JPH0459794A

JPH0459794A - Ｖｉｐ様活性を有するポリペプチド誘導体及びその用途

Info

Publication number: JPH0459794A
Application number: JP2165739A
Authority: JP
Inventors: Masatsune Kurono; 昌庸黒野; Takahiko Mitani; 隆彦三谷; Haruo Takahashi; 治雄高橋; Kiichi Sawai; 喜一澤井
Original assignee: Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Current assignee: Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Priority date: 1990-06-26
Filing date: 1990-06-26
Publication date: 1992-02-26

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はＶＩＰ様活性を有する新規なポリペプチド誘導
体及びその用途に係り、又その製造用原料をも対象とす
る。

本発明によるＶＩＰ様活性を有するポリペプチド誘導体
は医薬品成分として、殊に喘息及びインポテンツの治療
に用いることができる。

（従来の技術）ＶＩＰ　　（Ｖａｓｏａｃｔｌｖｅ　　Ｉｎｔｅｓｔｌ
ｎａｌ　　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅ）　　は為５ａｉｄ
　＆　Ｍｕｔｔにより　１９７０年にブタ十二指腸から
セクレチンを抽出精製する段階における副分画から精製
された、２８個のアミノ酸からなるペプチドホルモンで
ある。１９７４年にＶＩＦ’におけるアミノ酸の一次構
造が明らかになりセクレチン、グルカゴン等と類似して
いることから、ＶＩＰはグルカゴン−セクレチンファミ
リーに属するペプチドホルモンであるとされるに至って
いる。ＶＩＰは消化管以外に神経系にも汎く存在が認め
られており、その生理作用も多彩であって、強い血管拡
張・血圧降下作用、平滑筋弛緩作用、腸液分泌促進作用
、膵液・胆汁分泌促進作用、胃酸分泌抑制作用、グリコ
ーゲン分解促進作用、種々の下垂体ホルモン分泌促進作
用、更には生殖器の血流調節作用、気管支拡張作用等を
有することが明らかになっている。

これらの種々多様な薬理作用の内でも、ＶＩＰは気管支
並びに海綿体小柱における平滑筋弛緩作用を利用して喘
息やインポテンツの治療に用いる薬物として期待されて
いる。このＶＩＰの構造的な特徴としては、Ｃ末端がア
ミド化されている点であり、これが生理活性の発現に重
要な役割を果たしている。゛一般的に、大腸菌を利用する現在汎用の技術によりポリ
ペプチドを調製する場合にＣ末端がアミド型のポリペプ
チドを得るためには、発現したポリペプチドを精製する
と共に、Ｃ末端アミド化酵素を用いて処理する等の特殊
な酵素処理が要求されている。しかしながら、この種の
酵素が高価であるのみならず、目的物質の収率も低く、
従ってこのような酵素処理を要件とする従来技術方法は
は工業化に適していると云えないのが実杖である。

尚、本発明が対象としているＶＩＰとは直接的な関係を
有していないが、腸の螺動運動を促進するモチリン様生
理活性物質（モチリンアナログ）に関して、本発明者等
はＣ末端がホモセリン型のものであっても本来のモチリ
ンと同等又はそれ以上の活性を有していることを見い出
し、これを廉価に大量生産する方法を提案した（特願昭
６４−２８６）。

更に、ＶＩＰの１７位はメチオニンであるが、これをロ
イシン又はノルロイシンに変換したアミノ酸構造を宵す
るポリペプチドもＶＩＰと同様な生理活性□を示すこと
が報告されており　（特開昭６２−２４６５９５）、１
７位のメチオニンが活性に及ぼす影響は殆どないものと
考えられている。

（発明が解決しようとする課題及び発明の目的）慣用技
術によれば、ＶＩＰを得るには合成法又は生物試料から
の抽出に頼らざるを得す、廉価で大量に市場に供給する
ことは極めて困難であった。

尚、バイオテクノロジーによる技術を用いても、既述の
ように、Ｃ末端のアミド化に特殊な技術を用いねばなら
ず、工業的に有利なＶＩＰの製法をもたらすには至らな
かった。

本発明は従来技術における上記のような困難を踏まえて
なされたものであり、ブロムシアンによる切断によって
Ｃ末端にホモセリン（ホモセリンラクトンをも含む）を
有し且つＶＩＰ様構造を有するポリペプチドを先ず調製
し　（生理活性型ＶＩＰ様ポリペプチド調製用原料の合
成）、次いでこれに簡単な化学反応を施すことにより、
ＶＩＰと同程度の活性を有するＶＩＰ様ポリペプチド誘
導体（ＶＩＰアナログ）を提供することにある。

本発明の附随的な、但し重要な目的は効率的にしかも廉
価に提供できる、上記のＶＩＰ様活性を有するポリペプ
チド誘導体を有効成分とする医薬品、殊に気管支拡張剤
及びインポテンン治療剤を提供することにある。

本発明の他の目的は、生理活性型ＶＩＰ様ポリペプチド
誘導体の調製用原料として有用なポリペプチド誘導体を
提供することにある。

（課題を解決し、目的を達成する手段及び作用）本発明
者等は鋭意検討を重ねた結果、醗酵法又は合成法により
得られ、且つ１７位がメチオニン（Ｍｅｔ）以外のアミ
ノ酸残基であるＶＩＰ様の構造を有するポリペプチドに
関して、ブロムシアンにより切断した後に得られるポリ
ペプチドはＣ末端がホモセリン（ホモセリンラクトンを
も含む）になっているが、このラクトン型のものには比
較的容易にアミドや脂肪族アミン等を通常の合成法によ
って結合せしめ得ることを見い出し且つこのようにして
得たポリペプチド誘導体が、Ｃ末端にアミド構造を有す
る本来のＶＩＰと同等又はそれ以上の活性を有すること
を見い出し、これによって本発明を完成するに至った。

本発明によれば、既述の従来技術における課題は式（１
）％式％［式中ＸはＮｅｔ以外のアミノ酸残基を意味し、Ｙはホ
モセリンのアミド化されているもの、ホモセリンラクト
ンに炭素数が２０個以下の第一級脂肪酸アミンを反応さ
せたもの、又はＣ末端にホモセリンのアミド化されてい
るものを含む任意のポリペプチドを意味する］にて示され、ＶＩＰ様活性を有するポリペプチド誘導体
にて解決されると共に、本発明による既述の主目的が達
成される。

尚、上記の一般式（１）において、ＸがｒＭｅｔ以外の
アミノ酸残基」として定義されているのは、仮にＭｅｔ
　（メチオニン）であると、醗酵法で調製し、ブロムシ
アンにて処理する場合に当該Ｍｅｔの部位でも切断が生
じ、結果的にはＶＩＰ様の構造を有するポリペプチドが
得られないからである。

上記の式（１）にて示される生理活性型ＶＩＰ様ポリペ
プチド調製用の本発明によるポリペプチド誘導体は式（
Ｉ”）Ｈ１ｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａ　１ａ−ｖａ　ｌ　−Ｐｈ
ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−ＴｙｒＴｈｒ−Ａｒｇ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｘ　−Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ
−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ’［式中ＸはＮｅｔ以外
のアミノ酸残基を意味し、Ｙ″はホモセリン（ホモセリ
ンラクトンをも含み、ｌ１ｓｅで示される）を意味する
コにて示される。

（実施例等）次に、製造例及び薬理活性試験例に関して本発明を更に
詳細に且つ具体的に説明する。

尚、以下においてはＶＩＰの１７位がロイシン（Ｌｅｕ
）に変換されたＶＩＰアナログに関して説明するが醗酵
法を用いた場合、メチオニン　（Ｎｅｔ　）以外のアミ
ノ酸残基であれば、同様にして他のＶＩＰアナログを調
製し得ることに留意されたい。

裂盗Ｌ（１）　ＶＩＰ様ポリペプチドの合成ペプチドの合成はアプライドバイオシステムズ社のペプ
チドシンセサイザー４３ＯＡにて行った。

先ず、以下に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを
合成した。

Ｈｌｓ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅ
ｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａ！ａ−Ｖａｌ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−５ｅｒ−
１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ａ　ｌａ−Ｓｅｒ合成したペプチドサンプルはウォーターズ社製のマイク
ロボンダスフェアのＣ−１８カラム　（１９ｍｍｘ　１
５ｃｍ）を用いＨＰＬＣにて精製した。

サンプル１０ｍｇを秤取した後、７０％蟻酸溶液３０ｍ
１に溶解させ、ブロムシアン５０ｍｇを添加し、３７°
Ｃで２４時間反応させた。その後、蒸溜水２００ｍ１を
添加し凍結乾燥することによって蟻酸及ヒフロムシアン
を除去した。次いで、再度ウォーターズ社製のマイクロ
ボンダスフェアのＣ−１８カラム　（１９ｍｍ　ｘ　１
５ｃｍ）を用い１（ＰＬＯにて以下の条件下で精製した
。

溶出液二０．１％トリフルオロ酢酸中３０％から６０％
のアセトニトリルの直線勾配、３０分間。

流速　：　７．Ｏｍｌ／ｍｉｎ。

ＨＰＬＣによるメインピーク部分を回収して凍結乾燥す
る。以上の過程を経ると、ペプチドサンプルのＣ末端は
、ホモセリン又はホモセリンラクトンとなる。

更に、酸処理（例えば、０．ＩＮ　ＨＣＩ中３０″Ｃ１
３時ｒｊＪ）を施し凍結乾燥するこきにより、Ｃ末端の
７０％以上をラクトン型に変換することができる。

このようにして形成されたラクトン型のものを■ＰＬｃ
で分取し、凍結乾燥粉末をジメチルボルムアミド中に１
０％のアンモニアを含む溶液で室温下に２４時間処理す
ることによりＣ末端がホモセリンアミド型のし一ロイシ
ンー１７−ＶＩＰを調製することができる。このＶＩＰ
アナログの一部を採取し、アブライドバイオシステムズ
社のベプチドシークエンサーにて調べたところ、サンプ
ルはメチオニン（Ｎｅｔ）の位置で正しく切断されてお
り、Ｃ末端はアミド化されていることが確認された。

尚、ホモセリンラクトン型のし一ロイシンー１７＝ＶＩ
ＰにＣＨ３（ＣＨ２）９ＮＨ２、ＣＨ３（ＣＨ２）Ｉ　
ｓ　ＮＬ等の第一級脂肪族アミンをジメチルスルホキシ
ド中で反応させるとＣ末端に脂肪族アミンの付加したＶ
ＩＰアナログを容易に得ることができる。

目Ｅｌ　　　”　　　（気管支収縮抑制活性の測定）上
記の製造例で得られたＶＩＰアナログを被験物質とし、
化学合成法により得られたＶＩＰを対照物質として、モ
ルモット気管支を用いるマグヌス法［”Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ”第６巻第５９７−１１ｉ０１頁（１９８５年）コに
従い気管支収縮抑制活性を測定し、濃度１０−６Ｍのヒ
スタミンが示す収縮活性を１００％とし収縮阻害活性と
して比較した結果は、第１図に示される通りであった。

この図から明らかなように、本発明によるＶＩＰアナロ
グであり、Ｌ−ロイシン１７−ＶＩＰのＣ末端側にホモ
セリンアミド又は第一級脂肪族アミンを有するポリペプ
チド誘導体が示す気管支収縮抑制活性は化学合成された
純ＶＩＰと同程度であることが確認された。

鼠■Ｌ製造例で得たし一ロイシンー１７４’１Ｐ４ｓｅ−ＮＬ
をｌｒｎｇ宛含有するようにバイアルに無菌的に分配シ
、凍結乾燥にて水分を除去し、次いでバイアルを密封す
ることにより注射目的用の粉末製剤を得た。

この粉末製剤は用時には生理食塩水に添加溶解される。

尚、本発明によるＶＩＰアナログの安定化剤としてはヒ
ト血清アルブミン等を用いることができる。

（発明の効果）本発明によるポリペプチド誘導体は、化学合成された純
１’ＩＰと同程度の生理活性を示す。

本発明による生理活性型ポリペプチド誘導体の原料とな
り、Ｃ末端にホモセリン（ホモセリンラクトンをも含む
）を有するＶＩＰアナログは、本発明者等が開発した方
法（特願平１−２１８０３４）を応用して大腸菌等によ
り産生させれば容易に且つ極めて廉価に得ることができ
る。

本発明による生理活性型のＶＩＰアナログは、この原料
を用いて、アンモニア又は第一級脂肪族７ミンを作用さ
せることにより容易に調製することができる。

従って、本発明によるＶＩＰアナログの調製に際しては
、従来行なわれていた酵素処理が省略できるので、製造
コストが著しく低減し、収率も向上し、結果として生産
効率が高まり、ＶＩＰ様生理活性物質の廉価な且つ大量
の供給が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるｎＰ様活性を有するポリペプチド
誘導体を被験物質とし、化学合成法により調製された純
ＶＩＰを対照物質とし、これらの物質が示すモルモット
気管支収縮阻害活性をマグヌス法ニヨって測定した結果
を示すグラフである。特許出願人　株式会社三和化学研究所、−一１１、　　、−　−　碌ｎ月色第１図投与量（ｌｏｇＭ） −Ｇ−−：　ｖｒｐ

Claims

【特許請求の範囲】

（１）式（ I ）【遺伝子配列があります】（式中ＸはＭｅｔ以外のアミノ酸残基を意味し、Ｙはホ
モセリンのアミド化されているもの、ホモセリンラクト
ンに炭素数が２０個以下の第一級脂肪族アミンを反応さ
せたもの、又はＣ末端にホモセリンのアミド化されてい
るものを含む任意のポリペプチドを意味する）にて示され、ＶＩＰ様活性を有するポリペプチド誘導体
。
（２）請求項１に記載のポリペプチド誘導体を有効成分
とする気管支拡張剤。
（３）請求項１に記載のポリペプチド誘導体を有効成分
とするインポテンツ治療剤。
（４）式（ I ′）【遺伝子配列があります】［式中ＸはＭｅｔ以外のアミノ酸残基を意味し、Ｙ′は
ホモセリン（ホモセリンラクトンをも含み、Ｈｓｅで示
される）を意味する］にて示されるポリペプチド誘導体。