JP7100367B2 - 化学修飾siRNA - Google Patents
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Description
項1. センス鎖の5'末端にポリデオキシアデニル酸が付加されている化学修飾siRNAであって、
センス鎖の塩基配列が、CA、UA、及びUGからなる群から選択される少なくとも1種のジヌクレオチド配列を含み、
アンチセンス鎖の5'末端側から8番目以降の塩基配列が、CA、UA、及びUGからなる群から選択される少なくとも1種のジヌクレオチド配列を含み、且つ
下記条件(i)~(ix)を満たす化学修飾siRNA:
(i)センス鎖の塩基配列において、CAからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(ii)センス鎖の塩基配列において、UAからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(iii)センス鎖の塩基配列において、UGからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のグアニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(iv)アンチセンス鎖の5'末端側から8番目以降の塩基配列において、CAからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(v)アンチセンス鎖の5'末端側から8番目以降の塩基配列において、UAからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(vi)アンチセンス鎖の5'末端側から8番目以降の塩基配列において、UGからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のグアニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(vii)アンチセンス鎖の5'末端側から1~7番目のリボヌクレオチド残基は、化学修飾が施されていない。
(viii)前記(i)~(vi)に従って化学修飾を施すと、センス鎖の5'末端側から1番目及びアンチセンス鎖5'末端側から19番目のリボヌクレオチド残基が共に化学修飾されない場合には、センス鎖の5'末端側から1番目のリボヌクレオチド残基がシチジル酸残基又はウリジル残基であれば2'位をフルオロ基で修飾されており、当該リボヌクレオチド残基がアデニル酸残基又はグアニル酸残基であれば2'位をメトキシ基で修飾されている。
(ix)前記(i)~(vi)に従って化学修飾を施すと、センス鎖の5'末端側から1番目及びアンチセンス鎖5'末端側から19番目のリボヌクレオチド残基が共に化学修飾される場合には、アンチセンス鎖5'末端側から19番目のリボヌクレオチド残基は化学修飾が施されない。
項2. 前記ポリデオキシアデニル酸が10~100塩基長である、項1に記載の化学修飾siRNA。
項3. 項1又は2に記載の化学修飾siRNAがシゾフィランと複合化されている、シゾフィラン/化学修飾siRNA複合体。
ポリデオキシアデニル酸が付加されたsiRNAの塩基配列・構造
本発明の化学修飾siRNAは、センス鎖の5'末端にポリデオキシアデニル酸が付加されてなり、センス鎖及びアンチセンス鎖が特定のジヌクレオチド配列を含み、当該ジヌクレオチド配列に特定の化学修飾が施されていることを特徴とする。以下、本発明の化学修飾siRNAについて詳述する。
本発明の化学修飾siRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖に対して、後述する条件(i)~(ix)に従った化学修飾(A-3修飾)が施されている。なお、本発明の化学修飾siRNAにおいて、センス鎖及びアンチセンス鎖は後述する条件(i)~(ix)以外の化学修飾は行わないことを要する。
本発明の化学修飾siRNAのセンス鎖は、以下の条件(i)~(iii)を満たすように化学修飾が施される。
(i)センス鎖の塩基配列において、CAからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(ii)センス鎖の塩基配列において、UAからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(iii)センス鎖の塩基配列において、UGからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のグアニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
本発明の化学修飾siRNAのアンチセンス鎖は、以下の条件(iv)~(vii)を満たすように化学修飾が施される。
(iv)アンチセンス鎖の5'末端側から8番目以降の塩基配列において、CAからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(v)アンチセンス鎖の5'末端側から8番目以降の塩基配列において、UAからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(vi)アンチセンス鎖の5'末端側から8番目以降の塩基配列において、UGからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のグアニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(vii)アンチセンス鎖の5'末端側から1~7番目のリボヌクレオチド残基は、化学修飾が施されていない。
本発明の化学修飾siRNAにおいて、センス鎖の5'末端側から1番目及びアンチセンス鎖5'末端側から19番目のリボヌクレオチド残基は、ポリデオキシアデニル酸に最も近接する位置に配されている。本発明の化学修飾siRNAでは、これらのリボヌクレオチド残基については、前記条件(i)~(vii)をそのまま当てはめてはいけない場合がある。
(viii)前記(i)~(vi)に従って化学修飾を施すと、センス鎖の5'末端側から1番目及びアンチセンス鎖5'末端側から19番目のリボヌクレオチド残基が共に化学修飾されない場合には、センス鎖の5'末端側から1番目のリボヌクレオチド残基がシチジル酸残基又はウリジル残基であれば2'位をフルオロ基で修飾されており、当該リボヌクレオチド残基がアデニル酸残基又はグアニル酸残基であれば2'位をメトキシ基で修飾されている。
(ix)前記(i)~(vi)に従って化学修飾を施すと、センス鎖の5'末端側から1番目及びアンチセンス鎖5'末端側から19番目のリボヌクレオチド残基が共に化学修飾される場合には、アンチセンス鎖5'末端側から19番目のリボヌクレオチド残基は化学修飾が施されない。
シチジル酸残基及びウリジル酸残基のリボース部分の2'位のヒドロキシ基をフルオロ基で置換(修飾)する方法、アデニル酸残基及びグアニル酸残基のリボース部分の2'位のヒドロキシ基をメトキシ基で置換(修飾)する方法は公知であり、本発明の化学修飾siRNAは、公知の手法で製造することができる。
本発明の化学修飾siRNAは、SPGと複合化させて、シゾフィラン/化学修飾siRNA複合体の状態で使用される。SPGは、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖であり、シゾフィラン/化学修飾siRNA複合体は、SPGが前述の細胞表面に存在する受容体Dctin-1と結合することによって、エンドサイトーシスで細部内に送達される。
以下の試験例で用いたSPG/化学修飾siRNA複合体は次のようにして形成した。分子量約15万のSPGを、0.25N水酸化ナトリウム水溶液に最終濃度15mg/mlになるように調製した後、1時間振動攪拌して4℃で1日静置し変性させた。330mMの第1リン酸ナトリウムに溶解させた、S化されたポリデオキシアデニル酸を付加した所定配列の化学修飾siRNAの溶液を、この変性SPG溶液に加えて中和し4℃で24時間以上静置した。この時、化学修飾siRNA 1モルに対してSPGが0.27モルとなるようにした。なお、S化されたポリデオキシアデニル酸を付加した化学修飾siRNAは、siRNAのセンス鎖5'末端に40個のデオキシアデニル酸が、リン酸エステル結合によって連結されたものである。
化学修飾がなされたCD40に対する化学修飾siRNA(表3に示すNJ050.11及びNJ050.13)を用いて、SPG/化学修飾siRNA複合体を調製した。また、ポリデオキシアデニル酸が付加されていない化学修飾siRNAとして、表3に示すNJ050.12及びNJ050.13を準備した。当該化学修飾siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列は、それぞれ配列番号1及び2に該当している。
NJ050.13の化学修飾siRNAを使用したSPG/化学修飾siRNA複合体では、遺伝子発現抑制効果は認められなかった要因として、塩基配列の脆弱性に起因するRLCへの取り込み不全の可能性が考えられたことから、本試験では、化学修飾siRNA、及びSPG/化学修飾siRNA複合体の血清中での安定性の評価を行った。
参考試験例2の結果から、S化したポリデオキシアデニル酸とsiRNAのセンス鎖との結合部位付近の安定性を高める必要性が示唆されたことから、センス鎖の接合部位に化学修飾を入れることとした。また、参考試験例1の結果から、NJ050.11で採用したセンス鎖修飾では活性を喪失することが懸念されるため、表4に示すNJ050.14の化学修飾を施したsiRNAを調製した。
NJ050.14の化学修飾siRNAを使用したSPG/化学修飾siRNA複合体200ngを血清(マウス血清、ヒト血清、及びFBS)に添加し、37℃で1分間又は30分間インキュベートした。次いで、試料と同量のTE飽和フェノール/クロロホルムを加え、ボルテックスで強撹拌した後、12000 ×gで15分間遠心分離した。次いで、上清を回収し、上清中の核酸濃度を分光光度計で測定し、核酸200ng相当量を15%ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供した。
NJ050.14の化学修飾siRNAは、アデニル酸残基及びグアニル酸残基の2'位のヒドロキシ基をメトキシ基で置換している箇所が多く、製造上、収率が低下することが懸念される。また、NJ050.14の化学修飾siRNAは、血清存在下で比較的安定であるとはいえ、NJ050.13の化学修飾siRNAよりも血清下での安定性が悪く、in vivoでの使用に耐えないと考えられる。そこで、S化したポリデオキシアデニル酸とsiRNAのセンス鎖との結合箇所への化学修飾は不可欠とするも、安定性を犠牲にしても、可能な限り化学修飾の数を減らして、適切な遺伝子発現抑制効果を備える化学修飾siRNAを開発することが必要になる。
NJ050.14又はNJ050.15の化学修飾siRNAを使用したSPG/化学修飾siRNA複合体、及び表6に示す化学修飾siRNAを使用したSPG/化学修飾siRNA複合体について、血清中での安定性を評価した。具体的には、各SPG/化学修飾siRNA複合体を1μMとなるように血清(ヒト血清、及びFBS)に添加し、37℃で16時間インキュベートした。次いで、試料と同量のTE飽和フェノール/クロロホルムを加え、ボルテックスで強撹拌した後、12000 ×gで15分間遠心分離した。次いで、上清を回収し、上清中の核酸濃度を分光光度計で測定し、核酸20ng相当量を15%ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供した。分解されていない化学修飾siRNAについて、Image J解析ソフトを用いて定量を行い、残存率(%)を求めた。
NJ050.14又はNJ050.15の化学修飾siRNAを使用したSPG/化学修飾siRNA複合体を用いて、x-vivo MLR(リンパ球混合培養)アッセイを行い、細胞増殖抑制効果を評価した。具体的には、NJ050.14又はNJ050.15の化学修飾siRNAを使用したSPG/化学修飾siRNA複合体を0.2μg/head又は2μg/headとなるように、BALB/cマウス(オス、9週齢)に尾静脈より投与した。20時間経過後、BALB/cマウスより脾臓を摘出し、定法に従って脾臓細胞(5×106 cells/mL)を調製した。得られた脾臓細胞に15Gyの放射線を照射して不活性化処理を行い、stimulator細胞を準備した。別途、C57BL/6マウス(オス、9週齢)の脾臓を摘出し、定法に従って脾臓細胞(5×106 cells/mL)を調製し、responder細胞を準備した。96穴プレートの各穴にstimulator細胞及びresponder細胞をそれぞれ100μLを入れて、37℃、5% CO2下で96時間混合リンパ球反応(MLR)を行った。反応後、細胞をCell Proliferation ELISA, BrdU kit(Roche Lifescence)を用いて細胞増殖を測定した。なお、SPG/化学修飾siRNA複合体の代わりに、PBSを使用したものをコントロールとした。
特定の法則の下で化学修飾を施したsiRNA(CD40に対するsiRNA、ヒト配列用)を用いてSPG/化学修飾siRNA複合体を調製した。具体的には、表7に示す各種化学修飾siRNAのセンス鎖5'末端に40個のS化されたデオキシアデル酸が、リン酸エステル結合によって連結されたものを準備し、前述する方法で各種SPG/化学修飾siRNA複合体を調製した。なお、表7に示すhsiCD40(208)のセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列は、それぞれ配列番号3及び4に該当し、hsiCD40(867)のセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列は、それぞれ配列番号5及び6に該当し、hsiCD40(1019)のセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列は、それぞれ配列番号7及び8に該当し、hsiCD40(998)のセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列は、それぞれ配列番号9及び10に該当している。
Claims (3)
- センス鎖の5'末端にポリデオキシアデニル酸が付加されている化学修飾siRNAであって、
センス鎖の塩基配列が、CA、UA、及びUGからなる群から選択される少なくとも1種のジヌクレオチド配列を含み、
アンチセンス鎖の5'末端側から8番目以降の塩基配列が、CA、UA、及びUGからなる群から選択される少なくとも1種のジヌクレオチド配列を含み、且つ
下記条件(i)~(ix)を満たす化学修飾siRNA:
(i)センス鎖の塩基配列において、CAからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(ii)センス鎖の塩基配列において、UAからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(iii)センス鎖の塩基配列において、UGからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のグアニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(iv)アンチセンス鎖の5'末端側から8番目以降の塩基配列において、CAからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(v)アンチセンス鎖の5'末端側から8番目以降の塩基配列において、UAからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(vi)アンチセンス鎖の5'末端側から8番目以降の塩基配列において、UGからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のグアニル酸残基の2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(vii)アンチセンス鎖の5'末端側から1~7番目のリボヌクレオチド残基は、化学修飾が施されていない。
(viii)前記(i)~(vi)に従って化学修飾を施すと、センス鎖の5'末端側から1番目及びアンチセンス鎖5'末端側から19番目のリボヌクレオチド残基が共に化学修飾されない場合には、センス鎖の5'末端側から1番目のリボヌクレオチド残基がシチジル酸残基又はウリジル残基であれば2'位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該リボヌクレオチド残基がアデニル酸残基又はグアニル酸残基であれば2'位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(ix)前記(i)~(vi)に従って化学修飾を施すと、センス鎖の5'末端側から1番目及びアンチセンス鎖5'末端側から19番目のリボヌクレオチド残基が共に化学修飾される場合には、アンチセンス鎖5'末端側から19番目のリボヌクレオチド残基は化学修飾が施されない。 - 前記ポリデオキシアデニル酸が10~100塩基長である、請求項1に記載の化学修飾siRNA。
- 請求項1又は2に記載の化学修飾siRNAがシゾフィランと複合化されている、シゾフィラン/化学修飾siRNA複合体。
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