 세포에 대하여 siRNA를 선택적으로 송달할 수 있고, 게다가 세포 내에 송달되면 RNAi 효과를 유효하게 발휘할 수 있으므로, 핵산 의약으로서의 실용화가 기대되고 있다. 당해 siRNA/SPG 복합체는, siRNA가 SPG에 의해 포매된 상태로 되어 있기 때문에, 어느 정도의 RNase 내성은 기대할 수 있지만, 많은 RNase가 존재하는 혈 중 내에서는 RNase에 의한 분해는 피할 수 없어, 당해 siRNA/SPG 복합체를 핵산 의약으로서 개발하기 위해서는, RNAi 활성을 유지시키면서 RNase에 대한 내성을 향상시키는 기술의 개발이 요망되고 있다.
선행기술문헌
비특허문헌
비특허문헌 1: Development of Therapeutic-Grade Small Interfering RNAs by Chemical Engineering, Jesper B. Bramsen and Jorgen Kjems, Front Genet. 2012; 3: 154.
비특허문헌 2: Oligonucleotide Therapies: The Past and the Present, Karin E. Lundin, Olof Gissberg, and C. I. Edvard Smith, Hum Gene Ther. 2015 Aug 1; 26(8): 475-485.
비특허문헌 3: siRNAmod: A database of experimentally validated chemically modified siRNAs, Showkat Ahmad Dar, Anamika Thakur, Abid Qureshi & Manoj Kumar, Sci Rep. 2016; 6: 20031.
비특허문헌 4: Preclinical and clinical development of siRNA-based therapeutics, Gulnihal Ozcan, Bulent Ozpolat, Robert L. Coleman, Anil K. Sood, and Gabriel Lopez-Berestein, Adv Drug Deliv Rev. 2015 June 29; 87: 108-119.
특허문헌
특허문헌 1: WO2009/078470 공보
본 발명의 목적은, 센스쇄의 5' 말단에 폴리데옥시아데닐산(특별히 한정되지 않는 한, 이하 포스포로티오에이트화된 폴리데옥시아데닐산도 포함하는 의미로 사용함)이 부가되어 있는 화학 수식 siRNA로서, 시조피란과 복합화한 경우에 RNase에 대한 내성이 높고, 게다가 효과적으로 RNAi 활성을 나타내는 화학 수식 siRNA를 제공하는 것이다.
센스쇄의 5' 말단에 폴리데옥시아데닐산이 부가되어 있는 siRNA에 대하여, 화학 수식을 행하여 RNase에 대한 내성을 향상시키는 경우에는, 당업자라면 통상 (1) 센스쇄와의 접합력이 특히 약하다고 여겨지는 안티센스쇄의 5' 말단측, (2) siRNA와 폴리데옥시아데닐산의 이음매 근방의 2군데에는 화학 수식에 의한 RNase에 대한 내성의 강화가 불가결하다고 생각되는 바, 본 발명자들은, 이들 2군데에 화학 수식을 실시해도 RNase에 대한 내성이 충분히 향상되지 않는 것을 확인하였다. 또한, 공지 문헌에서 보고되어 있는 siRNA의 화학 수식법에 대하여 검토를 행하였다.
이러한 상황 하에, 본 발명자들은 예의 검토를 행함으로써, 센스쇄의 5' 말단에 폴리데옥시아데닐산이 부가되어 있는 siRNA에 대하여, 통상의 폴리데옥시아데닐산을 부가하지 않은 siRNA와 비교하여, 특정한 염기에 특정한 화학 수식을 실시함으로써, 비교적 적은 화학 수식이어도, 센스쇄의 5' 말단에 폴리데옥시아데닐산이 부가되어 있는 siRNA에 대하여, 시조피란과 복합화했을 때의 RNase에 대한 내성을 현저히 향상시켜, 효과적으로 RNAi 활성을 나타내는 것이 가능해지는 것을 발견하였다. 본 발명은 이러한 지견에 기초하여 더욱 검토를 거듭함으로써 완성한 것이다.
즉, 본 발명은 하기에 게재하는 양태의 발명을 제공한다. 하기 항 1의 조건 (i) 내지 (ix)에 나타내는 본 발명의 수식법을 본 명세서 중에서는 A-3 수식이라고도 한다.
항 1. 센스쇄의 5' 말단에 폴리데옥시아데닐산이 부가되어 있는 화학 수식 siRNA로서,
센스쇄의 염기 서열이, CA, UA 및 UG로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 디뉴클레오티드 서열을 포함하고,
안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 염기 서열이, CA, UA 및 UG로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 디뉴클레오티드 서열을 포함하며, 또한
하기 조건 (i) 내지 (ix)를 만족시키는 화학 수식 siRNA:
(i) 센스쇄의 염기 서열에 있어서, CA를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 시티딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
(ii) 센스쇄의 염기 서열에 있어서, UA를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
(iii) 센스쇄의 염기 서열에 있어서, UG를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
(iv) 안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 염기 서열에 있어서, CA를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 시티딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
(v) 안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 염기 서열에 있어서, UA를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
(vi) 안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 염기 서열에 있어서, UG를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
(vii) 안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 1 내지 7번째의 리보뉴클레오티드 잔기는, 화학 수식이 실시되어 있지 않다.
(viii) 상기 (i) 내지 (vi)에 따라서 화학 수식을 실시하면, 센스쇄의 5' 말단측으로부터 1번째 및 안티센스쇄 5' 말단측으로부터 19번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 모두 화학 수식되지 않은 경우에는, 센스쇄의 5' 말단측으로부터 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 시티딜산 잔기 또는 우리딜산 잔기라면 2' 위치를 플루오로기로 수식되어 있으며, 당해 리보뉴클레오티드 잔기가 아데닐산 잔기 또는 구아닐산 잔기라면 2' 위치를 메톡시기로 수식되어 있다.
(ix) 상기 (i) 내지 (vi)에 따라서 화학 수식을 실시하면, 센스쇄의 5' 말단측으로부터 1번째 및 안티센스쇄 5' 말단측으로부터 19번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 모두 화학 수식되는 경우에는, 안티센스쇄 5' 말단측으로부터 19번째의 리보뉴클레오티드 잔기는 화학 수식이 실시되지 않는다.
항 2. 상기 폴리데옥시아데닐산이 10 내지 100염기 길이인, 항 1에 기재된 화학 수식 siRNA.
항 3. 항 1 또는 2에 기재된 화학 수식 siRNA가 시조피란과 복합화되어 있는, 시조피란/화학 수식 siRNA 복합체.
본 발명에 따르면, 비교적 적은 화학 수식을 실시함으로써, 센스쇄의 5' 말단에 폴리데옥시아데닐산이 부가되어 있는 화학 수식 siRNA로서, 시조피란과 복합화한 경우에 RNase에 대한 내성이 높고, 게다가 효과적으로 RNAi 활성을 나타내는 화학 수식 siRNA를 제공하는 것이 가능해진다.
도 1은, 참고 시험예 1에 있어서, 각종 화학 수식 siRNA, 및 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체에 대하여, 유전자 발현 억제 효과를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는, 참고 시험예 2에 있어서, 각종 화학 수식 siRNA, 및 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체에 대하여, 혈청 중에서의 안정성을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은, 참고 시험예 3에 있어서, 각종 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체에 대하여, 유전자 발현 억제 효과를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는, 참고 시험예 4에 있어서, 각종 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체에 대하여, 혈청 중에서의 안정성을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는, 시험예 1에 있어서, 각종 화학 수식 siRNA, 및 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체에 대하여, 유전자 발현 억제 효과를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은, 시험예 2에 있어서, 각종 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체에 대하여, 혈청 중에서의 안정성을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은, 시험예 3에 있어서, 각종 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체에 대하여, 생체 외 MLR(림프구 혼합 배양) 분석에 의해 세포 증식 억제 효과를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은, 시험예 4에 있어서, 각종 화학 수식 siRNA, 및 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체에 대하여, 유전자 발현 억제 효과를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명에 있어서, 2 이상의 염기를 포함하는 염기 서열을 나타내는 경우에는, 염기 서열의 좌측 단부가 5' 말단, 우측 단부가 3' 말단이다.
1. 화학 수식 siRNA
폴리데옥시아데닐산이 부가된 siRNA의 염기 서열·구조
본 발명의 화학 수식 siRNA는, 센스쇄의 5' 말단에 폴리데옥시아데닐산이 부가되어 이루어지고, 센스쇄 및 안티센스쇄가 특정한 디뉴클레오티드 서열을 포함하고, 당해 디뉴클레오티드 서열에 특정한 화학 수식이 실시되어 있는 것을 특징으로 한다. 이하, 본 발명의 화학 수식 siRNA에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명의 화학 수식 siRNA에 있어서, 센스쇄와 안티센스쇄의 염기 서열에 대해서는, 표적 유전자 중의 표적 서열에 따라서 설정된다. 표적 유전자 중의 표적 서열은, IDT사(Integrated DNA Technologies, INC)의 매뉴얼(Dicer Substrate RNAi Design) 등을 따라서 공지된 방법으로 설정할 수 있다. siRNA는, 통상 당해 표적 서열에 대하여 100％ 일치하는 서열을 포함하거나 원하는 RNA 간섭 효과가 얻어지는 한, 당해 표적 서열로부터 1 또는 수개의 염기가 치환·부가되어 있는 서열을 포함하도록 설계된다. 또한, 안티센스쇄의 5' 말단이 A/U 페어이고, 센스쇄의 5' 말단이 G/C 페어이고, 안티센스쇄의 5' 말단측에 5개 정도의 A/U 페어가 있고, 또한 2중쇄 중에 9개 이상의 G/C 페어가 없는 2중쇄 RNA를 설계함으로써, 우수한 RNA 간섭 효과를 가지는 siRNA를 디자인할 수 있는 것도 보고되어 있다(Ui-Tei et. al, Nucleic Acids Res., 32, 936-948(2004)). 예를 들어, CD40에 대한 siRNA로서, 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열을 포함하는 센스쇄와 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열을 포함하는 안티센스쇄를 포함하는 siRNA, 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열을 포함하는 센스쇄와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열을 포함하는 안티센스쇄를 포함하는 siRNA, 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열을 포함하는 센스쇄와 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열을 포함하는 안티센스쇄를 포함하는 siRNA, 서열 번호 7에 나타내는 염기 서열을 포함하는 센스쇄와 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열을 포함하는 안티센스쇄를 포함하는 siRNA, 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열을 포함하는 센스쇄와 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열을 포함하는 안티센스쇄를 포함하는 siRNA 등을 들 수 있다.
본 발명의 화학 수식 siRNA에 있어서, 센스쇄의 염기 서열은, CA, UA 및 UG로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 디뉴클레오티드 서열을 포함하며, 또한 안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 염기 서열이, CA, UA 및 UG로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 디뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 디뉴클레오티드 서열에 대하여, 후술하는 특정한 화학 수식을 실시함으로써, SPG와 복합화했을 때, RNAi 활성을 유지시키면서 RNase에 대한 내성을 향상시키는 것이 가능해진다.
본 발명의 화학 수식 siRNA의 표적 유전자에 대해서는, 특별히 제한되지 않고, 당해 화학 수식 siRNA의 용도에 기초하여 적절히 선택하면 되지만, 의약 용도로의 사용이라는 관점에서는, 병태에 관여하고 있으며 그의 발현 억제가 요망되고 있는 유전자가 적합하다.
본 발명의 화학 수식 siRNA의 표적 유전자의 적합한 일 형태로서, 덱틴-1 발현 세포에 있어서 발현되고, 또한 당해 세포가 담당하는 생체 내 기능에 영향을 미치는 유전자를 들 수 있다. 덱틴-1이란, 세포막 상에 존재하는 C형 렙틴 타입의 당쇄 인식 도메인을 갖는 수용체(Pattern Recognition Receptor)이다. 덱틴-1은 세포 밖에 SPG를 특이적으로 인식하는 영역을 가지고, 세포 내에 ITAM(immunoreceptor tyrosinase-based activation motif-1)이라 불리는 활성화 시그널을 전달하는 모티프를 갖는다. 덱틴-1은 SPG를 인식하면, NF-κB나 염증성 사이토카인의 산생을 촉진하여, 생체 방어 반응을 야기한다. 덱틴-1 발현 세포로서는, 구체적으로는 마크로파지, 수상 세포, 호중구 등을 들 수 있다. SPG는 β-1,3-글루칸 골격을 갖고 있으며, 덱틴-1 발현 세포의 세포막에 존재하는 덱틴-1과 결합함으로써, 엔도사이토시스로 덱틴-1 발현 세포 내에 송달되는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 화학 수식 siRNA를 SPG와 복합화하면, SPG가 덱틴-1로 인식됨으로써, 본 발명의 화학 수식 siRNA를 덱틴-1 발현 세포 내에 선택적으로 송달하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 화학 수식 siRNA의 표적 유전자로서, 덱틴-1 발현 세포가 담당하는 생체 내 기능에 영향을 미치는 유전자를 선택함으로써, 생체 내의 면역 제어를 유도하여, 면역을 조절하는 것이 가능해진다.
본 발명의 화학 수식 siRNA에 있어서, 덱틴-1 발현 세포에 있어서 발현되어, 당해 세포가 담당하는 생체 내 기능에 영향을 미치는 유전자를 표적 유전자로 하는 경우, 그 유전자의 종류는 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 화학 수식 siRNA의 용도에 기초하여 적절히 선택할 수 있지만, 생체 내의 면역 조절, 특히 면역 제어를 보다 유효하게 유도한다는 관점에서, 적합한 표적 유전자로서, CD40 등의 공자극 인자(공자극 분자라고도 함)를 코딩하는 유전자를 비롯한 항원 제시에 관련되는 유전자 등을 들 수 있다.
본 발명의 화학 수식 siRNA에 있어서, 센스쇄 및 안티센스쇄의 염기 길이에 대해서는, 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 21을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 화학 수식 siRNA에 있어서, 센스쇄 및 안티센스쇄가, 양쪽 3' 말단의 2 내지 5개 정도의 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 댕글링 엔드를 갖도록 하이브리다이징하여 2중쇄를 형성하고 있는 것이어도 된다.
본 발명의 화학 수식 siRNA의 적합한 양태의 일례로서, 센스쇄 및 안티센스쇄의 염기 길이가 모두 21이며, 또한 센스쇄의 5' 말단 및 안티센스쇄의 3' 말단에 2개의 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 댕글링 엔드가 형성되어 있는 것을 들 수 있다. 즉, 이러한 siRNA의 경우에는, 안티센스쇄의 3' 말단측으로부터 3 내지 21번째의 리보뉴클레오티드 서열은, 센스쇄의 5' 말단측으로부터 1 내지 19번째의 리보뉴클레오티드 서열에 상보적이 된다.
본 발명의 화학 수식 siRNA에서는, 센스쇄의 5' 말단에 폴리데옥시아데닐산이 부가되어 있다. 당해 폴리데옥시아데닐산은 2개의 SPG와 3중 나선 구조를 형성하고, 본 발명의 화학 수식 siRNA를 SPG와 복합화시키는 역할을 담당한다.
폴리데옥시아데닐산을 구성하는 데옥시아데닐산 잔기의 수로서는, SPG와의 복합체 형성이 가능한 것을 한도로 하여, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 10 내지 100개, 바람직하게는 20 내지 100개, 보다 바람직하게는 20 내지 80개, 더욱 바람직하게는 30 내지 50개를 들 수 있다.
본 발명의 화학 수식 siRNA에 있어서, 폴리데옥시아데닐산은, 센스쇄의 5' 말단에 포스포디에스테르 결합에 의해 직접 결합되어 있는 것이 바람직하지만, 센스쇄의 5' 말단에 링커(스페이서)를 통해 결합되어 있어도 된다.
또한, 본 발명의 화학 수식 siRNA에 있어서, 센스쇄, 안티센스쇄 및 폴리데옥시아데닐산의 포스포디에스테르 결합은, 일부 또는 모두가 포스포로티오에이트화(S화)되어 있어도 된다. 본 발명의 화학 수식 siRNA의 폴리데옥시아데닐산 부분에 대해서는, S화되어 있는 것이 바람직하다. S화되어 있는 포스포디에스테르 결합이란, 포스포디에스테르 결합 부분의 인산 잔기의 산소 원자의 하나가 황 원자로 치환되어 있는 결합 구조이다.
siRNA의 화학 수식
본 발명의 화학 수식 siRNA는, 센스쇄 및 안티센스쇄에 대하여 후술하는 조건 (i) 내지 (ix)에 따른 화학 수식(A-3 수식)이 실시되어 있다. 또한, 본 발명의 화학 수식 siRNA에 있어서, 센스쇄 및 안티센스쇄는 후술하는 조건 (i) 내지 (ix) 이외의 화학 수식은 행하지 않을 것을 요한다.
<센스쇄의 화학 수식>
본 발명의 화학 수식 siRNA의 센스쇄는, 이하의 조건 (i) 내지 (iii)을 만족시키도록 화학 수식이 실시된다.
(i) 센스쇄의 염기 서열에 있어서, CA를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 시티딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
(ii) 센스쇄의 염기 서열에 있어서, UA를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
(iii) 센스쇄의 염기 서열에 있어서, UG를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
즉, 예를 들어 siRNA의 센스쇄가 표 1의 (A)에 나타내는 21염기 길이의 염기 서열인 경우에는, 조건 (i) 내지 (iii)에 따른 화학 수식을 실시한 것으로 하여, 표 1의 (B)에 나타내는 양태를 들 수 있다.
Figure pct00001
<안티센스쇄의 화학 수식>
본 발명의 화학 수식 siRNA의 안티센스쇄는, 이하의 조건 (iv) 내지 (vii)을 만족시키도록 화학 수식이 실시된다.
(iv) 안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 염기 서열에 있어서, CA를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 시티딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
(v) 안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 염기 서열에 있어서, UA를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
(vi) 안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 염기 서열에 있어서, UG를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
(vii) 안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 1 내지 7번째의 리보뉴클레오티드 잔기는, 화학 수식이 실시되어 있지 않다.
즉, 예를 들어 siRNA의 안티센스쇄가 표 2의 (A)에 나타내는 21염기 길이의 염기 서열인 경우에는, 조건 (iv) 내지 (vii)에 따른 화학 수식을 실시한 것으로 하여, 표 2의 (B)에 나타내는 양태를 들 수 있다.
Figure pct00002
<폴리데옥시아데닐산 근방에 있어서의 화학 수식>
본 발명의 화학 수식 siRNA에 있어서, 센스쇄의 5' 말단측으로부터 1번째 및 안티센스쇄 5' 말단측으로부터 19번째의 리보뉴클레오티드 잔기는, 폴리데옥시아데닐산에 가장 근접하는 위치에 배치되어 있다. 본 발명의 화학 수식 siRNA에서는, 이들 리보뉴클레오티드 잔기에 대해서는, 상기 조건 (i) 내지 (vii)을 그대로 적용해서는 안되는 경우가 있다.
구체적으로는, 본 발명의 화학 수식 siRNA에서는, 센스쇄 및 안티센스쇄는, 상기 조건 (i) 내지 (vii)에 따라서 화학 수식이 실시되지만, 이러한 조건에 따라서 화학 수식을 실시한 경우, 센스쇄의 5' 말단측으로부터 1번째 및 안티센스쇄 5' 말단측으로부터 19번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 모두 화학 수식되지 않거나, 또는 모두 화학 수식되어 있는 경우에는, 하기 조건 (viii) 및 (ix)에 따른 화학 수식이 필요하게 된다.
(viii) 상기 (i) 내지 (vi)에 따라서 화학 수식을 실시하면, 센스쇄의 5' 말단측으로부터 1번째 및 안티센스쇄 5' 말단측으로부터 19번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 모두 화학 수식되지 않은 경우에는, 센스쇄의 5' 말단측으로부터 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 시티딜산 잔기 또는 우리딜산 잔기라면 2' 위치를 플루오로기로 수식되어 있으며, 당해 리보뉴클레오티드 잔기가 아데닐산 잔기 또는 구아닐산 잔기라면 2' 위치를 메톡시기로 수식되어 있다.
(ix) 상기 (i) 내지 (vi)에 따라서 화학 수식을 실시하면, 센스쇄의 5' 말단측으로부터 1번째 및 안티센스쇄 5' 말단측으로부터 19번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 모두 화학 수식되는 경우에는, 안티센스쇄 5' 말단측으로부터 19번째의 리보뉴클레오티드 잔기는 화학 수식이 실시되지 않는다.
<화학 수식의 방법>
시티딜산 잔기 및 우리딜산 잔기의 리보오스 부분의 2' 위치의 히드록시기를 플루오로기로 치환(수식)하는 방법, 아데닐산 잔기 및 구아닐산 잔기의 리보오스 부분의 2' 위치의 히드록시기를 메톡시기로 치환(수식)하는 방법은 공지되어 있으며, 본 발명의 화학 수식 siRNA는 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
2. SPG /화학 수식 siRNA 복합체
본 발명의 화학 수식 siRNA는, SPG와 복합화시켜, 시조피란/화학 수식 siRNA 복합체의 상태에서 사용된다. SPG는, β-1,3-글루칸 골격을 갖는 다당이며, 시조피란/화학 수식 siRNA 복합체는, SPG가 전술한 세포 표면에 존재하는 수용체 덱틴-1과 결합함으로써, 엔도사이토시스로 세포 내에 송달된다.
SPG/화학 수식 siRNA 복합체의 구성 성분인 시조피란(SPG라 약기하는 경우가 있음)은, 문헌(A.C.S. 38(1), 253(1997); Carbohydrate Research, 89, 121-135(1981))에 기재된 통상적인 방법을 따라서 제조할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 시조피란은, 초음파 처리에 의해 원하는 분자량의 시조피란을 얻을 수 있다.
SPG/화학 수식 siRNA 복합체에 사용되는 시조피란의 분자량에 대해서는, 특별히 제한되지 않고, 화학 수식 siRNA에 부가되어 있는 폴리데옥시아데닐산의 쇄 길이 등에 따라서 적절히 설정하면 된다. 구체적으로는, 시조피란의 분자량으로서, 통상 25,000 내지 500,000, 바람직하게는 25,000 내지 250,000이 예시된다.
SPG/화학 수식 siRNA 복합체는, SPG와 폴리데옥시아데닐산을 복합화시키는 공지된 방법에 따라서 조제할 수 있다. 구체적으로는, 이하의 (1) 내지 (3)의 공정으로 제조하는 방법이 예시된다: (1) 폴리데옥시아데닐산을 포함하는 화학 수식 siRNA를 공지된 방법에 따라서 조제하고, (2) 또한, 별도로 SPG를 준비하고, (3) 이어서, 화학 수식 siRNA에 결합되어 있는 폴리데옥시아데닐산과 SPG를 사용하여 복합체를 형성시킨다.
상기 방법의 (3)의 공정에 있어서, 화학 수식 siRNA와 SPG의 혼합비는, 폴리데옥시아데닐산의 쇄 길이나 SPG의 분자량에 따라서 적절히 선택할 수 있다. SPG/화학 수식 siRNA 복합체는, 폴리데옥시아데닐산의 데옥시아데닐산 잔기 1개에 대하여 SPG의 주쇄의 글루코오스 1 분자가 대응하여, 폴리데옥시아데닐산 1개와 SPG 2개가 3중 나선 구조를 취한다. 즉, SPG/화학 수식 siRNA 복합체에서는, 2개의 SPG로 형성된 2중 나선 구조의 1군데 또는 2군데 이상에 폴리데옥시아데닐산이 도입되어 3중 나선 구조가 형성되어 있다. 예를 들어, 40염기 길이의 폴리데옥시아데닐산을 포함하는 화학 수식 siRNA와 분자량 150000의 SPG라면, 분자량 150000의 SPG 2 분자에 염기 길이의 폴리데옥시아데닐산을 포함하는 화학 수식 siRNA를 17 분자 포함하여 3중 나선 구조를 취할 수 있다. 폴리데옥시아데닐산을 포함하는 화학 수식 siRNA와 SPG의 바람직한 몰비로서는, 20:1 내지 1:5, 바람직하게는 10:1 내지 1:1로 혼합하고, 화학 수식 siRNA에 결합되어 있는 1중쇄 폴리데옥시아데닐산 영역과 SPG를 복합화시키는 것이 바람직하다. 이러한 몰비로, 폴리데옥시아데닐산을 포함하는 화학 수식 siRNA와 SPG를 복합체 형성 조건 하에 노출시킴으로써, 양자를 효율적으로 상호 작용시키는 것이 가능해지고, SPG/화학 수식 siRNA 복합체의 제조 효율을 향상시킬 수 있다.
SPG/화학 수식 siRNA 복합체에 있어서의 폴리데옥시아데닐산과 SPG의 3중쇄 나선 구조의 형성은, 구체적으로는 이하의 방법에 따라서 실시할 수 있다. SPG는 천연 또는 수 중에서는 3중 나선 구조를 취하고 있다. 이 SPG를, DMSO(디메틸술포옥시드) 등의 극성 용매나 수산화나트륨 수용액 등의 알칼리 수용액에 용해시켜 1중쇄로 변성시킨 후, 폴리데옥시아데닐산을 포함하는 화학 수식 siRNA를 첨가하고, 용매를 물로 복귀시키는 것 또는 알칼리 수용액을 중화시키는 것(재생 과정)에 의해, 화학 수식 siRNA에 연결된 폴리데옥시아데닐산 1중쇄 부분과 2개의 SPG를 포함하는, 3중 나선형으로 복합화된 구조(회합 구조)가 형성된다. 이러한 폴리데옥시아데닐산과 다당의 복합화는, 주로 수소 결합과 소수성 상호 작용을 통해 형성된다고 생각된다.
SPG/화학 수식 siRNA 복합체는, 세포 내에 도입됨으로써 세포 내에서의 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있으므로, 표적 유전자의 발현 억제를 목적으로 한 의약 조성물로서 사용할 수 있다. 당해 의약 조성물은, 유효 성분으로서 SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 치료 유효량 함유시키고, 추가로 약학적으로 허용되는 담체를 적절히 조합하여 조제할 수 있다. 이러한 담체로서는, 정제수, 당 함유 수용액, 완충액, 생리 식염수, 뉴클레아제 프리의 물 등의 수성 담체; 부형제 등을 들 수 있다.
SPG/화학 수식 siRNA 복합체의 투여 경로는, 경구, 비경구(정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하, 직장 내, 질 내 투여를 포함함), 흡입, 전신 투여, 국소 투여(피부나 협면와동(頰面窩洞)으로의 외용; 눈, 귀, 코 등의 실질적으로 혈류에 침입하지 않는 부위로의 점적 주입을 포함함) 등, 환자의 증상, 병태, 질환의 종류 등에 기초하여 종래 이용되고 있는 방법으로부터 적절히 선택할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 : SPG /화학 수식 siRNA 복합체의 제조
이하의 시험예에서 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체는 다음과 같이 하여 형성하였다. 분자량 약 15만의 SPG를, 0.25N 수산화나트륨 수용액에 최종 농도 15mg/ml가 되도록 조제한 후, 1시간 진동 교반하여 4℃에서 1일 정치하여 변성시켰다. 330mM의 제1인산나트륨에 용해시킨, S화된 폴리데옥시아데닐산을 부가한 소정 서열의 화학 수식 siRNA의 용액을, 이 변성 SPG 용액에 첨가하여 중화시켜 4℃에서 24시간 이상 정치하였다. 이 때, 화학 수식 siRNA 1몰에 대하여 SPG가 0.27몰이 되도록 하였다. 또한, S화된 폴리데옥시아데닐산을 부가한 화학 수식 siRNA는, siRNA의 센스쇄 5' 말단에 40개의 데옥시아데닐산이 인산에스테르 결합에 의해 연결된 것이다.
참고 시험예 1
화학 수식이 이루어진 CD40에 대한 화학 수식 siRNA(표 3에 나타내는 NJ050.11 및 NJ050.13)를 사용하여, SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 조제하였다. 또한, 폴리데옥시아데닐산이 부가되지 않은 화학 수식 siRNA로서, 표 3에 나타내는 NJ050.12 및 NJ050.13을 준비하였다. 당해 화학 수식 siRNA의 센스쇄 및 안티센스쇄의 염기 서열은, 각각 서열 번호 1 및 2에 해당한다.
NJ050.11에서는, 센스쇄에 있어서, 모든 아데닐산 및 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 메톡시기로 치환하고, 모든 시티딜산 및 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 플루오로기로 치환하고 있으며, 안티센스쇄에 있어서, 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 아데닐산 잔기 및 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 메톡시기로 치환하고, 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 시티딜산 및 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 플루오로기로 치환한다.
NJ050.12에서는, 센스쇄 및 안티센스쇄의 양쪽에 있어서, CA, UA 및 UG를 포함하는 디뉴클레오티드 서열 중의 시티딜산 잔기 및 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 플루오로기로 치환하고, 또한 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기 및 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 메톡시기로 치환하고 있다.
NJ050.13에서는, 센스쇄에 있어서, CA, UA 및 UG를 포함하는 디뉴클레오티드 서열 중의 시티딜산 잔기 및 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 플루오로기로 치환하고, 또한 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기 및 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 메톡시기로 치환하고 있으며, 안티센스쇄에 있어서, 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 아데닐산 잔기 및 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 메톡시기로 치환하고, 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 시티딜산 잔기 및 우리딜산 잔기의 2' 위치의 메톡시기를 플루오로기로 치환하고 있다.
Figure pct00003
각 SPG/화학 수식 siRNA 복합체 및 화학 수식 siRNA를, 20만개의 c-wrt-7LR 세포(래트 골수 단구성 백혈병 유래 세포)에 전기 천공법에 의해 도입하였다. 도입 후, 각 세포를 48구멍 플레이트에 2×105cells/well이 되도록 파종하여, 37℃, 5％ CO2 하에서 2시간 인큐베이팅하였다. 그 후, 각 구멍에 10ng/mL가 되도록 리포폴리사카라이드(LPS)를 첨가하여, 37℃, 5％ CO2 하에서 22시간 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포로부터 전체 RNA를 추출하고, 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하여, CD40 프라이머(primer)를 사용하여 리얼 타임 PCR을 행하고, CD40의 mRNA양을 측정하였다. siRNA를 삽입하지 않고 LPS 처리를 행한 것을 양성 컨트롤로 하고, siRNA를 삽입하지 않고 LPS 처리도 행하지 않은 것을 음성 컨트롤로 하였다. 또한, CD40의 mRNA양은, 하우스 키핑 유전자인 18SrRNA양으로 보정하였다.
얻어진 결과를 도 1에 도시한다. 도 1 중, 「LPS(-)」는 음성 컨트롤, 「LPS(+)」는 양성 컨트롤, 「21bp of NJ050.12」는 NJ050.12의 화학 수식 siRNA(21염기 길이), 「21bp of NJ050.13」은 NJ050.13의 화학 수식 siRNA(21염기 길이), 「NJ050.11(dA40-dsRNA)」은 NJ050.11의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체, 및 「NJ050.13(dA40-dsRNA)」은 NJ050.13의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 나타낸다.
이 결과, NJ050.13의 화학 수식 siRNA는, NJ050.12의 화학 수식 siRNA보다도, CD40의 mRNA양이 저하되어 있으며, 안티센스쇄에 있어서 5' 말단측으로부터 7번째까지의 리보뉴클레오티드 잔기는 화학 수식을 실시하지 않는 쪽이, 유전자 발현 억제 효과가 높아지는 것이 확인되었다. 한편, NJ050.13의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체에서는, 유전자 발현 억제 효과는 확인되지 않았다.
참고 시험예 2
NJ050.13의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체에서는, 유전자 발현 억제 효과는 확인되지 않은 요인으로서, 염기 서열의 취약성에서 기인하는 RLC로의 도입 부전의 가능성을 생각할 수 있는 점에서, 본 시험에서는, 화학 수식 siRNA 및 SPG/화학 수식 siRNA 복합체의 혈청 중에서의 안정성의 평가를 행하였다.
센스쇄 5' 말단에 40개의 데옥시아데닌을 인산에스테르 결합에 의해 연결시킨 NJ050.13의 화학 수식 siRNA(Naked)를 1μM이 되도록, 10 용량％ 소태아 혈청(FBS)을 포함하는 RPMI1640 배지(Gibco)에 첨가하여, 37℃에서 16시간 인큐베이팅하였다. 이어서, 시료와 동량의 TE 포화 페놀/클로로포름을 첨가하고, 볼텍스로 강교반한 후, 12000×g으로 15분간 원심 분리하였다. 이어서, 상청을 회수하여, 상청 중의 핵산 농도를 분광 광도계로 측정하고, 핵산 200ng 상당량을 15％ 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 전기 영동에 제공하였다. 또한, 컨트롤로서, 센스쇄 5' 말단에 40개의 S화한 폴리데옥시아데닐산을 인산에스테르 결합에 의해 연결시킨 NJ003.2의 dsRNA를 사용하였다. NJ003.2의 dsRNA의 염기 서열은 표 4에 나타내는 바와 같고, 혈청 중에서도 비교적 안정된 것을 알았다.
또한, NJ050.13의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체, 및 NJ003.2의 dsRNA를 사용한 SPG/siRNA 복합체에 대해서도, 전기 영동에 제공하는 핵산량을 400ng으로 설정한 것 이외에는, 상기와 동일하게 시험을 행하였다.
얻어진 결과를 도 2에 도시한다. 도 2의 (A)에는, NJ050.13의 화학 수식 siRNA(Naked) 및 NJ050.13의 화학 수식 siRNA(Naked)의 결과를 나타낸다. 도 2의 (A) 중 「Naked」란 FBS 존재 하에서 인큐베이팅을 행하지 않은 경우, 「Naked in FBS」란 FBS 존재 하에서 인큐베이팅을 행한 경우이다. 도 2의 (B)에는, NJ050.13의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체, 및 NJ003.2의 dsRNA를 사용한 SPG/siRNA 복합체의 결과를 나타낸다. 도 2의 (B) 중, 「Naked」란, NJ050.13의 화학 수식 siRNA 또는 NJ003.2의 dsRNA를 FBS 존재 하에서 인큐베이팅을 행하지 않은 경우, 「Complex」란 SPG/화학 수식 siRNA 복합체 또는 SPG/siRNA 복합체를 FBS 존재 하에서 인큐베이팅을 행한 경우, 「Complex in FBS」란 SPG/화학 수식 siRNA 복합체 또는 SPG/siRNA 복합체를 FBS 존재 하에서 인큐베이팅한 경우이다.
이 결과로부터, 센스쇄의 5' 말단에 S화한 폴리데옥시아데닐산을 부가한 NJ050.13의 화학 수식 siRNA는, 폴리데옥시아데닐산과 센스쇄의 결합 부위 부근에서 절단되어 있을 가능성이 시사되었다.
참고 시험예 3
참고 시험예 2의 결과로부터, S화한 폴리데옥시아데닐산과 siRNA의 센스쇄의 결합 부위 부근의 안정성을 높일 필요성이 시사된 점에서, 센스쇄의 접합 부위에 화학 수식을 도입한 것으로 하였다. 또한, 참고 시험예 1의 결과로부터, NJ050.11로 채용한 센스쇄 수식에서는 활성을 상실할 것이 우려되기 때문에, 표 4에 나타내는 NJ050.14의 화학 수식을 실시한 siRNA를 조제하였다.
Figure pct00004
2×104cells/well이 되도록 dRAW 세포(마우스 마크로파지; 덱틴-1을 과잉 발현하는 RAW264 세포)를 48구멍 플레이트에 파종하여, 37℃, 5％ CO2 하에서 24시간 인큐베이팅하였다. 이어서, SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 200nM 또는 400nM이 되도록 첨가하여, 37℃, 5％ CO2 하에서 12시간 인큐베이팅하였다. 그 후, 각 구멍에 0.2ng/mL가 되도록 인터페론 γ(IFNr)를 첨가하여 37℃, 5％ CO2 하에서 4시간 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포로부터 전체 RNA를 추출하고, 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하여, CD40 프라이머를 사용하여 리얼 타임 PCR을 행하여, CD40의 mRNA양을 측정하였다. SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 첨가하지 않고 IFNr 처리를 행한 것을 양성 컨트롤로 하고, SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 첨가하지 않고 IFNr 처리도 행하지 않은 것을 음성 컨트롤로 하였다. 또한, CD40의 mRNA양은, 하우스 키핑 유전자인 18SrRNA양으로 보정하였다.
얻어진 결과를 도 3에 도시한다. 도 3 중, 「NT」는 음성 컨트롤, 「IFNγ(+)」는 양성 컨트롤, 「NJ050.13 SPG complex」는 NJ050.13의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체, 「NJ050.14 SPG complex」는 NJ050.14의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 나타낸다. 이 결과로부터, NJ050.14의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체는, NJ050.13의 화학 수식 siRNA를 사용한 복합체의 경우와 동일한 정도로 양호한 유전자 발현 억제 효과를 갖고 있는 것이 확인되었다.
참고 시험예 4
NJ050.14의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체 200ng을 혈청(마우스 혈청, 인간 혈청 및 FBS)에 첨가하여, 37℃에서 1분간 또는 30분간 인큐베이팅하였다. 이어서, 시료와 동량의 TE 포화 페놀/클로로포름을 첨가하고, 볼텍스로 강교반한 후, 12000×g으로 15분간 원심 분리하였다. 이어서, 상청을 회수하여, 상청 중의 핵산 농도를 분광 광도계로 측정하고, 핵산 200ng 상당량을 15％ 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 전기 영동에 제공하였다.
얻어진 결과를 도 4에 도시한다. 도 4 중, 레인 1의 「Naked」란, S화한 폴리데옥시아데닐산이 부가된 NJ050.13의 화학 수식 siRNA를 혈청 존재 하에서 인큐베이팅을 행하지 않은 경우, 레인 2의 「Complex」란, NJ050.14의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 혈청 존재 하에서 인큐베이팅을 행하지 않은 경우, 레인 3 내지 5 및 9 내지 11의 「NJ050.14 complex」란, NJ050.14의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체, 레인 12의 「21mer」란, NJ003.2의 화학 수식 siRNA 부분의 센스쇄 서열이며 사이즈 마커로서 사용하였다. 이 결과로부터, NJ050.14의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체는, 혈청 존재 하에서 비교적 안정된 것이 확인되었다.
시험예 1
NJ050.14의 화학 수식 siRNA는, 아데닐산 잔기 및 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 메톡시기로 치환하고 있는 개소가 많아, 제조 상, 수율이 저하될 것이 염려된다. 또한, NJ050.14의 화학 수식 siRNA는, 혈청 존재 하에서 비교적 안정된다고는 해도, NJ050.13의 화학 수식 siRNA보다도 혈청 하에서의 안정성이 나빠서, 생체 내(in vivo)에서의 사용에 견딜 수 없다고 생각된다. 그래서, S화한 폴리데옥시아데닐산과 siRNA의 센스쇄의 결합 개소에의 화학 수식은 불가결하다고 해도, 안정성을 희생해서 라도 가능한 한 화학 수식의 수를 저감시켜, 적절한 유전자 발현 억제 효과를 구비하는 화학 수식 siRNA를 개발할 것이 필요해진다.
그래서, 표 5에 나타내는 NJ050.15의 화학 수식을 실시한 siRNA를 조제하였다. NJ050.15의 화학 수식을 실시한 siRNA는, 본 발명에서 규정하고 있는 조건 (i) 내지 (ix)를 만족시키는 것이다.
Figure pct00005
5×104cells/well이 되도록 dRAW 세포(마우스 마크로파지; 덱틴-1을 과잉 발현하는 RAW264 세포)를 48구멍 플레이트에 파종하고, 동시에 200nM의 SPG/화학 수식 siRNA 복합체(NJ050.14 및 NJ050.15의 화학 수식 siRNA를 사용), 및 0.2ng/mL의 인터페론 γ(IFNr)를 첨가하여, 37℃, 5％ CO2 하에서 24시간 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포로부터 전체 RNA를 추출하고, 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하여, CD40 프라이머를 사용하여 리얼 타임 PCR을 행하고, CD40의 mRNA양을 측정하였다. SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 첨가하지 않고 IFNr 처리를 행한 것을 양성 컨트롤로 하고, SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 첨가하지 않고 IFNr 처리도 행하지 않은 것을 음성 컨트롤로 하였다. 또한, CD40의 mRNA양은, 하우스 키핑 유전자인 18SrRNA양으로 보정하였다. 또한, 비교를 위해서, S화한 폴리데옥시아데닐산이 부가된 NJ050.14 및 NJ050.15의 화학 수식 siRNA를 사용하여, 동일하게 시험을 행하였다.
얻어진 결과를 도 5에 도시한다. 도 5 중, 「NT」는 음성 컨트롤, 「IFNγ(+)」는 양성 컨트롤, 「NJ050.14 naked」는, 센스쇄 5' 말단에 40개의 데옥시아데닌을 인산에스테르 결합에 의해 연결시킨 NJ050.14의 화학 수식 siRNA, 「NJ050.14 complex」는, NJ050.14의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체, 「NJ050.15 naked」는, 센스쇄 5' 말단에 40개의 데옥시아데닐산을 인산에스테르 결합에 의해 연결시킨 NJ050.15의 화학 수식 siRNA, 「NJ050.15 complex」는, NJ050.15의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체이다. 이 결과, NJ050.15의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체는, NJ050.14의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체에 비해, 동등하거나 또는 양호한 유전자 발현 억제 효과를 갖고 있는 것이 확인되었다.
시험예 2
NJ050.14 또는 NJ050.15의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체, 및 표 6에 나타내는 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체에 대하여, 혈청 중에서의 안정성을 평가하였다. 구체적으로는, 각 SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 1μM이 되도록 혈청(인간 혈청 및 FBS)에 첨가하여, 37℃에서 16시간 인큐베이팅하였다. 이어서, 시료와 동량의 TE 포화 페놀/클로로포름을 첨가하고, 볼텍스로 강교반한 후, 12000×g으로 15분간 원심 분리하였다. 이어서, 상청을 회수하여, 상청 중의 핵산 농도를 분광 광도계로 측정하고, 핵산 20ng 상당량을 15％ 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 전기 영동에 제공하였다. 분해되지 않은 화학 수식 siRNA에 대하여, Image J 해석 소프트웨어를 사용하여 정량을 행하고, 잔존율(％)을 구하였다.
Figure pct00006
얻어진 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6의 (A)에는 인간 혈청을 사용한 결과, (B)에는 FBS를 사용한 결과를 나타낸다. 의외로, NJA050.15의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체는, NJA050.14를 사용한 경우에 비해, 화학 수식의 수가 적음에도 불구하고, 그것과 동등하거나 또는 양호한 안정성을 구비하고 있었다.
시험예 3
NJ050.14 또는 NJ050.15의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 사용하여, 생체 외 MLR(림프구 혼합 배양) 분석을 행하고, 세포 증식 억제 효과를 평가하였다. 구체적으로는, NJ050.14 또는 NJ050.15의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 0.2μg/head 또는 2μg/head가 되도록, BALB/c 마우스(숫컷, 9주령)에 꼬리 정맥으로부터 투여하였다. 20시간 경과 후, BALB/c 마우스로부터 비장을 적출하고, 통상적인 방법을 따라서 비장 세포(5×106cells/mL)를 조제하였다. 얻어진 비장 세포에 15Gy의 방사선을 조사하여 불활성화 처리를 행하고, 자극제(stimulator) 세포를 준비하였다. 별도로, C57BL/6 마우스(숫컷, 9주령)의 비장을 적출하고, 통상적인 방법을 따라서 비장 세포(5×106cells/mL)를 조제하고, 반응자(responder) 세포를 준비하였다. 96구멍 플레이트의 각 구멍에 자극제 세포 및 반응자 세포를 각각 100μL를 넣어, 37℃, 5％ CO2 하에서 96시간 혼합 림프구 반응(MLR)을 행하였다. 반응 후, 세포를 세포 증식(Cell Proliferation) ELISA, BrdU kit(Roche Lifescence)를 사용하여 세포 증식을 측정하였다. 또한, SPG/화학 수식 siRNA 복합체 대신에 PBS를 사용한 것을 컨트롤로 하였다.
얻어진 결과를 도 7에 나타낸다. 이 결과로부터, NJ050.15의 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체는, 더 적은 화학 수식으로 안정성을 향상시키고, 또한 높은 녹다운 활성을 유도할 수 있는 것이 확인되었다.
시험예 4
특정한 법칙 하에서 화학 수식을 실시한 siRNA(CD40에 대한 siRNA, 인간 서열용)를 사용하여 SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 조제하였다. 구체적으로는, 표 7에 나타내는 각종 화학 수식 siRNA의 센스쇄 5' 말단에 40개의 S화된 데옥시아데닐산이, 인산에스테르 결합에 의해 연결된 것을 준비하고, 전술한 방법으로 각종 SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 조제하였다. 또한, 표 7에 나타내는 hsiCD40(208)의 센스쇄 및 안티센스쇄의 염기 서열은 각각 서열 번호 3 및 4에 해당하고, hsiCD40(867)의 센스쇄 및 안티센스쇄의 염기 서열은 각각 서열 번호 5 및 6에 해당하고, hsiCD40(1019)의 센스쇄 및 안티센스쇄의 염기 서열은 각각 서열 번호 7 및 8에 해당하고, hsiCD40(998)의 센스쇄 및 안티센스쇄의 염기 서열은 각각 서열 번호 9 및 10에 해당한다.
표 7에 나타내는 화학 수식 패턴 A-1은, 사전에 S화한 폴리데옥시아데닌이 부가된 siRNA와 SPG의 복합체의 안정화 검토의 결과, 발견한 비교적 안정성이 높고 활성이 강한 수식 패턴이다. 당해 화학 수식 패턴 A-1은, 센스쇄에 있어서, 5' 말단측으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 16, 17 및 18번째의 리보뉴클레오티드 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 플루오로기로 치환하고, 5' 말단측으로부터 6, 12, 14, 15 및 19번째의 리보뉴클레오티드 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 메톡시기로 치환하고 있다. 또한, 당해 화학 수식 패턴 A-1은, 안티센스쇄에 있어서, CA, UA 및 UG를 포함하는 디뉴클레오티드 서열 중의 시티딜산 잔기 및 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 플루오로기로 치환하고, 또한 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기 및 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 메톡시기로 치환하고 있다.
표 7에 나타내는 화학 수식 패턴 A-2는, 센스쇄에 있어서, 모든 시티딜산 잔기 및 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 모든 아데닐산 잔기 및 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다. 또한, 당해 화학 수식 패턴 A-2는, 안티센스쇄에 있어서, CA, UA 및 UG를 포함하는 디뉴클레오티드 서열 중의 시티딜산 잔기 및 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 플루오로기로 치환하고, 또한 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기 및 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기를 메톡시기로 치환하고 있다. 단, 안티센스쇄의 5' 말단 측으로부터 1 내지 7번째의 리보뉴클레오티드 잔기에 대해서는 수식을 행하지 않았다.
표 7에 나타내는 화학 수식 패턴 A-3은, 본 발명에서 규정하고 있는 조건 (i) 내지 (ix)를 만족시키는 것이다.
Figure pct00007
각 SPG/화학 수식 siRNA 복합체 400nM을 50만개의 인간 말초혈 단핵구 세포(PBMC)에 전기 천공법에 의해 도입하였다. 도입 후, 각 세포를 48구멍 플레이트에 2×105cells/well이 되도록 파종하고, 동시에 TNFα를 2.5ng/mL가 되도록 첨가하여, 37℃, 5％ CO2 하에서 24시간 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포로부터 전체 RNA를 추출하고, 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하여, CD40 프라이머를 사용하여 리얼 타임 PCR을 행하고, CD40의 mRNA양을 측정하였다. siRNA를 삽입하지 않고 LPS 처리를 행한 것을 양성 컨트롤로 하고, siRNA를 삽입하지 않고 LPS 처리도 행하지 않은 것을 음성 컨트롤로 하였다. 또한, 결과의 해석은 ΔΔCT법으로 행하고, CD40의 mRNA양은, 하우스 키핑 유전자인 GAPDH양으로 보정하였다. 또한, 비교를 위해서, SPG/화학 수식 siRNA 복합체 대신에 화학 수식을 실시하지 않은 siRNA를 사용한 SPG/siRNA 복합체, 및 센스쇄 5' 말단에 S화한 40개의 데옥시아데닐산이 인산에스테르 결합에 의해 연결된 각종 화학 수식 siRNA를 사용하여 동일하게 시험을 행하였다.
얻어진 결과를 도 8에 나타낸다. 도 8 중, 「Complex」란 화학 수식을 실시하지 않은 siRNA를 사용한 SPG/siRNA 복합체, 「A-1」이란 화학 수식 패턴 A-1을 실시한 화학 수식 siRNA의 센스쇄 5' 말단에 S화한 40개의 데옥시아데닐산을 인산에스테르 결합에 의해 연결시킨 것, 「Complex A-1」이란 화학 수식 패턴 A-1을 실시한 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체, 「A-2」란 화학 수식 패턴 A-2를 실시한 화학 수식 siRNA의 센스쇄 5' 말단에 S화한 40개의 데옥시아데닐산을 인산에스테르 결합에 의해 연결시킨 것, 「Complex A-2」란 화학 수식 패턴 A-2를 실시한 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체, 「A-3」이란 화학 수식 패턴 A-3을 실시한 화학 수식 siRNA의 센스쇄 5' 말단에 S화한 40개의 데옥시아데닐산을 인산에스테르 결합에 의해 연결시킨 것, 「Complex A-3」이란 화학 수식 패턴 A-3을 실시한 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체이다. 이 결과, 화학 수식 패턴 A-3을 실시한 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체를 사용한 경우에, 유전자 발현 억제 효과가 가장 높아져 있었다.
이상의 시험예 1 내지 4의 결과로부터, 본 발명에서 규정하고 있는 조건 (i) 내지 (ix)를 만족시키는 화학 수식을 실시한 화학 수식 siRNA를 사용한 SPG/화학 수식 siRNA 복합체에 의해, RNase에 대한 내성 및 RNAi 활성이 모두 높고, 생체 내에서 사용해도 충분한 유전자 발현 효과가 발휘될 수 있는 것이 명확해졌다.
SEQUENCE LISTING <110> NapaJen Pharma, Inc. <120> Modified siRNA <130> 17105WO <150> JP2016-230640 <151> 2016-11-28 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of siRNA for CD40 <400> 1 cgugcaguga caaacaguat t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of siRNA for CD40 <400> 2 uacuguuugu cacugcacgt t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of hsiCD40(208) <400> 3 gacagaaacu ggugagugat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of hsiCD40(208) <400> 4 ucacucacca guuucuguct t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of hsiCD40(867) <400> 5 aguguggcca cgugggcaat t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of hsiCD40(867) <400> 6 uugcccacgu ggccacacut t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of hsiCD40(1019) <400> 7 cagaaacagu ucaccuugat t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand of hsiCD40(1019) <400> 8 ucaaggugaa cuguuucugt t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense srrand of hsiCD40(998) <400> 9 caggagaccu ggcacuggat t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense srrand of hsiCD40(998) <400> 10 uccagugcca ggucuccugt t 21

Claims (3)

  1. 센스쇄의 5' 말단에 폴리데옥시아데닐산이 부가되어 있는 화학 수식 siRNA로서,
    센스쇄의 염기 서열이, CA, UA 및 UG로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 디뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 염기 서열이, CA, UA 및 UG로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 디뉴클레오티드 서열을 포함하며, 또한
    하기 조건 (i) 내지 (ix)를 만족시키는 화학 수식 siRNA:
    (i) 센스쇄의 염기 서열에 있어서, CA를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 시티딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
    (ii) 센스쇄의 염기 서열에 있어서, UA를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
    (iii) 센스쇄의 염기 서열에 있어서, UG를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
    (iv) 안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 염기 서열에 있어서, CA를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 시티딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
    (v) 안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 염기 서열에 있어서, UA를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 아데닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
    (vi) 안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 8번째 이후의 염기 서열에 있어서, UG를 포함하는 디뉴클레오티드 서열이 포함되는 경우에는, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 우리딜산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 디뉴클레오티드 서열 중의 구아닐산 잔기의 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
    (vii) 안티센스쇄의 5' 말단측으로부터 1 내지 7번째의 리보뉴클레오티드 잔기는, 화학 수식이 실시되어 있지 않다.
    (viii) 상기 (i) 내지 (vi)에 따라서 화학 수식을 실시하면, 센스쇄의 5' 말단측으로부터 1번째 및 안티센스쇄 5' 말단측으로부터 19번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 모두 화학 수식되지 않은 경우에는, 센스쇄의 5' 말단측으로부터 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 시티딜산 잔기 또는 우리딜산 잔기라면 2' 위치의 히드록시기가 플루오로기로 치환되어 있으며, 당해 리보뉴클레오티드 잔기가 아데닐산 잔기 또는 구아닐산 잔기라면 2' 위치의 히드록시기가 메톡시기로 치환되어 있다.
    (ix) 상기 (i) 내지 (vi)에 따라서 화학 수식을 실시하면, 센스쇄의 5' 말단측으로부터 1번째 및 안티센스쇄 5' 말단측으로부터 19번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 모두 화학 수식되는 경우에는, 안티센스쇄 5' 말단측으로부터 19번째의 리보뉴클레오티드 잔기는 화학 수식이 실시되지 않는다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리데옥시아데닐산이 10 내지 100염기 길이인 화학 수식 siRNA.
  3. 제1항 또는 제2항에 기재된 화학 수식 siRNA가 시조피란과 복합화되어 있는 시조피란/화학 수식 siRNA 복합체.
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