ES2568933T3 - ARNbc como agente de control de insectos - Google Patents

Abstract

Un ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, en el que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en: (i) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040, 1061, 1113, 1437 y 1677, (ii) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoácidos representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 24, 260, 897 y 1114, y (iii) polirribonucleótidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleótidos de (i) o (ii).

Description

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de la plaga, muerte de la plaga, inhibición o diferenciación y desarrollo de la plaga, ausencia o capacidad reducida de la reproducción sexual por la plaga, formación de músculos, formación de hormona juvenil, regulación de hormona juvenil, regulación y transporte de iones, mantenimiento del potencial de la membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación del esperma, síntesis de feromonas, percepción de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación de patas, desarrollo y diferenciación, formación de huevos, maduración larvaria, formación de enzimas digestivas, síntesis de hemolinfa, mantenimiento de la hemolinfa, neurotransmisión, división celular, metabolismo energético, respiración, apoptosis y cualquier componente de la estructura citoesquelética de una célula eucariota, tales como, por ejemplo, actinas y tubulinas.

ADN complementario (ADNc) se refiere a un ADN monocatenario sintetizado a partir de un molde de ARNm maduro. Aunque hay varios métodos, el ADNc se sintetiza más frecuentemente a partir de ARNm maduro (completamente cortado y empalmado) usando la enzima transcriptasa inversa. Esta enzima actúa sobre una sola hebra de ARNm, generando su ADN complementario basándose en el emparejamiento de pares de bases de ARN (A, U, G, C) a sus complementos de ADN (T, A, C, G). Dos hebras de ácido nucleico son sustancialmente complementarias cuando se emparejan al menos un 85 % de sus bases.

Polinucleótido deseado: un polinucleótido deseado es un elemento genético, tal como un promotor, potenciador, o terminador, o un gen o un polinucleótido que se va a transcribir y/o traducir en una célula transformada que comprende el polinucleótido deseado en su genoma. Si el polinucleótido deseado comprende una secuencia que codifica un producto proteico, la región codificante puede unirse operativamente a elementos reguladores, tales como a un promotor y a un terminador, que producen la expresión de un transcrito de ARN mensajero asociado y/o un producto proteico codificado por el polinucleótido deseado. Por lo tanto, un "polinucleótido deseado" puede comprender un gen que está unido operativamente en la orientación 5' a 3' a un promotor, un gen que codifica una proteína y un terminador. Como alternativa, el polinucleótido deseado puede comprender un gen o un fragmento del mismo, en una orientación "sentido" o "antisentido", cuya transcripción produce ácidos nucleicos que pueden afectar a la expresión de un gen endógeno en la célula hospedadora. Un polinucleótido deseado también puede producir tras la transcripción un producto de ARN bicatenario tras lo que se inicia la interferencia de ARN de un gen al que se asocia el polinucleótido deseado. Un polinucleótido deseado puede posicionarse en un vector, de tal forma que las secuencias del límite izquierdo y derecho flanquean o se encuentran a cada lado del polinucleótido deseado. La presente divulgación prevé la integración estable de uno o más polinucleótidos deseados en el genoma de al menos una célula hospedadora. Un polinucleótido deseado puede estar mutado o ser una variante de su secuencia de tipo silvestre. Se entiende que la totalidad o parte del polinucleótido deseado puede integrarse en el genoma de un hospedador. También se entiende que la expresión "polinucleótido deseado" abarca uno o más de dichos polinucleótidos. Por lo tanto, un vector puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez

o más polinucleótidos deseados.

La “exposición” incluye cualquier método mediante el cual una plaga puede ponerse en contacto con un ARNbc, comprendiendo el ARNbc cadenas complementarias hibridadas, teniendo una de ellas una secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos parte de la secuencia de nucleótidos de un gen diana de plaga que se regula de modo negativo. Una plaga puede exponerse al ARNbc por captación directa (por ejemplo, a través de la alimentación), lo que no requiere la expresión del ARNbc en la plaga. Como alternativa, una plaga puede ponerse en contacto directo con una composición que comprenda el ARNbc. Por ejemplo, una plaga puede ponerse en contacto con una superficie o un material tratado con una composición que comprenda un ARNbc. Una célula hospedadora procariota (por ejemplo, pero sin limitación, una bacteria) o eucariota (por ejemplo, pero sin limitación, una levadura)

o un organismo hospedador, puede expresar un ARNbc.

Exógeno: “exógeno”, en referencia a un ácido nucleico, significa que ese ácido nucleico se deriva de organismos no hospedadores. El ADN o ARN exógeno representa ácidos nucleicos que son de origen natural en la composición genética de hongos, bacterias, virus, mamíferos, peces o aves, pero que no son de origen natural en el hospedador que se va a transformar. Por lo tanto, un ácido nucleico exógeno es uno que codifica, por ejemplo, un polipéptido que no se produce de manera natural por el hospedador transformado. Un ácido nucleico exógeno no tiene por qué codificar un producto proteico.

Gen: se refiere a una secuencia polinucleotídica que comprende secuencias de control y codificantes necesarias para la producción de un polipéptido o precursor. El polipéptido puede estar codificado por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificante. Un gen puede constituir una secuencia codificante no interrumpida o puede incluir uno o más intrones, unidos por las uniones de corte y empalme adecuadas. Además, un gen puede contener una o más modificaciones bien en las regiones codificantes o no traducidas que podrían afectar a la actividad biológica o a la estructura química del producto de expresión, a la velocidad de expresión o al modo de control de la expresión. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, mutaciones, inserciones, eliminaciones y sustituciones de uno o más nucleótidos. En este sentido, dichos genes modificados pueden citarse como "variantes" del gen "nativo".

Elemento genético: un “elemento genético” es cualquier secuencia nucleotídica discreta, tal como, pero sin limitación, un promotor, gen, terminador, intrón, potenciador, espaciador, región 5' no traducida, región 3' no traducida, o sitio de reconocimiento de recombinasa.

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Modificación genética: introducción estable de un ácido nucleico en el genoma de determinados organismos aplicando métodos de biología molecular y celular.

La "supresión génica" o "regulación negativa de la expresión génica" o "inhibición de la expresión génica" se usan de manera intercambiable y se refieren a una reducción medible u observable en la expresión génica o una supresión completa detectable de la expresión génica, al nivel de producto proteico y/o producto de ARNm del gen diana. La regulación negativa o inhibición de la expresión génica es "específica" cuando la regulación negativa o la inhibición del gen diana sucede sin efectos evidentes en otros genes de la plaga.

Dependiendo de la naturaleza del gen diana, la regulación negativa o la inhibición de la expresión génica en las células de una plaga puede confirmarse mediante análisis fenotípico de la célula o de la plaga completa o midiendo el ARNm o la expresión proteica usando técnicas moleculares, tales como hibridación de solución de ARN, protección de nucleasas, hibridación de Northern, retrotranscripción, control de la expresión génica con una micromatriz, unión de anticuerpos, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA), otros inmunoensayos o análisis de células activadas por fluorescencia (FACS).

Gimnosperma, tal como se usan en el presente documento, se refiere a una planta de semilla que porta semillas sin ovarios. Los ejemplos de gimnospermas incluyen coníferas, cícadas, ginkgos y efedras.

Homología, tal como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias. Es posible que las secuencias de proteínas o nucleótidos sean homólogas si muestran un nivel "significativo" de similitud de secuencia o más preferentemente de identidad de secuencia. Las secuencias realmente homólogas están relacionadas por la divergencia a partir de un gen antecesor común. Los homólogos de secuencia pueden ser de dos tipos: (i) en los casos donde existen homólogos en diferentes especies se conocen como ortólogos. Por ejemplo, los genes de αglobina en ser humano y ratón son ortólogos; (ii) los parálogos son genes homólogos en una sola especie. Por ejemplo, los genes de α-y β-globina en ratón son parálogos.

Una célula hospedadora se refiere a un microorganismo, a una célula procariota, a una célula eucariota, o a una línea celular cultivada como una entidad unicelular que puede usarse, o se ha usado como receptor para un vector recombinante u otra transferencia de polinucleótidos, e incluye la descendencia de la célula original que se ha transfectado. La descendencia de una célula individual puede no ser necesariamente completamente idéntica en su morfología en su genómica o en el complemento de ADN total que el progenitor original debido a mutaciones naturales, accidentales o deliberadas.

Introducción: tal como se usan en el presente documento, se refiere a la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula, mediante métodos que incluyen infección, transfección, transformación o transducción.

Las plagas de insectos tal como se usan en el presente documento incluyen, pero sin limitación:

del orden Lepidoptera, por ejemplo, Acleris spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amylois spp., Anticarsia gemmatalis, Archips spp, Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp., Cnephasia spp., Cochylis spp., Coleophora spp., Crocidolomia binotalis, Cryptophlebia leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea, Earias spp., Ephestia spp., Eucosma spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp., Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hellula undalis, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Leucoptera scitella, Lithocollethis spp., Lobesia botrana, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma spp., Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia Nubilalis, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis flammea, Pectinophora gossypiella, Phthorimaea operculella, Pieris rapae, Pieris spp., Plutella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia ni y Yponomeuta spp.; del orden Coleoptera, por ejemplo, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. y Trogoderma spp.; del orden Orthoptera, por ejemplo, Blatta spp., Blattella spp., Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta ssp. y Schistocerca spp.; del orden Isoptera, por ejemplo, Reticulitemes ssp; del orden Psocoptera, por ejemplo, Liposcelis spp.; del orden Anoplura, por ejemplo, Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Pemphigus spp. y Phylloxera spp.; del orden Mallophaga, por ejemplo, Damalinea spp. y Trichodectes spp.; del orden Thysanoptera, por ejemplo, Franklinella spp., Hercinothrips spp., Taeniothrips spp., Thrips palmi, Thrips tabaci y Scirtothrips aurantii; del orden Heteroptera, por ejemplo, Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptocorisa spp., Nezara spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scotinophara spp., Triatoma spp., familia Miridae spp. tales como Lygus hesperus y Lygus lineoloris, familia Lygaeidae spp. tales como Blissus leucopterus y familia Pentatomidae spp.; del orden Homoptera, por ejemplo, Aleurothrixus floccosus, Aleyrodes brassicae, Aonidiella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bemisia tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus dictyospermi, Coccus hesperidum, Empoasca spp., Eriosoma larigerum, Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lacanium corni, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nehotettix spp., Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphigus spp., Planococcus spp., Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla ssp.,

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Pulvinaria aethiopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp.., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Sitobion spp., Trialeurodes vaporariorum, Trioza erytreae y Unaspis citri; del orden Hymenoptera, por ejemplo, Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Diprion spp., Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Neodiprion spp, Solenopsis spp. y Vespa ssp.; del orden Diptera, por ejemplo, Aedes spp., Antherigona soccata, Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis spp., Chrysomyia spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Drosophila melanogaster, Fannia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomysa spp., Lucilia spp., Melanagromyza spp., Musca ssp., Oestrus spp., Orseolia spp., Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis pomonella, Sciara spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. y Tipula spp., del orden Siphonaptera, por ejemplo, Ceratophyllus spp. y Xenopsylla cheopis y del orden Thysanura, por ejemplo, Lepisma saccharina.

Una planta monocotiledónea (monocot) es una planta de flor que tiene embriones con un cotiledón u hoja de semilla, venas foliares paralelas y partes de flor en múltiplos de tres. Los ejemplos de monocotiledóneas incluyen, pero sin limitación, césped, maíz, arroz, avena, trigo, cebada, sorgo, orquídea, iris, lirio, cebolla y palmera.

Plaga o plaga diana se refiere a insectos, arácnidos, crustáceos, hongos, bacterias, virus, nematodos, platelmintos, lombrices, oxiuros, anquilosomas, tenias, tripanosomas, esquistosomas, moscardones, pulgas, garrapatas, ácaros y piojos y similares que son parasíticos en el ambiente humano. Una plaga puede ingerir o entrar en contacto con una

o más células, tejidos, o productos producidos por un organismo transformado con un agente de supresión génica bicatenario, así como un material o una superficie tratada con un agente de supresión génica bicatenario.

Los nematodos, o lombrices, son uno de los phylums de animales más comunes, con más de 20.000 especies diferentes descritas (más de 15.000 son parasíticas. Son ubicuos en ambientes de agua dulce, marinos y terrestres, donde generalmente superan en número a otros animales en cuando al recuento de individuos y de especies y se encuentran en localizaciones tan diversas como la Antártida y fosas oceánicas. Además, hay muchas formas parasíticas, incluyendo patógenos en la mayoría de plantas y animales.

Las plagas de nematodos de interés particular incluyen, por ejemplo, A. caninum, A. ceylancium, H. contortus, O. ostertagi, C. elegans, C. briggsae, P. pacificus, S. stercoralis, S. ratti, P. trichosuri, M. arenaria, M. chitwoodi, M. hapla, M. incognita, M. javanica, M. paraensis, G. rostochiensis, G. pallida, H. glycines, H. schattii, P. penetrans, P. vulnus, R. similis, Z. punctata, A. suum, T. canis, B. malayi, D. immitis, O. volvulus, T. vulpis, T. spiralis, X. index. A. duodenale, A. lumbricoides, así como especies de los siguientes géneros: Aphelenchoides, Nacobbus, Ditylenchus, Longidorus, Trichodorus y Bursaphelenchus.

Una célula normal se refiere a una célula de un fenotipo no transformado o que muestra una morfología de una célula no transformada del tipo de tejido que se está examinando.

Unido operativamente: combinar dos o más moléculas de tal modo que en combinación funcionan adecuadamente en una célula. Por ejemplo, un promotor se une operativamente a un gen estructural cuando el promotor controla la transcripción del gen estructural.

Los ortólogos son genes que están relacionados por descendencia vertical de un ancestro común y codifican proteínas con la misma función en especies diferentes. Debido a su separación después de un suceso de especiación, los ortólogos pueden divergir, pero normalmente tienen similitudes a niveles de secuencia y de estructura. Dos genes que se derivan de un ancestro común y codifican proteínas con función similar se citan como ortólogos. La identificación de ortólogos es crítica para hacer predicciones fiables de la función génica en genomas recién secuenciados.

Un "agente para el control de plagas" o un "agente de supresión génica" se refiere a una molécula particular de ARN que comprende un primer segmento de ARN y un segundo segmento de ARN, en el que la complementariedad entre el primer y el segundo segmento de ARN da como resultado la capacidad de los dos segmentos para que hibriden in vivo e in vitro para formar una molécula bicatenaria. Generalmente, puede ser preferible incluir un tercer segmento de ARN que enlace y estabilice a la primera y segunda secuencia de tal forma que puede formarse un tallo unido junto a un extremo de cada uno del primer y el segundo segmento por el tercer segmento para formar un bucle, de tal forma que la estructura completa forma una estructura de tallo y bucle, o las estructuras que hibridan de una manera más estrechas pueden formar una estructura de tallo-bucle anudada. Como alternativa, podría formarse una horquilla simétrica sin un tercer segmento en el que no se ha diseñado un bucle, pero que por razones estéricas una horquilla podría formar su propio bucle cuando el tallo es lo suficientemente largo como para estabilizarse por sí mismo. El primer y el segundo segmento de ARN se encontrará generalmente entre la longitud de la molécula de ARN y será una repetición sustancialmente invertida del otro y se unen juntos mediante el tercer segmento de ARN. El primer y el segundo segmento corresponde invariablemente y no respectivamente a una secuencia sentido y una antisentido respecto del ARN transcrito a partir del gen diana en la plaga de insecto diana que se suprime por la ingestión de la molécula de ARNbc.

El agente de control de plagas puede ser una molécula de ácido nucleico sustancialmente purificada (o aislada) y más específicamente moléculas de ácido nucleico o fragmentos de moléculas de ácido nucleico de las mismas de un ADN genómico (ADNg) o una biblioteca de ADNc. Como alternativa, los fragmentos pueden comprender

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oligonucleótidos más pequeños que tengan de aproximadamente 15 a aproximadamente 250 restos de nucleótidos y más preferentemente, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 restos de nucleótidos.

Un pesticida se refiere a cualquier sustancia o mezcla de sustancias pensadas para prevenir, destruir, repeler o mitigar cualquier plaga. Un pesticida puede ser una sustancia química o un agente biológico, usada contra plagas incluyendo insectos, patógenos, malas hierbas, nematodos y microbios que compiten con los humanos por la comida, destruyen la propiedad, esparcen enfermedades o son una molestia.

El fenotipo es un rasgo o característica distintiva de un organismo, que puede alterarse integrando uno o más "polinucleótidos deseados" y/o marcadores de selección/exploración en el genoma de al menos una célula de un organismo transformado. Los "polinucleótidos deseados" y/o marcadores pueden conferir un cambio en el fenotipo de un organismo transformado, modificando una cualquiera de una serie de características o propiedades genéticas, moleculares, bioquímicas, fisiológicas o morfológicas de la célula o organismo transformado en su conjunto.

Planta y tejido vegetal: una "planta" es cualquiera de los diversos organismos fotosintéticos, eucariotas y multicelulares del reino Plantae que de manera característica producen embriones, contienen cloroplastos y tienen paredes celulares de celulosa. Una parte de una planta, es decir, un "tejido de planta" puede tratarse de acuerdo con los métodos de la presente divulgación para prevenir intestaciones por plagas de la planta o de la parte de la planta. Pueden tratarse muchos tejidos de plantas e incluyen, pero sin limitación, embriones somáticos, polen, hojas, tallos, callos, estolones, microtubérculos y brotes. Por lo tanto, la presente divulgación prevé el tratamiento de plantas angiospermas y gimnospermas tales como acacia, alfalfa, manzana, albaricoque, alcachofa, fresno, espárrago, aguacate, banana, cebada, judía, remolacha, abedul, haya, mora, arándano, brécol, coles de Bruselas, repollo, colza, cantalupo, zanahoria, mandioca, coliflor, cedro, un cereal, apio, castaña, cereza, col china, cítricos, clementinas, trébol, café, maíz, algodón, caupí, pepino, ciprés, berenjena, olmo, endivia, eucalipto, hinojo, higos, abeto, geranio, uva, pomelo, cacahuete, cereza de suelo, cicuta, nogal americano, con rizada, kiwi, colinabo, alerce, lechuga, puerro, limón, lima, algarroba, pino, culantrillo, maíz, mango, arce, melón, mijo, champiñón, mostaza, nuez, roble, avena, okra, cebolla naranja, una planta, flor o árbol ornamental, papaya, palma, perejil, chirivía, guisante, melocotón, cacahuete, pera, turba, pimiento, caqui, guandul, pino, piña, plátano, ciruela, granada, patata, calabaza, achicoria, rábano, colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, sauce, soja, espinaca, pícea, calabaza, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, batata, maíz dulce, mandarina, té, tabaco, tomate, árboles, tritical, céspedes, nabo, una vid, nogal, berro, sandía, trigo, batata, tejo y calabacín.

De acuerdo con la presente divulgación, un "tejido de planta" también abarca células vegetales. Las células vegetales incluyen cultivos en suspensión, callos, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, semillas y microesporas. Los tejidos de plantas pueden estar en varios estados de madurez y pueden crecerse en cultivo líquido o sólido, o en suelo o medio adecuado en macetas, invernaderos o campos. Un tejido de planta también se refiere a cualquier clon de dicha planta, semilla, descendencia, propágulo ya se genere sexual o asexualmente y los descendientes de cualquiera de estos, tales como esquejes o semillas.

Promotor: pretende significar un ácido nucleico, preferentemente ADN que se une a ARN polimerasa y/o a otros elementos reguladores de la transcripción. Como con cualquier promotor, los promotores facilitarán o controlarán la transcripción del ADN o ARN para generar una molécula de ARNm a partir de una molécula de ácido nucleico que está unida operativamente al promotor. Tal como se ha afirmado anteriormente, el ARN generado puede codificar una proteína o polipéptido o puede codificar un ARN de interferencia, o una molécula antisentido.

Un polinucleótido es una secuencia nucleotídica que comprende una secuencia génica codificante o un fragmento de la misma, un promotor, un intrón, una región potenciadora, un sitio de poliadenilación, un sitio de inicio de la traducción, regiones 5' o 3' no traducidas, un gen indicador, un marcador de selección o similares. El polinucleótido puede comprender ADN o ARN monocatenario o bicatenario. El polinucleótido puede comprender bases modificadas o una estructura modificada. El polinucleótido puede ser genómico, un transcrito de ARN (tal como ARNm) o una secuencia nucleotídica procesada (tal como un ADNc). El polinucleótido puede comprender una secuencia en orientación sentido o antisentido.

Un polinucleótido aislado es una secuencia polinucleotídica que no está en su estado nativo, por ejemplo, el polinucleótido está compuesto de una secuencia nucleotídica no encontrada en la naturaleza o el polinucleótido está separado de secuencias nucleotídicas con las que está típicamente en proximidad o está próximo a secuencias nucleotídicas con las que típicamente no está en proximidad.

Una secuencia nucleotídica recombinante se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene una modificación diseñada por ingeniería genética mediante manipulación por mutagénesis, enzimas de restricción y similares.

Interferencia de ARN (ARNi) se refiere a la supresión específica de secuencia o específica de gen de la expresión génica (síntesis de proteínas) que está mediada por ARN pequeño interferente (ARNpi).

Identidad de secuencia: tal como se usa en el presente documento, la "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico incluye referencia a los restos en las dos secuencias que son iguales

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cuando se alinean para máxima correspondencia a lo largo de una región específica.

Tal como se usa en el presente documento, el porcentaje de identidad de secuencia significa el valor determinado al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de una ventana de comparación, en el que la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia.

La "identidad de secuencia" tiene un significado reconocido en la técnica y puede calcularse usando técnicas publicadas. Véase COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, ed. (Oxford University Press, 1988), BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, ed. (Academic Press, 1993), COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PARTE I, Griffin y Griffin, eds., (Humana Press, 1994), SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje ed., Academic Press (1987), SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov y Devereux, eds. (Macmillan Stockton Press, 1991) y Carillo y Lipton, SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988). Los métodos empleados comúnmente para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, aquellos divulgados en GUIDE To HUGE COMPUTERS, Bishop, ed., (Academic Press, 1994) y Carillo y Lipton, anteriormente citado. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas informáticos. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, al paquete informático GCG (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)) y FASTDB (Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6: 237 (1990)).

Los ARN de horquilla corta (ARNhc) son ARN monocatenarios que tienen un alto grado de estructura secundaria, de tal forma que una porción de la hebra de ARN forma un bucle de horquilla.

ARN pequeño interferente (ARNpi) se refiere a moléculas de ARN bicatenario de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que se nombran por su capacidad para interferir de manera específica con la expresión génica de proteínas.

Una secuencia diana se refiere a una secuencia nucleotídica en una plaga que se selecciona para su supresión o inhibición mediante tecnología de ARN bicatenario. Una secuencia diana codifica una característica o actividad biológica esencial en una plaga.

Terminadores transcripcionales: Las construcciones de expresión de ADN tienen típicamente una región de terminación transcripcional en el extremo opuesto de la región reguladora del inicio de la transcripción. La región de terminación puede seleccionarse para estabilidad del ARNm para potenciar la expresión y/o para la adición de colas de poliadenilación añadidas al producto de transcripción génica. La traducción de un nuevo polipéptido sufre terminación cuando cualquiera de los tres codones de terminación de cadena entran en el sitio A en el ribosoma. Los codones de terminación de la traducción son UAA, UAG y UGA.

Transformación: Un proceso mediante el cual se inserta de manera estable un ácido nucleico en el genoma de un organismo. La transformación puede suceder en condiciones naturales o artificiales usando diversos métodos bien conocidos en la técnica. La transformación puede basarse en cualquier método conocido para la inserción de secuencias de ácido nucleico en una célula hospedadora procariota o eucariota, incluyendo la transformación mediada por microorganismos, infección viral, bigotes, electroporación, microinyección, tratamiento con polietilenglicol, choque térmico, lipofección y bombardeo con micropartículas.

Un organismo transgénico comprende al menos una célula en la que un ácido nucleico exógeno se ha integrado de manera estable. Un organismo transgénico es, por ejemplo, una bacteria, o una célula hospedadora eucariota, tal como una levadura, o un organismo hospedador. La bacteria puede seleccionarse del grupo que comprende bacterias Gram negativas y Gram positivas, tales como, pero sin limitación, Escherichia spp. (por ejemplo E. coli), Bacillus spp. (por ejemplo B. thuringiensis), Rhizobium spp; Lactobacillus spp., Lactococcus spp., etc. La bacteria puede seleccionarse del grupo que comprende Saccharomyces spp., etc.

Variante: una "variante", tal como se usa en el presente documento, pretende indicar una secuencia nucleotídica que se desvía de la secuencia nucleotídica o aminoacídica estándar o dada de un gen o una proteína particular. Los términos "isoforma", "isotipo" y "análogo" también se refieren a formas "variantes" de una secuencia nucleotídica. Una "variante" también puede referirse a un "gen reordenado", tal como aquellos descritos en las patentes asignadas a Maxygen.

Se entiende que la presente divulgación no está limitada a la metodología particular, protocolos, vectores y reactivos, etc., descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento solo se usa con el fin de describir realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente divulgación. Cabe destacar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas del singular "un", "una" y "el" o "la" incluyen referencia en plural a

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menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a "un gen" es una referencia a uno o más genes e incluye equivalentes de los mismos conocidos para los expertos en la materia.

I. Plagas diana

La presente divulgación proporciona metodologías y construcciones para controlar las infestaciones por plagas de insectos administrando a, o exponendo, una plaga una secuencia codificante diana que suprime o inhibe de manera post-transcripcional una función biológica requerida en la plaga. Tal como se usa en el presente documento, el término "plaga" se refiere a insectos, arácnidos, crustáceos, hongos, bacterias, virus, nematodos, platelmintos, lombrices, oxiuros, anquilosomas, tenias, tripanosomas, esquistosomas, moscardones, pulgas, garrapatas, ácaros y piojos y similares que son parasíticos en el ambiente humano. Una plaga puede ingerir o entrar en contacto con una

o más células, tejidos, o productos producidos por un organismo transformado con un agente de supresión génica bicatenario, así como una superficie o un material tratado con un agente de supresión génica bicatenario.

Un rasgo de "resistencia a plagas" es una característica de un hospedador transgénico que hace que el hospedador sea resistente al ataque de una plaga que típicamente inflige daño al hospedador. Dicha resistencia a plagas puede surgir de una mutación natural o más típicamente de la incorporación de ADN recombinante que confiere resistencia a plagas. Para conferir resistencia a plagas a un hospedador transgénico, un ADN recombinante puede, por ejemplo, transcribirse en una molécula de ARN que forma una molécula de ARNbc en los tejidos o fluidos del hospedador recombinante. La molécula de ARNbc está compuesta en parte de un segmento de ARN que es idéntico a un segmento correspondiente de ARN codificado a partir de una secuencia de ADN en una plaga que prefiere alimentarse del hospedador recombinante. La expresión del gen en la plaga diana se suprime por el ARNbc y la supresión de la expresión del gen en la plaga diana da como resultado que el hospedador sea resistente la plaga.

Las plagas adecuadas incluyen cualquier organismo que cause daño a otro organismo. La divulgación contempla plagas de insectos, nematodos y hongos en particular.

Insecto tal como se usa en el presente documento puede ser cualquier insecto, lo que significa cualquier organismo que pertenece al reino de los Animales, más específicamente al phylum Arthropoda y a la clase Insecta o a la clase arachnida. Los métodos son aplicables a todos los insectos que son susceptibles de silenciamiento génico mediante interferencia de ARN y que son capaces de internalizar ARN bicatenario a partir de su ambiente inmediato.

El insecto puede pertenecer a los siguientes órdenes: Acari, Araneae, Anoplura, Coleoptera, Collembola, Dermaptera, Dictyoptera, Diplura, Diptera, Embioptera, Ephemeroptera, Grylloblatodea, Hemiptera, Homoptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Mecoptera, Neuroptera, Odonata, Orthoptera, Phasmida, Plecoptera, Protura, Psocoptera, Siphonaptera, Siphunculata, Thysanura, Strepsiptera, Thysanoptera, Trichoptera y Zoraptera.

El insecto se selecciona entre el grupo que consiste en:

(1)

un insecto que es una plaga para plantas, tal como, pero sin limitación Nilaparvata spp. (por ejemplo, N. lugens (saltamontes marrón)); Laodelphax spp. (por ejemplo, L. striatellus (saltamontes marrón pequeño)); Nephotettix spp. (por ejemplo, N. virescens o N. cincticeps (saltahojas verde), o N.nigropictus (saltahojas del arroz)); Sogatella spp. (por ejemplo, S. furcifera (saltamontes de dorso blanco)); Blissus spp. (por ejemplo, B. leucopterus leucopterus (chinche)); Scotinophora spp. (por ejemplo, S. vermidulate (insecto negro del arroz)); Acrosternum spp. (por ejemplo,

A.

hilare (chinche verde)); Parnara spp. (por ejemplo, P. guttata (saltador del arroz)); Chilo spp. (por ejemplo, C. suppressalis (barrenador rayado del tallo del arroz), C. auricilius (barrenador del tallo de flecos dorados), o C. polychrysus (barrenador del tallo de cabeza negra)); Chilotraea spp. (por ejemplo, C. polychrysa (barrenador del tallo del arroz)); Sesamia spp. (por ejemplo, S. inferens (barrenador rosa del arroz)); Tryporyza spp. (por ejemplo, T. innotata (barrenador blanco del arroz), o T. incertulas (barrenador amarillo del arroz)); Cnaphalocrocis spp. (por ejemplo, C. medinalis (enrollador de la hoja del arroz)); Agromyza spp. (por ejemplo, A. osyzae (mosca minadora), o

A.

parvicornis (mosca minadora de la hoja del maíz)); Diatraea spp. (por ejemplo, D. saccharalis (barrenador de la caña del azúcar), o D. grandiosella (barrenador del maíz del suroeste)); Narnaga spp. (por ejemplo, N. aenescens (oruga verde del arroz)); Xanthodes spp. (por ejemplo, X. transversa (oruga verde)); Spodoptera spp. (por ejemplo,

S.

frugiperda (gusano cogollero), S. exigua (oruga de la remolacha), S. littoralis (oruga podadora) o S. praefica (oruga podadora de rayas amarillas occidental)); Mythimna spp. (por ejemplo, Mythmna (Pseudaletia) seperata (oruga negra)); Helicoverpa spp. (por ejemplo, H. zea (gusano del maíz)); Colaspis spp. (por ejemplo, C. brunnea (colaspis de la uva)); Lissorhoptrus spp. (por ejemplo, L. oryzophilus (picudo acuático del arroz)); Echinocnemus spp. (por ejemplo, E. squamos (picudo de la planta del arroz)); Diclodispa spp. (por ejemplo, D. armigera (hispa del arroz)); Oulema spp. (por ejemplo, O. oryzae (escarabajo de la hoja); Sitophilus spp. (por ejemplo, S. oryzae (picudo del arroz)); Pachydiplosis spp. (por ejemplo, P. oryzae (mosquito enano del arroz)); Hydrellia spp. (por ejemplo, H. griseola (minador pequeño del arroz), o H. sasakii (gusano del tallo del arroz)); Chlorops spp. (por ejemplo, C. oryzae (gusano del arroz)); Ostrinia spp. (por ejemplo, O. nubilalis (barrenador europeo del maíz)); Agrotis spp. (por ejemplo, A.ipsilon (gusano cortador negro)); Elasmopalpus spp. (por ejemplo, E. lignosellus (barrenador menor del tallo del maiz)); Melanotus spp. (gusano alambre); Cyclocephala spp. (por ejemplo, C. borealis (escarabajo rubio del norte), o C. immaculata (escarabajo rubio del sur)); Popillia spp. (por ejemplo, P. japonica (escarabajo japonés));

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Phormia spp., Sarcophaga spp., Simulium spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. o Tipula spp.; Mallophaga (piojo mordedor) por ejemplo representantes de las especies Damalina spp., Felicola spp., Heterodoxus spp. o Trichodectes spp.; o Siphonaptera (insectos ápteros) por ejemplo representantes de las especies Ceratophyllus spp., spp., Pulex spp., o Xenopsylla spp; Cimicidae (chinches verdaderas) por ejemplo representantes de las especies Cimex spp., Tritominae spp., Rhodinius spp., o Triatoma spp.

y

(3) un insecto que causa daños no deseados a sustratos o a materiales, tales como insectos que atacan a los comestibles, a las semillas, a la madera, a la pintura, al plástico, a textiles, etc.

Los métodos de la divulgación son aplicables a todos los nematodos y hongos que sean susceptibles al silenciamiento génico por interferencia de ARN y que puedan internalizar el ARN bicatenario desde su entorno inmediato.

En una realización, el nematodo puede pertenecer a la familia Heteroderidae, que incluye los géneros Heterodera y Globodera.

En los métodos y en las realizaciones preferidas, pero sin limitación, de la invención el nematodo se selecciona del grupo que comprende, pero sin limitación:

(1)

un nematodo que es un nematodo patógeno para plantas, tales como, sin limitación: Meloidogyne spp. (por ejemplo M. incognita, M. javanica, M. graminicola, M. arenaria, M. chitwoodi, M. hapla o M. paranaensis); Heterodera spp. (por ejemplo H. oryzae, H. glycines, H. zeae o H. schachtii); Globodera spp. (por ejemplo G. pallida o G. rostochiensis); Rotylenchulus spp. (por ejemplo R. reniformis); Pratylenchus spp. (por ejemplo P. coffeae, P. Zeae o

P.

goodeyi); Radopholus spp. (por ejemplo R. similis); Hirschmaniella spp. (por ejemplo H. oryzae); Ancylostoma spp. (por ejemplo A. caninum, A. ceylanicum, A. duodenale o A. tubaeforme); Anisakid; Aphelenchoides spp. (por ejemplo A. Besseyi); Ascarids; Ascaris spp., (por ejemplo A. suum o A. lumbridoides); Belonolaimus spp.; Brugia spp. (por ejemplo B. malayi o B. pahangi); Bursaphelenchus spp.; Caenorhabditis spp. (por ejemplo C. elegans, C. briggsae o C. remanei); Clostridium spp. (por ejemplo C. acetobutylicum); Cooperia spp. (por ejemplo C. oncophora); Criconemoides spp.; Cyathostomum spp. (por ejemplo C. catinatum, C. coronatum o C. pateratum); Cylicocyclus spp. (por ejemplo C. insigne, C. nassatus o C. radiatus); Cylicostephanus spp. (por ejemplo C. goldi o C. longibursatus); Diphyllobothrium; Dirofilaria spp. (por ejemplo D. immitis); Ditylenchus spp. (por ejemplo D. dipsaci,

D.

destructor o D. Augustus); Enterobius spp. (por ejemplo E. vermicularis); Haemonchus spp. (por ejemplo H. contortus); Helicotylenchus spp.; Hoplolaimus spp.; Litomosoides spp. (por ejemplo L. sigmodontis); Longidorus spp. (por ejemplo L. macrosoma); Necator spp. (por ejemplo N. americanus); Nippostrongylus spp. (por ejemplo N. brasiliensis); Onchocerca spp. (por ejemplo O. volvulus); Ostertagia spp. (por ejemplo O. ostertagi); Parastrongyloides spp. (por ejemplo P. trichosuri); Paratrichodorus spp. (por ejemplo P. minor o P. teres); Parelaphostrongylus spp. (por ejemplo P. tenuis); Radophulus spp.; Scutellonerna. spp.; Strongyloides spp. (por ejemplo S. Ratti o S. stercoralis); Teladorsagia spp. (por ejemplo T. circumcincta); Toxascaris spp. (por ejemplo T. leonina); Toxocara spp. (por ejemplo T. canis o T. cati); Trichinella spp. (por ejemplo T. britovi, T. spiralis o T. spirae); Trichodorus spp. (por ejemplo T. similis);Trichuris spp. (por ejemplo T. muris, T. vulpis o T. trichiura); Tylenchulus spp.; Tylenchorhynchus spp.; Uncinaria spp. (por ejemplo U. stenocephala); Wuchereria spp. (por ejemplo W. bancrofti); Xiphinema spp. (por ejemplo X. Index o X. americanum).

(2)

un nematodo capaz de infestar seres humanos tales como, pero sin limitación: Enterobius vermicularis, el oxiuro que causa la enterobiasis; Ascaris lumbridoides, el ascárido del intestino grueso que causa la ascariasis; Necator y Ancylostoma, dos tipos de anquilostomas que causan la anquilostomiasis; Trichuris trichiura, el tricocéfalo que causa la tricuriasis; Strongyloides stercoralis que causa la estrongiloidiasis; y Trichonella spirae que causa la triquinosis; Brugia malayi y Wuchereria bancrofti, los nematodos de la filaria asociados con infecciones causadas por gusanos conocidas como filariasis linfática y su grotesca manifestación, la elefantiasis, y Onchocerca volvulus que causa la ceguera del río. La transferencia de nematodos a seres humanos también puede producirse a través de mosquitos hematófagos, que se han alimentado de animales o de seres humanos infectados;

(3)

un nematodo capaz de infestar animales tales como, pero sin limitación: perros (anquilostomas, por ejemplo Ancylostoma caninum o Uncinaria stenocephala, ascáridos, por ejemplo, Toxocara canis o Toxascaris leonina, o tricocéfalos, por ejemplo, Trichuris vulpis), gatos (anquilostomas, por ejemplo, Ancylostoma tubaeforme, ascáridos, por ejemplo, Toxocara cati), peces (gusanos del arenque o del bacalao por ejemplo Anisakid, o céstodos por ejemplo Diphyllobothrium), ovejas (elatéridos por ejemplo Haemonchus contortus) y ganado (gusanos gastrointestinales por ejemplo Ostertagia ostertagi, Cooperia oncophora);

(4)

un nematodo que causa daños no deseados a sustratos o a materiales, tales como nematodos que atacan a comestibles, semillas, madera, pintura, plástico, textiles, etc. Los ejemplos de dichos nematodos se incluyen, pero sin limitación, Meloidogyne spp. (por ejemplo M. incognita, M. javanica, M. arenaria, M. graminicola, M. chitwoodi o

M.

hapla); Heterodera spp. (por ejemplo H. oryzae, H. glycines, H. zeae o H. schachtii); Globodera spp. (por ejemplo

G.

pallida o G. rostochiensis); Ditylenchus spp. (por ejemplo D. dipsaci, D. destructor o D. angustus); Belonolaimus spp.; Rotylenchulus spp. (por ejemplo R. reniformis); Pratylenchus spp. (por ejemplo P. coffeae, P. goodeyi o P.

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zeae); Radopholus spp. (por ejemplo R. Similis); Hirschmaniella spp. (por ejemplo H. oryzae); Aphelenchoide spp. (por ejemplo A. besseyi); Criconemoides spp.; Longidorus spp.; Helicotylenchus spp.; Hoplolaimus spp.; Xiphinema spp.; Paratrichodorus spp. (por ejemplo P. minor); Tylenchorhynchi spp;

(5) nematodos trasmisores de virus (por ejemplo Longidorus macrosoma: transmite el virus de mancha anular necrótica del Prunus; Xiphinema americanum: transmite el virus de la mancha anular del tabaco, Paratrichadorus teres: trasmite el virus de la descomposición precoz del guisante, o Trichodorus similis: trasmite el virus de la necrosis del tabaco).

Las plagas fúngicas de particular interés incluyen, pero sin limitación, las siguientes. En una realización, el hongo puede ser un moho, o más particularmente un hongo filamentoso. En otras realizaciones el hongo puede ser una levadura.

En una realización el hongo puede ser un hongo ascomiceto, es decir, un hongo que pertenece al Phylum

Ascomycota.

En realizaciones preferidas, pero no limitantes, la célula fúngica se selecciona del grupo que consiste en:

(1) una célula fúngica de, o una célula derivada de un hongo patógeno para plantas, tales como, pero sin limitación,

Acremoniella spp., Alternaria spp. (por ejemplo Alternaria brassicola o Alternaria solani), Ascochyta spp. (por ejemplo Ascochyta pisi), Botrytis spp. (por ejemplo Botrytis cinerea o Botryotinia fuckeliana), Cladosporium spp., Cercospora spp. (por ejemplo Cercospora kikuchii o Cercospora zaea-maydis), Cladosporium spp. (por ejemplo Cladosporium fulvum), Colletotrichum spp. (por ejemplo Colletotrichum lindemuthianum), Curvularia spp., Diplodia spp. (por ejemplo Diplodia maydis), Erysiphe spp. (por ejemplo Erysiphe graminis f.sp. graminis, Erysiphe graminis f.sp. hordei o Erysiphe pisi), Erwinia armylovora, Fusarium spp. (por ejemplo Fusarium nivale, Fusarium sporotrichioides, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium germinearum, Fusarium culmorum, Fusarium solani, Fusarium moniliforme o Fusarium roseum), Gaeumanomyces spp. (por ejemplo Gaeumanomyces graminis f.sp. tritici), Gibberella spp. (por ejemplo Gibberella zeae), Helminthosporium spp. (por ejemplo Helminthosporium turcicum, Helminthosporium carbonum, Helminthosporium mavdis o Helminthosporium sigmoideum), Leptosphaeria salvinii, Macrophomina spp. (por ejemplo Macrophomina phaseolina), Magnaportha spp. (por ejemplo Magnaporthe oryzae), Mycosphaerella spp., Nectria spp. (por ejemplo Nectria heamatococca), Peronospora spp. (por ejemplo Peronospora manshurica o Peronospora tabacina), Phoma spp. (por ejemplo Phoma betae), Phakopsora spp. (por ejemplo Phakopsora pachyrhizi), Phymatotrichum spp. (por ejemplo Phymatotrichum omnivorum), Phytophthora spp. (por ejemplo Phytophthora cinnamomi, Phytophthora cactorum, Phytophthora phaseoli, Phytophthora parasitica, Phytophthora citrophthora, Phytophthora megasperma f.sp. soiae o Phytophthora infestans), Plasmopara spp. (por ejemplo Plasmopara viticola), Podosphaera spp. (por ejemplo Podosphaera leucotricha), Puccinia spp. (por ejemplo Puccinia sorghi, Puccinia striiformis, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia asparagi, Puccinia recondita o Puccinia arachidis), Pythium spp. (por ejemplo Pythium aphanidermatum), Pyrenophora spp. (por ejemplo Pyrenophora tritici-repentens o Pyrenophora teres), Pyricularia spp. (por ejemplo Pyricularia oryzae), Pythium spp. (por ejemplo Pythium ultimum), Rhincosporium secalis, Rhizoctonia spp. (por ejemplo Rhizoctonia solani, Rhizoctonia oryzae o Rhizoctonia cerealis), Rhizopus spp. (por ejemplo Rhizopus chinensid), Scerotium spp. (por ejemplo Scerotium rolfsii), Sclerotinia spp. (por ejemplo Sclerotinia sclerotiorum), Septoria spp. (por ejemplo Septoria lycopersici, Septoria glycines, Septoria nodorum o Septoria tritici), Thielaviopsis spp. (por ejemplo Thielaviopsis basicola), Tilletia spp., Trichoderma spp. (por ejemplo Trichoderma virde), Uncinula spp. (por ejemplo Uncinula necator), Ustilago maydis (por ejemplo tizón del maíz), Venturia spp. (por ejemplo Venturia inaequalis o Venturia pirina) o Verticillium spp. (por ejemplo Verticillium dahliae o Verticillium albo-atrum);

(2)

una célula fúngica de, o una célula derivada de un hongo capaz de infestar a seres humanos, tales como, pero sin limitación, Candida spp., particularmente Candida albicans; Dermatofitos incluyendo Epidermophyton spp., Trichophyton spp, y Microsporum spp.; Aspergillus spp. (particularmente Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus terreus); Blastomyces dermatitidis; Paracoccidioides brasiliensis; Coccidioides immitis; Cryptococcus neoformans; Histoplasma capsulatum Var. capsulatum o Var. Duboisii; Sporothrix schenckii; Fusarium spp.; Scopulariopsis brevicaulis; Fonsecaea spp.; Penicillium spp.; o el grupo de hongos zigomicetos (particularmente Absidia corymbifera, Rhizomucor pusillus o Rhizopus arrhizus);

(3)

una célula fúngica de, o una célula derivada de un hongo capaz de infestar a animales, tales como, pero sin limitación, Candida spp., Microsporum spp. (particularmente Microsporum canis o Microsporum gypseum), Trichophyton mentagrophytes, Aspergillus spp., o Cryptococcus neoforman;

y

(4)

una célula fúngica de, o una célula derivada de un hongo que causa daños no deseados a sustratos o a materiales, tales como hongos que atacan a comestibles, semillas, madera, pintura, plástico, textiles, etc. Los ejemplos de dichos hongos son los mohos, incluyendo pero sin limitación, Stachybotrys spp., Aspergillus spp., Alternaria spp., Cladosporium spp., Penicillium spp.o Phanerochaete chrysosporium.

II. Identificación de secuencias diana

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La presente divulgación proporciona un método para identificar y obtener un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica para producir un ARNbc o un ARNpi. Por ejemplo, dicho método comprende: (a) sondar un ADNc o una biblioteca de ADN genómico con una sonda de hibridación que comprende la totalidad o una porción de una secuencia nucleotídica o un homólogo de la misma a partir de una plaga usada como diana; (b) identificar un clon de ADN que hibrida con la sonda de hibridación; (c) aislar el clon de ADN identificado en la etapa (b); y (d) secuenciar el ADNc o el fragmento de ADN genómico que comprende el clon aislado en la etapa (c) en el que la molécula de ácido nucleico secuenciada transcribe la totalidad o una porción sustancial de la secuencia del nucleótido de ARN o un homólogo del mismo.

Adicionalmente, la presente divulgación contempla un método para obtener un fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica para producir una porción sustancial de un ARNbc o un ARNpi que comprende: (a) sintetizar el primer y el segundo cebador oligonucleotídico correspondiente a una porción de una de las secuencias nucleotídicas de una plaga usada como diana; y (b) amplificar un molde de ADNc o de ADN genómico en un vector de clonación usando el primer y el segundo cebador oligonucleotídico de la etapa (a) en el que la molécula de ácido nucleico amplificada transcribe una porción sustancial de un ARNbc o ARNpi.

En la puesta en práctica de la presente divulgación, un gen diana puede derivarse de cualquier plaga que cause daño a otro organismo. Pueden emplearse varios criterios para la selección de los genes diana preferidos. El gen es uno cuyo producto proteico tiene una rápida velocidad de renovación, de tal forma que la inhibición del ARNbc dará como resultado una rápida disminución de los niveles de proteína. En determinadas realizaciones, es ventajoso seleccionar un gen para el que una pequeña pérdida en el nivel de expresión da como resultado efectos perjudiciales para la plaga receptora. Si se desea usar como diana una amplia variedad de especies de insectos, por ejemplo, se selecciona un gen que esté elevadamente conservado entre estas especies. Por el contrario, con el fin de conferir especificidad, en determinadas realizaciones, se selecciona un gen que contiene regiones que están poco conservadas entre especies individuales de insectos, o entre insectos y otros organismos. En determinadas realizaciones, puede ser deseable seleccionar un gen que no tiene homólogos conocidos en otros organismos.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "derivado de" se refiere a una secuencia nucleotídica específica que puede obtenerse a partir de una fuente o especie particular específica, aunque no necesariamente directamente de esa fuente o especie específica.

En una realización, se selecciona un gen que se expresa en el intestino del insecto. Los genes diana expresados en el intestino evitan la necesidad de que el ARNbc se extienda por el insecto. Los genes diana pueden incluir, por ejemplo, aquellos que comparten homologías sustanciales con las secuencias nucleotídicas de genes conocidos que se expresan en el intestino que codifican componentes proteicos de la V-ATPasa de protones de membrana plasmática (Dow et al., 1997, Dow, 1999). Este complejo de proteínas es la única fuente de energía del transporte de iones epitelial y es responsable de la alcalinización del lumen del intestino medio. La V-ATPasa también se expresa en el túbulo de Malpighi, un sobrecrecimiento de intestino posterior del insecto que funciona en equilibrio fluido y en la detoxificación de compuestos exógenos de un modo análogo a un órgano de riñón de un mamífero.

En otra realización, se selecciona un gen que está esencialmente implicado en el crecimiento, desarrollo y reproducción de un insecto. Los genes ejemplares incluyen, pero sin limitación, las subunidades estructurales de proteínas ribosomales y un gen de coatómero beta, el gen CHD3. Las proteínas ribosomales, tales como S4 (RpS4) y S9 (RpS9) son constituyentes estructurales del ribosoma implicados en la biosíntesis de proteínas y que son componentes de la subunidad pequeña ribosómica citosólica, las proteínas ribosómicas, tales como L9 y L19 son constituyentes estructurales del ribosoma implicados en la biosíntesis de proteínas que se localiza en el ribosoma. El gen de coatómero beta en C. elegans codifica una proteína que es una subunidad de un complejo multimérico que forma un revestimiento de vesícula de membrana. Se han descubierto secuencias similares en diversos organismos, tales como Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster y Saccharomyces cerevisiae. Se encuentran secuencias relacionadas en diversos organismos, tales como Leptinotarsa decemlineata, Phaedon cochleariae, Epilachna varivetis, Anthonomus grandis, Tribolium castaneum, Myzus persicae, Nilaparvata lugens, Chilo suppressalis, Plutella xylostella y Acheta domesticus. Otras dianas génicas pueden incluir, por ejemplo, aquellas que juegan papeles importantes en la viabilidad, crecimiento, desarrollo, reproducción e infectividad. Estos genes diana incluyen, por ejemplo, genes constitutivos, factores de transcripción y genes específicos de insecto o mutaciones knockout letales en Caenorhabditis o Drosophila. Los genes diana también pueden ser aquellos que son de otros organismos, por ejemplo, de un nematodo (por ejemplo, Meloidogyne spp. o Heterodera spp.), otros insectos o arácnidos (por ejemplo, Leptinotarsa spp., Phaedon spp., Epilachna spp., Anthonomus spp., Tribolium spp., Myzus spp., Nilaparvata spp., Chilo spp., Plutella spp., o Acheta spp. Además, la secuencia nucleotídica para su uso como secuencia diana también puede derivarse de genes virales, bacterianos, fúngicos, o de insecto cuyas funciones se han establecido a través de la bibliografía y cuyas secuencias de nucleótidos comparten una similitud sustancial con los genes diana en el genoma de un insecto.

Para muchos de los insectos que son dianas potenciales para su control, puede haber información limitada referente a las secuencias de la mayoría de genes o del fenotipo resultante de la mutación de genes particulares. Por tanto, pueden seleccionarse genes basándose en la información disponible referente a genes correspondientes en un organismo modelo, tal como Caenorhabditis o Drosophila, o en otras especies de insectos. También pueden seleccionarse genes basándose en la información de secuencias disponible para otras especies, tales como

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especies de nematodos o fúngicas, en las que se han caracterizado los genes. En algunos casos será posible obtener la secuencia de un gen correspondiente a partir de un insecto diana efectuando búsquedas en bases de datos, tales como GenBank, usando bien el nombre del gen o la secuencia del gen. Una vez que se ha obtenido la secuencia, puede usarse la PCR para amplificar un segmento seleccionado de manera adecuada del gen en el insecto.

Para obtener un segmento de ADN a partir del gen correspondiente en una especie de insecto, por ejemplo, pueden diseñarse cebadores de PCR basándose en la secuencia tal como se encuentra en C. elegans o Drosophila, o un insecto a partir del cual ya se ha clonado el gen. Los cebadores se diseñan para amplificar un segmento de ADN de longitud suficiente. Las condiciones de amplificación se seleccionan de tal forma que sucederá la amplificación incluso si los cebadores no coinciden exactamente con la secuencia diana. Como alternativa, el gen, o una porción del mismo, puede clonarse a partir de una biblioteca de ADN genómico o de ADNc preparada a partir de la especie de plaga de insecto, usando un gen de insecto conocido como sonda. Se conocen técnicas para llevar a cabo la PCR y la clonación a partir de bibliotecas. En los ejemplos se proporcionan detalles adicionales del proceso mediante el cual los segmentos de ADN procedentes de especies de plagas de insecto diana pueden aislarse basándose en la secuencia de genes clonados anteriormente a partir de una especie de insecto. Un experto en la materia será consciente de que puede usarse una diversidad de técnicas para aislar segmentos génicos de especies de plagas de insectos que correspondan a genes previamente aislados de otras especies.

III. Métodos para inhibir o suprimir un gen diana

La presente divulgación proporciona métodos para inhibir la expresión génica de uno o múltiples genes diana en una plaga diana usando métodos de ARNbc estabilizado. La divulgación es particularmente útil para modular la expresión génica de eucariotas, en particular, modular la expresión de genes presentes en plagas que muestran un nivel de pH del sistema digestivo que es de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 9,5, más preferentemente de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0 y aún más preferentemente de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5. Para plagas con un sistema digestivo que muestra niveles de pH fuera de estos intervalos, pueden desearse el uso de métodos de administración que no requieran la ingestión de moléculas de ARNbc.

Los métodos abarcan proporcionar simultánea o secuencialmente dos o más construcciones de ARN bicatenario o de ARN al mismo insecto, para lograr la regulación negativa o la inhibición de múltiples genes diana o para lograr una inhibición más potente de un solo gen diana.

Como alternativa, se usan múltiples dianas proporcionando un ARN bicatenario que se dirige a múltiples secuencias diana y una sola diana se inhibe de manera más eficaz por la presencia de más de una copia del fragmento de ARN bicatenario correspondiente al gen diana. Por lo tanto, en una realización, la construcción de ARN bicatenario comprende múltiples regiones de ARNbc, comprendiendo al menos una hebra de cada región de ARNbc una secuencia nucleotídica que es complementaria a al menos parte de una secuencia nucleotídica diana de un gen diana de insecto. Las regiones de ARNbc en la construcción de ARN pueden ser complementarias al mismo o a diferentes genes diana y/o las regiones de ARNbc pueden ser complementarias a dianas de la misma o diferentes especies de insectos. El uso de dichas construcciones de ARNbc en una célula vegetal hospedadora, por lo tanto, confiere una resistencia más potente a una sola o a múltiples especies de insectos en la planta. En una realización, la región de ARN bicatenario comprende múltiples copias de la secuencia nucleotídica que es complementaria al gen diana. Como alternativa, el ARNbc se dirige a más de una secuencia diana del mismo gen diana. La divulgación por lo tanto abarca construcciones de ARN bicatenario aislado que comprenden al menos dos copias de dicha secuencia de nucleótidos complementarias a al menos parte de una secuencia nucleotídica de una diana de insecto. Puede desarrollarse ARNbc que se dirige a más de una de las dianas anteriormente mencionadas, o una combinación de diferentes ARNbc contra dianas diferentes anteriormente mencionadas. Los nucleótidos de ARNbc y construcciones de ARNbc adecuadas se describen en el documento WO2006/046148.

Los términos "dirigir", "se dirige" y "dirección" son expresiones alternativas para indicar que al menos una de las hebras del ARNbc es complementaria a y como tal puede unirse a, el gen o secuencia nucleotídica diana.

El efecto modulador del ARNbc es aplicable a una diversidad de genes expresados en las plagas, incluyendo, por ejemplo, genes endógenos responsables del metabolismo celular o de la transformación celular, incluyendo genes constitutivos, factores de transcripción y otros genes que codifican polipéptidos implicados en el metabolismo celular.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "inhibición de la expresión génica" o "inhibir la expresión de una diana génica en la célula de una plaga" se refiere a la ausencia (o disminución observable) en el nivel de producto de proteína y/o ARNm del gen diana. La especificidad se refiere a la capacidad para inhibir el gen diana sin efectos manifiestos sobre otros genes de la célula y sin efectos sobre cualquier gen en la célula que esté produciendo la molécula de ARNbc. La inhibición de la expresión génica del gen diana en la plaga puede dar como resultado nuevos rasgos fenotípicos en la plaga.

"Supresión génica" se refiere a cualquiera de los métodos bien conocidos para reducir los niveles de transcripción génica a ARNm y/o la posterior traducción del ARNm. La supresión génica también pretende indicar la reducción de

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los extremos es romo.

Una molécula de ANpi puede comprender nucleótidos modificados a la vez que se mantiene la capacidad para mediar la ARNi. Los nucleótidos modificados pueden usarse para mejorar características in vitro o in vivo tales como la estabilidad, actividad, y/o biodisponibilidad. Por ejemplo, una molécula de ANpi puede comprender nucleótidos modificados como un porcentaje del número total de nucleótidos presentes en la molécula de ANpi. Como tal, una molécula de ANpi puede comprender generalmente de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 100 % de nucleótidos modificados (por ejemplo, aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de nucleótidos modificados). El porcentaje real de nucleótidos modificados presentes en una molécula de ANpi dada dependerá del número total de nucleótidos presentes en el ANpi. Si la molécula de ANpi es monocatenaria, el porcentaje de modificación puede basarse en el número total de nucleótidos presentes en las moléculas de ANpi monocatenarias. Del mismo modo, si la molécula de ANpi es bicatenaria, el porcentaje de modificación puede basarse en el número total de nucleótidos presentes en la hebra con sentido, en la hebra antisentido, o en las hebras tanto con sentido como antisentido.

VII. Construcciones de ácido nucleico

Un vector de ácido nucleico recombinante puede, por ejemplo, ser un plásmido lineal o circular cerrado. El sistema de vector puede ser un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ácido nucleico total que se va a introducir en el genoma del hospedador bacteriano. Además, un vector bacteriano puede ser un vector de expresión. Las moléculas de ácido nucleico tal como se exponen en las SEC ID Nº: 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040, 1061, 1113, 1437 y 1677 o fragmentos de las mismas pueden, por ejemplo, insertarse sustancialmente en un vector bajo el control de un promotor adecuado que funciona en uno o más hospedadores microbianos para dirigir la expresión de una secuencia codificante enlazada u otra secuencia de ADN. Hay muchos vectores disponibles para este fin y la selección del vector adecuado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico que se va a insertar en el vector y de la célula hospedadora particular que se va a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y de la célula hospedadora particular con la que sea compatible. Los componentes de vector para transformación bacteriana incluyen generalmente, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes de marcador de selección y un promotor inducible que permite la expresión de ADN exógeno.

Promotores

"Unido operativamente", tal como se usa en referencia a una secuencia reguladora y a una secuencia nucleotídica estructural, significa que la secuencia reguladora provoca la expresión regulada de la secuencia nucleotídica estructural enlazada. Las "secuencias reguladoras" o los "elementos de control" se refieren a secuencias nucleotídicas situadas cadena arriba (secuencias no codificantes 5'), en, o cadena abajo (secuencias 3' no traducidas) de una secuencia nucleotídica estructural y que influencia la sincronía y el nivel o cantidad de transcripción, procesamiento de ARN o estabilidad, o la traducción de la secuencia nucleotídica estructural asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, intrones, potenciadores, estructuras de tallo-bucle, secuencias de unión represoras y secuencias de reconocimiento de poliadenilación y similares.

Un vector de expresión para producir un ARNm también puede contener un promotor inducible que se reconoce por el organismo bacteriano hospedador y está unido operativamente al ácido nucleico que codifica, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico que codifica el ARNm de D. v. virgifera o un fragmento de interés del mismo. Los promotores inducibles adecuados para su uso con hospedadores bacterianos incluyen el promotor de β-lactamasa, promotores PL y PR de fago λ de E. coli y promotor de galactosa de E. coli, promotor de arabinosa, promotor de fosfatasa alcalina, promotor de triptófano (trp) y el promotor del operón de lactosa y variaciones de los mismos y promotores híbridos, tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos inducibles conocidos.

En determinadas realizaciones, los genes pueden proceder de diferentes insectos para ampliar la variedad de insectos contra la que el agente es efectivo. Cuando genes múltiples se dirigen a la supresión o a una combinación de expresión y supresión, puede fabricarse un elemento de ADN policistrónico como se ilustra y se desvela en la solicitud de publicación de patente de Estados Unidos N.º 2004-0029283 de Fillati.

Genes de marcador de selección

Un vector o construcción de ADN recombinante comprenderá típicamente un marcador de selección que confiera un fenotipo de selección en células trasformadas. Los marcadores de selección también pueden usarse para seleccionar células que contienen los ácidos nucleicos exógenos que codifican polipéptidos o proteínas. El marcador puede codificar resistencia a un biocida, tal como la resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanamicina, bleomicina G418, higromicina, etc.). Los ejemplos de marcadores de selección incluyen, pero sin limitación, un gen neo que codifica resistencia a kanamicina y puede seleccionarse para usar kanamicina, G418, etc., un gen bar que codifica resistencia a bialafós; un gen de nitrilasa que confiere resistencia a bromoxinilo; y un gen DHFR de resistencia a

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metotrexato. Los ejemplos de dichos marcadores de selección se ilustran en las Patentes de Estados Unidos 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 y 6.118.047.

Un vector o construcción recombinante puede incluir también un marcador de exploración. Los marcadores de exploración pueden usarse para controlar la expresión. Los ejemplos de marcadores de exploración incluyen un gen de β-glucuronidasa o de uidA (GUS) que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (Jefferson, 1987; Jefferson et al., 1987); un gen de β-lactamasa (Sutcliffe et al., 1978), un gen que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen de luciferasa (Ow et al., 1986) un gen de xylE (Zukowsky et al., 1983) que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; un gen de α-amilasa (Ikatu et al., 1990); un gen de tirosinasa (Katz et al., 1983) que codifica una enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez se condensa en melanina; una α-galactosidasa, que cataliza a un sustrato cromogénico de α-galactosa.

Puede prepararse un vector de transformación usando métodos disponibles en la técnica. El vector de transformación comprende una o más secuencias de nucleótidos que es/son capaces de transcribirse a una molécula de ARN y que es/son sustancialmente homólogos y/o complementarios a una o más secuencias de nucleótidos codificadas por el genoma del insecto, de tal forma que tras la captación del ARN existe regulación negativa de la expresión de al menos una de las secuencias de nucleótidos respectivas del genoma de la plaga.

VIII. Métodos para ingeniería genética

La presente divulgación contempla la introducción de una secuencia nucleotídica en un organismo para lograr niveles de expresión inhibidores de una plaga de una o más moléculas de ARNbc. Los polinucleótidos y polipéptidos pueden introducirse en una célula hospedadora, tal como una célula bacteriana o levadura, mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica para introducir secuencias recombinantes en una célula hospedadora diana. Dichos procedimientos incluyen, pero sin limitación, protocolos de transfección, infección, transformación captación natural, fosfato de calcio, electroporación, microinyección, biolística y transformación mediada por microorganismos. Los métodos seleccionados varían en función del organismo hospedador.

Un organismo transgénico es uno que comprende al menos una célula en su genoma en el que un ácido nucleico exógeno se ha integrado de manera estable. Por lo tanto, un organismo transgénico puede solo contener células modificadas genéticamente en determinadas partes de su estructura.

Por consiguiente, la presente divulgación también incluye una célula transgénica u organismo transgénico que comprende cualquiera de las secuencias de nucleótidos a construcciones de ADN recombinante descritas en el presente documento. La divulgación incluye adicionalmente células procariotas (tales como, pero sin limitación, células de bacterias gram positivas y gram negativas) y células eucariotas (tales como, pero sin limitación, células de levaduras o células vegetales).

Por ejemplo, la presente divulgación contempla la introducción de un gen diana en una bacteria tal como Lactobacillus. Las construcciones de ácido nucleico pueden integrarse en un genoma bacteriano con un vector de integración. Los vectores de integración típicamente contienen al menos una secuencia homóloga a la del cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. La integración parece ser el resultado de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos con ADN de diversas cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (EP 0 127,328). Los vectores de integración también pueden comprender secuencias de bacteriófagos o de transposones. En la técnica también se conocen vectores suicidas.

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes anteriormente indicados emplean técnicas convencionales de ADN recombinante. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se escinden, se diseñan y vuelven a ligarse en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos. Los ejemplos de vectores de expresión bacterianos disponibles incluyen, pero sin limitación, los vectores de clonación y expresión multifuncionales de E. coli tales como Bluescript™ (Stratagene, La Jolla, CA), en el que, por ejemplo, una proteína

D. v. virgifera o fragmento de la misma, puede ligarse en fase en el vector con secuencias para la Met amino terminal y los 7 restos posteriores de la β-galactosidasa, de tal manera que se produce una proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke y Schuster, 1989); y similares.

La divulgación también contempla la introducción de un gen diana en la célula de levadura. Una construcción recombinante de levadura puede incluir típicamente uno o más de los siguientes elementos: una secuencia promotora, una secuencia compañera de fusión, una secuencia líder, una secuencia de terminación de la transcripción, un marcador de selección. Estos elementos pueden combinarse en un casete de expresión, que pueden mantenerse en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz de un mantenimiento estable en un hospedador, tal como una levadura o una bacteria. El replicón puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo por tanto que se mantenga, por ejemplo, en la levadura para su expresión y en un hospedador procariota para la clonación y amplificación. Los ejemplos de dichos vectores lanzadera de levadurabacteria incluyen YEp24 (Botstein et al., 1979), pCl/1 (Brake et al., 1984), e YRp17 (Stinchcomb et al., 1982).

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En otras realizaciones la plaga puede ponerse en contacto con una composición que contenga el ARNbc. La composición puede contener, además del ARNbc, excipientes, diluyentes o transportadores adicionales.

El ARNbc también puede incorporarse en el medio en el que se desarrolla o infesta la plaga. Por ejemplo, como un medio para inhibir la infestación de la plaga, un ARNbc puede incorporarse en un envase o envoltorio protector para alimentos. La madera puede tratarse, por ejemplo, con una solución que comprenda un ARNbc para impedir la infestación de la plaga.

En otras realizaciones, el ARNbc se expresa en una célula bacteriana o fúngica y las especies de insectos lo captan

o la toman a través del alimento.

Como se ilustra en los ejemplos, las bacterias pueden modificarse genéticamente para producir cualquiera de ARNbc o las construcciones de ARNbc de la divulgación. Estas bacterias pueden ser el alimento de las especies de insectos. Cuando se captan, el ARNbc puede iniciar una respuesta de ARNi, lo que conduce a la degradación del ARNm diana y al debilitamiento o a la destrucción del insecto que se alimenta. Como alternativa, las bacterias o las células de levadura productoras de ARNbc pueden pulverizarse directamente sobre los cultivos.

Algunas bacterias tienen una interacción muy estrecha con la planta hospedadora, tal como, pero sin limitación, el Rhizobium simbiótico con leguminosas (por ejemplo soja). Dichas bacterias recombinantes podrían mezclarse con las semillas (por ejemplo, como un recubrimiento) y usarse como mejoradores de suelos.

También puede usarse un virus, tal como un baculovirus, que infecta específicamente a insectos. Esto garantiza la seguridad de mamíferos, especialmente de seres humanos, ya que los virus no infectaran al mamífero, de tal manera que no se producirá un efecto de ARNi no deseado.

Las posibles aplicaciones incluyen cultivos intensivos de invernadero, por ejemplo, cultivos que son menos interesantes desde un punto de vista de GMO, así como cultivos de campo más amplio, tales como soja.

Esta estrategia tiene diversas ventajas, por ejemplo: dado que no se presenta el problema de un posible troceado por un hospedador de plantas, esto permite la liberación de grandes fragmentos de ARNbc en el lumen intestinal de la plaga que se alimenta; el uso de bacterias como insecticidas no implica la generación de cultivos transgénicos, especialmente para determinados cultivos en los que son difíciles de obtener variantes transgénicas; hay una aplicación amplia y flexible en la que diferentes cultivos pueden tratarse simultáneamente en el mismo campo y/o diferentes plagas pueden dirigirse simultáneamente, por ejemplo combinando diferentes bacterias productoras de distintos ARNbc.

XI. Productos

Numerosos productos pueden incluir un ARNbc para su uso en el control de plagas, por ejemplo, se proporcionan composiciones farmacéuticas o veterinarias para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o infección de seres humanos o animales, respectivamente, causada por plagas. Dichas composiciones comprenden al menos una construcción de ARNbc o ARN, o una secuencia de nucleótidos o una construcción de ADN recombinante que codifica la construcción de ARNbc o ARN, en el que el ARN comprende cadenas complementarias hibridadas, una de las cuales tiene una secuencia de nucleótidos que se corresponde a una secuencia de nucleótidos diana de un gen diana de la plaga que causa la enfermedad o infección, y al menos un transportador, excipiente o diluyente adecuado para el uso farmacéutico.

Como alternativa, puede usarse una composición farmacéutica o veterinaria como una composición adecuada para su uso tópico, tal como una aplicación sobre la piel de un animal o un ser humano. Por ejemplo, un ARNbc puede usarse en una composición liquida a aplicar en la piel como gotas, gel aerosol, crema, pomada, etc. Adicionalmente, un ARNbc puede integrarse en un parche transdérmico o en otro dispositivo médico para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección. Otras formas de dosificación farmacéuticas convencionales también pueden producirse, incluyendo comprimidos, cápsulas, pesarios, parches transdérmicos supositorios, etc. La forma seleccionada dependerá de la naturaleza de la plaga diana y por tanto de la naturaleza de la enfermedad que se desea tratar.

Pueden producirse vacunas orales, por ejemplo, usando las construcciones y los métodos que se desvelan. Por ejemplo, produciendo un ARNbc en bacterias (por ejemplo lactobacillus) puede construirse una vacuna que puede incluirse en alimentos y que actúa como una vacuna oral contra infecciones causadas por insectos. Por consiguiente, pueden desarrollarse construcciones y métodos para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o una afección causada por plagas, que comprende administrar a un sujeto que necesite dicho tratamiento y/o prevención, cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento, comprendiendo dicha composición al menos un ARN bicatenario o una construcción de ARN bicatenario que comprenda cadenas complementarias hibridadas, una de las cuales tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria, al menos en parte, a una secuencia de nucleótidos de un gen diana de plagas que causa la enfermedad o afección.

Aunque las composiciones pueden usarse para el tratamiento de una enfermedad o afección en un paciente, las composiciones y métodos también pueden usarse como un medio para proteger un sustrato o un material de la

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infestación por plagas. La naturaleza de los excipientes incluidos en la composición y en la forma física de la misma puede variar dependiendo de la naturaleza del sustrato que se desee tratar.

Por ejemplo, dicha composición puede ser un recubrimiento o un polvo que puede aplicarse a un sustrato como un medio para proteger el sustrato de la infestación por un insecto y por lo tanto prevenir el daño inducido por la plaga al sustrato o al material. Por tanto, en una realización, la composición está en forma de un recubrimiento sobre una superficie adecuada a la que se adhiere, y eventualmente la ingiere un insecto que se pone en contacto con el recubrimiento. Dicha composición puede usarse para proteger cualquier sustrato o material que sea susceptible a infestación por o daño causado por una plaga, por ejemplo, comestibles y otros materiales perecederos, y sustratos tales como madera.

Por ejemplo, la composición puede ser un líquido con el que se cepilla, pulveriza o impregna el material o sustrato a tratar. Por tanto, un usuario puede pulverizar directamente al insecto o al sustrato con la composición.

Por ejemplo, las termitas, los escarabajos pulverizadores de madera y las hormigas carpinteras, pueden destruir casas y otros productos fabricados con madera. Tratando la madera o las fachadas de las casas con una composición que comprenda un ARNbc, puede ser posible reducir la infestación de la plaga. Del mismo modo, un tronco de un árbol puede tratarse con una composición que comprenda un ARNbc.

Los escarabajos de las flores, los gorgojos del grano, las polillas de la harina y otras plagas se alimentan de grano, cereales, pienso, chocolate en polvo almacenado y casi todo lo que se encuentre en la despensa de una cocina que no esté protegido. Por consiguiente, pueden desarrollarse medios para tratar cajas de cereales y otros envases que almacenen alimento y envolverlos con una composición que comprenda un ARNbc diana.

Las larvas de las polillas de textiles se alimentan de este material fabricado con productos de origen animal, tales como cuero, seda y lana. Por tanto, puede ser deseable tratar perchas, organizadores de armarios, y bolsas para ropa con el ARNbc. El piojo de los libros y el pececillo de plata son plagas que afectan a las bibliotecas ya que se alimentan de la cola de almidón de las encuadernaciones. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona composiciones para el tratamiento de libros que los proteja de la infestación y destrucción por las plagas.

En una realización, la composición está en forma de cebo. El cebo se diseña para atraer al insecto para que se ponga en contacto con la composición. Después de ponerse en contacto con el mismo, la composición se internaliza en el insecto, por digestión, por ejemplo, y actúa como mediadora en el ARNi para así destruir al insecto. El cebo puede depender de la especie que vaya a tratarse. También puede usarse un atrayente. El atrayente puede ser una feromona, tal como una feromona de macho o hembra, por ejemplo. El atrayente actúa atrayendo al insecto hacia el cebo y puede dirigirse a un insecto particular o puede atraer a una amplia variedad de insectos. El cebo puede tener cualquier forma adecuada, tal como forma de sólido, pasta, gránulo o polvo.

El cebo también puede transportarlo el insecto de regreso a la colonia. Después, el cebo puede actuar como una fuente de alimento para los restantes miembros de la colonia, proporcionando de este modo un control eficaz de una gran cantidad de insectos y posiblemente de toda una colonia de plagas de insectos. Esto es una ventaja asociada con el uso del ARN bicatenario o de bacterias que expresan el ARNbc, porque la acción retardada del ARNi actúa como mediadora sobre los efectos en las plagas permitiendo que el cebo se transporte de nuevo a la colonia, proporcionando de este modo un máximo impacto en términos de exposición a los insectos.

Los cebos pueden proporcionarse en una “carcasa” o “trampa” adecuada. Dichas carcasas y trampas se encuentran disponibles en el comercio y las trampas existentes pueden adaptarse para que incluyan las composiciones de la divulgación. La carcasa o trampa puede tener forma de caja, por ejemplo, y puede proporcionarse en un estado preformado o puede formase, por ejemplo, con cartón plegable. Los materiales adecuados para la carcasa o trampa incluyen plásticos y cartón, particularmente cartón corrugado. Las superficies internas de las trampas pueden recubrirse con una sustancia adhesiva para restringir el movimiento del insecto una vez en su interior. La carcasa o trampa puede contener una depresión interna adecuada para sujetar el cebo en su sitio. Una trampa se diferencia de una carcasa porque el insecto no puede salir fácilmente de la trampa después de haber entrado, mientras que una carcasa actúa como una “estación de alimentación” que proporciona al insecto arácnido un entorno preferido en el que poder alimentarse y estar a salvo de los depredadores.

Está claro que numerosos productos y sustratos puede tratarse con las composiciones para reducir la infestación causada por plagas. Por supuesto, la naturaleza de los excipientes y la forma física de la composición puede variar dependiendo de la naturaleza del sustrato que se desee tratar. Por ejemplo, la composición puede ser un líquido con el que se cepille, pulverice o impregne el material o sustrato a tratar, o un recubrimiento que se aplique al material o al sustrato a tratar.

A continuación se proporcionan ejemplos específicos de métodos para identificar secuencias diana y para introducir las secuencias en varias células y composiciones. Estos pretenden ser ilustrativos y no limitaciones de la presente invención.

Ejemplo 1: Genes diana silenciadores de C. elegans en C. elegans en exploración de alto rendimiento

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La genoteca completa de C. elegans se preparó en el vector pGN9A (WO 01/22121) entre dos promotores y terminadores de T7 idénticos, conduciendo su expresión en la dirección sentido y antisentido después de la expresión de la T7 polimerasa, que se indujo mediante IPTG.

Esta biblioteca se transformó en la cepa bacteriana AB301-105 (DE3) en formato de placas de 96 pocillos. Para la exploración del genoma completo, estas células bacterianas se alimentaron con la cepa nuc-1 (e1392) de C. elegans deficiente en nucleasa.

El suministro de ARNbc producido en la cepa bacteriana AB301-105 (DE3), en gusanos nuc-1 (e1392) de C. elegans, se realizó en un formato de placa de 96 pocillos de la siguiente manera: se transfirieron huevos de nuc-1 a una placa distinta y se dejaron incubar simultáneamente a 20 °C durante una sincronización de la generación L1. Las placas de 96 pocillos se llenaron con 100 µL de medio de crecimiento líquido que comprendía IPTG y con 10 µL de cultivo celular bacteriano de DO600 1 AB301-105 (DE3) de la biblioteca de ARNbc de C. elegans portadora cada una de un vector con un fragmento genómico de C. elegans para la expresión del ARNbc. A cada pocillo, se añadieron 4 de los gusanos sincronizados de L1 y se incubaron a 25 °C durante al menos 4 a 5 días. Estos experimentos se realizaron por cuadruplicado. En la exploración se usaron 6 controles:

-pGN29 = control negativo, tipo silvestre

-pGZ1 = unc-22 = fenotipo con contracciones nerviosas

-pGZ18 = quitina sintasa = letal embrionario

-pGZ25 = pos-1 = letal embrionario

-pGZ59 = bli-4D = letal agudo

-ACC = acetil co-enzima A carboxilasa = letal agudo

Después de 5 días, el fenotipo de los gusanos nuc-1 (e1392) de C. elegans alimentados con las bacterias productoras del ARNbc se compararon con el fenotipo de gusanos alimentados con el vector vacío (pGN29) y los otros controles. Los gusanos que se habían alimentado con ARNbc se exploraron con respecto a la letalidad (aguda

o larvaria) para la generación parental (Po), letalidad (embrionaria) para primera generación filial (F1), o para el retraso de crecimiento de Po de la siguiente manera: (i) Letalidad aguda de Po: Las L1 no se han desarrollado y se han muerto, este fenotipo nunca da progenie y los pocillos parecen vacíos; (ii) Letalidad (larvaria) de Po: Po murieron en un estadio posterior a L1, este fenotipo tampoco da progenie. Se encuentran larvas muertas o gusanos adultos muertos en los pocillos; (iii) Letalidad para F1: Las L1 se han desarrollado hasta el estadio adulto y están aún vivas. Este fenotipo no tiene progenie. Esto puede deberse a esterilidad, letalidad embrionaria (huevos muertos en la parte inferior del pocillo), detención embrionaria o detención larvaria (eventualmente termina siendo letal); (iv) Crecimiento detenido y retraso/retardo del crecimiento: Comparación con un pocillo con desarrollo normal y Nº normal de progenie.

Para las secuencias diana que se presentan en la Tabla 1A, se llegó a la conclusión de que el silenciamiento del gen diana de C. elegans mediado por el ARNbc en nematodos, tales como C. elegans, tenía un efecto fatal sobre el crecimiento y la viabilidad de los gusanos.

Después del experimento anterior de silenciamiento con ARNbc, se llevó a cabo un experimento de fenotipado más detallado en C. elegans en un formato de alto rendimiento en placas de 24 pocillos. La biblioteca de ARNbc producida en la cepa bacteriana AB301-105 (DE3), tal como se describe anteriormente, se suministró a gusanos C. elegans nuc-1 (e1392) en placas de 24 pocillos de la siguiente manera: se transfirieron huevos de nuc-1 a una placa distinta y se dejaron incubar simultáneamente a 20 °C durante una sincronización de la generación L1. Posteriormente 100 de los gusanos L1 sincronizados se sumergieron en 500 µL de una mezcla de medio de alimentación completo S, que comprendía colesterol 5 µg/ml, PEG 4 µL/ml e IPTG 1 mM y 500 µL de cultivo celular bacteriano de DO600 1 AB301-105 (DE3) de la biblioteca de ARNbc de C. elegans portadora cada una de un vector con un fragmento genómico de C. elegans para la expresión del ARNbc. Se rotó a los gusanos de L1 sumergidos durante 2 horas a 25 ºC.

Después de la centrifugación y retirada de 950 µL del sobrenadante, 5 µL del sedimento restante y resuspendido (que comprendía aproximadamente de 10 a 15 gusanos) se transfirieron a la mitad de cada pocillo de una placa de 24 pocillos, cargada con una capa de caldo LB agar. La placa inoculada se incubó a 25 °C durante 2 días. En la fase adulta, se individualizó 1 gusano adulto y se incubó a 25 °C durante 2 días para inspeccionar su progenie. Los gusanos adultos se inspeccionaron in situ en la placa de 24 pocillos original. Estos experimentos se realizaron por cuadruplicado.

Esta exploración fenotípica detallada se repitió con un segundo lote de gusanos, siendo la única diferencia que los gusanos del segundo lote se incubaron a 20 ºC durante 3 días.

El fenotipo de los gusanos alimentados con ARNbc de C. elegans se comparó con el fenotipo de gusanos C. elegans nuc-1 (e1392) alimentados con el vector vacío.

Basándose en este experimento, se llegó a la conclusión de que el silenciamiento de los genes diana de C. elegans como se representa en la Tabla 1A tenía un efecto fatal sobre el crecimiento y viabilidad de los gusanos y que este gen diana es esencial para la viabilidad de los nematodos. Por lo tanto, estos genes son buenos genes diana para

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controlar (eliminar o evitar el crecimiento) a los nematodos mediante el silenciamiento génico mediado por ARNbc. Por consiguiente, la presente divulgación abarca el uso de ortólogos en nematodos del gen diana anterior de C. elegans, para controlar la infestación por nematodos en una variedad de organismos y materiales.

Ejemplo 2: Identificación de ortólogos de D. melanogaster

Tal como se describe en el Ejemplo 1 anterior, se identificaron numerosas secuencias letales de C. elegans y pueden usarse para identificar ortólogos en otras especies y géneros. Por ejemplo, las secuencias letales de C. elegans pueden usarse para identificar secuencias ortólogas de D. melanogaster. Es decir, puede hacerse una búsqueda con cada secuencia de C. elegans contra una base de datos pública, tal como GenBank, para secuencias ortólogas en D. melanogaster. Se seleccionaron los ortólogos potenciales de D. melanogaster que compartían un alto grado de homología de secuencia (valor E preferentemente menor que o igual a 1E-30) y las secuencias son los mejores aciertos recíprocos de blast, esto último significa que las secuencias de organismos diferentes (por ejemplo,

C. elegans y D. melanogaster) son los mejores aciertos blast entre sí. Por ejemplo, la secuencia C de C. elegans se comparó frente a secuencias en D. melanogaster usando BLAST. Si la secuencia C tiene la secuencia D de D. melanogaster como la mejor coincidencia y cuando D se compara con todas las secuencias de C. elegans, a su vez también con la secuencia C, entonces D y C son mejores coincidencias recíprocas. Este criterio se usa a menudo para definir la ortología, que significa secuencias similares de especies diferentes, que tienen función similar. Los identificadores de secuencia de D. melanogaster se representan en la Tabla 1A.

Ejemplo 3: Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado)

A. Clonación de secuencias génicas parciales de Leptinotarsa decemlineata

Se aisló ARN intacto de alta calidad de 4 fases larvarias diferentes de Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado; Fuente: Jeroen van Schaik, Entocare CV Biologische Gewasbescherming, Postbus 162, 6700 AD Wageningen, Países Bajos) usando reactivo TRIzol® (Nº de Cat 15596-026/15596-018, Invitrogen™, Rockville, Maryland, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico presente en la preparación de ARN se retiró mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante (Nº de Cat. 1700, Promega®). El ADNc se generó usando un kit comercialmente disponible (Transcriptasa inversa SuperScript® III, Nº de Cat. 18080044, Invitrogen™, Rockville, Maryland, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para aislar secuencias de ADNc que comprendían una porción de los genes LD001, LD002, LD003, LD006, LD007, LD010, LD011, LD014, LD015, LD016 y LD018, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® (Nº de Cat. N8080240, Applied Biosystems®) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificación de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-LD, que muestra genes diana de Leptinotarsa decemlineata que incluyen las secuencias cebadoras y las secuencias de ADNc obtenidas. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, purificado (Kit de extracción de gel QIAquick®, Nº de Cat. 28706, Qiagen®), se clonaron en el vector pCR8/GW/TOPO® (Nº de Cat. K2500 20, Invitrogen™) y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-LD y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoácidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-LD, en la que el inicio de la fase de lectura se indica entre paréntesis.

B. Producción de ARNbc de los genes de Leptinotarsa decemlineata

Se sintetizó ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express (Nº de Cat. P1700, Promega®). En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientación diferente con respecto al promotor de T7.

Para cada uno de los genes diana, se generó el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso específicos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-LD. Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se generó usando cebadores directos e inversos de T7 específicos en una reacción PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-LD. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®, Nº de Cat. 28106, Qiagen®) y precipitación con NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-LD. La Tabla 8-LD presenta secuencias para la preparación de fragmentos de ARN de secuencias diana de

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Leptinotarsa decemlineata y secuencias de concatémero, incluyendo secuencias cebadoras.

C. Exploración de dianas de ARNbc usando dieta artificial para la actividad contra Leptinotarsa decemlineata

Se preparó dieta artificial para el escarabajo de la patata de Colorado de la siguiente manera (adaptada de Gelman et al., 2001, J. Ins. Sc., vol. 1, Nº 7, 1-10): se esterilizaron en autoclave el agua y el agar, y los demás ingredientes (mostrados en la Tabla 2 más adelante) se añadieron cuando la temperatura descendió a 55 °C. A esta temperatura, los ingredientes se mezclaron bien antes de dividir la dieta en alícuotas en placas de 24 pocillos (Nunc™) con una cantidad de 1 ml de diete por pocillo. Se dejó solidificar la dieta artificial por enfriamiento a temperatura ambiente. La dieta se almacenó a 4 °C durante hasta tres semanas.

Tabla 2: Ingredientes para la dieta artificial

Ingredientes

Volumen para 1 l

agua

768 ml

agar

14 g

copos de avena laminados

40 g

levadura de Tórula

60 g

hidrolizado de lactalbúmina

30 g

caseína

10 g

fructosa

20 g

mezcla salina de Wesson

4 g

polvo de fruto de tomate

12,5 g

hoja de patata en polvo

25 g

b-sitosterol

1 g

ácido sórbico

0,8 g

Metil parabeno

0,8 g

mezcla de vitaminas de Vanderzant

12 g

sulfato de neomicina

0,2 g

aureomicina

0,130 g

rifampicina

0,130 g

cloranfenicol

0,130 g

nistatina

0,050 g

aceite de soja

2 ml

aceite de germen de trigo

2 ml

Se aplicaron cincuenta µl de una solución de ARNbc a una concentración de 1 mg/ml por vía tópica sobre la dieta artificial sólida en los pocillos de la placa multipocillo. La dieta se secó en una cabina de flujo laminar. Por tratamiento, se ensayaron veinticuatro larvas de escarabajo de la patata de Colorado (2º estadio), con dos insectos por pocillo. Las placas se conservaron en la cámara de cría de insectos a una temperatura de 25 ± 2 °C, humedad relativa del 60 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Se evaluó a los escarabajos como vivos o muertos cada 1, 2 o 3 días. Después de siete días, para las dianas LD006, LD007, LD010, LD011 y LD014, la dieta se reemplazó por dieta nueva con ARNbc aplicado por vía tópica a la misma concentración (1 mg/ml); para las dianas LD001, LD002, LD003, LD015 y LD016, la dieta se reemplazó solo por dieta reciente. Los ARNbc diana se compararon con solo con dieta o dieta con ARNbc aplicado por vía tópica correspondiente a un fragmento de la secuencia codificante de la GFP (proteína fluorescente verde) (SEC ID Nº: 235).

La alimentación con dieta artificial que contenía los ARNbc desnudos a larvas de L. decemlineata dio como resultado aumentos significativos en la mortalidad de las larvas como se indica en dos bioensayos separados (Figuras 1LD-2LD).

Todos los ARNbc ensayados dieron como resultado finalmente una mortalidad del 100 % después de 7 a 14 días. La dieta con o sin ARNbc de GFP mantuvo a los insectos a lo largo del bioensayo con poca o sin mortalidad.

Típicamente, en todos los ensayos observados, las larvas de EPC de segundo estadio se alimentaron normalmente con dieta con o sin ARNbc durante 2 días y cambiaron al tercer estadio larvario. En este nuevo estadio larvario, se observó que los EPC reducían significativamente o del todo su alimentación, con un aumento en la mortalidad como resultado.

D. Bioensayo de dianas de ARNbc usando discos foliares de patata para actividad contra Leptinotarsadecemlineata

Se empleó un método de bioensayo alternativo usando material foliar de patata en lugar de dieta artificial como fuente de alimentación para los EPC. Se cortaron discos de aproximadamente 1,1 cm de diámetro (o 0,95 cm2) de hojas de plantas de patata de 2 a 3 de vida usando un horadador de corteza de tamaño adecuado. Los discos foliares tratados se prepararon aplicando 20 µl de una solución de 10 ng/µl de ARNbc de LD002 diana o ARNbc de gfp de control en la superficie foliar adaxial. Se dejó que los discos foliares se secasen y se colocaron individualmente en 24 pocillos de una

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Se aisló ARN intacto de alta calidad de 4 fases larvarias diferentes de Epilachna varivetis (escarabajo del frijol mexicano; Fuente: Thomas Dorsey, Supervising Entomologist, New Jersey Department of Agriculture, Division of Plant. Industry, Bureau of Biological Pest Control, Phillip Alampi Beneficial Insect Laboratory, PO Box 330, Trenton, Nueva Jersey 08625-0330, EE.UU.) usando reactivo TRIzoI® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico presente en la preparación de ARN se retiró mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc se generó usando un kit comercialmente disponible (Transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para aislar secuencias de ADNc que comprendían una porción de los genes EV005, EV009, EV010, EV015 y EV016, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificación de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-EV, que muestra genes diana de Epilachna varivetis que incluyen las secuencias cebadoras y las secuencias de ADNc obtenidas. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: para EV005 y EV009, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 50°C y 1 minuto 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para EV014, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para EV010 y EV016, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 40 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR4/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-EV y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoácidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-EV, en la que el inicio de la fase de lectura se indica entre paréntesis.

B. Producción de ARNbc de los genes de Epilachna varivetis

Se sintetizó ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientación diferente con respecto al promotor de T7.

Para cada uno de los genes diana, se generó el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso específicos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-EV.

Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se generó usando cebadores directos e inversos de T7 específicos en una reacción PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-EV. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®) y precipitación de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-EV.

C. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc usando discos foliares de judía con respecto a actividad contra larvas de Epilachna varivetis

El ejemplo proporcionado a continuación es una ejemplificación del hallazgo de que las larvas del escarabajo del frijol mexicano (EFM) son susceptibles a ARNbc ingerido por vía oral correspondiente a los propios genes diana.

Para ensayar las diferentes muestras de ARN bicatenario contra larvas de EFM, se empleó un ensayo de disco foliar usando material foliar de judía verde (Phaseolus vulgaris variedad Montano; Fuente: Aveve NV, Bélgica) como fuente de alimentación. La misma variedad de judías se usó para mantener cultivos de insectos en la cámara de insectos 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 60 ± 5 % con un fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Se cortaron discos de aproximadamente 1,1 cm de diámetro (o 0,95 cm2) de hojas de plantas de judía de 1 a 2 semanas de edad usando un taladro de corteza de tamaño adecuado. Se diluyeron muestras de ARN bicatenario a 1 µg/µl en agua Milli-Q que contenía Triton™ X-100 al 0,05 %. Se prepararon discos foliares tratados aplicando 25 µl de la solución diluida de ARNbc diana de EV005, EV010, EV015, EV016 y ARNbc de gfp de control o Triton™ X-100 0,05 % sobre la superficie foliar adaxial. Se dejaron secar los discos foliares y se colocaron individualmente en cada uno de los 24 pocillos de una multiplaca de 24 pocillos que contenían 1 ml de agar al 2 % gelificado que ayuda a evitar que el disco foliar se seque. Se colocó una única larva de EFM neonata en cada pocillo de una placa, que después se cubrió con una tapa de plástico multipocillo. La placa se dividió en 3 replicados de 8 insectos por

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Fuente: Dr. Gary Benzon, Benzon Research Inc., 7 Kuhn Drive, Carlisle, Pennsylvania 17013, EE.UU.) usando reactivo TRIzoI® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico presente en la preparación de ARN se retiró mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se generó ADNc usando un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para aislar secuencias de ADNc que comprendían una porción de los genes AG001, AG005, AG010, AG014 y AG016, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificación de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-AG. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: para AG001, AG005 y AG016, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 50°C y 1 minuto y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para AG010, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 2 minutos y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para AG014, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 7 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR8/GW/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-AG y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoácidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-AG,

B. Producción de ARNbc de los genes de Anthonomus grandis (grillo de la cápsula del algodonero)

Se sintetizó ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientación diferente con respecto al promotor de T7.

Para cada uno de los genes diana, se generó el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso específicos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-AG. Se realizó una PCR touchdown de la siguiente manera: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C con reducción de la temperatura de 0,5 °C por ciclo y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se generó usando cebadores directos e inversos de T7 específicos en una reacción PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-AG. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®) y precipitación de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-AG.

C. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc, usando dieta artificial con respecto a actividad contra las larvas del grillo de la cápsula del algodonero, Anthonomus grandis. Se mantiene un cultivo de grillos de la cápsula del algodonero, Anthonomus grandis, con dieta artificial. Para los bioensayos, se recogen huevos de grillo de la cápsula del algodonero y se preparan tal como se ha descrito anteriormente y se colocan en una placa de Petri sobre papel de filtro húmedo. Los huevos se incuban en oscuridad a 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 65 ± 5 % durante tres días para obtener larvas de primera fase. Estas larvas se usan en superposición de superficie de la dieta y bioensayos de incorporación para ensayar ARNbc correspondiente a genes diana de GCA AG001, AG005, AG010, AG014 y AG016.

Para el bioensayo de superposición de superficie de la dieta, se aplican por vía tópica 25 µl muestras de ARN bicatenario a una concentración de 1 µg/µl a 500 µl dieta establecida en cada pocillo. Para el bioensayo de incorporación en la dieta, se mezclan 50 µl de ARNbc (1 µg/µl) con 500 µl dieta establecida (a una temperatura aproximada de 45 °C). En ambos bioensayos, las placas se dejan secar en una cabina de flujo laminar horizontal. Se transfieren larvas de grillos de la cápsula del algodonero L1 a la dieta con un insecto por pocillo. Se ensayan cuarenta y ocho insectos en total para cada uno de los tratamientos.

Se realizan evaluaciones a intervalos diarios hasta el día 7 (7 días después del inicio del bioensayo). En cada evaluación los insectos se evalúan como vivos o muertos y se examinan en busca de anomalías. Durante la prueba las condiciones de ensayo son 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 65 ± 5 %, con un fotoperiodo de 14:10 horas de luz:oscuridad.

D. Clonación de un fragmento génico de GCA en un vector adecuado para la producción bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos

A continuación hay un ejemplo de clonación de un fragmento de ADN correspondiente a una diana génica de GCA en un vector para la expresión de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier

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DI de C.elegans

ID de D. melanogaster Descripción Exploración de ARNi Devgen

B0250.1

CG1263 Proteína de subunidad ribosómica grande L8. Aguda letal o letal

B0336.10

CG3661 Proteína de subunidad ribosómica grande L23. Aguda letal o letal

B0336.2

CG8385 Factor de ribosilación de ADP. Aguda letal o letal

B0464.1

CG3821 Aspartil(D) ARNt sintetasa putativa. Aguda letal o letal

C01G8.5

CG10701 Ortólogo de la familia ERM de enlazantes citoesqueléticos. Aguda letal o letal

C01H6.5

CG33183 Receptor de hormonas nucleares que se requiere en todas las mudas larvarias Aguda letal o letal

C02C6.1

CG18102 Miembro de la clase génica relacionada con DYNamina Aguda letal o letal

C03D6.8

CG6764 Proteína de subunidad ribosómica grande L24 (Rlp24p). Aguda letal o letal

C04F12.4

CG6253 rpl-14 codifica una proteína de subunidad ribosómica grande de L14. Aguda letal o letal

C04H5.6

CG10689 Producto con actividad ARN helicasa (EC:2.7.7.) implicado en el corte y empalme de ARNm nuclear, mediante espliceosoma que es un componente del complejo de espliceosoma. Embrionaria letal o estéril

C13B9.3

CG14813 Subunidad delta del complejo de coatómero (COPI). Aguda letal o letal

C17H12.14

CG1088 Miembro de la clase génica de ATPasa vacuolar H. Aguda letal o letal

C26E6.4

CG3180 ARN polimerasa II dirigida por ADN. Aguda letal o letal

F23F12.6

CG16916 Subunidad de ATPasa triple A del subcomplejo de base de partícula reguladora 19S del proteasoma 26S (RP) Aguda letal o letal

F57B9.10

CG10149 Miembro de la clase génica de tipo no ATPasa, partícula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal

K11D9.2

CG3725 Homólogo de Ca[2+] ATPasa del retículo sarcoendoplásmico. Embrionaria letal o estéril

T20G5.1

CG9012 Cadena pesada de clatrina Aguda letal o letal

T20H4.3

CG5394 Prolil-ARNt sintetasa (ProRS) citoplásmica predicha. Aguda letal o letal

T21E12.4

CG7507 Homólogo de cadena pesada de dineína citoplasmática. Aguda letal o letal

C05C10.3

CG1140 ortólogo del gen humano 3-OXOÁCIDO COA TRANSFERASA Aguda letal o letal

C09D4.5

CG2746 Proteína ribosómica L19, constituyente estructural de ribosoma implicado en la biosíntesis de proteínas que se localiza en el ribosoma. Aguda letal o letal

C09E10.2

CG31140 Ortólogo de diacilglicerol cinasa implicado en el movimiento, oviposición y transmisión sináptica y se expresa en neuronas. Aguda letal o letal

C13B9.3

CG14813 Subunidad delta del coatómero (COPI). Aguda letal o letal

C14B9.7

CG12775 Proteína de subunidad ribosómica grande L21 (RPL-21) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal

C15H11.7

CG30382 Subunidad tipo 6 alfa de la partícula del núcleo de proteasa 20S del proteasoma 26S (CP). Aguda letal o letal

C17E4.9

CG9261 Proteína implicada en el complejo de ATPasa que intercambia Na+/K+. Embrionaria letal o estéril

C17H12.14

CG1088 Subunidad E de V-ATPasa. Aguda letal o letal

C23G10.4

CG11888 Subunidad no ATPasa del subcomplejo de base de partícula reguladora 19S del proteasoma 26S (RPN-2). Aguda letal o letal

C26D10.2

CG7269 Producto con actividad helicasa implicado en el corte y empalme de ARNm nuclear, mediante espliceasoma que se localiza en el núcleo. Aguda letal o letal

C26E6.4

CG3180 Subunidad de 140 kD de ARN polimerasa II (RpII 140), actividad de ARN polimerasa dirigida por ADN (EC:2.7.7.6) implicada en la transcripción del promotor Pol II que es un componente del complejo de núcleo de ARN polimerasa II dirigida por ADN. Aguda letal o letal

C26F1.4

CG15697 Producto con función en la biosíntesis de proteínas y ubiquitina en la degradación de proteínas. Aguda letal o letal

C30C11.1

CG12220 Función desconocida. Aguda letal o letal

C30C11.2

CG10484 Miembro de la clase génica de tipo no ATPasa, partícula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal

C36A4.2

CG13977 Citocromo P450. Aguda letal o letal

C37C3.6

CG33103 Ortólogo de trombospondina, papilina y lacunina. Aguda letal o letal

DI de C.elegans

ID de D. melanogaster Descripción Exploración de ARNi Devgen

C37H5.8

CG8542 Miembro de la clase génica de proteína de choque térmico. Aguda letal o letal

C39F7.4

CG3320 Proteína Rab-1 implicada en la adhesión celular. Aguda letal o letal

C41C4.8

CG2331 ATPasa del retículo endoplasmático transicional TER94, organización y biogénesis del Golgi. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento

C42D8.5

CG8827 Proteína similar a ACE. Aguda letal o letal

C47E12.5

CG1782 Enzima activadora de ubiquitina, función en una reacción dependiente de ATP que activa ubiquitina antes de su conjugación a proteínas que se degradarán posteriormente por el proteasoma 26S. Aguda letal o letal

C47E8.5

CG1242 Miembro de la clase génica de formación de DAuer anómala. Aguda letal o letal

C49H3.11

CG5920 Proteína de subunidad ribosómica pequeña S2. Aguda letal o letal

C52E4.4

CG1341 Miembro de la clase génica de tipo ATPasa, partícula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal

C56C10.3

CG8055 Proteína vehículo potencialmente implicada en el transporte intracelular de proteínas. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento

CD4.6

CG4904 Subunidad tipo 1 alfa de la partícula del núcleo de proteasa 20S del proteasoma 26S (CP). Aguda letal o letal

D1007.12

CG9282 Proteína de subunidad ribosómica grande L24. Aguda letal o letal

D1054.2

CG5266 Miembro de la clase génica de subunidad alfa de proteasoma. Aguda letal o letal

D1081.8

CG6905 Proteína transformante de MYB. Aguda letal o letal

F07D10.1

CG7726 Proteína de subunidad ribosómica grande L11 (RPL-11.2) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal

F11C3.3

CG17927 Cadena pesada de miosina muscular (MHC B). Aguda letal o letal

F13B10.2

CG4863 Proteína L3 de subunidad ribosómica grande (rpl-3). Aguda letal o letal

F16A11.2

CG9987 Tipo de proteína hipotética de Methanococcus 0682. Aguda letal o letal

F20B6.2

CG17369 Subunidad B de V-ATPasa. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento

F23F12.6

CG16916 Subunidad de ATPasa triple A del subcomplejo de base de partícula reguladora 19S del proteasoma 26S (RP) (RPT-3). Aguda letal o letal

F25H5.4

CG2238 Factor de elongación de la traducción 2 (EF-2), una proteína de unión a GTP implicada en la síntesis de proteínas. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento

F26D10.3

CG4264 Miembro de la clase génica de proteína de choque térmico. Aguda letal o letal

F28C6.7

CG6846 Proteína de subunidad ribosómica grande L26 (RPL-26) implicada en la biosíntesis de proteínas. Embrionaria letal o estéril

F28D1.7

CG8415 Proteína de subunidad ribosómica pequeña (S23) (RPS23) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal

F29G9.5

CG5289 Miembro de la clase génica de tipo ATPasa, partícula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal

F32H2.5

CG3523 Proteína mitocondrial. Aguda letal o letal

F37C12.11

CG2986 Proteína de subunidad ribosómica pequeña (S21) (RPS21) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal

F37C12.4

CG7622 Proteína de subunidad ribosómica grande L36 (RPL-36) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal

F37C12.9

CG1527 Proteína de subunidad ribosómica pequeña (S14) (RPS14) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal

F38E11.5

CG6699 Subunidad beta' (beta-prima) del complejo de coatómero (COPI). Aguda letal o letal

F39B2.6

CG10305 Proteína de subunidad ribosómica pequeña (S26) (RPS26) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal

DI de C.elegans

ID de D. melanogaster Descripción Exploración de ARNi Devgen

F39H11.5

CG12000 Miembro de la clase génica de subunidad beta de proteasoma. Aguda letal o letal

F40F8.10

CG3395 Proteína ribosómica S9 (RpS9), constituyente estructural de ribosoma implicado en la biosíntesis de proteínas que es un componente de la subunidad ribosómica pequeña citosólica. Aguda letal o letal

F42C5.8

CG7808 Proteína de subunidad ribosómica pequeña (S8) (RPS-8) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal

F49C12.8

CG5378 Miembro de la clase génica de tipo no ATPasa, partícula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal

F53A3.3

CG2033 Proteína de subunidad ribosómica pequeña S15a. Aguda letal o letal

F53G12.10

CG4897 Proteína L7 de subunidad ribosómica grande (rpl-7). Aguda letal o letal

F54A3.3

CG8977 Función desconocida. Aguda letal o letal

F54E2.3

CG1915 Producto con actividad cinasa de cadena ligera de miosina sallimus (sls) (EC:2.7.1.117) implicado en la condensación de cromosoma mitótico que se localiza en el núcleo.

F54E7.2

CG11271 Proteína de subunidad ribosómica pequeña (S12) (RPS12) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal

F55A11.2

CG4214 Miembro de la clase génica de SYNtaxina. Aguda letal o letal

F55A3.3

CG1828 Factor de transcripción. Aguda letal o letal

F55C10.1

CG11217 Ortólogo de calcineurina B, la subunidad reguladora de la proteína fosfatasa 2B. Aguda letal o letal

F56F3.5

CG2168 rps-1 codifica una proteína de subunidad ribosómica pequeña S3A. Aguda letal o letal

F57B9.10

CG10149 Miembro de la clase génica de tipo no ATPasa, partícula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal

F58F12.1

CG2968 ATP sintasa. Aguda letal o letal

F59E10.3

CG3948 Subunidad zeta del complejo de coatómero (COPI). Aguda letal o letal

JC8.3

CG3195 Proteína L12 de subunidad ribosómica grande (rpl-12). Aguda letal o letal

K01G5.4

CG1404 GTPasa monomérica pequeña RAN potencial (adhesión celular). Aguda letal o letal

K04F10.4

CG 18734 Subtilasa. Aguda letal o letal

K05C4.1

CG12323 Miembro de la clase génica de subunidad beta de proteasoma. Aguda letal o letal

K07D4.3

CG18174 Partícula reguladora del proteasoma potencial, subcomplejo de tapa, rpn11 Aguda letal o letal

K11D9.2

CG3725 Ca[2+] ATPasa del retículo sarcoendoplásmico. Embrionaria letal o estéril; Aguda letal o letal

M03F4.2

CG4027 Una actina que se expresa en la pared corporal y músculos vulvares y la espermateca. Aguda letal o letal

R06A4.9

CG1109 Seis repeticiones de WD40. Aguda letal o letal

R10E11.1

CG15319 Cofactor transcripcional potencial. Aguda letal o letal

R12E2.3

CG3416 Proteína con actividad endopeptidasa implicada en la proteolisis y peptidolisis. Aguda letal o letal

F10C1.2

CG10119 Miembro de la clase génica B de filamento intermedio. Embrionaria letal o estéril

F35G12.8

CG11397 Homólogo de la subunidad SMC4 de condensina mitótica. Embrionaria letal o estéril

F53G12.1

CG5771 Homólogo de GTPasa. Embrionaria letal o estéril

F54E7.3

CG5055 Proteína que contiene dominio PDZ. Embrionaria letal o estéril

H28O16.1

CG3612 ATP sintasa. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento

K12C11.2

CG4494 Miembro de la clase génica homóloga de SUMO (relacionada con ubiquitina). Embrionaria letal o estéril

R12E2.3

CG3416 Miembro de la clase génica de tipo no ATPasa, partícula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal

DI de C.elegans

ID de D. melanogaster Descripción Exploración de ARNi Devgen

R13A5.8

CG6141 Proteína ribosómica L9, constituyente estructural de ribosoma implicado en la biosíntesis de proteínas que se localiza en el ribosoma. Aguda letal o letal

T01C3.6

CG4046 rps-16 codifica una proteína de subunidad ribosómica pequeña S16. Aguda letal o letal

T01H3.1

CG7007 Proteína de tipo proteína proteolipídica PPA1. Aguda letal o letal

T05C12.7

CG5374 Chaperonina citosólica. Aguda letal o letal

T05H4.6

CG5605 Subunidad 1 del factor de liberación de cadena peptídica eucariota. Aguda letal o letal

T10H9.4

CG17248 N-sinaptobrevina; v-SNARE, transporte mediado por vesículas, vesícula sináptica.

T14F9.1

CG17332 Subunidad de ATPasa. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento

T20G5.1

CG9012 Cadena pesada de clatrina Aguda letal o letal

T21B10.7

CG7033 Proteína 1 de complejo t. Embrionaria letal o estéril

W09B12.1

CG17907 Acetilcolinesterasa.

T27F2.1

CG8264 Miembro de la clase génica homóloga SKIP (proteína que interactúa con Ski) de mamífero. Aguda letal o letal

ZC434.5

CG5394 Glutamil-ARNt sintetasa mitocondrial predicha (GluRS). Aguda letal o letal

B0511.6

CG6375 Helicasa. Embrionaria letal o estéril

DY3.2

CG10119 Lamina nuclear; proteína LMN-1. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento

R13G10.1

CG11397 Homólogo de la subunidad SMC4 de condensina mitótica. Tipo silvestre

T26E3.7

CG3612 Proteína mitocondrial predicha. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento

Y113G7A.3

CG1250 Activador de GTPasa, transporte de proteínas de ER al Golgi, componente del la pila del Golgi. Aguda letal o letal

Y43B11AR.4

CG11276 Proteína ribosómica S4 (RpS4), constituyente estructural de ribosoma implicado en la biosíntesis de proteínas que es un componente de la subunidad ribosómica pequeña citosólica. Aguda letal o letal

Y46G5A.4

CG5931 Gen Y46G5A.4. Aguda letal o letal

Y71F9AL.17

CG7961 Subunidad alfa del complejo de coatómero (COPI). Aguda letal o letal

Y76B12C.7

CG10110 Factor de escisión génica y especificidad de poliadenilación. Embrionaria letal o estéril

Y37D8A.10

CG1751 Función desconocida. Embrionaria letal o estéril

CG7765

C06G3.2 Miembro de la clase génica de proteína de tipo kinesina.

CG10922

C44E4.4 Proteína de unión a ARN. Embrionaria letal o estéril

CG4145

F01G12.5 Colágeno de tipo IV alfa-2. Embrionaria letal o estéril

CG13391

F28H1.3 Alanil-ARNt sintetasa (AlaRS) citoplasmática no predicha. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento

CG7765

R05D3.7 Miembro de la clase génica descoordinada. Embrionaria letal o estéril

CG7398

R06A4.4 Miembro de la clase génica de la familia de importina beta. Embrionaria letal o estéril

CG7436

T17E9.2 Función desconocida. Embrionaria letal o estéril

CG2666

T25G3.2 Quitina sintasa potencial. Embrionaria letal o estéril

imagen41

imagen42

imagen43

Tabla 5-MP

ID de diana

SEC ID Nº Nº de Ejemplo Gi y especie

MP027

1023 27540724 (Meloidogyne hapla)

MP027

1024 34026304 (Meloidogyne arenaria)

MP027

1025 34028558 (Meloidogyne javanica)

Tabla 6-LD/MP

ID de diana

SEC ID Nº Nº de Ejemplo Gi y especie

LD027

157 90546087 (Gloeophyllum trabeum)

LD027

158 50292600 (Candida glabrata CBS 138)

MP027

1040 60673889 (Alternaria brassicicola)

Tabla 8-LD

ID de diana

Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc (hebra con sentido) 5' → 3'

LD001

SEC ID Nº: 164 SEC ID Nº: 166 SEC ID Nº: 165 SEC ID Nº: 167 SEC ID Nº: 163

LD002

SEC ID Nº: 169 SEC ID Nº: 171 SEC ID Nº: 170 SEC ID Nº: 172 SEC ID Nº: 168

LD003

SEC ID Nº: 174 SEC ID Nº: 176 SEC ID Nº: 175 SEC ID Nº: 177 SEC ID Nº: 173

LD006

SEC ID Nº: 179 SEC ID Nº: 181 SEC ID Nº: 180 SEC ID Nº: 182 SEC ID Nº: 178

LD007

SEC ID Nº: 184 SEC ID Nº: 186 SEC ID Nº: 185 SEC ID Nº: 187 SEC ID Nº: 183

LD010

SEC ID Nº: 189 SEC ID Nº: 191 SEC ID Nº: 190 SEC ID Nº: 192 SEC ID Nº: 188

LD011

SEC ID Nº: 194 SEC ID Nº: 196 SEC ID Nº: 195 SEC ID Nº: 197 SEC ID Nº: 193

LD014

SEC ID Nº: 199 SEC ID Nº: 201 SEC ID Nº: 200 SEC ID Nº: 202 SEC ID Nº: 198

LD014_F1

SEC ID Nº: 204 SEC ID Nº: 206 SEC ID Nº: 205 SEC ID Nº: 207 SEC ID Nº: 203

LD014_F2

SEC ID Nº: 209 SEC ID Nº: 211 SEC ID Nº: 210 SEC ID Nº: 212 SEC ID Nº: 208

LD014_C1

SEC ID Nº: 213

LD014_C2

SEC ID Nº: 214

LD015

SEC ID Nº: 216 SEC ID Nº: 218 SEC ID Nº: 217 SEC ID Nº: 219 SEC ID Nº: 215

LD016

SEC ID Nº: 221 SEC ID Nº: 223 SEC ID Nº: 222 SEC ID Nº: 224 SEC ID Nº: 220

LD018

SEC ID Nº: 226 SEC ID Nº: 228 SEC ID Nº: 227 SEC ID Nº: 229 SEC ID Nº: 225

LD027

SEC ID Nº: 231 SEC ID Nº: 233 SEC ID Nº: 232 SEC ID Nº: 234 SEC ID Nº: 230

gfp

SEC ID Nº: 236 SEC ID Nº: 238 SEC ID Nº: 237 SEC ID Nº: 239 SEC ID Nº: 235

Tabla 8-PC

ID de diana

Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc (hebra con sentido) 5' → 3'

PC001

SEC ID Nº: 474 SEC ID Nº: 476 SEC ID Nº: 475 SEC ID Nº: 477 SEC ID Nº: 473

PC003

SEC ID Nº: 479 SEC ID Nº: 481 SEC ID Nº: 480 SEC ID Nº: 482 SEC ID Nº: 478

PC005

SEC ID Nº: 484 SEC ID Nº: 486 SEC ID Nº: 485 SEC ID Nº: 487 SEC ID Nº: 483

imagen44

MP016

SEC ID Nº: 1057 SEC ID Nº: 1059 SEC ID Nº: 1058 SEC ID Nº: 1060 SEC ID Nº: 1056

MP027

SEC ID Nº: 1062 SEC ID Nº: 1064 SEC ID Nº: 1063 SEC ID Nº: 1065 SEC ID Nº: 1061

Tabla 8-NL

ID de diana

Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc 5' → 3'

NL001

SEC ID Nº: 1573 SEC ID Nº: 1575 SEC ID Nº: 1574 SEC ID Nº: 1576 SEC ID Nº: 1572

NL002

SEC ID Nº: 1578 SEC ID Nº: 1580 SEC ID Nº: 1579 SEC ID Nº: 1581 SEC ID Nº: 1577

NL003

SEC ID Nº: 1583 SEC ID Nº: 1585 SEC ID Nº: 1584 SEC ID Nº: 1586 SEC ID Nº: 1582

NL004

SEC ID Nº: 1588 SEC ID Nº: 1590 SEC ID Nº: 1589 SEC ID Nº: 1591 SEC ID Nº: 1587

NL005

SEC ID Nº: 1593 SEC ID Nº: 1595 SEC ID Nº: 1594 SEC ID Nº: 1596 SEC ID Nº: 1592

NL006

SEC ID Nº: 1598 SEC ID Nº: 1600 SEC ID Nº: 1599 SEC ID Nº: 1601 SEC ID Nº: 1597

NL007

SEC ID Nº: 1603 SEC ID Nº: 1605 SEC ID Nº: 1604 SEC ID Nº: 1606 SEC ID Nº: 1602

NL008

SEC ID Nº: 1608 SEC ID Nº: 1610 SEC ID Nº: 1609 SEC ID Nº: 1611 SEC ID Nº: 1607

NL009

SEC ID Nº: 1613 SEC ID Nº: 1615 SEC ID Nº: 1614 SEC ID Nº: 1616 SEC ID Nº: 1612

NL010

SEC ID Nº: 1618 SEC ID Nº: 1620 SEC ID Nº: 1619 SEC ID Nº: 1621 SEC ID Nº: 1617

NL011

SEC ID Nº: 1623 SEC ID Nº: 1625 SEC ID Nº: 1624 SEC ID Nº: 1626 SEC ID Nº: 1622

NL012

SEC ID Nº: 1628 SEC ID Nº: 1630 SEC ID Nº: 1629 SEC ID Nº: 1631 SEC ID Nº: 1627

NL013

SEC ID Nº: 1633 SEC ID Nº: 1635 SEC ID Nº: 1634 SEC ID Nº: 1636 SEC ID Nº: 1632

NL014

SEC ID Nº: 1638 SEC ID Nº: 1640 SEC ID Nº: 1639 SEC ID Nº: 1641 SEC ID Nº: 1637

NL015

SEC ID Nº: 1643 SEC ID Nº: 1645 SEC ID Nº: 1644 SEC ID Nº: 1646 SEC ID Nº: 1642

NL016

SEC ID Nº: 1648 SEC ID Nº: 1650 SEC ID Nº: 1649 SEC ID Nº: 1651 SEC ID Nº: 1647

NL018

SEC ID Nº: 1653 SEC ID Nº: 1655 SEC ID Nº: 1654 SEC ID Nº: 1656 SEC ID Nº: 1652

NL019

SEC ID Nº: 1658 SEC ID Nº: 1660 SEC ID Nº: 1659 SEC ID Nº: 1661 SEC ID Nº: 1657

NL021

SEC ID Nº: 1663 SEC ID Nº: 1665 SEC ID Nº: 1664 SEC ID Nº: 1666 SEC ID Nº: 1662

NL022

SEC ID Nº: 1668 SEC ID Nº: 1670 SEC ID Nº: 1669 SEC ID Nº: 1671 SEC ID Nº: 1667

NL023

SEC ID Nº: 1673 SEC ID Nº: 1675 SEC ID Nº: 1674 SEC ID Nº: 1676 SEC ID Nº: 1672

NL027

SEC ID Nº: 1678 SEC ID Nº: 1680 SEC ID Nº: 1679 SEC ID Nº: 1681 SEC ID Nº: 1677

Tabla 8-CS

ID de diana

Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc (hebra con sentido) 5' → 3'

CS001

SEC ID Nº: 2041 SEC ID Nº: 2043 SEC ID Nº: 2042 SEC ID Nº: 2044 SEC ID Nº: 2040

CS002

SEC ID Nº: 2046 SEC ID Nº: 2048 SEC ID Nº: 2047 SEC ID Nº: 2049 SEC ID Nº: 2045

CS003

SEC ID Nº: 2051 SEC ID Nº: 2053 SEC ID Nº: 2052 SEC ID Nº: 2054 SEC ID Nº: 2050

CS006

SEC ID Nº: 2056 SEC ID Nº: 2057 SEC ID Nº: 2055

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Claims (1)

1. imagen1