MXPA01002468A

MXPA01002468A - Analogos de grf con potencia biologica incrementada.

Info

Publication number: MXPA01002468A
Application number: MXPA01002468A
Authority: MX
Inventors: Denis Gravel
Original assignee: Theratechnologies Inc
Priority date: 1998-09-08
Filing date: 1999-09-07
Publication date: 2002-04-24
Also published as: US20040171534A1; KR100474868B1; ES2164626T1; DE1109909T1; DE69928677D1; EP1109909B1; EP1109909A2; WO2000014236A2; ATE311453T1; WO2000014236A3; US6458764B1; BR9913515A; KR20010086368A; JP2002524472A; AU755852B2; CA2342070A1; AU5500799A

Abstract

La presente invencion se refiere a analogos de GRF de cuerpo graso quimericos con potencia biologica incrementada, su aplicacion como agentes anabolicos y en el diagnostico y tratamiento de deficiencias de la hormona de crecimiento. Los analogos de GRF de cuerpo graso quimericos incluyen un elemento hidrofobico (cola) y pueden prepararse ya sea mediante el anclaje de al menos una cola hidrofobica al GRF, en la sistesis quimica del GRF. Los analogos de GRF de la presente invencion son biodegradables, no inmunogenicos y exhiben una potencia anabolica mejorada con una dosis reducida y actividad prolongada.

Description

ANÁLOGOS DE GRF CON POTENCIA BIOLÓGICA INCREMENTADA Campo de la Invención La invención se refiere a análogos hidrofóbicos de GRF con potencia biológica incrementada y actividad prolongada, su aplicación como agentes anabólicos y tratamientos de deficiencias de la hormona de crecimiento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hormona de crecimiento (GH) o somatotropina, segregada por la glándula pituitaria constituye una familia de hormonas cuya actividad biológica es fundamental para el crecimiento lineal de un organismo joven pero también para el mantenimiento de la integridad en su estado adulto. La GH actúa directamente o indirectamente en los órganos periféricos al estimular la síntesis de factores de crecimiento (como el factor-l de crecimiento similar a la insulin o IGF-I) o de sus receptores (factor de crecimiento epidérmico o EGF). La acción directa de la GH es del referido como anti-insulínica, lo cual favorece la lipólisis a nivel de tejido adiposo. A través de su acción sobre la síntesis y secreción de IGF-I (somatomedina C), la GH estimula el crecimiento de cartílagos y huesos (crecimiento estructural), la síntesis de proteínas y la proliferación celular en órganos periféricos múltiples, incluyendo músculos y la piel. A través de su actividad biológica, la GH participa dentro de los adultos en el mantenimiento de un estado de anabolismo de proteínas y juega un papel principal en fenómeno de regeneración de tejidos después I lililí l i IMiíñ i - A > de un trauma. La disminución de secreción de GH con la edad, demostrada en humanos y animales, favorece un desplazamiento metabólico hacia el catabolismo que inicia o participa en el envejecimiento de un organismo. La pérdida de masa muscular, la acumulación de tejido adiposo, la desmineralización de huesos, la pérdida de capacidad de regeneración de tejido después de un daño, lo cual se observa en el envejecimiento, se correlaciona con el decremento en la secreción de GH. La GH es, por lo tanto, un agente anabólico fisiológico absolutamente necesario para el crecimiento lineal de niños y la cual controla el metabolismo de proteínas en adultos. La secreción de GH por la glándula pituitaria se controla principalmente por dos péptidos hipotalámicos, somatostatina y factor de liberación de la hormona de crecimiento (GRF). La somatostatina inhibe su secreción, mientras que el GRF la estimula. La GH humana se ha producido mediante diseño genético durante aproximadamente diez años. Hasta hace poco, la mayoría de los usos de GH tenía que ver con el retraso de crecimiento en niños y ahora se están estudiando los usos de GH en adultos. Los usos farmacológicos de la GH y el GRF pueden clasificarse en las siguientes tres categorías principales. Crecimiento de Niños Los tratamientos con hormona de crecimiento humana recombinante han demostrado estimular el crecimiento en niños con enanismo pituitario, insuficiencias renales, síndrome de Turner y estatura corta. La GH humana recombinante se comercializa actualmente como un "fármaco huérfano" en Europa y en los Estados Unidos para el retardo de crecimiento en niños originado por una deficiencia de GH y para insuficiencias renales en niños. Los otros usos se encuentran bajo 5 investigación de e nsayo clínico. Tratamiento a largo plazo para adultos y pacientes de edad avanzada Un decremento en la secreción de GH origina cambios en la composición corporal durante el envejecimiento. Los estudios preliminares de tratamiento a un año con GH humana recombinante reportaron un 10 incremento en la masa muscular y en el grosor de la piel, un decremento en la masa de grasa con un ligero incremento en la densidad ósea en una población de pacientes de edad avanzada. Con respecto a la osteoporosis, los estudios recientes sugieren que la GH humana recombinante no incrementa la mineralización de los huesos pero sugiere 15 que puede evitar la desmineralización ósea en mujeres post- menopáusicas. Actualmente se han llevado a cabo estudios adicionales para demostrar su teoría. Tratamiento a corto plazo en adultos y pacientes de edad avanzada En e studios preclínicos y clínicos, la hormona de crecimiento 20 ha demostrado estimular el anabolismo de proteínas en la curación de heridas y huesos en casos de quemaduras, SIDA y cáncer. La GH y el GRF también se proponen para usos veterinarios farmacológicos. Tanto la GH como el GRF estimulan el crecimiento en cerdos durante su periodo de engorda al favorecer la deposición de tejido 25 muscular en lugar de tejido adiposo e incrementa la producción de leche en las vacas y esto sin efectos colaterales indeseados que pudieran poner en peligro la salud de los animales y sin ningún residuo en la carne o la leche que se producen. La somatotropina bovina (BST) se comercializa actualmente en los Estados Unidos. La mayoría de los estudios clínicos llevados a cabo se condujeron GH recombinante. El GRF se considera como un producto de segunda generación, destinado a reemplazar, en un futuro cercano, el uso de la GH en la mayoría de los casos. De acuerdo con lo anterior, el uso del GRF presenta un número de ventajas sobre el uso de GH per se. Ventajas Fisiológicas La hormona de crecimiento (GH) se segrega por la glándula pituitaria en una forma de impulso. Ya que este ritmo de secreción es crucial para una actividad biológica óptima, es difícil de lograr la administración de GH que corresponda a su modo natural de secreción. Cuando el GRF se administra en una manera continua como una preparación de liberación lenta o como una infusión, incrementa la secreción de GH mientras se respeta se pulsatilidad. La GH recombinante que se comercializa actualmente es la forma kDa 22 mientras que el GRF induce la síntesis y secreción de la glándula pituitaria de todos los isómeros químicos de GH que participan en un rango más amplio de actividades biológicas. Un tratamiento con GH da como resultado una capacidad disminuida de la glándula pituitaria que segrega hormona de crecimiento endógena y la respuesta de la GH al GRF se disminuye después de tal tratamiento. Por el contrario, un tratamiento con GRF no presenta esta desventaja, su acción trófica en la glándula pituitaria incrementa la capacidad de secreción de esta glándula en animales normales y en pacientes con insuficiencia somatotrófica. Ventajas económicas La producción de GH mediante diseño genético es muy cara para uso clínico. En particular, existen riesgos de contaminación de estas preparaciones comerciales con material de la cepa bacteriana utilizada. Estos contaminantes bacterianos pueden ser pirogénicos o pueden dar como resultado reacciones inmunogénicas en pacientes. La purificación del producto recombinante se lleva a cabo tras la realización de una pluralidad de etapas sucesivas de cromatografía. El criterio de pureza drástico impuesto por agencias reguladoras necesita de múltiples etapas de control de calidad. Por otro lado, la síntesis de GRF es de naturaleza química. La síntesis se lleva a cabo en una fase sólida y su purificación se realiza en una sola etapa mediante el uso de cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC). También, la cantidad de GRF por administrarse es mucho menor que la cantidad de GH para el mismo resultado biológico. Incluso con todas estas ventajas, el GRF aún no se comercializa como un agente terapéutico a la fecha, principalmente debido a su inestabilidad. El GRF humano es un péptido de 44 amino ácidos de la siguiente secuencia: Tyr Ala Asp Ala Me Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp He Met Ser Arg Gln Gln Gly 20 25 30 l__rtt. **te,.M .. «,, . . . - > - . ...- « . , > .^^muMA»^****** .

Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu-NH2 35 40 (SEQ ID NO: 1 ) El núcleo activo mínimo es hGRF (1 -29)NH2 Tyr Ala Asp Ala He Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln 1 5 10 1 5 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp lie Met Ser Arg 20 25 (SEQ ID NO:2) Como muchos péptidos, el hGRF (1 -29)NH2 se degrada rápidamente en un medio de suero y sus metabolitos no tienen actividad biológica residual. Se ha establecido bien que la acción de las enzimas, es decir la de dipeptidilaminopeptidasa de tipo IV, en un medio sanguíneo da como resultado la hidrólisis de la unión péptida Ala2-Asp3 del GRF. Esta hidrólisis da como resultado una multitud de consecuencias negativas que son sujeto de muchos estudios reportados en la literatura. Esencialmente, esta hidrólisis conduce a menos de 1 /1000 de la actividad biológica. Los estudios clínicos con niños y adultos han confirmado que el hGRF natural (1 -44)NH2 o el hGRF de fragmento activo (1 -29)NH2 no son lo suficientemente potentes para producir efectos iguales correspondientes a aquellos de GH recombinantes. Se sabe bien que el anclaje de grupos hidrofóbicos, tales como -NEt2 en la terminal C de una secuencia péptida puede dar como resultado una actividad específica significativamente incrementada. En términos de hidrofobicidad, estos resultados se contradicen por un número razonable de trabajos recientes tales como aquellos de Muranichi (S. Muranichi eí al. , 1 991 , Pharm Res. , 8:649-652) los cuales subrayan la ineficacia del grupo lauroilo como un grupo hidrofóbico en la terminal N que crea pequeños análogos péptidos que tienen la actividad biológica deseada . No obstante, las investigaciones contradictorias de la técnica anterior fallaron en dirigir el tema de hallazgo de un análogo de GRF más potente mediante el uso de residuos hidrofóbicos. Gaudreau et al. (P. Gaudreau ef al. , 1992, J. Med. Chem., 35(10): 1864-1869) describe la afinidad de acetil-, 6-aminohexanoil-, y 8- aminooctanoil-GR F(1 -29)NH2 con el receptor pituitario de la rata. En este reporte, ninguno de los compuestos de GRF-ácido graso examinados mostraron una afinidad mayor que el hGRF(1 -29)NH2 por sí mismo y los autores concluyeron que "...las modificaciones para incrementar el carácter hidrofóbica en el término N del hGRF(1 -29)NH2 no constituyen un enfoque adecuado para incrementar la afinidad del receptor.". Coy ef al. (D.H. Cow er al. , 1 987, J. Med. Chem. , 30:219-222) describe un péptido de GRF-acetilo con una actividad biológica incrementada sobre un modelo de rata, más particularmente sobre una rata anestesiada con pentobarbital de sodio. También se analizó la respuesta de GH in vitro mediante células pituitarias cultivadas de rata. Sin embargo, estos autores no sintetizaron no examinaron los análogos de GRF-ácido graso con una cadena de carbono mayor de dos (2) átomos de carbono (grupo acetilo) agregados en la región de término N del GRF y el acetilo no puede considerarse un grupo hidrofóbico. Hasta ahora, la mayoría de los análogos de GRF descritos #h?*±áil**~ . ,. Y ..AÚm~*í *.a?m « á__á_fi_- ^jg^ - --^iitr*^^^^ (incluyendo aquellos de Gaudreau et al. y aquellos de Coy et al. ) se han examinado en modelos de rata, ya sea in vitro o in vivo. Ya que el GRF(1 - 29)NH2 de humano y de rata son notablemente diferentes, las relaciones de estructura-actividad del GRF son diferentes en ambas especies. Por consiguiente, no es posible extrapolar resultados obtenidos en ratas a humanos. De acuerdo con lo anterior, es necesario diseñar análogos de GRF con potencia anabólica mejorada y que tengan actividad prolongada. Esta potencia incrementada podría dar como resultado una resistencia a la degradación del suero y/o a propiedades hiperagonísticas. Sería altamente deseable que se proporcionaran análogos de GRF con potencia anabólica incrementada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un propósito de la presente invención es proporcionar nuevos análogos de GRF biodegradables con potencia biológica mejorada y actividad prolongada. Otro propósito de la presente invención es proporcionar análogos de GRF con potencia anabólica incrementada y actividad prolongada, es decir, capaces de elevar substancialmente los niveles de factor de crecimiento I similar a la insulina (IGF-I) cuando se administre de manera crónica en humanos y animales. Otro propósito de la presente invención es proporcionar un medio para volver cualquier análogo de GRF más potente biológicamente y con una actividad prolongada.

Otro propósito de la presente invención es proporcionar un método para producir análogos activos de GRF con potencia anabólica mejorada y actividad prolongada. La presente invención se refiere a la preparación de análogos hidrofóbicos de GRF. Estos análogos quiméricos incluyen un elemento hidrofóbico (cola) y pueden prepararse ya sea mediante anclaje de una o más colas hidrofóbicas al GRF, o mediante la substitución de uno o varios amino-ácidos mediante un residuo pseudomicelar en la síntesis química del GRF. De acuerdo con la presente invención, los análogos de GRF se caracterizan porque: a) Estos análogos poseen una actividad biológica mejorada; específicamente, son capaces de incrementar notablemente los niveles sanguíneos de GH e IGF-I cuando se administra en un modelo animal muy relacionado con el humano. Esta característica es particularmente ventajosa ya que da como resultado una dosis reducida de un compuesto hiperactivo que se administra al paciente, mejorando así la eficacia del tratamiento y reduciendo los costos del tratamiento. b) Ambas substancias naturales amino acidas e hidrofóbicas, tales como ácidos grasos, se utilizan para la síntesis química de los análogos de GRF. c) Presentan una actividad biológica elevada a dosis infinitamente pequeñas. d) Permanecen activos por un periodo de tiempo prolongado, con una actividad biológica elevada. fe* .. ^.«...-...^^ .^i&k — ...^.. ..... _.. ,. .^_¿ ^._¿a ? ?aBfc^ ^ | El uso de cuerpos grasos de acuerdo con la presente invención da corno resultado análogos de GRF que superan todas las desventajas de la técnica anterior. Los análogos de GRF de la presente invención exhiben una potencia anabólica mejorada con una dosis reducida y tienen actividad prolongada. Además, la presente invención trata con GRF y cualquiera de sus análogos, truncos o substituidos. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un análogo hidrofóbico de GRF de la fórmula A: X GRF - péptido (A) en donde; el péptido de GRF es un péptido de la fórmula B; A1 -A2-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-A8-Ser-Tyr-Arg-Lys-A13-Leu-A15- Gln-Leu-A18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-A24-A25-lle-A27-A28-Arg- A30-R0 (B) en donde, A1 es Tyr o His; A2 es Val o Ala; A8 es Asn o Ser; A13 es Val o He; A15 es Ala o Gly; A18 es Ser o Tyr; A24 es Gln o His; A25 es Asp o Glu; A27 es Met, He o NIe; A28 es Ser o Asn; A30 es una unión o cualquier secuencia amino acida de 1 hasta 1 5 residuos; Ro es NH2 o NH-(CH2)n-CONH2, con n= 1 hasta 12 y; X es una cola hidrofóbica anclada a través de una unión de amida al término N del péptido y dicha cola hidrofóbica define una estructura de 5 a 7 átomos; en donde dicha estructura puede substituirse por alquilo C?_6, cicloalquilo C3.6 o arilo C6-?2; y comprende al menos un elemento de rigidez conectado a por menos dos átomos de la estructura; seleccionado dicho residuo a partir del grupo que consiste en doble unión, triple unión, cicloalquilo C3-9 saturado o no saturado y arilo C6-?2. Por el término elemento de rigidez se entiende un elemento que conferirá rigidez a la cola hidrofóbica. El elemento de rigidez conecta al menos dos átomos que son parte de la estructura de la cola hidrofóbica. Por ejemplo, la estructura de la siguiente cola hidrofóbica es como sigue: Cola Estructura Preferentemente, la estructura se substituye con un elemento de rigidez seleccionado a partir del grupo que consiste en unión doble, unión triple, cicloalquilo C3- saturado y arilo C6. También preferentemente, la estructura se substituye con 2 elementos de rigidez que se seleccionan de manera independiente a partir del grupo que consiste en cicloalquilo C3.9 saturado o no saturado.

Más preferentemente, la estructura se substituye con 2 elementos de rigidez que se seleccionan de manera independiente a partir del grupo que consiste en unión doble, unión triple, cicloalquilo C3-saturado y arilo C5 En una modalidad alternativa, la estructura se substituye con un elemento de rigidez seleccionado a partir del grupo que consiste en unión doble, unión triple, cicloalquilo C3.7 saturado y arilo C6, los cuales se localizan en las posiciones 3,4, las posiciones 3,5 o las posiciones 3,6 de la estructura. Preferentemente, la cola hidrofóbica se selecciona a partir del grupo que consiste en: 3 (R=H o CH3 o CH2CH3) 4 (R=H o CH3 o CH2CH3) cis o trans, tanto como mezclas cis o trans, (donde R ? H) racémicas o como pares enantioméricos tanto como mezclas racémicas puros. o como pares enantioméricos puros. ;.í¡r?i¡jÍA ._.J»Ai_._ta;. . --_;., .-.. .. .-.i,, ... . -, . .gaA^^t*¿»^^-S^-as>Sfc.^„-... 1 (R=H o CH3 o CH2CH3) 2 (R=H o CH3 o CH2CH3) cis o trans, tanto como mezclas racémicas o como pares enantioméricos puros. 5 (R=H o CH3 o CH2CH3) 6 (R=H o CH3 o CH2CH3) cis o trans, tanto como mezclas cis o trans, (donde R ? H) racémicas o como pares enantioméricos tanto como mezclas racémicas puros. o como pares enantioméricos puros. 7 (R=H o CH3 o CH2CH3) 8 (R=H o CH3 o CH2CH3) cis o trans, tanto como mezclas cis o trans, (donde R ? H) racémicas o como pares enantioméricos tanto como mezclas racémicas puros. o como pares enantioméricos puros. 9 (R=H o CH3) 10 (R=H o CH3 o CH2CH3) cis o trans, (donde R ? H) tanto como mezclas racémicas o como pares enantioméricos puros. 1 1 (R=H o CH3 o CH2CH3) 12 (R=H o CH3) De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar el nivel de hormona de crecimiento en un paciente, el cual comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un análogo de GRF de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para el diagnóstico de deficiencias de la hormona de crecimiento en pacientes, el cual comprende la administración a dicho paciente de un análogo de GRF de la presente invención y la medición de la respuesta de la hormona de crecimiento. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para el tratamiento de enanismo pituitario o retardo de crecimiento en un paciente, el cual comprende la administración a dicho paciente de _^^_^^*^ t^ riíif -.riri i i *- ÉÉi. ____!______•____. ¡i|¿!j¡|l una cantidad efectiva de un análogo de GRF de la presente invención. De acuerdo con la presente invención , se proporciona un método para el tratamiento de curación de heridas o huesos en un paciente, el cual comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un análogo de GRF de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para el tratamiento de osteoporosis en un paciente, el cual comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un análogo de GRF de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar el anabolismo de proteínas (incluyendo el efecto de escasez de proteína) en humanos o animales, el cual comprende la administración a dicho humano o animal de una cantidad efectiva de un análogo de GRF de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para inducir un efecto lipolítico en humanos o animales afligidos con obesidad clínica, el cual comprende la administración a dicho humano o animal de una cantidad efectiva de un análogo de GRF de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para la mejora total de la función somatotrófica en humanos o animales, el cual comprende la administración a dicho humano o animal de una cantidad efectiva de un análogo de GRF de la presente invención. En la presente invención, los amino ácidos se identifican por las abreviaturas convencionales de tres letras según se indica abajo, las _.... , ..^...».-->J». iliililiilililiitál -^' MftlÉ-^^ — -*-- ^M^?ámt? cuales se aceptan generalmente en la materia de péptidos según se recomienda por la comisión IUPAC-IUB en nomenclatura bioquímica: Alanina Ala Arginina Arg Asparagina Asn Ácido Aspártico Asp Cisteína Cys Ácido Glutámico Glu Glicina Gly Histidina His Leucina Leu Lisina Lys Metionina Met Ornitina Orn Fenilalanina Phe Prolina Pro Serina Ser Treonina Thr Triptofano Trp Tirosina Tyr D-Tirosina Tyr Valina Val El término "arpiño ácido natural" significa un amino ácido que ocurre en la naturaleza o el cual se incorpora como un residuo amino ácido en un péptido naturalmente ocurrente. Además, la abreviatura NIe se propone como significado de Norleucina. Otras abreviaturas utilizadas son: TFA Ácido trifluoroacético; HOBt 1 -Hidroxibenzotriazol; DIC Diisopropilcarbodiimida; DMF Dimetilformamida; Pip Piperidina; DMAP 4-d imetilamino piridina; Boc t-butiloxicarbonilo; Fmoc Fluorenilmetiloxicarbonilo; BOP Hexafluorofosfato de benzotriazo-1 - iloxitris(dimetilamino)fosfonio; Me Metilo; HF Ácido hidrofluórico; NEts Trietilamina; y TEAP Fosfato de trietilamoniaco (regulador). Todas las secuencias péptidas aquí establecidas se escriben de acuerdo a la convención generalmente aceptada por la cual el amino ácido de terminal N se encuentra a la izquierda y el amino ácido de terminal C se encuentra a la derecha.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica del efecto de análogos de hGRF(1 -29)NH2 inyectados de manera subcutánea en suero de cerdo IGF-1 ; La Figura 2 es una curva del efecto de una inyección .r.r-j,*..?: . - -r í -i A. J faáU ., ,_, «t. _________fci . - . _____Ü________h ' •'M'r>tTl1ÍliÉt t < ? 8? rtÍ'lF?T t__^iI^___i_^L ___._L-J_2.ji_ intravenosa de hGRF(1 -29)NH2 (4µg/kg) y (4µg/kg) (Hexenoil trans-3)° hGRF(1 -29)NH2 (TT-01 024) + análogo en GH de suero de cerdo; La Figura 3 es una gráfica que muestra el efecto de diversas dosis de hGRF(1 -29)NH2 vs [hexenoil trans-3]° hGRF(1 -29)NH2 (TT-01 024) 5 en el área de GH bajo la curva durante 300 minutos después de administración I.V. (**P<0.01 y ***P<0.001 cuando se comparó con el periodo basal —60 a 0 min-); La Figura 4 es una curva del efecto de una inyección subcutánea de 5µg/kg de análogo de hGRF(1 -29)NH2 y (5µg/kg) (Hexenoil 10 trans-3)° hGRF(1 -29)NH2 en GH de suero de cerdo; La Figura 5 es una gráfica que muestra el efecto de diversas dosis de hGRF(1 -29)NH2 vs [hexenoil trans-3]° hGRF(1 -29)NH2 (TT-01024) en el área de GH bajo la curva durante 420 minutos después de administración S .C. (**P<0.01 y ***P<0.001 cuando se comparó con el 15 periodo basal —60 a 0 min-); La Figura 6A a 6C ilustra ejemplos de síntesis específicas de la porción X de los análogos de GRF con radicales R preferidos de acuerdo con la presente invención; y La Figura 7A y 7B ilustran el efecto de 8 diferentes análogos 20 de hGRF(1 -44)NH2 de la presente invención en niveles IGF-1 en cerdos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de cuerpos grasos, es decir, residuos pseudomicelares y/o colas hidrofóbicas, para producir una 25 nueva familia de análogos de GRF-cuerpos grasos quiméricos, altamente potentes De acuerdo con la presente invención, los análogos de GRF- cuerpo graso pueden sintetizarse químicamente mediante el anclaje de una o varias colas hidrofóbicas en la porción de terminal N del GRF o uno de sus análogos. Para un mejor desempeño de la reacción de anclaje química, se utiliza preferentemente el hidrofóbico funcionalizado bajo la forma acida. En estas condiciones, la reacción de anclaje se efectúa preferentemente en una fase sólida (Merrifield R.B. , 1963, J. Am. Chem. Soc , 85:2149; 1964, J. Am. Chem. Soc, 86:304) mediante el uso de reactivos extremadamente activos, tales como por ejemplo, hexafluorofosfato de fosfonio conocido en la materia anterior (B. castro et al. , 1975, Tetrahedron letters, Vol. 14: 1219). En el caso en que la cola hidrofóbica por anclarse consiste en un ácido graso, la activación en vista del anclaje puede llevarse a cabo in situ. Dependiendo de las estrategias de síntesis utilizadas, el sitio de anclaje del péptido se libera justo antes del anclaje en las condiciones tradicionales de desprotección (Gross et Meienhofer, 1981 , The Peptides, vol. 3, Academic Press: páginas 1 .341 ). La cola hidrofóbica (Ht) se condensa entonces con el agente de anclaje en solventes orgánicos tales como un éter (tetrahidrofurano), un solvente halogenado alifático (diclorometano), un nitrilo (acetonitrilo) o una amida (dimetilformamida). Con respecto a la dinámica de anclaje, las temperaturas de trabajo preferidas se encuentran entre 20 y 60°C. El tiempo de reacción de anclaje cuando se utiliza una cola hidrofóbica que es más y más hidrofóbica, varía inversamente con la temperatura, pero varía entre 0.1 y 24 horas. Como un ejemplo ilustrativo, la síntesis de lisina de triacilo según se establece abajo, ilustra en una manera esquemática, todo el principio de anclaje de una cola de ácido graso hidrofóbica.

Se llevaron a cabo etapas generales de síntesis de análogos de GRF mediante metodología de fase sólida en un sintetizador de péptidos 9050™ plus (Millipore Corporation, Milford, MA) mediante el uso de una estrategia Fmoc y ciclos de síntesis suministrados por Millipore.

Los amino ácidos Fmoc se suministraron por Bachem California y otras fuentes comerciales. La química de Fmoc secuencial que utiliza BOP/HOBt como metodología de acoplamiento se aplicó a la resina de inicio de Fmoc-Pal-PEL (Millipore, número de catálogo: GEN 913383) para la producción de carboxamidas de terminal C. Las desprotecciones de Fmoc se llevaron a cabo con una solución de piperidina al 20% en DMF. Después del término de la síntesis, la resina se enjuagó bien con DMF y éter antes de secarse. Las descomposiciones finales de los grupos protectores de cadena lateral y las uniones de péptido-resina se llevaron a cabo mediante el uso del procedimiento suministrado por Millipore que consiste en la siguiente mezcla: TFA, agua, fenol, triisopropilsilano (88:5:5:2). Los péptidos se precipitaron y enjuagaron después con éter antes de secarse. La purificación de HPLC de fase inversa (regulador A: TEAP 2.5, regulador B: CH3CN al 80% en A) mediante el uso de una preparación de agua 4000, absorción 214 nm, modelo de detector 486, velocidad de flujo 50ml/min; gradiente lineal generalmente desde 25 hasta 60%B en 105 min.) seguido por una etapa de desalación (regulador C:0.1 % de TFA en H2O; regulador D:0.1 % de TFA en CH3CH/H2O 80:20) produjo péptidos en rendimientos que sumaban un total de 10 hasta 30% con homogeneidad mayor a 97% según se estimó por HPLC (milenio/detección de instalación de fotodiodo). De acuerdo con la presente invención, el cerdo se seleccionó como una especie de prueba, ya que es un modelo preclínico valioso para el desarrollo de análogos de GRF. No obstante, el GRF(1 -29)NH2 humano y porcino comparten un 100% de homología de estructura y el patrón fisiológico de secreción de GH es casi idéntico en ambas especies. Adem ás, la potencia de los análogos de GRF se determinó por su habilidad para incrementar significativamente los niveles sanguíneos de IGF-I en vez de su potencia de liberación de GH aguda. No obstante, se sabe que los efectos anabólicos y de sanación de la GH o de la GH inducida por GRF se median por un incremento en la síntesis y secreción de IGF-I. Por consiguiente, la medición de la elevación de IGF-I inducida por GRF es el mejor indicador de la eficacia del tratamiento. La presente invención se entenderá más fácilmente con relación a los siguientes ejemplos, los cuales se dan para ilustrar la invención más no para limitar su alcance. EJEMPLO I Efecto de administraciones repetidas de [BUTIRILO0], [OCTANOILO0]-, [HEXANOILO°]-[HEXANOILO30], [HEXANOILO0,30], HGRF(1 -29)NH2 y [HEXANOILO°]HGRF(1 -44)NH2 VS hGRF(1 -29)NH2 sobre niveles de IGF-I de suero en cerdos El objetivo de estos experimentos fue determinar el potencial de los análogos de GRF como agentes anabólicos. Se sabe que la secreción de GH o de GH inducida por GRF ejerce su efecto anabólico a través de un incremento en la secreción y síntesis del factor de crecimiento I similar a la insulina (IGF-I), que da como resultado niveles elevados de IGF-I circulante. Se ha demostrado previamente que la intensidad de la respuesta anabólica al tratamiento análogo de GRF es proporcional al incremento en niveles de IGF-I en cerdos (Dubreuil P. ef al. , 1990, J. Anim. Sci. , 68: 1254-1268). '-¿-^^^<^á*$áa¡¡£,tsJk??,¿&í ? «*** ,*, ¡O-A. - < tb? . aÁí Por consiguiente, con objeto de investigar la potencia anabólica de los análogos de GRF-ácido graso, se evaluó su habilidad para incrementar los niveles de IGF-I después de administraciones S.C. repetidas en cerdos. Experimento 1 26 cerdos macho castrados Landrace x Yorkshire (40-45 kg BW) se distribuyeron de manera aleatoria en 4 grupos experimentales: 1 - hGRF(1 -29)NH2 (20µg/kg, n=7) 2- [octanoil°]hGRF(1 -29)NH2 (20µg/kg, n=6) 3- [hexanoil°]hGRF(1 -29)NH2 (20µg/kg, n=6) 4- [butirilo°]hGRF(1 -29)NH2 (20µg/kg, n=7) Cada animal fue inyectado BID (dos veces al día) de manera subcutánea durante 4 días consecutivos. Se recolectó una muestra de sangre cada mañana antes de la primera inyección del día y un día después de la última inyección, para la medición del IGF-I. Experimento 2 40 cerdos macho castrados Landrace x Yorkshire (40-45 kg BW) se distribuyeron de manera aleatoria en 5 grupos experimentales: 1 - solución salina (n=8) 2- hGRF(1 -29)NH2 (40µg/kg, n=8) 3- [hexanoil°]hGRF(1 -29)NH2 (10µg/kg, n=8) 4- [hexanoil°]hGRF(1 -29)NH2 (20µg/kg, n=8) 5- [hexanoil°]hGRF(1 -29)NH2 (40µg/kg, n=8) Cada animal fue inyectado BID (dos veces al día) de manera subcutánea durante 5 días consecutivos. Se recolectó una muestra de .... ita ??*S? m*¡?e »*Á?¿¡áA?k!í i .¿kan... „. i sangre cada mañana antes de la primera inyección del día y un día después de la úll ima inyección , para la medición del IGF-I . Experimento 3 48 cerdos macho castrados Landrace x Yorkshire (40-45 kg BW) se distribuyeron de manera aleatoria en 6 grupos experimentales: 1 - Solución salina (n=8) 2- hGRF(1 -44)NH2 (30µg/kg , n=8) 3- [hexanoil°]hGRF(1 -44)NH2 (30µg/kg, n=8) 4- [hexanoil°]hGRF(1 -29)NH2 (20µg/kg, n=8) 5- [hexanoil30]hGRF(1 -29)NH2 (20µg/kg , n=8) 6- [hexanoil°'30]hGRF(1 -29)NH2 (20µg/kg , n=8) Las dosis seleccionadas fueron de 30µg/kg para los análogos de hGRF(1 -44)NH2 y 20 µg/kg para análogos de hGRF(1 -29)NH2, lo cual da dosis idénticas sobre una base molar. Cada animal fue inyectado BID (dos veces al día) de manera subcutánea durante 5 días consecutivos. Se recolectó una muestra de sangre cada mañana antes de la primera inyección del día y un día después de la última inyección, para la medición del IGF-I. Mediciones de IGF-I Los niveles de IGF-I se midieron en suero de cerdo mediante doble radioinmunoensayo de anticuerpos después de extracción de ácido fórmico-acetona, como se describió previamente (Abribat T. ef al. , 1 993, J. Endocrinol. , 39:583-589). La extracción anterior al radioinmunoensayo es una etapa necesaria para retirar las proteínas endógenas de unión a IGF. Análisis estadísticos En ambos experimentos, los datos de IGF-I se analizaron por un análisis de varianza de medición repetida de dos vías, con día y tratamiento (análogo de GRF) como fuentes de variación. Se ejecutaron entonces múltiples procedimientos de comparación (método Student- Newman Keuls). Una P<0.05 se consideró como estadísticamente significativo. Resultados Experimento 1 Existió tanto un efecto significativo de día (P=0.0004) como un tratamiento significativo x interacción de día (P=0.01 1 ), indicando que el incremento en los niveles de IGF-I dependió del análogo examinado (Tabla 1 ). Las muestras de sangre para las mediciones de IGF-I se recolectaron diariamente antes de la primer inyección de compuestos. Los datos se muestran como media +SEM de 6 a 7 valores por grupo. Tabla 1 Efecto de inyección SC repetida (20µg/kg BID x 4 días) de análogos de GRF en niveles de IGF-I en suero Tratamiento P=0.42 Día P=0.0004 Tratamiento x Día P=0.01 1 a P<0.05 cuando se compara con el día 1 P<0.05 cuando se compara con el día 2 Las múltiples comparaciones revelaron que solamente [hexanoil°]hGRF(1 -29)NH2 produjo un incremento en los niveles de IGF-I , el cual fue signif icativo los días 4 (29%, P<0.05) y 5 (38%, P<0.05). El GRF(1 -29)NH2 humano no tuvo efecto en los niveles de IGF-I en las dosis examinadas. Experimento 2 Existió tanto un efecto significativo del día (P<0.0001 ) como una interacción significativa de tratamiento x día (P<0.0001 ), indicando que el incremento en los niveles de IGF-I dependió del análogo examinado (Tabla 2). Se recolectaron muestras de sangre para las mediciones de IGF-I diariamente antes de la primer inyección del día. . Los datos se muestran como media +SEM de 8 valores por grupo.

Tabla 2 Efecto relacionado con la dosis de inyección SC repetida (BID X 5 días) de análogos de GRF sobre niveles de IGF-I de suero Tratamiento x Día P=0.0001 a P<0.05 cuando se compara con el día 1 b P<0.05 cuando se compara con el día 2 c P<0.05 cuando se compara con el día 3 Las múltiples comparaciones revelaron que las tres dosis examinadas de [hexanoil°]hGRF(1 -29)NH2 incrementaron los niveles de IGF-I. A 10µg/kg, los niveles de IGF-I se incrementaron significativamente los días 5 y 6 (16a 21 %, P<0.05). A 20µg/kg, se incrementaron los días 3, 4, 5 y 6 (20 a 22%, P<0.05). A 40µg/kg, se incrementaron los días 3, 4, 5 y 6 (27 a 48%, P<0.05). Los niveles de IGF-I de suero permanecieron estables en la solución salina y los cerdos tratados con hGRF(1 -29)NH2. j ^ Finalmente, un análisis de regresión reveló que el incremento en las concentraciones de IGF-I del día 1 al día 6 dependió de la dosis de [hexanoil°]hGRF(1 -29)NH2 (?IGF-I = 1 1 .9 + (2.77 * dosis); r = 0.68, P<0.0001 ). Experimento 3 Existió tanto un efecto significativo de día (P<0.0001 ) como una interacción significativa de tratamiento x día (P<0.0001 ), indicando que el incremento en los niveles de IGF-I dependió del análogo examinado (Tabla IV). Múltiples comparaciones revelaron que los análogos con función hexanoil ramificada en la región de terminal N del GRF fueron altamente potentes: [hexanoil°]hGRF(1 -29)NH2 incrementó significativamente los niveles de IGF-I los días 5 y 6 (por 28% y 31 %, P<0.05) [hexanoil0,30]hGRF(1 -29)NH2 incrementó significativamente los niveles de IGF-I los días 4, 5 y 6 (por 32%, 35% y 43%, P<0.05) [hexanoil°]hGRF(1 -44)NH2 incrementó significativamente los niveles de IGF-I los días 3, 4, 5 y 6 (por 41 %, 54%, 50% y 61 &, P<0.05). Como se observó previamente para hGRF(1 -29)NH (experimentos 1 y 2), el hGRF(1 -44)NH2 de longitud total tuvo poco o nulo efecto sobre los niveles de IGF-I (excepto para un efecto significativo el día 5, el cual no se mantuvo el día 6). Finalmente, el anclaje de una función hexanoil en la región de terminal C del hGRF(1 -29)NH2, produjo un análogo con potencia incrementada cuando se comparó con el hGRF(1 -29)NH2 (21 % de incremento en los niveles de IGF-I el día 6, P<0.05), pero menos potente que [hexanoil°]hGRF(1 -29)NH2. fb^ ^h^i^ » ,„ ¿^ &.« ^ ^^ Á& Í .* ? ^ ^ *..' Se inyectaron GRF( 1 -29)NH2 y hGRF( 1 -44)N H2 humanos en 20µg/kg y 30µg/kg , respectiva mente, con objeto de lograr concentraciones equimolares. Los datos mostrados son medias + SEM de 8 valores por grupo. Tabla 3 Efecto de múltiples inyecciones SC de análogos de GRF (BID x 5 días) sobre niveles de IGF-I de suero en cerdos en crecimiento Día P<0.0001 b P<0.05 cuando se compara con el día 2 Tratamiento x Día P<0.0001 c P<0.05 cuando se compara con el día 3 Conclusiones Ni hG RF(1 -29)NH2 ni hGRF(1 -44)NH2 a dosis que varían desde . l.JtJk,tJAÁj& _-»_fc-.. ...y..-.. , Astea t.? i i. 20 hasta 40 µg/kg fueron capaces de modular los niveles de IGF-I. Sin embargo, el anclaje de ácido graso volvió a GRF más potente y produjo análogos con actividad notablemente mejorada sobre la secreción de IGF- I . El anclaje de ácidos grasos fue eficiente en la mejora de la potencia 5 anabólica tanto de hGRF(1 -29)NH2 como de hGRF(1 -44)NH2. A partir de los resultados anteriores, se concluye que el ácido graso ideal a utilizar es ácido hexanóico o cualquier derivado graso de C6 y que preferentemente debe anclarse en la región de terminal N del GRF para producir análogos potentes al máximo. 0 EJEMPLO II Efectos comparativos de análogos de GRF sobre niveles de IGF-I en cerdos Este fue un tratamiento de 5 días, dos veces al día una administración S C. de una sola dosis de cada artículo de prueba vs 5 solución salina. Este experimento se condujo para comparar la eficacia de (Aminohexanoil)o hGRF (1 -29) NH2) (Hexilformiato)o hGRF (1 -29) NH2, (Hexenoil trans-2)0 hGRF (1 -29) NH2, (Hexenoil trans-3)0 hGRF (1 -29) NH2 y (Muconoil)o hGRF (1 -29) NH2 con la de (Hexanoil)0 hGRF (1 -29) NH2. Todos los compuestos pertenecen a la misma familia de 0 análogos de GRF : son una combinación del GRF natural y ácidos grasos naturales, diseñados para mejorar la actividad de la molécula. Identidad de los análogos examinados: en solución salina TT-01015 (Hexanoil)o hGRF (1 -29) NH2 20 µg/kg TT-01 021 (Amimohexanoil)o hGRF (1 -29) NH2 20 µg/kg 5 TT-01022 (Hexilformiato)o hGRF (1 -29) NH2 20 µg/kg wia_fl-_fttfoM» . t.. J, !*£*.* . íJiS?ií" - < .iMm.~ti.. -^ -.„_ .». — >.-.¿ii-.,.>tt. »^...¿. „tffl¡lif^ _^ ^ .^ . - - y^^^-r...

TT-01023 (Hexenoil trans-2)0 hGRF (1 -29) NH2 20 µg/kg TT-01 024 (Hexenoil trans-3)0 hGRF (1 -29) NH2 20 µg/kg TT-01 025 (Muconoil)o hGRF (1 -29) NH2 20 µg/kg Ruta y frecuencia del artículo de prueba ADMINISTRACIÓN: Dos inyecciones subcutáneas diarias SISTEMA DE PRUEBA: Cerdos Landrace x Yorkshire DESCRIPCIÓN ANIMAL: Cincuenta y seis (56) cerdos castrados en crecimiento con peso de 35 kg al momento de la compra. PROPORCIÓN: Concentrado alimenticio comercial (18% de proteína) ofrecido ad libitum. DISEÑO EXPERIMENTAL: Cincuenta y seis (56) cerdos se distribuyeron de manera aleatoria en 7 grupos experimentales (n = 8 cerdos por grupo). Cada grupo recibió dos administraciones S.C. diarias de los siguientes tratamientos (volumen: 3 ml, inyección S.C.) grupo 1 : solución salina 2 x/día grupo 2: TT-01015 20µg/kg 2 x/día grupo 3: TT-01 021 20µg/kg 2 x/día grupo 4: TT-01022 20µg/kg 2 x/día grupo 5: TT-0 023 20µg/kg 2 x/día grupo 6: TT-0 1024 20µg/kg 2 x/día grupo 7: TT-0 1025 20µg/kg 2 x/día Los tratamientos se administraron del día 1 al 5.

Inmediatamente antes de las inyecciones, se recolectó una muestra de sangre de cada animal y se recolectaron muestras de sangre adicionales el día 6. Las muestras de sangre se dejaron coagular, se recolectó el suero mediante centrifugación y se sometió a ensayos de IGF-I. Los resultados se muestran en la Figura 1 como D-IGF-I, lo cual se define como el incremento en niveles de IGF-I desde el día 1 (niveles de pretratamiento) hasta el día 6 (después de 5 días de administraciones de GRFs). Entre todos los análogos examinados, solamente hexanoil-, hexilformiato-, hexenoil trans2- y hexenoil trans3- hGRF(1 -29)NH2 incrementaron significativamente los niveles de IGF-I durante el periodo de estudio de 6 días, mientras que el aminohexanoil- y muconoil-hGRF(1 -29)NH2 no lo hicieron. Ya que el hGRF(1 -29)NH2 ha demostrado ser inefectivo a la misma dosis en las mismas condiciones que en ensayos previos (ver Ejemplo I), estos resultados muestran que la adición de diversas cadenas de carbono C6 en la región de término N del GRF incrementa su bioactividad. EJEMPLO lll Potencia de lliberación de GH intravenosa de (Hexenoil trans-3)0 hGRF(1 -29)NH2 vs hGRF(1 -29)NH2 en cerdos Este experimento se condujo para examinar la potencia de liberación de GH aguda I.V. de (Hexenoil trans-3)0 hGRF (1 -29) NH2 | un análogo de GRF, en un modelo fisiológicamente cercano al humano y para compararlo con hGRF(1 -29)NH2. (Hexenoil trans-3)0 hGRF (1 -29) NH2 es una combinación del hGRF(1 -29)NH2 natural y ácidos grasos naturales. Este estudio fue un estudio de una sola inyección I.V. de multidosis. Identidad de los análogos examinados: TT-01 024 (Hexenoil trans-3)0 hGRF (1 -29) NH2 0.25 µg/kg TT-01 024 (Hexenoil trans-3)0 hGRF (1 -29) NH2 1 µg/kg TT-01 024 (Hexenoil trans-3)0 hGRF (1 -29) NH2 4 µg/kg hGRF (1 -29) NH2 0.25 µg/kg hGRF (1 -29) NH2 1 µg/kg hGRF (1 -29) NH2 4 µg/kg Ruta y frecuencia del artículo de prueba ADMINISTRACIÓN: inyección aguda intravenosa SISTEMA DE PRUEBA: Cerdos Landrace x Yorkshire DESCRIPCIÓN ANIMAL: Cincuenta y seis (56) cerdos castrados en crecimiento con peso de 35 kg al momento de la compra. PROPORCIÓN: Concentrado alimenticio comercial (18% de proteína) ofrecido ad libitum. DISEÑO EXPERIMENTAL: Cincuenta y seis (56) cerdos (4 animales sobrantes) se canularon (se implantó un catéter quirúrgicamente en una vena yugular) dentro de una semana antes del estudio. Los días 1 y 7, los animales canulados se distribuyeron de manera aleatoria en 7 grupos (n = 4 cerdos por grupo). grupo 1 : solución salina ¿k -, , SfcstotaÉte t sj?* JL?i.¿~¡ . » .«._.. . -_ . ^B. i , - - ^A,.-... grupo 2: TT-01 024 0.25µg/kg grupo 3: TT-0 024 1 µg/kg grupo 4: TT-0 024 4µg/kg grupo 5: hGRF(1 -29)NH2 0.25µg/kg grupo 6: hGRF(1 -29)NH2 1 µg/kg grupo 7: hGRF(1 -29)NH2 4µg/kg Las muestras de sangre para el ensayo de pGH se recolectaron cada 20 min desde 1 hora antes hasta 5 horas después de las inyecciones de GRF, con muéstreos adicionales 1 0 y 30 min después de la inyección (n = 21 muestras). Las muestras de sangre se dejaron coagular a +4°C. El suero se recolectó mediante centrifugación, se almacenó a - 20°C y se sometió a ensayos de pGH. Los resultados se ilustraron en las Figuras 2 y 3. Como se muestra en la Figura 2, el hGRF(1 -29)NH2 (4µg/kg) indujo una liberación rápida de GH que se sostuvo durante aproximadamente 60 minutos después de la inyección. En contraste, el hexenoil trans3-hGRF(1 -29)NH2 inyectado en la misma dosis, incrementó los niveles de GH sobre un mayor periodo, aproximadamente 260 minutos. Además, la respuesta de la GH en los primeros 60 minutos fue moderada, sugiriendo que este análogo actúa como un GRF, procesándose en el suero hacia GRF nativo en los minutos u horas que siguen a la inyección. Como se muestra en la Figura 3, la cual presenta los efectos de diversas dosis de GRF y el análogo sobre el área de la GH bajo la curva (0 a 300 minutos después de la inyección), el hGRF(1 -29)NH2 produjo un efecto significativo sobre la secreción de GH a 4µg/kg, pero no a 0.25 o 1 µg/kg, mientras que el hexenoil trans3-hGRF(1 -29)NH2 produjo una respuesta significativa en las 3 dosis examinadas. En conclusión, estos resultados muestran que el hexenoil trans3-hGRF(1 -29)NH2 es un análogo de GRF con potencia incrementada sobre la secreción de GH y sugiere que puede actuar como un GRF, protegiéndose de la degradación enzimática en el suero. EJEMPLO IV Potencia de liberación de GH subcutánea de (Hexenoil trans-3)0 hGRF(1 -29)NH2 vs hGRF(1 -29)NH2 en cerdos Este experimento se condujo para examinar la potencia de liberación de GH aguda S.C. de (Hexenoil trans-3)0 hGRF (1 -29) NH2, un análogo de GRF, en un modelo fisiológicamente cercano al humano y para compararlo con hGRF(1 -29)NH2. Identidad de los análogos examinados: TT-01024 (Hexenoil trans-3)0 hGRF (1 -29) NH2 0.31 µg/kg TT-01024 (Hexenoil trans-3)0 hGRF (1 -29) NH2 1 .25 µg/kg TT-01024 (Hexenoil trans-3)0 hGRF (1 -29) NH2 5 µg/kg TT-01024 (Hexenoil trans-3)0 hGRF (1 -29) NH2 20 µg/kg hGRF (1 -29) NH2 1 .25 µg/kg hGRF (1 -29) NH2 5 µg/kg hGRF (1 -29) NH2 20 µg/kg Ruta y frecuencia del artículo de prueba ADMINISTRACIÓN: inyección aguda subcutánea SISTEMA DE PRUEBA: Cerdos Landrace x Yorkshire DESCRIPCIÓN ANIMAL:Sesenta y cuatro (64) cerdos castrados en crecimiento con peso de 35 kg al momento de la ¿ÉÉj ^i i iiiii. mniHiitíf ir Í flirt ff compra. PROPORCIÓN : Concentrado alimenticio comercial (1 8% de proteína) ofrecido ad libitum. DISEÑO EXPERIMENTAL Treinta y seis (36) cerdos (4 animales sobrantes) se canularon (se implantó un catéter quirúrgicamente en una vena yugular) dentro de una semana antes del estudio. Los días 1 y 7, los animales canulados se distribuyeron de manera 10 aleatoria en 8 grupos (n = 4 cerdos por grupo), grupo 1 : solución salina grupo 2: TT-0 024 0.31 µg/kg grupo 3: TT-01024 1 .25µg/kg grupo 4: TT-01024 5µg/kg 15 ggrruuppoo 55:: TTTT--0011002244 20µg/kg grupo 6: hGRF(1 -29)NH2 1 .25µg/kg grupo 7: hGRF(1 -29)NH2 5µg/kg grupo 8: hGRF(1 -29)NH2 20µg/kg Las muestras de sangre para el ensayo de pGH se 20 recolectaron cada 20 min desde 1 hora antes hasta 7 horas después de las inyecciones de GRF (n = 25 muestras). Las muestras de sangre se dejaron coagular a +4CC. El suero se recolectó mediante centrifugación, se almacenó a -20°C y se sometió a ensayos de pGH. Los resultados se ilustraron en las Figuras 4 y 5. Como se 25 muestra en la Figura 4, la inyección subcutánea de 5 µg/kg de hGRF(1 - 29)NH2 indujo una respuesta de GH en los primeros 60 minutos después de la administración , mientras que la misma inyección de hexenoil trams3- hGRF(1 -29)NH2 indujo una respuesta de GH que se sostuvo durante 240 minutos. La Figura 5 ilustra el efecto de diversa dosis de los GRFs examinados en el área de la GH bajo la curva durante el periodo de estudio, es decir, desde 0 hasta 420 minutos después de la inyección. Durante este pepodo, el hGRF(1 -29)NH2 no indujo ninguna respuesta de GH significativa en ninguna de las dosis examinadas, mientras que el hexenoil trans3-hGRF(1 -29)NH2 produjo incrementos significativos de AUC GH a 5 y 20 µg/kg . En conjunto, estos resultados sugieren que el hexenoil trans3-hGRF(1 -29)NH2 es un análogo de secreción de la GH altamente potente, incluso cuando se administra de manera subcutánea. EJ EMPLO V De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, se proporciona un análogo de GRF hidrofóbico de la fórmula A: X GRF - péptido (A) en donde; el péptido de GRF es un péptido de la fórmula B; A1 -A2-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-A8-Ser-Tyr-Arg-Lys-A13-Leu-A15- Gln-Leu-A18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-A24-A25-lle-A27-A28-Arg- A30-R0 (B) en donde, A1 es Tyr o His; A2 es Val o Ala; A8 es Asn o Ser; A13 es Val o lie, A15 es Ala o Gly, A18 es Ser o Tyr; A24 es Gln o His; A25 es Asp o Glu ; A27 es Met, lie o NIe; A28 es Ser o Asn; A30 es una unión o cualquier secuencia amino acida de 1 hasta 1 5 residuos; 10 Ro es NH2 o NH-(CH2)n-CONH2, con n=1 hasta 12 y; X es cis o trans CH3-CH2-CH=CH-CH2-CO-, o un elemento seleccionado a partir de un enantiómero cis o trans o una mezcla racémica de: 1 (R=H o CH3 o CH2CH3) 2 (R=H o CH3 o CH2CH3) 25 _a_____ß__i_l_i -Üfci, .... .. ijfa Ífa ,- .. > *&}**.*****,*< **, . . „.. - -A-fc^=e (R=H o CH3 o CH2CH3) (R=H o CH3 o CH2CH3) (R=H o CH3 o CH2CH3) (R=H o CH3 o CH2CH3) (R=H o CH3 o CH2CH3) 5 (R=H o CH3 o CH2CH3) (R=H o CH3) 10 (R=H o CH3 o CH2CH3) 11 (R=H o CH3 o CH2CH3) 12 (R=H o CH3) ^b. ... . J ÍJto ....é.^-& >a . .^¿j^g en donde R es un hidrógeno o un alquilo inferior. Las Figuras 6A a 6C ilustran ejemplos de síntesis específica de la porción X de los análogos de GRF con radicales preferidos R de acuerdo con la presente invención. Los radicales de acilo X identificados arriba con los números 10 (R=CH3) y 1J (R=CH3), se derivan de los ácidos carboxílicos precursores (X-OH) vendidos por Aldrich bajo los números de catálogo T3, 808-3 y T3, 809-1 . EJEMPLO VI Síntesis de ácido (+.-)-c/s-2-etilciclopropilacético (15) La síntesis de ácido (+,-)-c/'s-2-etilciclopropilacético (1_5) se llevó a cabo como se ilustra en el esquema 1 . Primero, el c/s-3-hexen-1 -ol se reaccionó con cinc de dietilo en presencia de cloroyodometano (Scott E. Denmark y James P. Edwards J. Org. Chem. 1991 , 56, 6974-6981 ) en diclorometano a 0°C para dar el alcohol de ciclopropiio 14_ deseado en 92% de producción. La oxidación del alcohol 14_ con dicromato de piridinio (Corey, E.J. y Schimidt, G. Tetrahedron Lett. 1979, 399-402) en DMF seco dio el ácido (+,-)-c/s-2-etilciclopropilacético (15) en 66% de producción. Esquema 1 ácido (+,-)-c/'s-2-etilciclopropilacético (15) Preparación de ácido (+,-)-c/s-2-etilciclopropilacético (15) 1. Preparación de alcohol de ciclopropilo 14_ En un matraz de un solo cuello de 250 ml se enfrió hasta 0°C una solución de E:t2Zn (4.0 ml; 40 mmol; 2 eq.) en diclorometano seco (70 ml) y se agregó una solución de CICH2I (5.8 ml; 80 mmol; 4 eq.) a través de jeringa. La solución se agitó durante 5 min a 0°C, durante cuyo tiempo se formó un precipitado y se agregó una solución de c/'s-3-hexen-1 -ol (2.0 g, 20 mmol) en CH2CI2 (32 ml) a través de cánula. La mezcla de reacción s,e agitó durante 90 min a 0°C y se enfrió repentinamente con una solución acuosa saturada de NH4CI (100 ml). La solución se dejó entonces calentar a temperatura ambiente, se agitó vigorosamente durante 1 0 min y se extrajo con diclorometano (3 x 60 ml). Los extractos se enjuagaron con H2O (1 x 20 ml) y solución salina (1 x 20 ml), se combinaron, secaron (MgSO ) y se concentraron bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de gel de silicio (hexano/AcOEt, 8/2) para producir . á. -i ljAtf .^i*^ ^tu ^ ^tJ^a^JÍÉt **u¡?> . .. . . . ..Afcüá-.. - 2.10 g (92.3%) del producto 1_4 deseado como un líquido claro, incoloro. Rf=0.22 (hexano/AcOEt, 8/2) Caracterización: Nmr(1 H, 13C), ir, ms 2. Preparación de ácido (+,-)-c/s-2-etilciclopropilacético (15) El alcohol 14. (2.30 g; 19.8 mmol) se disolvió en DMF seco (96 ml) y se agregó dicromato de piridinio (PDC) (3.5 eq. , 26 g) en una porción. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente y después se vació en 300 ml de agua y se extrajo con (4 x 8 ml) de éter. Las capas orgánicas se combinaron, se enjuagaron con solución salina y se concentraron bajo presión reducida. El residuo se disolvió entonces en cloroformo (30 ml) y la solución se extrajo dos veces con 25 ml de una solución acuosa al 1 0% de NaOH. Las fases acuosas combinadas se extrajeron entonces con cloroformo (2 x 25 ml) y se acidificaron con HCl acuoso al 1 0% seguido por una extracción con éter (4 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO > se filtraron y concentraron bajo presión reducida para dar el producto deseado de ácido (+,-)-c/'s-2-etilciclopropilacético (15) como un aceite incoloro (1 .7 g, 66%). Caracterización: Nmr(1 H, 13C), ir, ms EJEMPLO Vil Síntesis de ácido (1 f?, 2S)-2-etilciclopropilacético (22) y ácido (1 , 2R)- 2-etilciclopropilacético (24) La síntesis de los ácidos ópticamente puros cis y trans de ácido (I R, 2/?)-2-etilciclopropilacético (24) y ácido (1 R, 2S)-2- etilciclopropilacético (22) se llevó a cabo de acuerdo al protocolo de Charette. (Charette, A.B.; Juteau, H.; Lebel, H.; y Molinaro C. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 11943-11952). Para lograr esto, se requirió del ligando de dioxaborolano quiral 20.. 1. Síntesis del ligando de dioxaborolano 20 La síntesis (Esquema 2) comenzó con la preparación de ácido borónico de butilo 18 a través del tratamiento de bromuro de magnesio de butilo con borato de trimetilo seguido por hidrólisis acídica. Para evitar la deshidratación de ácido borónico de butilo y su transformación en boroxina, se convirtió a su complejo de dietanolamina 19.. La diamida de ácido tartárico de (R,R)-(+)-N,N,N,'N,'-tetrametilo 16. se preparó fácilmente mediante el uso del procedimiento de Seebach (Seebach, D.; Kalinowski, H.-O.; Langer, W.; Wilka, E.-M. Organic Syntheses; Wiley: Nueva York, 1990; Coil. Vol. Vil, pp 41-50) al condensar ácido tartárico de (R,R)-(+)-dimetilo con dimetilamina. El complejo de dietanolamina 19., cuando se trató con un ligero exceso de diamida de ácido tartárico de (R,R)-(+)-N,N,N,'N,'-tetrametilo (16) en un medio bifásico, reaccionó para dar el ligando de dioxaborolano quiral deseado 20. en 93% de producción. .i., ? mtHAek&tf -"IJjfrNf .--*-*a*--> - Esquema 2 H .Oh (NetoiioUiiniíui p i f> etei -C - I Oi , 2. Síntesis de ácido (1 f?,2S)-2-etilciclopropilacético (22) Una vez que se tiene el ligando de dioxaborolano 20, procedemos con la síntesis de ácido (1 R,2S)-2-etilciclopropilacético (22) como se muestra en el esquema 3. De esta manera, se agregó trans-3- hexen-1 -ol de alcohol homoalílico a una mezcla del ligando de dioxaborolano 20. y el reactivo de cinc (Zn(CH2l)2 DME) (obtenido de la mezcla de Et2Zn, CH2I2 y DME) en diclorometano a -10°C. La mezcla homogénea se calienta entonces a temperatura ambiente y se agita durante la noche El trabajo no oxidativo produjo el producto deseado 21 en 79% de producción, después de una destilación de Kugeirohr. Finalmente, la oxidación de dicromato de piridinio (PDC) del alcohol 21 dio el ácido (1 R, 2S)-2-etilciclopropilacético (22) en 39.7% de producción (esquema 3). Esquema 3 Z' (m-. - DM . M. - -p-.iv iraní, 3-ne\en-l - .)] 3. Síntesis de ácido (1 /?, 2R)-2-etilciclopropilacético (24) La síntesis del ácido (1 R, 2R)-2-etilciclopropilacético (24) (esquema 4), se llevó a cabo mediante el uso del mismo método utilizado para producir ácido (1 R, 2S)-2-etilciclopropilacético (22).

Esquema 4 Preparación de ácido (1 R,2S)-2-etilcicloprop¡lacético (22) y ácido (1 R,2R)-2-etilciclopropilacético (24) 1. Preparación de ligando de dioxaborolano 20 1.1 Preparación de Bromuro de butilmagnesio 17. A un matraz de fondo redondo, de tres cuellos, de 1 L, equipado con un agitador magnético, un túnel de adición para igualar la presión de 125 mL, un condensador de reflujo y un obturador de vidrio, se agregan 34.0 g (1 .40 mol) de vueltas de magnesio. La agitación se inicia y el sistema se seca por flama durante 2 min. El matraz se enfría entonces a temperatura ambiente bajo un flujo de nitrógeno y 60 ml de éter se introducen para cubrir el magnesio. Se coloca una solución de 48 ml (0.44 mol) de bromobutano en 140 ml de éter en el túnel de adición para igualar la presión. La mezcla se calienta suavemente para iniciar la reacción. Cuando la reacción ha comenzado, la solución de bromuro en éter se agrega gota a gota a una velocidad suficiente para mantener un reflujo suave. Después del término de la adición, el túnel se enjuaga con 10 ml de éter. La solución gris se agita durante 20 min y después se transfiere a un matraz seco bajo nitrógeno a través de cánula. El reactivo de Grignard se titula con una solución de ¡sopropanol en benceno mediante el uso de 1 , 1 0-fenantrolina como indicador como sigue: un matraz de fondo redondo, de un cuello, de 1 0 ml, se carga con 1 ml de reactivo de Grignard, algunas gotas de THF seco y un cristal de 1 , 1 0- fenantrolina. La solución ligeramente rosa se titula con una solución de 0.5 M de isopropanol en benceno seco. Se obtienen entre 3.8 y 4.2 ml para dar una solución clara incolora (3 titulaciones). Se obtiene una solución de reactivo de Grignard de 1 .90-2.00 M. 1.2 Preparación de ácido borónico de butilo 18. A un matraz de fondo redondo, de tres cuellos, de 1 L, equipado con un agitador magnético y termómetro, se agregaron 480 ml de éter, seguidos por 20 ml (1 76 mmol) de trimetilborato. La solución clara se enfrió hasta -75°C (temperatura interna) y se agitó vigorosamente, después se agregaron gota a gota 90 ml (176 mmol) de 1 .95 M de solución de bromuro de butilmagnesio en éter a través de una cánula a una velocidad tal que la temperatura interna no excedió -65°C. Después de que se completó la adición, la mezcla blanca resultante se agitó durante 2 horas adicionales a -75°C bajo nitrógeno. El baño de enfriamiento se retiró entonces y la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente (entre 1 h y 2h fueron necesarias). La hidrólisis se llevó a cabo mediante la adición gota a gota de 200 ml de una solución acuosa al 10% de ácido hidroclórico. El precipitado blanco se disolvió y la mezcla bifásica clara resultante se agitó durante 1 5 min , después de cuyo tiempo, se separaron las dos capas. La capa acuosa se extrajo con éter (2 x 1 00 ml) y los extractos se combinaron en seco sobre sulfato de magnesio. Después de la concentración de la solución etérea bajo presión reducida, el sólido blanco residual e purificó mediante recristalización como sigue: después de la disolución en agua caliente (50 ml), la solución bifásica resultante se enfrió hasta 0°C para inducir la recristalización del ácido borónico. El sólido se recolectó en un túnel de disco de aglomerado del medio y se enjuagó con 100 ml de hexanos y se colocó al vacío durante 60 min. Se produjo una cantidad de 1 3.6 g del ácido borónico 18 como un sólido blanco Producción: 74.88% m.p. = 94-96°C (lit. m.p. = 95-97°C) (Charette, A. B. ; Juteau, H. ; Lebel, H. ; y Molinaro C. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1 1943-1 1952) Caracterización: NMR (1 H) 1.3 Preparación de [(2-)-N,O,0'[2,2'-iminobis[etanolato]]]-2-butil boro 19. Un matraz de fondo redondo, de un cuello, de 1 L, equipado con un agitador magnético y termómetro y bajo nitrógeno, se cargó con 13,6 g (133 mmol) del ácido butilborónico 1 . y 14,0 g (1 34 mmol) de dietanolamina. Después, se agregaron 133 ml de diclorometano y 265 ml de éter, seguidos por aproximadamente 27 g de criba molecular 3Á (polvo, seco en un horno durante la noche a 250°C). La solución heterogénea resultante se agitó durante 1 día bajo nitrógeno. El sólido se trituró . -t.- d.. _ Aé t.. -. - f . ft,». ^ , v .,f ... . *.*¿ ¡Síha??*8A a<M?á? í -.. s » . .. . . . ** &** entonces con diclorometano (2 x 100 ml). El filtrado se concentró bajo presión reducida para producir el complejo deseado crudo. El complejo de dietanolamina se purificó mediante recristalización como sigue: el sólido blanco se disolvió en diclorometano caliente (40 ml), después se agregó éter (100 ml) para inducir la cristalización del complejo. La mezcla se enfrió entonces a 0°C y el sólido se recolectó en un túnel de disco aglomerado en el medio y se enjuagó con éter (2 x 60 ml). El producto se secó al vacío para producir 1 8.31 g del compuesto principal 19. como un sólido blanco cristalino. Producción: 80% m.p. = 143-145°C (lit. m.p. = 145-148°C) (Charette, A.B. ; Juteau, H. ; Lebel , H. ; y Molinaro C. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1 1943- 1 1952) Caracterización: NMR (1 H) 1.4 Preparación de diamida de ácido tartárico de (R,R)-(+)-N,N,N,'N,'- tetrametilo 16. En una mezcla de 68 g (381 mmol) de tartrato de dimetilo y 77 ml de espectrogrado de metanol en un matraz de Erlenmeyer de 250 ml se vaciaron al menos 100 ml de dimetilamina fría (-78°C), anhidrosa, líquida (obtenida de la condensación de gas de dimetilamina a -78°C). La mezcla se remolineó brevemente y se dejó permanecer en una tapa durante 3 días con un tubo de secado en el lugar. Después de la cristalización, los cristales masivos se recolectaron mediante filtración por succión. El filtrado se concentró, se sembró y enfrió para producir un segundo cultivo. Los cristales combinados se enjuagaron con metanol frío (-30°C) y se secaron al vacío. La diamida 16. así obtenida fue lo suficientemente pura para utilizarse en la siguiente etapa Producción: 90% m.p. = 1 88-189°C (lit. 189-1 90°C) (Seebach, D. ; Kalinowski, 5 H.-O. ; Langer, W. ; Wilka, E.-M. Organic Syntheses.; Wiley, Nueva York, 1990; Coll. Vol. Vil, pp 41 -50) Caracterización: NMR (1 H) 1 .5 Preparación de [4,5]dicarboxamida de (4R-fraps)-2-butil- N,N,N',N'-tetrametil[1 ,3,2]dioxa-borolano 20 10 Un matraz de cuello redondo, de un cuello, de 500 mL, equipado con un agitador magnético, y bajo nitrógeno, se cargó con 7.00 g (40.9 mmol) de complejo de dietanolamina de butilboronato 19. y 1 1 g (53.8 mmol) de diamida de ácido ( . M+J-N. N. N'.N'-tetrametiltartárico 16.. Los sólidos se disolvieron tras la adición de 205 ml de diclorometano. 15 Después, se agregaron 64 ml de solución salina y la solución bifásica resultante se agitó durante 2 h 45 min bajo nitrógeno. Las dos capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con diclorometano (50 ml). Las capas orgánicas combinadas se enjuagaron con solución salina (50 ml), se secaron sobre MgSO y se filtraron. El filtrado se concentró bajo presión 20 reducida y se secó al vacío para producir 10,2 g del compuesto principal 20 como un aceite amarillo pálido. Producción: 92% (lit. 93%) (Charette, A. B. ; Juteau, H. ; Lebel, H. ; y Molinaro C. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1 1943-1 1952) Caracterización: NMR (1 H, 13C), ir, ms) 25 2. Preparación de ácido (1 R,2S)-2-etilciclopropilacético (22) 2.1 (1 R,2S)-2-etilciclopropiletanol 2 . Un matraz de fondo redondo, de tres cuellos, de 250 mL, equiado con un agitador magnético y un termómetro, y bajo nitrógeno, se cargó con 45 ml de CH2CI2 seco y 4.6 ml (45 mmol, 4.5 eq .) de DME seco. La solución se enfrió hasta -1 0°C (temperatura interna) con un baño de acetona/hielo y se agregaron 4.6 ml (45 mmol, 4.5 eq.) de Et2Zn. A esta solución agitada se agregaron 7.2 ml (90 mmol, 9 eq.) de CH2I2 durante un periodo de 1 hora mientras se mantenía la temperatura interna entre -8 y - 12°C. Después de terminar la adición, la solución resultante se agitó durante 10 min a -10°C. Se agregó una solución de 3.36 g (10.8 mmol, 1 .2 eq.) del ligando de dioxaborolano 20 en 10 ml de CH2CI2 a través de cánula, bajo nitrógeno, durante un periodo de 5-6 min mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de -5°C. Se agregó inmediatamente una solución de 1 .00 g (10 mmol) de c/'s-3-hexen-1 -ol en 10 ml de CH2CI2 a través de cánula, bajo nitrógeno, durante un periodo de 5-6 min mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de -5°C. El baño de enfriamiento se retiró y la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche a esa temperatura. La reacción se enfrió repentinamente con NH4CI acuoso saturado (10 ml) y HCl acuoso al 1 0% (40 ml). Las dos capas se separaron y la capa acuosa se enjuagó con CH2CI2 (50 ml). Las capas orgánicas combinadas se transfirieron en un matraz Erlenmeyer y se agregó una solución de 5 M de KOH acuoso (200 ml). La solución bifásica resultante se agitó vigorosamente durante la noche. Las dos capas se separaron entonces y la capa orgánica se enjuagó sucesivamente con NH4CI acuoso saturado (3 x 50 ml) y solución salina (10 ml), se secaron sobre MgSO , se filtraron y concentraron bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (AcOEt/hexanos 2/8) seguida por destilación Kugeirohr (1 50-160°C) para proporcionar el derivado de ciclopropano deseado 2 _ (0.9 g). Rf = 0,33 (AcOEt/hexanos 2/8) Producción: 79% [a]D = +1 5.6° (c = 1 .66, CHCI3) Caracterización: NMR (1H, 13C), ir, ms) 2.2. Preparación de ácido (1 R,2S)-2-etilciclopropilacético (22) Un matraz de fondo redondo, de un cuello, de 250 mL, equipado con agitador magnético y bajo nitrógeno, se cargó con 1 .65 g (14.3 mmol) de alcohol 21 y 40 ml de DMF seco. Se agregó dicromato de piridinio 18.8 g (3.5 eq. ; 50.1 mmol) en una porción. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a 25°C y después se vació en 200 ml de agua y se extrajo con éter (4 x 80 ml). Las capas orgánicas se concentraron bajo presión reducida y el residuo se disolvió entonces en cloroformo (50 ml) y se extrajo con NaOH acuoso al 10% (2 x 25 ml). Las capas acuosas combinadas se enjuagaron dos veces con 25 ml de cloroformo, seguido por la acidificación con HCl acuoso al 1 0%. La extracción con éter (4 x 50 ml), el secado sobre MgSO4, la filtración y concentración bajo presión reducida produjeron el compuesto deseado de ácido (1 R,2S)-2-etilciclopropilacético (22) como un aceite incoloro (737 mg). Producción: 39.7% ^^U£_ ^^ ^i ^ -"*- .-a^.>. T?Í'ii-íitÉ-Iitirr [a]D = +7.7° (c = 3.5, CHCI3) Caracterización: NMR (1 H, 13C), ir, ms) 3. Preparación de ácido (1 R,2R)-2-etilciclopropilacético (24) 3.1 (1 R,2R)-2-etilciclopropiletanol 23 Un matraz de fondo redondo de tres cuellos, de 250 mL, equipado con un agitador magnético y un termómetro y bajo nitrógeno, se cargó con 45 ml e CH2CI2 seco y 4.67 ml (45 mmol, 4.5 eq.) de DME seco. La solución se enfrió a -1 0°C (temperatura interna) con un baño de acetona/hielo y se agregaron 4.6 ml (45 mmol, 4.5 eq.) de Et2Zn. A esta solución agitada se agregaron 7.2 ml (90 mmol, 9 eq.) de CH2I2 por un periodo de 1 hora mientras se mantenía la temperatura interna entre -8 y - 12°C. Después de completar la adición, la solución resultante se agitó por 10 min a -1 0°C. Una solución de 3.36 g (10.8 mmol, 1 .2 eq.) del ligando de dioxaborolano 20 en 10 ml de CH2CI2 se agregó a través de cánula bajo nitrógeno durante un periodo de 5-6 min mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de -5°C. Una solución de 1 .00 g (10 mmol) de fra/js-3-hexen-1 -ol en 1 0 ml de CH2CI2 se agregó inmediatamente a través de cánula bajo nitrógeno durante un periodo de 5-6 min mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de -5°C. El baño de enfriamiento de retiró y la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche a esa temperatura. La reacción se enfrió repentinamente con NH CI acuoso saturado (10 ml) y HCl acuoso al 10% (40 ml). Las dos capas se separaron y la capa acuosa se enjuagó con CH2CI2 (50 ml). Las capas orgánicas combinadas se transfirieron a un matraz Erlenmeyer y se agregó una solución de 5 M de KOH acuoso (200 ml). La solución bifásica resultante se agitó vigorosamente durante la noche. Las dos capas se separaron entonces y la capa orgánica se enjuagó sucesivamente con NH4CI acuoso saturado (3 x 50 ml) y solución salina (10 ml), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y concentraron bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (AcOEt/hexanos 2/8) seguida por destilación Kugeirohr (1 50-162°C) para proporcionar el derivado de ciclopropano deseado 23. (1 .06 g). Rf=0.33 (AcOEt/hexanos 2/8) Producción: 93% [a]D = +6.22° (c = 2.25, CHCI3) (l¡t. [a]D = +9.6° (c = 0.3, CHCI3) (Charette, A.B. ; Juteau, H. ; Lebel, H. ; y Molinaro C. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1 1943-1 1 952) Caracterización: NMR (1 H, 13C), ir, ms) 3.2 Preparación de ácido (1 R,2R)-2-etilciclopropilacético (24) Un matraz de fondo redondo de un cuello, de 250 mL, equipado con un agitador magnético y bajo nitrógeno, se cargó con 1 .7 g (14.9 mmol) de alcohol 23. y 40 ml de DMF seco. Se agregó dicromato de piridinio 19.6 g (3.5 eq. ; 52.1 mmol) en una porción. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a 25°C y después se vació en 200 ml de agua y se extrajo con éter (4 x 80 ml). Las capas orgánicas se concentraron bajo presión reducida y el residuo se disolvió entonces en cloroformo (50 ml) y se extrajo con un NaOH acuoso al (10%) (2 x 25 ml). Las capas acuosas combinadas se enjuagaron dos veces con 25 ml de cloroformo, seguido por acidificación con HCl acuoso al 10%. La - n , -¿-i iniA . .t lM iat imák?J kát?K .? A ± ?? extracción con éter (4 x 50 ml), el secado sobre MgSO ) la filtración y concentración bajo presión reducida produjeron el compuesto deseado de ácido (1R,2R)-2-etilciclopropilacético (24) como un aceite incoloro (1.05 g)- Producción: 55.5% [a]D = +4.36° (c = 1.83, CHCI3) Caracterización: NMR (1H, 13C), ir, ms) EJEMPLO Vil Síntesis de una mezcla (1:1) de ácidos (1S,3R) y (1R,3R)-3- metilciclopentilacéitco (27.) La mezcla (1:1) de ácidos (1S,3R) y (1R,3R)-3- metilciclopentilacéitco (27) se sintetizó de acuerdo al perfil en el esquema 5. Una reacción Wittig-Horner (Duraisamy, M. y Walborsky H.M. J. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 3252-3264) que involucró la condensación de (R)(+)-3-metil ciclopentanona y trietilfosfonoacetato dio una mezcla (1:1) de etilo (E, y Z,3R)-(3-metil ciclopentilideno) carboxilato 25. La hidrogenación del éster a,ß-no saturado 25 procedió sin estereocontrol y se obtuvo una mezcla (1:1) del éster 26 en producción cuantitativa. La hidrólisis del éster 26. con KOH alcohólico produjo una mezcla 1:1 de ácido deseado (1S.3R) y (1 R,3 -3-metilciclopentilacético (27) en 92% de producción.

Esquema 5 ( l:1> mezclo de acklo <1S,_R>yí1R,?R). 3-?netik;?clo|>e??til.?cetico ( 27 I Preparación de una mezcla (1 :1 ) de ácido (1 S,3R) y (1 R,3R)-3- metilciclopentilacético (27) 1 . Preparación de éster a, ß-no saturado 25 A un matraz de fondo redondo, de un cuello, de 100 ml, equipado con un agitador magnético, se agregaron 61 1 mg (15.8 mmol) de hidruro de sodio al 60% como una dispersión en aceite mineral. El aceite se retiró al enjuagar dos veces con pentano. Se agregó THF seco (21 ml) y la suspensión se mantuvo bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de enfriar el matraz a 0°C en un baño de hielo, se agregaron lentamente 3.43 g (15.2 mmol) de trietil fosfonoacetato. La agitación continuó durante 35 min y después se agregó R-(+)-3-metilciclopentanona (1 .51 g; 1 5.2 mmol) y la temperatura se mantuvo a temperatura ambiente durante una hora adicional, durante cuyo tiempo apareció un precipitado gelatinoso. Se agregaron éter (1 00 ml) y agua (50 ml) para enfriar repentinamente la reacción. La mezcla se transfirió a un túnel separador y se enjuagó dos veces con agua y después con solución salina. La solución orgánica se secó sobre MgSO , se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (hexano/AcOEt, 9/1 ) para producir 2.4 g (96%) del producto deseado 25 como un aceite claro, incoloro. Rf=0.53 (hexano/AcOEt, 9/1 ) Caracterización: NMR (1 H, 13C), ir, ms) 2. Preparación de éster 26_ A una solución agitada de éster a, ß-no saturado 25 (1 .3 g; 7.7 mmol) en etanol anhidro (68 ml) se agregaron 163 mg de paladio sobre carbono al 10%. La mezcla se agitó durante la noche bajo una atmósfera de hidrógeno. El catalizador se retiró entonces mediante filtración sobre un cojinete de celita. El filtrado se concentró y el residuo, éster 26, un aceite incoloro, se utilizó sin purificación para la siguiente etapa. Producción: (1 .2 g) 92% Caracterización: NMR (1H, 13C), ir, ms) 3. Preparación de una mezcla (1 :1 ) de ácido (1 S,3R) y (1 R,3R)-3 metilciclopentilacético (27) Al ésler 26 (1 .20 g; 7.05 mmol) en etanol (50 ml) se agregaron 15 ml de una solución acuosa al 10% de hidróxido de potasio. La mezcla . .. . .. ? .¿. .1 .fe- a - t --.___g____a_.At_,. . _ ..._»,- t ?¡m *¡ £ Í?*j r. ? r. --"— -"" - - .. J ? . * „ de reacción se agitó bajo reflujo durante 5 horas. El etanol se evaporó después al vacío y el residuo se extrajo con éter (20 ml). La fase acuosa se acidificó con HCl acuoso al 1 0% y se extrajo con éter (3 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron entonces sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para dar una mezcla (1 : 1 ) de ácido (1 S, 3R) y (1 , 3R)-3-metilciclopentilacético (27) como un aceite incoloro (920 mg) al 92% de producción. Caracterización: NMR (1 H, 13C), ir, ms) EJ EMPLO VIII Síntesis de ácido biciclo[4.1 .0.] heptilacético (31 ) El compuesto 3_1 se preparó en cuatro etapas según se perfiló en el esquema 6. La aplicación del procedimiento Wittig-Horner (Duraisamy, M. y Walborsky H. M. J. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 3252- 3264) a ciciohexanona con fosfonoacetato de trietilo (naH, THF) proporcionó el éster a, ß-no saturado 28 al 88% de producción. El éster deseado ß,?-no saturado 29 podía prepararse a partir del éster a,ß-no saturado 28 mediante la captura cinética del enolato extendido (LDA, THF) con NH4CI acuoso saturado a -78°C. La ciclopropanación (Scott E. Denmark Y james P. Edwards J. Org. Chem. 1991 , 56, 6974-6981 ) con dietilcinc/cloroyodometano en diclorometano a 0°C produjo el ciclopropilo 30 al 91 .5% de producción. La saponificación del éster 30 en KOH/EtOH seguida por la acidificación subsecuente produjeron 3_1 al 92% de producción (Kantorowski, E.J.; Eisenberg, S.W. E.; Fink, W. H.; y Kurth, M.J. J. Org. Chem. , 1999, 64, 570-580).

Esquema 6 30 Preparación de ácido biciclo[4.1.0.] heptilacético (31 ) 1. preparación de éster a,ß-no saturado 28. A un matraz de fondo redondo, de un cuello, de 200 ml seco, equipado con un agitador magnético, se agregaron 1 .22 g (30.5 mmol) de hidruro de sodio al 60% como una dispersión en aceite mineral. El aceite se retiró mediante doble enjuague con pentano. Se agregó THF seco (50 ml) y la suspensión se mantuvo bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de enfriar el matraz a 0°C en un baño de hielo, se agregaron lentamente 6.85 g (30.5 mmol) de fosfonoacetato de trietilo. La agitación se continuó durante 30 min y se agregó entonces ciciohexano (3.00 g; 30.5 mmol) y fa mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente t O...? ?i&jjtiUA ,4 . *-_t¿-H._t??-L--.-a, JJ?^> . j-_aaua-¿-»s durante una hora adicional, durante cuyo tiempo apareció un precipitado gelatinoso. Se agregaron éter (50 ml) y agua (50 ml) para enfriar repentinamente la reacción. La mezcla se transfirió a un túnel separador y se enjuagó dos veces con agua y después con solución salina. La solución orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró bajo presión reducida . El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (hexano/AcOEt, 9.5/0.5) para producir 4.52 g (88%) del producto deseado 28 como un aceite claro, incoloro. Rf=0.56 (hexano/AcOEt, 9.5/0.5) Caracterización: NMR (1 H, 13C), ir, ms) 2. Preparación de éster ß,?-no saturado 29. A una solución de diisopropilamina (3.33 ml; 23.7 mmol) en THF seco (90 ml), mantenida a 0°C, se agregó lentamente n-butilitio (1 1 .9 ml; 23.7 mmol). La solución se agitó durante 20 min y después se enfrió a -78°C. El éster a,ß-no saturado 28 (2.00 g, 1 1 .9 mmol) en THF (9 ml) se agregó gota a gota durante 10 min y la mezcla se dejó agitar durante 30 min a esa temperatura. Se agregó NH4CI acuoso saturado (20 ml) gota a gota sobre un periodo de 10 min y la reacción templada se dejó calentar a temperatura ambiente antes de vaciarse en agua (10 ml) y extraerse con éter (3 x 50 ml). Los extractos se secaron (MgSO4), se filtraron y concentraron para producir una mezcla de (4: 1 ) éster ß,?-no saturado:a,ß- no saturado (nmr) como un aceite amarillo. La cromatografía instantánea (hexano/AcOEt 9.65/0.35) produjo 1 g (50%) del producto deseado 29 como un aceite claro, incoloro. Rf=0.44 (hexano/AcOEt, 9.5/0.5) Caracterización: NMR (1 H, 13C), ir, ms) 3. Preparación de éster de ciclopropilo 30. En un matraz de un cuello, de 100 ml, se enfrió una solución de Et2Zn (1 .27 ml; 1 1 .0 mmol; 2 eq.) en diclorometano seco (20 ml) hasta 5 0°C y se agregó a través de jeringa una solución de CICH2I (1 .6 ml; 22 mmol; 4 eq .). La solución se agitó durante 5 min a 0°C, durante cuyo tiempo se formó un precipitado y se agregó a través de cánula una solución de éster ß,?-no saturado 29 (924 mg, 5,49 mmol) en CH2CI2 (8 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 60 min a 0°C y se enfrió 10 repentinamente con una solución acuosa saturada de NH CI (60 ml). La solución se dejó calentar entonces a temperatura ambiente, se agitó vigorosamente durante 10 min y se extrajo con éter (3 x 20 ml). Los extractos se enjuagaron con H2O (1 x 20 ml) y solución salina (1 x 20 ml), se combinaron, se secaron (MgSO ) y se concentraron bajo presión 15 reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (hexano/AcOEt, 9.5/0.5) para producir 915 mg (91 .5%) del producto deseado 30 como un líquido claro, incoloro. Rf=0.44 (hexano/AcOEt, 9.5/0.5) Caracterización: NMR (1 H, 13C), ir, ms) 20 Preparación de ácido biciclo[4.1.0.]heptilacético (31 ) El éster 30 (600 mg; 3.29 mmol) en etanol básico (2.09 g de KOH en 27 ml de etanol al 95%) se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se diluyó con éter y se extrajo con NaOH (2 M, 2 x 50 ml), los extractos combinados se acidificaron con HCl acuoso al 10% y 25 se extrajeron con éter (3 x 40 ml). Los orgánicos combinados se secaron É^ÉÜ. ¿ AJ (MgSO4), se filtraron y se concentraron para dar el 3 _ deseado como un líquido amarillo pálido (467 mg; 92%). Caracterización- NMR (1 H , 13C), ir, ms) EJEMPLO IX Síntesis de ácido (1 S,3R)-3-metilciclohexilacético (36) Finalmente, la síntesis de ácido (1 S, 3R)-3- metilciclohexilacético (36.) se llevó a cabo como se describe en el esquema 7. Primero, se redujo (R)-(+)-3-metilciclohexano a una producción de 75% de acuerdo al método de Brown (Brown, H.C. ; Jadhav, P. K. En "Asymmetric Synthesis" Morisson, J. D. , Ed. ; Academic Press: Nueva York, 1983; Vol. II, Capítulo 1 ; Brown H. C ; Desai, M.C.; Jadhav, P.K. J. Org. Chem. 1982, 47, 5065-5069) a (3R, íR)-3-metilciclohexanol 32. El ópticamente activo 32 se mesiló y reaccionó con la sal de sodio de malonato de dimetilo en DMF seco a 80-90°C para producir el diéster deseado 34 al 31 % de producción. La hidrólisis del diéster 34 con KOH alcohólico produjo el diácido 35. que después de la descarboxilación bajo cualquier condición drástica (mezcla de H2SO concentrado en dioxano/agua bajo reflujo durante dos días) dio el compuesto deseado de ácido (1 S, 3R)-3-metilciclohexilacético (36) al 74.8% de producción.

Esquema 7 (? -? 2 3 10 15 ácido (1S,3R)-3-metilciclohexilacético (36) 25 ..^^te-^ ^. . . . .. ,.,.. ^. t. *. ¿ ?. . >fe. ^.i a_^.Jt«-á-^i^.^~_||1|f|^^ ,^ .. >T__it__-..- , .... - .-....-^.-.¿a -. ____t_i_l Preparación de ácido (1 S,3R)-3-metilciclohexilacético (36) 1. Preparación de alcohol 32 Una solución agitada de R-(+)-3-metilciclohexanona (3.50 g; 31 .1 mmol) en THF seco (40 ml) a -78°C se trató con una solución de 1 .0 M de L-selectrida en THF (63 ml; 63 mmol) Después de 2 horas de agitación a esa temperatura, se agregó una solución de 2M de hidróxido de sodio acuoso (33 ml) seguido por 23 ml de H2O2 al 30%. Después de calentar a temperatura ambiente la mezcla de reacción se trató con 10% de HCl acuoso y el producto se aisló mediante extracción con éter (3 x 80 ml). Los extractos se combinaron, se secaron sobre (MgSO ), se filtraron y concentraron al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (hexano/AcOEt, 8/2) para producir 2.70 g (75%) del producto deseado 32 como un aceite claro, incoloro. Rf= 052 (hexano/AcOEt, 8/2) [a]D = -2.90 (c = 7.9, cloroformo)) Caracterización: NMR (1 H, 13C), ir, ms) 2. Preparación de mesilato 33 A una solución agitada de (1 R, 3R)-(-)-3-metil ciciohexanol (32) (1 .27 g; 1 1 .1 mmol) en diclorometano seco (45 ml) se agregó Et3N (2.3 eq. ; 25.7 mmol; 3.58 ml) y cloruro de metanosulfonilo (1 .2 eq.; 13.4 mmol; 1 .00 ml) gota a gota a 0°C. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a 0°C y después se diluyó con diclorometano (80 ml) y 50 ml de HCl acuoso al 10%. La fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (50 ml). Las capas orgánicas combinadas se enjuagaron sucesivamente con NaHCO3 saturado (1 x 20 ml) y solución salina (1 x 20 ml) y se secaron después sobre MgSO4, se filtraron y concentraron al vacío para producir (2.1 3 g) de mesilato crudo 33 como un aceite amarillo que se utilizó sin purificación para la siguiente etapa. Rf= 0.52 (hexano/AcOEt, 8/2) Caracterización: NMR (1 H, 13C) 3. Preparación de diéster 34 A un matraz de fondo redondo, de un cuello, de 200 ml seco, equipado con un agitador magnético, se agregó 60% de hidruro de sodio (3.5 eq.; 39 mmol; 1 .16 g) como una dispersión en aceite mineral. El aceite se retiró mediante enjuague dos veces con pentano. El DMF seco (30 ml) se agregó y la suspensión se mantuvo bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de enfriar el matraz a 0°C en un baño de hielo, se agregó malonato de dimetilo (3.5 eq.; 39 mmol; 5.16 g). La agitación continuó durante 10 min y se agregó a través de cánula una solución del mesilato 33 en DMF (58 ml). La mezcla se enjuagó entonces y se calentó a 80-90°C durante 3 días. Se agregó entonces agua (50 ml) y la mezcla se transfirió a un túnel separador y se extrajo con éter (3 x 100 ml). Los orgánicos se secaron sobre MgSO4, se filtraron y concentraron bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (hexano/AcOEt, 8/2) para producir 800 mg (31 %) del producto deseado 34 como un aceite claro incoloro. Rf=0.49 (hexano/AcOEt, 8/2) Caracterización: NMR 1 H 4. Preparación de diácido 35 A una solución del diéster 34 (800 mg; 3.50 mmol) en 53 ml de etanol, se agregaron 8 ml de una solución acuosa al 10% de hidróxido de potasio. La mezcla se calentó a reflujo durante 5 horas, después se dejó agitar durante la noche. El etanol se evaporó bajo presión reducida y el residuo se diluyó con agua (1 0 ml) y se extrajo con éter (20 ml). La fase acuosa se acidificó con HCl acuoso al 10%, después se extrajo con éter (3 x 30 ml). Después del secado sobre MgSO , la filtración y la concentración al vacío, obtuvimos un sólido cristalino, blanco que se utilizó sin purificación para la siguiente etapa. Producción: (600 mg) 85.6% Caracterización: NMR 1 H (CD3OD) 5. Preparación de ácido (1 S,3R)-3-metilciclohexilacético (36) Al diácido 35 (800 mg, 4.00 mmol) se agregaron 1 5 ml de dioxano, 5 ml de agua y 2 ml de ácido sulfúrico. La mezcla se calentó entonces a reflujo durante 3 días. Después del enfriamiento a temperatura ambiente y de la extracción con éter (3 x 30 ml), las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO l se filtraron y concentraron para dar ácido (1 S, 3R)-3-metilciclohexilacético (36) como un aceite amarillo. Producción: (467 mg) 74.8% Caracterización: NMR (1H, 13C), ir, ms EJEMPLO X Formación de análogos de GRF hidrofóbicos El acoplamiento del elemento X al péptido de GRF para dar como resultado la formación del análogo hidrofóbico de GRF de la presente invención se sintetizó químicamente mediante el anclaje de una o varias colas hidrofóbicas en la porción de terminal N del GRF o uno de sus HJMll ?g i&fo a k.ry ..- r*,.^ análogos como se describe arriba. De manera más precisa , para una mejor realización de la reacción de anclaje, se utiliza preferentemente hidrofóbico funcionalizado bajo la forma acida. En estas condiciones, la reacción de anclaje se efectúa preferentemente en una fase sólida (Merrifield R. B. , 1963, J. Am. Chem. Soc , 85:2149; 1 964, J. Am. Chem. Soc, 86:304) utilizando reactivos extremadamente activos tales como por ejemplo hexafluorofosfonato debBenzotriazol-1 -iloxitris (dimetilamino) fosfosnio conocido en la técnica anterior (B Castro et al. , 1975, Tetrahedron letters, Vol. 14: 1219). En el caso donde la cola hidrofóbica por anclarse consiste en un ácido graso, la activación en vista del anclaje puede llevarse a cabo in situ. Dependiendo de las estrategias de síntesis utilizadas, el sitio de anclaje péptido se libera justo antes del anclaje en las condiciones tradicionales de clesprotección (Gross et Meienhofer, 1981 , The Peptides, vol. 3, Aacademic Press: páginas 1 -341 ). La cola hidrofóbica (Ht) se condensa entonces con el agente de anclaje en solventes orgánicos tales como un éter (tetrahidrofurano), un solvente halogenado alifático (diclorometano), un nitrilo (acetonitrilo) o una amida (n, N- dimetilformamida). Con respecto a la dinámica de anclaje, las temperaturas de trabajo preferidas se encuentran entre 20 y 60°C. El tiempo de reacción de anclaje cuando la cola hidrofóbica utilizada es más y más hidrofóbica, varía inversamente con la temperatura, pero varía entre 0.1 y 24 horas. Las etapas de síntesis de análogos de GRF generales se llevaron a cabo por metodolog ía de fase sólida en un sintetizador péptido 9050™ plus (Millipore Corporation, Milford, MA) utilizando estrategia de Fmoc y ciclos de síntesis suministrados por Millipore. Los amino ácidos de Fmoc se suminis traron por Bachem California y otras fuentes comerciales La química secuencial de Fmoc que utiliza BOP/HOBt como metodología de acoplamiento se aplicó a la resina de inicio Fmoc-Pal-PEG (Millipore, número de catálogo: GEN 91 3383) para la producción de carboxamidas de terminal C. Las desprotecciones de Fmoc se llevaron a cabo con una solución de piperidina al 20% en DMF. Después de terminar la síntesis, la resina se enjuagó bien con DMF y éter antes de secarse. Las descomposiciones finales de los grupos protectores de cadena lateral y las uniones de péptido-resina se llevaron a cabo mediante el uso del procedimiento suministrado por Millipore que consiste en la siguiente mezcla: TFA, agua, fenol, triisopropilsilano (88:5:5:2). Los péptidos se precipitaron entonces y se enjuagaron con éter antes del secado. La purificación de HPLC de fase inversa (regulador A: TEAP 2.5; regulador B: 80% de CH3CN en A) que utiliza una preparación de agua 4000, absorción 214 nm, modelo detector 486, velocidad de flujo 50 ml/min; gradiente lineal generalmente desde 25 hasta 60% B en 105 min) seguido por una etapa de desalación (regulador C:0.1 % TFA en H2O; regulador D:0.1 % TFA en CH3CH/H2O 80:20) produjeron péptidos en cantidades de producción desde 10 hasta 30% con homogeneidad mayor a 97% según se estima por HPLC (milenio/detección de instalación de fotodiodo). El procedimiento anterior se utilizó para sintetizar siete nuevos análogos de GRF de la fórmula A: GRF - péptido (A) en donde X es la porción de acilo de los ácidos carboxílicos correspondientes X-OH sintetizados en los ejemplos VI, Vil, VIII y IX. análogo X= (1 R,2S)-2-etilciclopropilacetilo (+,-)-c/'s-2-etilciclopropilacetilo (1 R,2R)-2-etilciclopropilacetilo - .. .i ?lHÁAt** ',*. *. - "**-k-*~ - -**-« * ^ ^ - mezcla (1:1) de (1S.3R) y (1R,3R)-3-metilciclopentilacetilo biciclo [4.1.Ojheptilacetilo 15 20 2-metilfenilacetilo 25 3-metilfenilacetilo ^JTifi^l^^ iifí i?íttiiii^ i^^^--8^ J^^....^J -* « *.._a»_ ^._..

EJEMPLO XI Efecto de 8 diferentes análogos de hGRF(1 -44)NH en niveles de IGF-1 El objetivo de este experimento fue comparar los efectos de 8 diferentes análogos de hGRF(1 -44)NH2 incluyendo TH 9507 en niveles de IGF-1 después de la administración S.C. crónica en el crecimiento de cerdos macho. Los procedimientos en animales se condujeron como se describe en el protocolo GRF-30 emitido el 30 de Abril de 1999 con la siguiente modificación: solamente 8 análogos de GRF, incluyendo TH 9507, se proporcionaron por el responsable. De acuerdo con lo anterior, el estudio se llevó a cabo en 30 cerdos. Los procedimientos de laboratorio se condujeron como sigue: niveles de IGF-1 se midieron en suero de cerdo mediante el uso de quipo comercial (DSL-5600) adquirido a Diagnostic Systems Laboratories Inc. , Tx, USA. En resumen, los niveles de IGF-1 se cuantifican mediante el uso de un ensayo inmunoradiométrico de dos sitios (IRMA) después de la extracción de ácido-etanol. Análisis estadístico: los datos de IGF-1 se sujetaron a un análisis de varianza de mediciones repetidas de dos vías, con tiempo (día 1 , 3 o 6) y tratamientos (A a J) como factores de variación, se llevaron a cabo después procedimientos de comparación múltiple por pares mediante el método de Student-Newman-Keuls. Todos los procedimientos estadísticos se llevaron a cabo mediante el uso de un software computarizado SigmaStat (Jandel Scientific). Un P<0.05 se consideró estadísticamente significativo. ¡. ?. ? i~ik?*¡? AJ -tiaafctt.w-a*B ü .-*á¡álÉ¡ Zy. * ...?k-rr.-z . ? ' _. I Como se muestra en la figura 7, ni la solución salina ni los animales tratados con HGRF(1 -44)NH2 tuvieron variaciones significativas de sus concentraciones de IGF-1 en el periodo de estudio. Esto confirma los resultados previos que muestran que el hGRF(1 -44)NH2 no es capaz de inducir ningún incremento significativo en niveles de IGF-1 cuando se inyecta de manera subcutánea en cerdos dos veces al día a 1 0 ug/kg. Todos los análogos examinados (TH 9507 y análogos 1 a 7) incrementaron significativamente los niveles de IGF-1 en cerdos el día 6, cuando se compararon con sus niveles básales el día 1 . Solamente los análogos 3 y 6 incrementaron significativamente los niveles de IGF-1 el día 3. No se derivó ninguna diferencia significativa entre análogos de los análisis estadísticos. Sin embargo, el análogo 6 pareció exhibir una eficacia de inducción de IGF-1 muy fuerte, llevando a los niveles de IGF-1 por encima de 358.3 + 1 7.1 ng/ml después de 5 días de inyección (cuando se compara con 190.1 + 21 .0 ng/ml y 279.1 + 28.4 ng/ml en los grupos tratados con la solución salina y el TH 9507, respectivamente. Estos resultados indican que los 7 nuevos análogos de hGRF(1 -44)NH2 examinados en la presente invención son más potentes que la molécula nativa de GRF. Esto sugiere que la adhesión de diversas cadenas alifáticas en la porción de terminal N del GRF(1 -44)NH2 incrementa exitosamente su potencial de liberación de GH. t . i i.r r íít^.S?¿¡::-^..& jíiY^r. r. r .¿....lia.. ¡&s. -£> *^??. & - A? . . .

LISTADO DE SECUENCIAS <110> THERATECH OLOGIES INC . GRAVEL, Denis HABÍ , Abdelkri BRAZEAU, Paul <120> ANÁLOGOS DE GRF CON POTENCIA BIOLÓGICA INCREMENTADA <130> 12411-5PCT- 2 FC/ <1S 0> US 09/148 , 982 <151> 1998 - 09- 08 <150> US <151> 1999- 09-03 <1€0> 2 <170> FastSEQ para Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> GRF Humano <400> 1 Tyr Ala Aep Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp lie Met Ser Arg Gln Gln Gly 20 25 30 Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu 35 40 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213 > Núcleo activo de GRF humano <400> 2 Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Aep lie Met Ser Arg 20 25

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Un análogo de GRF hidrofóbico de la fórmula A: X GRF - péptido (A) en donde; 5 el péptido de GRF es un péptido de la fórmula B; A1 -A2-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-A8-Ser-Tyr-Arg-Lys-A13-Leu-A15- Gln-Leu-A18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-A24-A25-lle-A27-A28-Arg- A30-R0 (B) en donde, 10 A1 es Tyr o His; A2 es Val o Ala; A8 es Asn o Ser; A13 es Val o lie; A15 es Ala o Gly; 15 A18 es Ser o Tyr; A24 es Gln o His; A25 es Asp o Glu; A27 es Met, lie o NIe; A28 es Ser o Asn; 20 A30 es una unión o cualquier secuencia amino acida de 1 hasta 15 residuos; Ro es NH2 o NH-(CH2)n-CONH2, con n=1 hasta 12 y; X se selecciona a partir del grupo que consiste en: 25 1 (R=H o CH3 o CH2CH3) 2 (R=H o CH3 o CH2CH3) 10 3 (R=H o CH3 o CH2CH3) 15 4 (R=H o CH3 o CH2CH3) 25 6 (R=H o CH3 o CH2CH3) 7 (R=H o CH3 o CH2CH3) 8 (R=H o CH3 o CH2CH3) 9 (R=H o CH3) 10 (R=H o CH3 o CH2CH3) 25 1 1 (R=H o CH3 o CH2CH3) 12 (R=H o CH3) 10 13 2. Una formulación farmacéutica para inducir la liberación de hormona de crecimiento, la cual comprende como un ingrediente activo un análogo de GRF según la reivindicación 1 , en asociación con un 20 vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. 3. El uso de un análogo de GRF según la reivindicación 1 , caracterizado por la fabricación de un medicamento para incrementar el nivel de la hormona de crecimiento en un paciente, el cual comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de dicho análogo 25 de GRF 4. Un método para el diagnóstico de deficiencias de la hormona de crecimiento en pacientes, el cual comprende la administración a dicho paciente de un análogo de GRF según la reivindicación 1 y la medición de la respuesta de la hormona de crecimiento. 5 5. El uso de un análogo de GRF según la reivindicación 1 , caracterizado por la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enanismo pituitario o retardo de crecimiento en un paciente, el cual comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de dicho análogo de GRF. 10 6. El uso de un análogo de GRF según la reivindicación 1 , caracterizado por la fabricación de un medicamento para el tratamiento de sanación de heridas o huesos en un paciente, el cual comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de dicho análogo de GRF. 15 7. El uso de un análogo de GRF según la reivindicación 1 , caracterizado por la fabricación de un medicamento para el tratamiento de osteoporosis en un paciente, el cual comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de dicho análogo de GRF. 8. El uso de un análogo de GRF según la reivindicación 1 , 0 caracterizado por la fabricación de un medicamento para mejorar el anabolismo de proteínas en humanos o animales, el cual comprende la administración a dicho humano o animal de una cantidad efectiva de dicho análogo de GRF. 9. El uso de un análogo de GRF según la reivindicación 1 , 5 caracterizado por la fabricación de un medicamento para inducir un efecto ^m mn^ ^^^¡¡¿ . >.^A¿. ' ti I. É.BtlI-tté-'f---'"- ' "-^" **- -**»- i^k- « - lipolítico en humanos o animales afligidos con obesidad clínica, el cual comprende la administración a dicho humano o animal de una cantidad efectiva de dicho análogo de GRF. 10. El uso de un análogo de GRF según la reivindicación 1 , caracterizado por la fabricación de un medicamento para la mejora total de la función somatrófica en humanos o animales, el cual comprende la administración a dicho humano o animal de una cantidad efectiva de dicho análogo de GRF. 10