JP2002500161A - 神経栄養性および鎮痛性のレトロインバースペプチド - Google Patents

神経栄養性および鎮痛性のレトロインバースペプチド

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Abstract

(57)【要約】 【課題】生物学的活性を保持したままで、大きな代謝安定性を示す神経栄養性および鎮痛性のペプチドを提供する。 【解決手段】サポシンＣの神経栄養活性領域に由来するレトロインバースペプチドアナログ。このサポシンＣ由来のペプチド（プロサプチド）は、軸索突起の成長をインビトロで誘導し、プログラム化された細胞死を防止し、ミエリン形成を誘導し、そして鎮痛作用を有する。このペプチドは、中枢神経系および末梢神経系の疾患ならびに痛み管理の処置に有用である。このレトロインバースペプチドは、代謝分解に対して、対応する非インバースペプチドよりも著しく大きな耐性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経栄養性および鎮痛性のペプチドならびにその使用方法に関する
。より詳細には、本発明は、サポシンＣの神経栄養性ペプチドフラグメントの安
定で活性なレトロインバースアナログに関する。
【０００２】
【従来の技術】
（背景技術） 脱髄は、多数の中枢神経系（ＣＮＳ）疾患に共通した欠陥の１つである。最も
一般的な疾患は多発性硬化症（ＭＳ）である。全身的な無力化に至り得る慢性疾
患であるＭＳは、軸索はほとんど無傷のままであるが、ミエリン鞘に対する損傷
を特徴とする。ＭＳは、若年成人の最も一般的な神経学的疾患である。合衆国で
のＭＳ発生は、約３００，０００である。現在、抗炎症薬を使用するＭＳの処置
は、治療的であるというよりも一時的なものである：これらの薬物は、回復を促
進するというよりも炎症を抑えるように作用するので、脱鞘の阻止は非常に限ら
れている（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ
Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、Ｒｅｄｅｒ，Ａ．ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７）。脱鞘を含む他の中枢神経系の疾患には、急性播
種性脳脊髄炎、脳および／または脊髄に対する障害、急性出血性白質脳症、進行
性多中心性白質脳症、異染性白質萎縮症、副腎白質萎縮症、および未熟児の白質
形成異常（脳室周囲の白質軟化）が含まれる。末梢神経系（ＰＮＳ）もまた脱鞘
し得る：例えば、ギラン−バレー症候群（Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｂａｓｉｓ
ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｒｏｂｂｉｎｓ他編、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ、Ｐｈ
ｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９７９年、１５７８頁〜１５８２頁）、外傷性の損傷
および炎症、または感染性の神経障害などで生じている。糖尿病または化学療法
などから生じる末梢神経の損傷および末梢の神経障害は、最も一般的な末梢の神
経系疾患を含む。
【０００３】 ニューロトロフィンおよび神経栄養因子は、ニューロン細胞集団の生存、標的
の神経支配および／または機能に影響し得るタンパク質またはペプチドである（
Ｂａｒｄｅ、Ｎｅｕｒｏｎ、２：１５２５〜１５３４、１９８９）。インビボお
よびインビトロの両方におけるニューロトロフィンの効力は十分に立証されてい
る。例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）は、前脳のコリン作動性の末梢ニューロン
および感覚ニューロンに対する栄養因子として作用する（Ｈｅｆｔｉ他、Ｎｅｕ
ｒｏｂｉｏ．Ａｇｉｎｇ、１０：５１５〜５３３、１９８９）。インビボ実験に
より、ＮＧＦは、末梢神経に対する自然に生じる損傷および物理的外傷を修復し
得ることが示されている（Ｒｉｃｈ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．、１６：２
６１〜２６８、１９８７）。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、末梢感覚ニュ
ーロン、黒質のドーパミン作動性ニューロン、中枢のコリン作動性ニューロンお
よび網膜神経節に対する栄養因子である（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ他、Ｒｅｓｔｏｒ
．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、５：１５〜２８、１９９３）。ＢＤＮＦ
は、正常に生じる細胞死をインビトロおよびインビボの両方で防止することが明
らかにされている（Ｈｏｆｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：２６２〜２６２、１
９８８）。毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）は、ニワトリの胚の毛様体神経節の
生存をインビトロで促進し、そして培養された交感神経の感覚ニューロンおよび
脊髄運動ニューロンの生存を助ける（Ｉｐ他、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐａｒｉｓ
、８５：１２３〜１３０、１９９１）。
【０００４】 プロサポシンは、リソソームのヒドロラーゼによる糖スフィンゴ脂質の加水分
解に必要とされる一群の熱に安定な４つの小さな糖タンパク質の前駆体である（
Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ他、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、３３：１２５５〜１２６７
、１９９２）。プロサポシンは、リソソームにおいてタンパク質分解的にプロセ
シングされ、サポシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤを生成する（Ｏ' Ｂｒｉｅｎ他、ＦＡ
ＳＥＢ Ｊ．、５：３０１〜３０８、１９９１）。Ｏ' Ｂｒｉｅｎ他（Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１：９５９３〜９５９６、１
９９４）、米国特許第５，５７１，７８７号およびＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９
５／０３８２１号は、プロサポシンおよびサポシンＣが、軸索突起の成長を刺激
し、そしてミエリン形成の増大を促進することを開示している。さらに、米国特
許第５，５７１，７８７号および国際特許公開第ＷＯ９５／０３８２１号は、ヒ
トサポシンＣのアミノ酸８〜２９からなる２２ｍｅｒペプチド（ＣＥＦＬＶＫＥ
ＶＴＫＬＩＤＮＮＫＴＥＫＥＩＬ；配列番号１）が、神経芽腫細胞およびマウス
小脳外植片の両方における軸索突起の成長を刺激することを開示している。これ
らの参考文献はまた、（ＶがＹによって置換された）サポシンＣの活性な２２ｍ
ｅｒに含まれる１８ｍｅｒペプチド（ＹＫＥＶＴＫＬＩＤＮＮＫＴＥＫＥＩＬ；
配列番号２）もまた、軸索突起の成長を促進し、そして血液脳関門を通過するこ
とができたことを開示している。Ｏ' Ｂｒｉｅｎ他（ＦＡＳＥＢ Ｊ．、９：６
８１〜６８５、１９９５）は、この２２ｍｅｒがコリンアセチルトランスフェラ
ーゼ活性を刺激し、そして神経芽腫細胞の細胞死をインビトロで防止したことを
明らかにしている。この活性な軸索突起形成フラグメントは、サポシンＣのアミ
ノ末端配列に存在する線状の１２ｍｅｒに局在化していた（ＬＩＤＮＮＫＴＥＫ
ＥＩＬ；配列番号３）。
【０００５】 ペプチドをインビボの治療に使用するための大きな障害は、タンパク質分解的
な分解に対するその感受性である。レトロインバース（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒ
ｓｏ）ペプチドは、配列の方向が逆（レトロ：ｒｅｔｒｏ）であり、そして各ア
ミノ酸のキラリティー（ＤまたはＬ）が逆転（インバース：ｉｎｖｅｒｓｏ）し
ている線状ペプチドの異性体である。いくつかのペプチド結合のみが逆になり、
そして逆になった部分のアミノ酸残基のキラリティーが逆転している線状ペプチ
ドの部分的に改変されたレトロインバース異性体もまたは存在する。そのような
ペプチドの大きな利点は、タンパク質分解的な分解に対する耐性が改善されたこ
とによるその高まったインビボでの活性である（総説に関して、Ｃｈｏｒｅｖ他
、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１３：４３８〜４４５、１９８５を参照の
こと）。そのようなレトロインバースアナログは代謝安定性が増大しているが、
その生物学的活性は非常に抑えられていることが多い（Ｇｕｉｃｈａｒｄ他、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１：９７６５〜９７６
９、１９９４）。例えば、Ｒｉｃｈｍａｎ他（Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｒｅｓ．、２５：６４８〜６６２）は、Ｇｌｙ3 −Ｐｈｅ4 のアミド結合
が改変された線状または環状のｌｅｕ−エンケファリンのアナログが、元のｌｅ
ｕ−エンケファリンの６％〜１４％の範囲の活性を有することを明らかにした。
Ｃｈｏｒｅｖ他（上記）は、ビトロネクチンのそのレセプターに対する結合を阻
害するペプチドのレトロインバース化によって、活性が元の異性体の１／５０，
０００分に低下したペプチドが得られ、そして活性が元の環状ペプチドの４，０
００倍になった別のペプチドが得られたことを明らかにした。Ｇｕｉｃｈａｒｄ
他（ＴＩＢＴＥＣＨ １４、１９９６）は、レトロインバース（すべてがＤ体の
レトロ体）抗原性模倣体は、ランダムコイル形態、ループ形態または環状形態の
ペプチドに存在し得るだけであることを教示している。「らせん状」ペプチドの
場合、適切な機能的模倣体は、らせん性が、抗原性模倣体を評価するために使用
される溶媒条件下で実際に存在しないときにだけ予想される。上記の２２ｍｅｒ
（配列番号１）は、天然プロサポシンのらせん領域が隣接する隣り合うアスパラ
ギン残基でのループ体である。このペプチドは、プロサポシンレセプターに結合
したときにらせん状になることが非常に確からしい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
生物学的活性を保持したままで、大きな代謝安定性を示す神経栄養性および鎮
痛性のペプチドが必要とされている。本発明はこのような必要性を解決する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
（発明の要旨） 本発明は、神経栄養性サポシンＣフラグメントのレトロインバース化ペプチド
が驚くべき高レベルの神経栄養活性を有するという発見を含む。このようなペプ
チドの改変体および置換体もまた、驚くべき活性を有し、そしてインビボで安定
である。任意の特定の候補ペプチドに関する迅速な活性測定を可能にする簡便な
スクリーニングプロトコルが下記に示されている。レトロインバース化ペプチド
はこれまで低い活性を有していたが、本発明は、レトロインバース法がサポシン
Ｃの神経栄養フラグメントに理想的に適していることを実証する。
【０００８】 本発明の１つの実施形態は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む１０
個〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドである。好ましくは、このペプチ
ドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１１に示される配列
を有する。好ましくは、このペプチドは、アミノ末端またはカルボキシ末端で、
あるいはアミノ末端およびカルボキシ末端の両方で、下記の独立的に選択される
基の１つによって修飾される：ＣＨ3 ＣＯ、ＣＨ3 （ＣＨ2 ）n ＣＯ、Ｃ6 Ｈ5
ＣＨ2 ＣＯ、およびＨ2 Ｎ（ＣＨ2 ）n ＣＯ（ただし、ｎ＝は１〜１０）。好都
合なことに、このペプチドは、Ａｓｎ７またはα−アミノ基でグリコシル化され
る。この好ましい実施形態の１つの局面において、このペプチドの１つまたは複
数のアミド結合は還元されている。この好ましい実施形態の別の局面において、
このペプチドの１つまたは複数の窒素はメチル化されている。好ましくは、この
ペプチドの１つまたは複数のカルボン酸基はエステル化されている。
【０００９】 本発明はまた、軸索突起形成を刺激するか、あるいは神経細胞死を防止するた
めの方法を提供する。この方法は、神経細胞を、配列番号１２に示されるアミノ
酸配列を含む１１個〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドの軸索突起形成
または神経細胞死防止に効果的な量を含む組成物と接触させる工程を含む。好ま
しくは、この神経細胞は神経芽腫細胞である。好ましくは、この神経芽腫細胞は
ＮＳ２０Ｙ細胞である。この好ましい実施形態の１つの局面において、前記のペ
プチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１１に示される
配列を有する。
【００１０】 本発明の別の実施形態は、ミエリン形成を刺激するか、または脱髄を防止する
ための方法である。この方法は、神経細胞を、配列番号１２に示されるアミノ酸
配列を含む１１個〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドのミエリン形成刺
激または脱髄阻害に効果的な量を含む組成物と接触させる工程を含む。好ましく
は、このペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１１
に示される配列を有する。
【００１１】 本発明はまた、痛みの処置を必要とする哺乳動物において痛みを処置するため
の方法を提供する。この方法は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む１
１個〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドを含む組成物の痛み処置に効果
的な量を前記哺乳動物に投与する工程を含む。好ましくは、このペプチドは、配
列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１１に示される配列を有する
。
【００１２】 本発明はまた、薬学的組成物を提供するものであり、この薬学的組成物は薬学
的に受容可能なキャリアに、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む１１個
〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドを含む。好ましくは、この組成物は
制御放出配合物である。あるいは、この組成物はリポソーム形態である。この組
成物はまた、凍結乾燥された形態であり得る。好ましくは、この組成物は単位投
薬形態である。
【００１３】 本発明は、ミエリン形成の刺激または脱髄の阻害を必要とする哺乳動物におい
て、ミエリン形成を刺激するか、または脱髄を防止するための方法を提供する。
この方法は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号
５、配列番号７、配列番号８または配列番号１１に示される配列を有する１０個
〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドのミエリン形成刺激または脱髄阻害
に効果的な量を含む組成物を前記哺乳動物に投与する工程を含む。好ましくは、
この投与工程は、静脈内、肺的、くも膜下内、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、硬
膜外、局所的および経口的であることを含む。
【００１４】 本発明の別の実施形態は、軸索突起形成を刺激するか、または神経細胞死を防
止するためのペプチドであって、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む１
１個〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドの使用である。好ましくは、こ
のペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１１に示さ
れる配列を有する。
【００１５】 本発明はまた、ミエリン形成を刺激するか、または脱髄を防止するためのペプ
チドであって、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む１１個〜約４０個の
間のアミノ酸を有するペプチドの使用を提供する。好ましくは、このペプチドは
、配列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１１に示される配列を有
する。
【００１６】 本発明の別の実施形態は、痛みの処置を必要とする哺乳動物において痛みを処
置するためのペプチドであって、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む１
１個〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドの使用を提供する。好ましくは
、このペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１１に
示される配列を有する。
【００１７】 本発明はまた、ミエリン形成の刺激または脱髄の阻害を必要とする哺乳動物に
おいて、ミエリン形成を刺激するか、または脱髄を防止するためのペプチドであ
って、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む１１個〜約４０個の間のアミ
ノ酸を有するペプチドの使用を提供する。好ましくは、このペプチドは、配列番
号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１１に示される配列を有する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
（好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明は、天然のペプチドフラグメントと同様に、サポシンＣの活性な神経栄
養性領域を含むレトロインバース化（ＲＩ）ペプチドが、軸索突起の成長を刺激
し、そして神経細胞の死を防止するという発見を含む。このペプチドはまた、神
経細胞のミエリン形成の増大を促進する。このような結果は、レトロインバース
アナログが、プロサポシンレセプターへの結合に必要とされる立体配座に関して
、対応するすべてがＬ型のペプチドと同じ立体配座を取ることは、特に、大きな
割合のらせん構造を含有するレトロインバースペプチドは十分な機能的模倣体と
ならないことが予想されると教示するＧｕｉｃｈａｒｄ他（１９９６、上記）を
参照して考えられないので驚くべきものである。
【００１９】 ヒトサポシンＣに含まれ、配列番号３（ＬＩＤＮＮＫＴＥＫＥＩＬ）に示され
る活性な軸索突起促進領域を含む天然の１５ｍｅｒ（ＴＫＬＩＤＮＮＫＴＥＫＥ
ＩＬＤ；配列番号１０）は、インビボでのタンパク質分解作用に対するその感受
性を減少させるために下記のように改変された：Ｌｙｓ２をＤ−ａｌａと置換し
てエキソペプチダーゼに対する耐性を増大させ；ｌｙｓ８をａｌａと置換してト
リプシン消化に対する耐性を増大させ；そしてｌｙｓ１１を欠失してトリプシン
消化に対する耐性を増大させた。さらに、ａｓｐ１５をｔｙｒと置換してヨウ素
化部位とした。従って、得られたペプチドのＴＸ１４（Ａ）は、トリプシンまた
はキモトリプシンに対する切断部位を含有しなかった。レトロインバース化され
たＴＸ１４（Ａ）（ペプチドＤ２）は、逆方向にＴＸ１４（Ａ）のアミノ酸を含
有した。さらに、すべての残基はＤキラリティーを有し、タンパク質分解に対す
る感受性がさらに最小化された。
【００２０】 ＴＸ１４（Ａ）、Ｄ２、Ｄ４およびＤ５の各ペプチドはすべて、インビトロで
の軸索突起成長アッセイにて軸索突起形成活性を示した（図１および図３）。実
際、ペプチドＤ２、すなわち、ＲＩペプチドは、ＴＸ１４（Ａ）よりもわずかに
大きな活性を有した（図１）。ペプチドＤ４およびペプチドＤ５もまた、ＴＸ１
４（Ａ）よりも幾分か大きな活性を有した。ペプチドＴＸ１４（Ａ）およびペプ
チドＤ２はまた、培養された神経芽腫細胞の細胞死を同じ程度に防止した（図２
）。別のレトロインバースペプチドのＤ３（ＹＬＥＥＴＡＮＮＤＬＬＡＴ；配列
番号１１）もまた、インビトロで軸索突起の成長を促進した。
【００２１】 重要なことに、実施例５に示されているように、ペプチドＤ５の全身投与は、
ミエリン再形成プロセスに対する直接的な作用によって、ＬｅｗｉｓラットのＥ
ＡＥモデルでの病変重篤度を低下させる。この作用は、マクロファージでの作用
によって炎症を低下させるように作用する現在のＭＳ薬剤の抗炎症効果とは異な
る。配列番号１２に示される配列を含む所望するペプチドはいずれも、このモデ
ルで試験して、脱髄を回復させるその能力を測定することができ、あるいは本明
細書中に記載されているそれ以外のアッセイのいずれかで、軸索突起の成長およ
びミエリン形成を促進するその能力を測定することができる。機能の回復は、処
置された動物の歩幅が正常に戻ったことによって明らかにされた。歩幅は、四肢
の弱さの尺度である。
【００２２】 配列番号８に示されるＲＩされた活性な１１ｍｅｒ配列を含むか、あるいは下
記の配列番号１２に示されるコンセンサス配列を含む完全なＲＩ化サポシンＣ由
来ペプチドまたは部分的なＲＩ化サポシンＣ由来ペプチド、およびその神経栄養
性および／またはミエリン栄養性のアナログは、末梢神経系および中枢神経系に
対する毒性障害、外傷性障害、虚血性障害、変性的障害および遺伝的障害の後で
の機能回復を促進する際の重要な治療的応用を有する。さらに、これらのＲＩペ
プチドは、ミエリン形成を刺激し、そして脱鞘性疾患の影響を中和する。これら
のペプチドは、ニューロンの成長を刺激し、ミエリン形成を促進し、そしてミエ
リン形成性グリア（すなわち、稀突起神経膠細胞（オリゴデンドロサイト））の
ニューロン組織でのプログラム化された細胞死を防止する。本発明のＲＩ化サポ
シンＣ由来ペプチドはまた、特に、外傷の数日後または数ヶ月後に発症し得る神
経障害的な痛みで、長期間持続するかまたは慢性的であることが多い神経障害的
な痛みを処置するための鎮痛剤として有用である。配列番号８は、下記のように
改変することができるが、依然として神経栄養活性を保持している：Ｌｅｕ１お
よびＬｅｕ２は任意のアミノ酸にすることができ；Ｇｌｕ３およびＧｌｕ４は任
意の荷電アミノ酸（ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ、ａｓｐまたはｇｌｕ）にすること
ができ；Ｔｈｒ５は必須であり；Ａｌａ６は任意のアミノ酸にすることができ；
Ａｓｎ７およびＡｓｎ８は必須であり；Ａｓｐ９は任意のアミノ酸であり；そし
てＬｅｕ１０はロイシンまたはイソロイシンである。これにより、ＲＩペプチド
のＤ２およびＤ３の配列とともに、下記のコンセンサス配列（すべてがＤ型アミ
ノ酸）が得られる： Ｘ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 ＴＸ5 ＮＮＸ6 Ｘ7 Ｘ8 （配列番号１２） ただし、Ｘ1 およびＸ2 は任意のアミノ酸であり；Ｘ3 およびＸ4 は、リシン、
アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり；Ｔはトレ
オニンであり；Ｘ5 は任意のアミノ酸であり；Ｎはアスパラギンであり；Ｘ6 は
任意のアミノ酸であり；Ｘ7 は欠失、ロイシンまたはイソロイシンあり；そして
Ｘ8 はロイシンまたはイソロイシンである。プロサポシンの活性なＲＩフラグメ
ントは、好ましくは、約１０個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸を有する。好ま
しくは、プロサポシンから得られる活性なＲＩフラグメントは、約１０個のアミ
ノ酸〜約２２個のアミノ酸を有する。
【００２３】 本発明の１つの実施形態は、分化した神経細胞または未分化の神経細胞におけ
る軸索突起の成長を、そのような細胞に軸索突起成長を促進するのに効果的な量
にて、配列番号８に示されるＲＩ化された活性な１１ｍｅｒ領域を含むＲＩ化サ
ポシンＣ由来ペプチドまたは配列番号１２で規定されるそのアナログを投与する
ことによって促進させる方法である。そのようなアナログは、例えば、１個また
は複数個のリシン残基および／またはアルギニン残基のアラニンまたは別のアミ
ノ酸による置換；１個または複数個のリシン残基および／またはアルギニン残基
の欠失；１個または複数個のチロシン残基および／またはフェニルアラニン残基
の置換、１個または複数個のフェニルアラニン残基の欠失、およびペプチドにお
ける１個または複数個のアミノ酸の保存的置換を含む。リシン／アルギニンおよ
びチロシン／フェニルアラニンの各残基の置換または欠失は、それぞれ、トリプ
シンおよびキモトリプシンによるペプチド分解の感受性を低下させる。
【００２４】 本発明における使用のために包含されるこれらのペプチド配列のさらなる変化
体は、マイナーな挿入および欠失を含む。保存的なアミノ酸置換が考慮される。
そのような置換は、例えば、その側鎖の化学的性質にて関連付けられるアミノ酸
ファミリーの中で行われる置換である。アミノ酸のファミリーには、塩基性荷電
アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性荷電アミノ酸（アスパラギ
ン酸、グルタミン酸）；非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロ
イシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；非荷電
極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、ト
レオニン、チロシン）；および芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトフ
ァンおよびチロシン）が含まれる。特に、ロイシンのイソロイシンもしくはバリ
ンによる孤立的な置換、またはアスパラギン酸のグルタミン酸による孤立的な置
換、またはトレオニンのセリンによる孤立的な置換からなる保存的なアミノ酸置
換、あるいは構造的に関連するアミノ酸による類似したアミノ酸の保存的な置換
は、ペプチドの特性に大きく影響しないことが一般的に認められている。配列番
号１２に示される配列、あるいはその挿入、欠失または置換を含むいずれかのＲ
Ｉペプチドが軸索突起の成長およびミエリン形成を促進し、脱髄を回復し、そし
て神経細胞の死を防止する能力は、下記に示されている実施例において提供され
るアッセイを使用して測定することができる。
【００２５】 様々な標準的な化学的改変によって、ペプチドの安定性、生物活性、および血
液脳関門を通過する能力が改善される。そのような１つの修飾は、脂肪族酸また
は芳香族酸の誘導体による、アミド結合を形成する脂肪族アミノ末端修飾である
。そのような誘導体には、例えば、ＣＨ3 ＣＯ、ＣＨ3 （ＣＨ2 ）n ＣＯ（ｎ＝
１〜１０）、Ｃ6 Ｈ5 ＣＨ2 ＣＯ、およびＨ2 Ｎ（ＣＨ2 ）n ＣＯ（ｎ＝１〜１
０）が含まれる。別の修飾は、脂肪族または芳香族のアミン／アルコールの誘導
体をアミド／エステル結合によってペプチドに結合させることによるカルボキシ
末端修飾である。そのような誘導体には、上記の誘導体が含まれる。ペプチドは
また、アミノ末端修飾およびカルボキシ末端修飾の両方を含むことができる。こ
の場合、その誘導体は上記の誘導体から独立的に選択される。ペプチドはまた、
グリコシル化することができる：この場合、配列番号１２に示されるペプチドの
α−アミノ基またはＤ−Ａｓｎ８、あるいはそれらの両方が、グルコースまたは
ガラクトースによって修飾される。考えられる別の修飾においては、選択された
骨格アミド結合が還元される（−ＮＨ−ＣＨ2 ）。他の修飾としては、アミド結
合内の選択された窒素のＮ−メチル化、およびペプチドでの少なくとも１つの酸
基が芳香族エステルまたは脂肪族エステルとして修飾されたエステルが含まれる
。上記の修飾の任意の組合せもまた包含される。
【００２６】 そのようなペプチドのいずれかが、軸索突起の成長を刺激するか、またはオピ
エートレセプターアゴニストとして作用する能力は、下記の実施例１および実施
例２に記載されている手順を使用して当業者によって容易に測定することができ
る。
【００２７】 細胞増殖培地における神経栄養活性に必要なＲＩペプチドの代表的な最少量は
、通常、少なくとも５ｎｇ／ｍｌである。インビトロでの使用に関して本発明の
ＲＩペプチドのこの量またはそれ以上の量も包含される。典型的には、これらの
ペプチドは、濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの範囲にある濃度で使
用される。任意の特定の組織に関して効果的な量は、実施例１に従って決定する
ことができる。
【００２８】 神経細胞は、本発明のＲＩペプチドを細胞に直接投与することによってインビ
トロまたはエクスビボで処置することができる。このような処置は、例えば、特
定の細胞タイプに適切な増殖培地で細胞を培養し、その後、ペプチドを培地に加
えることによって行うことができる。処置され得る細胞が、典型的には脊椎動物
、好ましくは哺乳動物においてインビボである場合、組成物をいくつかの技術の
いずれかによって投与することができる。最も好ましくは、組成物は、ペプチド
の所望する局所的濃度が得られるのに十分な量で血液に直接注射される。本発明
のＲＩペプチドは、Ｄペプチド結合のためにインビボでより長く持続する。リシ
ン残基およびアルギニン残基を有さないペプチドの場合、タンパク質分解的な分
解が低減される。
【００２９】 より小さなペプチド（すなわち、５０ｍｅｒ以下）は、ＣＮＳ疾患の処置のた
めに血液脳関門を通過して中枢神経系に進入することは非常に確からしい（Ｂａ
ｎｋｓ他、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、１３：１２８９〜１２９４、１９９２）。実際、
ペプチドＤ４の著量が、ラットへの筋肉内注射の後に脳内に存在していた。
【００３０】 神経疾患を処置する場合、直接的な頭蓋内注射または脳脊髄液への注射もまた
、所望する局所的濃度のニューロトロフィンが得られるのに十分な量で使用する
ことができる。両方の場合、薬学的に受容可能で注射可能なキャリアが使用され
る。そのようなキャリアには、例えば、リン酸塩緩衝化生理食塩水およびリンゲ
ル液が含まれる。あるいは、組成物は、直接的な局所注射によって、または全身
投与によって末梢神経組織に投与することができる。様々な従来の投与形式が包
含される。これには、静脈内、肺的、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、硬膜下、く
も膜下、局所的および経口的が含まれる。鎮痛剤として使用される場合、直接的
な静脈内注射による投与が好ましい。
【００３１】 本発明の神経栄養性および鎮痛性のペプチド組成物は、患者に投与される日用
量に等しい投薬量での注射可能な組成物または局所的な調製物などの単位投薬形
態に、あるいは制御放出組成物として包装され投与することができる。ＰＢＳ中
または凍結乾燥形態のいずれかにおいて活性成分の日用量を含有するセプタム密
封バイアルは、単位投薬の例である。好ましい実施形態において、脊椎動物の体
重に基づく本発明のＲＩペプチドの１日あたりの全身投薬量は、神経疾患の処置
に関して、あるいは鎮痛剤として、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１０，０００μｇ
／ｋｇの範囲である。より好ましくは、１日あたりの全身投薬量は、約０．１μ
ｇ／ｋｇ〜約１，０００μｇ／ｋｇの間である。最も好ましくは、１日あたりの
全身投薬量は、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇの間である。局所的に投
与される物質の１日あたりの投薬量は、それよりも約１桁少ない程度である。経
口投与は、胃腸系でのタンパク質分解的な分解に対するペプチドの耐性のために
特に好ましい。
【００３２】 本発明の好ましい実施形態の１つにおいて、神経栄養ペプチドは、神経細胞に
、その移植によってインビボで局所的に投与される。例えば、ポリ乳酸、ポリガ
ラクト酸（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、再生コラーゲン、多重膜リ
ポソーム、および多くの他の従来型デポ剤配合物は、生物学的に活性な神経栄養
性ペプチド組成物と配合することができる生物崩壊性または生分解性の物質を構
成する。このような物質は、移植されたときに徐々に分解して、活性物質を周り
の組織に放出する。生物崩壊性、生分解性および他のデポ剤の配合物の使用は、
本発明において特に考慮される。注入ポンプ、マトリックス閉じ込めシステム、
および経皮送達デバイスとの組合せもまた考慮される。ペプチドはまた、米国特
許第５，５２９，９１４号に記載されているようにポリエチレングリコールコン
フォーマル（ｃｏｎｆｏｒｍａｌ）コーティング剤内にカプセル化され、その後
移植することができる。
【００３３】 本発明の神経栄養ペプチドはまた、ミセルまたはリポソームの中に封入するこ
とができる。リポソーム封入技術はよく知られている。リポソームは、標的化組
織と結合し得るレセプター、リガンドまたは抗体を使用することによって神経組
織などの特定の組織に標的化することができる。このような配合物の調製は、こ
の分野では十分に知られている（Ｒａｄｉｎ他、Ｍｅｔｈ．、Ｅｎｚｙｍｏｌ．
、９８：６１３〜６１８、１９８３）。
【００３４】 現在、神経系の構造的完全性の十分な機能的再生および修復を促進し得る薬を
入手することができない。これは、特にＣＮＳの場合にはそうである。神経栄養
因子の使用による末梢神経の再生は本発明の範囲に含まれる。さらに、神経栄養
因子は、神経集団または脳の特定領域の縮退に関連する神経変性疾患の処置にお
いて治療的に有用であり得る。パーキンソン病の主原因は、黒質のドーパミン作
動性ニューロンの縮退である。プロサポシンに対する抗体によって、ヒトの脳切
片における黒質ドーパミン作動性ニューロンが免疫組織学的に染色されるので、
本発明のＲＩペプチドは、パーキンソン病の処置において治療的に有用であり得
る。網膜の神経障害、すなわち、中高年層において視力喪失に至る眼の神経変性
疾患もまた、本発明のＲＩペプチドを使用して処置することができる。
【００３５】 脳においてニューロン集団を得るためには、神経栄養因子を脳内に投与しなけ
ればならないと長い間考えられていた。なぜなら、これらのタンパク質は、血液
脳関門を通過しないからである。米国特許第５，５７１，７８７号は、サポシン
Ｃ由来のヨウ素化された神経栄養性の１８ｍｅｒフラグメントが血液脳関門を通
過することを開示している。従って、約２２個までのアミノ酸を有するＲＩペプ
チドもまた、この関門を通過し、従って、静脈内投与することができる。運動ニ
ューロンなどの他のニューロン集団もまた、静脈内注射によって処置することが
できるが、脳脊髄液への直接的な注射もまた、代わりの経路として考えられてい
る。
【００３６】 細胞は、ミエリン生成を促進させるかまたは脱鞘を防止するために、上記の方
法で、インビボ、エクスビボまたはインビトロで処置することができる。ＭＳ、
急性播種性白質脳症、脳および／または脊髄への障害、進行性多中心性白質脳症
、異染性白質萎縮症、副腎白質萎縮症および未熟児の白質形成異常（脳室周囲の
白質軟化）を含む神経繊維の脱鞘をもたらす疾患は、このような疾患により冒さ
れた細胞に本発明の神経栄養性ペプチドを投与することによって、その進行を遅
くすることができ、あるいは止めることができる。
【００３７】 本発明の組成物は、神経栄養因子およびミエリン促進物質の効果を研究するた
めの研究用具としてインビトロで使用することができる。しかし、より実用的に
は、それらは、インビトロで神経細胞の増殖を容易にし、そして維持するために
実験室試薬および細胞増殖培地の成分として直ちに使用される。
【００３８】 本発明のペプチドは、この分野でよく知られている自動化された固相プロトコ
ルを使用し、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ）４３０型ペプチド合成機で合成することができる。すべてのペプチドは
、使用前に、バイダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ４カラムでの高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）によって９５％を超える程度に精製された。
【００３９】 下記の実施例は、単なる例示であり、本発明の範囲を限定することを意図しな
い。
【００４０】 （実施例１） 軸索突起の成長の刺激 ＮＳ２０Ｙ神経芽腫細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭ
ＥＭで増殖させた。細胞を、トリプシンを用いて取り出し、３０ｍｍペトリディ
ッシュ内のガラス製カバーガラスの上に置床した。２０〜２４時間後に、培地を
、０．５％のＦＣＳおよび０ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、２
ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌまたは８ｎｇ／ｍｌのエフェクターペプチドを含有す
る２ｍｌのＤＭＥＭと交換した。細胞をさらに２４時間培養し、ＰＢＳで洗浄し
て、Ｂｏｕｉｎ溶液（飽和ピクリン酸水溶液／ホルマリン／酢酸の１５：５：１
）で３０分間固定した。固定剤をＰＢＳで除き、軸索突起の成長を位相差顕微鏡
のもとで評価した。細胞直径に等しいか、またはそれよりも長いことが明らかに
認められる１つまたは複数個の軸索突起を示す細胞を陽性と評価した。少なくと
も２００個の細胞を各ディッシュの異なる部分で評価して、軸索突起生成細胞の
割合を求めた。アッセイは二連で行った。
【００４１】 図１および図３に示すように、ＴＸ１４（Ａ）（配列番号４）、ＲＩ化ＴＸ１
４（Ａ）（ペプチドＤ２；配列番号５）、ラット１４ｍｅｒ（配列番号６）、ペ
プチドＤ４（配列番号７）、およびペプチドＤ５（配列番号８）はすべて、ＮＳ
２０Ｙ細胞における軸索突起の成長を誘導した。軸索突起の成長の増大は、０．
５ｎｇ／ｍｌもの少量のペプチドを使用しても明らかであった。Ｄ２、ラット１
４ｍｅｒおよびＴＸ１４（Ａ）は、８ｎｇ／ｍｌで同じ程度に軸索突起の成長を
刺激したが、Ｄ２は、ＴＸ１４（Ａ）よりもわずかに効果的であった。このこと
は、これらのＲＩペプチドが神経栄養活性を有していることを示している。
【００４２】 （実施例２） 細胞死の防止 ＮＳ２０Ｙ細胞を、実施例１に記載されているようにガラス製カバーガラス上
に置床し、０．５％のウシ胎児血清で、２日間、８ｎｇ／ｍｌのエフェクターペ
プチドの存在下または非存在下で増殖させた。培地を除き、そして０．２％のト
リパンブルーを含むＰＢＳを各ウエルに加えた。青く染色された死細胞を、倒立
顕微鏡で、各ウエルの４領域において４００個の細胞を計数して細胞総数の割合
として評価した。二連での平均誤差は±５％であった。図２に示すように、ＴＸ
１４（Ａ）およびＤ２はともに、トリパンブルー陽性（死）細胞の数を約５０％
減少させた。このことは、このＲＩペプチドおよび野生型ペプチドはともに、細
胞死から神経細胞を保護し得ることを示している。
【００４３】 （実施例３） エクスビボでの軸索突起成長の促進 後根神経根を成体ラットから摘出して、感覚ニューロンをＫｕｆｆｅｒ他（Ｊ
．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２５：１２６７〜１２８２、１９９４）の記載に従って
調製した。ニューロンを０．５ｎｇ／ｍｌのペプチド１５−２またはペプチドＤ
２で処置した。処置の３日後、最も長く突き出た軸索突起の長さをマイクロメー
ターグリッドで測定した。ペプチドＤ５で処置したニューロンでの最も長い軸索
突起は、コントロール（非ＲＩ）ペプチド（１５−２）で処置したニューロンの
軸索突起または未処置のコントロールでのニューロンの軸索突起よりも約３倍長
かった（図４）。４８時間の処置後、すべての細胞は、過度な枝分かれが認めら
れた神経栄養因子（ＮＧＦ）と類似するように応答した。これらの結果は、ペプ
チドＤ５は感覚ニューロンの分化を促進することを示している。
【００４４】 （実施例４） 注射後のペプチドＤ４の局在化および完全性 ペプチドＤ４（配列番号７）を製造者の指示（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に従って 125Ｉで末端のチロシン残基を
ヨウ素化し、そしてＰＢＳ中で２００μｇ／ｋｇを成体の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−
Ｄａｗｌｅｙラットに筋肉内注射した。２０分後、ラットに麻酔をし、ＰＢＳで
灌流し、そして臓器を摘出して、ガンマーカウンターで計数した。下記の結果は
、ｃｐｍをｎｇ単位に変換した後の各組織におけるＤ４の組織１ｇあたりのｎｇ
数を示す（表１）。脳内濃度は、インビトロで求められた神経細胞に必要な神経
栄養用量よりも約２０倍高い。
【００４５】 別の研究において、脳、肝臓、肺および腎臓の一部を注射の６０分後に採取し
て、ＨＰＬＣ分析（バイダックＣ４カラム）を行い、脳、血液および腎臓におけ
るペプチドの完全性（無傷性）を調べた。ペプチドＤ４は、これらの臓器におい
て９５％が無傷であった。このことは、このペプチドがインビボで６０分後も安
定であることを示している。 125Ｉ−Ｄ４を注射した６０分後の脳、血液および
腎臓に存在するペプチドＤ４の量を図５に示す。１６分におけるピークは無傷の
Ｄ４であり；分解産物のピークが４分に現れている。これらの結果は、Ｄ４がイ
ンビボで安定であり、そして治療効果を発揮するのに十分な量で血液脳関門を通
過することを示している。インビトロ研究によって、１５分の暴露が、軸索突起
の成長を誘導し、そして神経細胞を死から救うのに十分であることが明らかにさ
れている。
【００４６】
【表１】 ───────────────────────────────── 組織 ２０分後の１ｇ湿重量あたりの 125Ｉ−Ｄ４（ｎｇ） ───────────────────────────────── 脳 ２．７ 坐骨神経 ３７９ 肺 １３０ 心臓 ３５ 肝臓 １９ 脾臓 ５８ 腎臓 ８００ 骨格 尿 無傷 血清 無傷 ─────────────────────────────────。
【００４７】 （実施例５） ラットモデルにおける脱髄の回復 実験的なアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ヒトの多発性硬化症（ＭＳ）の
ラットモデルである。ラットにおいて、ＥＡＥは、外部タンパク質（モルモット
の脊髄）を注射することによって誘導され、そのような注射によって、１１日後
に白質の炎症および脱髄が生じる。この脱髄は、活発に脱髄しているヒトのＭＳ
病変において見られる脱髄に類似している（Ｌｉｕ他、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃ
ｌｅｒｏｓｉｓ、１：２〜９、１９９５）。
【００４８】 ＥＡＥは、モルモットの脊髄および完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の
エマルションを注射することによってＬｅｗｉｓラットにおいて誘起された。弱
くなったことが明らかになった１４日目に、Ｄ５（配列番号８）による処置（２
００μｇ／ｋｇ筋肉内）を開始して、８日間毎日続けた。６匹のラットには賦形
剤のみを注射した。筋肉の弱さの尺度である歩幅を１４日目および２２日目に評
価した。さらに、２２日目の脊髄における１ｍｍ2 あたりの脱髄性病変（プラー
ク）の数および大きさを評価した。最後に、ミエリン分解のマーカーである脳内
コレステロールエステルの量を２２日目に評価した。結果を図６〜図１１に示す
。
【００４９】 図６に示すように、両群の歩幅は１４日目に減少した。これに対して、８日間
の処置を行った後では、Ｄ５で処置した動物は正常に戻ったが、賦形剤で処置し
た動物は回復しなかった（ｐ＜０．０１８）。図７に示すように、コレステロー
ルエステル含有量の著しい減少が処置群の脳で認められた。さらに、図８および
図９に示すように、脊髄病変の数は、Ｄ５による処置を１０日間行った後で７０
％減少した。最後に、図１０および図１１に示すように、病変の平均的な大きさ
は約７０％減少した。コントロール動物群および実験動物群の間には体重減少の
差はなかった。これらの結果は、Ｄ５による全身的な処置の後での著しい臨床的
で生物学的かつ形態学的なＥＡＥの回復を示している。この作用は、ミエリン修
復に直接作用しない現在のＭＳ薬の抗炎症性効果とは異なる。
【００５０】 （実施例６） エクスビボミエリン形成アッセイ 新生児マウスの小脳外植片をＳａｔｏｍｉ（Ｚｏｏｌ．Ｓｃｉ．９：１２７〜
１３７、１９９２）に従って調製する。軸索突起の成長およびミエリン形成を、
培養状態において２２日間にわたり観測する。この期間中、新生児マウスの小脳
は、ニューロンが正常に分化し、そしてミエリン形成が始まる。Ｄ２、Ｄ３、Ｄ
４、Ｄ５、または配列番号１２を含む別のペプチドを、外植片を調製した２日後
に添加した（３つのコントロール外植片および３つの処置した外植片）。軸索突
起の成長およびミエリン形成を、ビデオカメラを取り付けた明視野顕微鏡のもと
で評価する。サポシンＣを約１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの間の濃度で陽性コ
ントロールとして使用する。ミエリン形成は、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、または
配列番号１２を含む別のペプチドによって、サポシンＣの場合と同じような程度
に刺激される。
【００５１】 あるいは、ミエリン形成は、下記に記載されるように、ミエリンに専ら存在す
るスルホリピッドへの35Ｓの取り込みによって評価することができる。
【００５２】 （実施例７） 35Ｓのスルホリピッドへの取り込み 初代のミエリン含有Ｓｃｈｗａｎ細胞を、35Ｓ−メチオニンおよびＤ２、Ｄ３
、Ｄ４、Ｄ５、または配列番号１２を含む別のペプチドの添加を伴った０．５％
のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する低硫酸塩培地（ＤＭＥＭ）にて４８時間イ
ンキュベーションした。サポシンＣを陽性コントロールとして使用する。細胞を
ＰＢＳで洗浄して集めて、１００μｌの蒸留水中で超音波処理する。細胞溶解物
の一部をタンパク質分析のために取り、そして残りを５ｍｌのクロロホルム／メ
タノール（２：１、ｖ／ｖ）で抽出する。脂質抽出物をクロマトグラフィー処理
して、記載（Ｈｉｒａｉｗａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．、９４：４７７８〜４７８１）に従って抗スルファチドモノクローナル
抗体で免疫染色する。同じような量のスルファチドが、Ｄ２、または配列番号１
２を含むペプチド、およびサポシンＣによる処置を行った後で認められる。
【００５３】 （実施例８） 外傷性虚血性ＣＮＳ障害におけるＲＩペプチドの使用 脳または脊髄に対する外傷性障害を有するヒトに、約１００μｇ／ｍｌのペプ
チドＤ２、ペプチドＤ３、ペプチドＤ４、ペプチドＤ５、または配列番号１２を
含む別のペプチドを、滅菌した生理食塩水またはデポ剤形態で全身的な注射によ
って投与する。改善を感覚神経または運動神経の機能（すなわち、四肢の運動性
の増大）の回復によって評価する。処置を、それ以上の改善が生じなくなるまで
続ける。
【００５４】 （実施例９） 脱髄性疾患の処置におけるＲＩペプチドの使用 初期段階のＭＳを有する患者に、ペプチドＤ２、ペプチドＤ３、ペプチドＤ４
、ペプチドＤ５、または配列番号１２を含む別のペプチドを、実施例８の場合と
同じ用量範囲を使用して全身的な注射によって投与する。投薬を毎日あるいは毎
週繰り返えす。筋肉強度、筋格骨協調およびミエリン形成（ＭＲＩにより測定）
の改善を観測する。慢性の再発性ＭＳを有する患者を、再発したときに同じよう
に処置する。
【００５５】 （実施例１０） Ｃｈｕｎｇモデルラットにおける神経障害痛の緩和 この実施例は、末梢の神経障害痛のＣｈｕｎｇ実験モデルにおけるペプチドＤ
２、ペプチドＤ３、ペプチドＤ４、ペプチドＤ５、または配列番号１２に示す配
列を含む別のペプチドのボーラスくも膜下内注射の効果を明らかにする。４つの
ペプチドをそれぞれ化学的に合成し、精製し、滅菌ＰＢＳに溶解して、中性ｐＨ
に緩衝化する。Ｋｉｍ他（Ｐａｉｎ、５０：３５５〜３６３、１９９２）によっ
て以前に記載された手術手順を雄性ラットに行い、異痛性状態を誘導する。脊髄
カテーテルを手術の２週間後に導入する。その５日後、ペプチドを、０．００７
μｇ／ラット、０．０７μｇ／ラットおよび０．７μｇ／ラットで投与する。次
いで、最低圧力値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を、校正されたｖ
ｏｎ Ｆｒｅｙ毛を使用して測定する。加えた圧力に応答して動物が肢を引っ込
めるのに要した時間が長いほど、神経障害痛は重症ではない。これらのペプチド
は最低圧力値を著しく増大させる。このことは、神経障害痛の著しい軽減を示す
。
【００５６】 本発明は、詳細な説明において記載されたそのような実施形態のみに限定され
ないことに留意しなければならない。本発明の精神を保持する任意の実施形態は
、本発明の範囲に含まれると見されるものとする。しかし、本発明は、添付の請
求項によって限定されるのみである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、下記のペプチドを使用するＮＳ２０Ｙ神経芽腫の軸索突起成長アッセ
イを示す：ＴＸ１４（Ａ）ペプチド（ＴＸＬＩＤＮＮＡＴＥＥＩＬＹ；Ｘ＝Ｄ−
アラニン；配列番号４）、レトロインバース化ＴＸ１４（Ａ）（ペプチドＤ２；
ＹＬＩＥＥＴＡＮＮＤＩＬＡＴ、すべてがＤ−アミノ酸；配列番号５）、および
サポシンＣの活性配列に由来するラット１４ｍｅｒ（ＳＥＬＩＮＮＡＴＥＥＬＬ
Ｙ；配列番号６）。
【図２】 図２は、ＮＳ２０Ｙ神経芽腫細胞を使用する細胞死アッセイを示す。ＮＳ２０
Ｙ細胞を、エフェクターペプチドの存在下または非存在下の低血清状態で４８時
間増殖させた。死細胞をトリパンブルー染色によって同定した。
【図３】 図３は、ペプチドＤ４（ＹＬＬＥＥＴＡＮＮＤＬＬ、すべてがＤ−アミノ酸；
配列番号７）およびペプチドＤ５（ＬＬＥＥＴＡＮＮＤＬＬ、すべてがＤ−アミ
ノ酸；配列番号８）を使用するＮＳ２０Ｙ神経芽腫の軸索突起成長アッセイを示
す。
【図４】 図４は、エクスビボの成体ラットの感覚性軸索突起成長に対するペプチドＤ５
およびペプチド１５−２（ＴＸＬＩＤＮＮＫＴＥＫＥＩＬＹ、すべてがＤ−アミ
ノ酸；配列番号９）の作用を示す。
【図５】 図５は、成体ラットに筋肉内注射した６０分後のヨウ素化ペプチドＤ４のレベ
ルを示すグラフである。
【図６】 図６は、ペプチドＤ５で処置した動物およびコントロール動物におけるＲｅｗ
ｉｓラットの実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルでの歩幅を示すグラ
フである。
【図７】 図７は、ペプチドＤ５（２００μｇ／ｋｇ）の筋肉内処置を８日間行ったＲｅ
ｗｉｓラットＥＡＥモデルにおける脳内コレステロールエステル含有量を示すグ
ラフである。
【図８】 図８は、ペプチドＤ５（２００μｇ／ｋｇ）の筋肉内処置を８日間行ったＲｅ
ｗｉｓラットＥＡＥモデルにおける個々のラットの脊髄での１ｍｍ２あたりの脱
鞘病変の数を示すグラフである。
【図９】 図９は、ペプチドＤ５（２００μｇ／ｋｇ）の筋肉内処置を８日間行ったＲｅ
ｗｉｓラットＥＡＥモデルにおける１ｍｍ2 あたりの病変の平均数を示すグラフ
である。
【図１０】 図１０は、Ｄ５（２００μｇ／ｋｇ）の筋肉内処置を８日間行ったＲｅｗｉｓ
ラットＥＡＥモデルにおける個々のラットでの病変の大きさを示すグラフである
。
【図１１】 図１１は、Ｄ５（２００μｇ／ｋｇ）の筋肉内処置を８日間行ったＬｅｗｉｓ
ラットＥＡＥモデルにおける個々のラットでの病変の平均的な大きさを示すグラ
フである。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年１２月１０日（１９９９．１２．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ライト，デイビット，イー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92065、ラモナ、ウッドソン ヴュー レ ーン、 17140 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA07 BA19 BA50 CA18 MA24 MA44 MA52 MA56 MA66 MA70 NA12 ZA022 ZA082 4H045 AA10 AA30 BA16 BA17 BA18 BA19 CA40 EA21 FA51

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む１１個〜約４０
    個の間のアミノ酸を有するペプチド。
  2. 【請求項２】 前記ペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８およ
    び配列番号１１に示される配列から選択される配列を有する、請求項１に記載の
    ペプチド。
  3. 【請求項３】 前記ペプチドは、アミノ末端またはカルボキシ末端で、ある
    いはアミノ末端およびカルボキシ末端の両方で、ＣＨ3 ＣＯ、ＣＨ3 （ＣＨ2 ） n ＣＯ、Ｃ6 Ｈ5 ＣＨ2 ＣＯ、およびＨ2 Ｎ（ＣＨ2 ）n ＣＯ（ただし、ｎ＝１
    〜１０）からなる群から独立的に選択される基により修飾される、請求項１に記
    載のペプチド。
  4. 【請求項４】 前記ペプチドは、Ａｓｎ７またはα−アミノ基でグリコシル
    化されている請求項１に記載のペプチド。
  5. 【請求項５】 前記ペプチドの１つまたは複数のアミド結合が還元されてい
    る、請求項１に記載のペプチド。
  6. 【請求項６】 前記ペプチドの１つまたは複数の窒素がメチル化されている
    、請求項１に記載のペプチド。
  7. 【請求項７】 前記ペプチドの１つまたは複数のカルボン酸基がエステル化
    されている、請求項１に記載のペプチド。
  8. 【請求項８】 軸索突起形成を刺激するか、あるいは神経細胞死を防止する
    ための方法であって、神経細胞を、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む
    １１個〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドの軸索突起形成または神経細
    胞死防止に効果的な量を含む組成物と接触させる工程を含む方法。
  9. 【請求項９】 前記神経細胞は神経芽腫細胞である、請求項８に記載の方法
    。
  10. 【請求項１０】 前記神経芽腫細胞はＮＳ２０Ｙ細胞である、請求項９に記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記ペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８お
    よび配列番号１１に示される配列から選択される配列を有する、請求項９に記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】 ミエリン形成を刺激するか、または脱髄を防止するための
    方法であって、神経細胞を、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む１１個
    〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドのミエリン形成刺激または脱髄阻害
    に効果的な量を含む組成物と接触させる工程を含む方法。
  13. 【請求項１３】 前記ペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８お
    よび配列番号１１に示される配列から選択される配列を有する、請求項１２に記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】 痛みの処置を必要とする哺乳動物において痛みを処置する
    ための方法であって、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む１１個〜約４
    ０個の間のアミノ酸を有するペプチドを含む組成物の痛み処置に効果的な量を前
    記哺乳動物に投与する工程を含む方法。
  15. 【請求項１５】 前記ペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８お
    よび配列番号１１に示される配列から選択される配列を有する、請求項１４に記
    載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記投与工程は、静脈内、肺的、くも膜下内、筋肉内、皮
    内、皮下、頭蓋内、硬膜外、局所的および経口的からなる群から選択される、請
    求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 薬学的に受容可能なキャリアに、配列番号１２に示される
    配列を含む１１個〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドを含む薬学的組成
    物。
  18. 【請求項１８】 制御放出配合物である、請求項１７に記載の組成物。
  19. 【請求項１９】 リポソーム形態である、請求項１７に記載の組成物。
  20. 【請求項２０】 凍結乾燥された形態である請求項１７に記載の組成物。
  21. 【請求項２１】 単位投薬形態である、請求項１７に記載の組成物。
  22. 【請求項２２】 ミエリン形成の刺激または脱髄の阻害を必要とする哺乳動
    物において、ミエリン形成を刺激するか、または脱髄を防止するための方法であ
    って、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む１１個〜約４０個の間のアミ
    ノ酸を有するペプチドのミエリン形成刺激または脱髄阻害に効果的な量を含む組
    成物を前記哺乳動物に投与する工程を含む方法。
  23. 【請求項２３】 前記ペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８お
    よび配列番号１１に示される配列から選択される配列を有する、請求項２２に記
    載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記投与工程は、静脈内、肺的、くも膜下内、筋肉内、皮
    内、皮下、頭蓋内、硬膜外、局所的および経口的からなる群から選択される、請
    求項２２に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 １１個〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドであっ
    て、軸索突起形成を刺激するか、または神経細胞死を防止するための、配列番号
    １２に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
  26. 【請求項２６】 前記ペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８お
    よび配列番号１１に示される配列から選択される配列を有する、請求項２５に記
    載のペプチド。
  27. 【請求項２７】 １１個〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドであっ
    て、ミエリン形成を刺激するか、または脱髄を防止するための、配列番号１２に
    示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
  28. 【請求項２８】 前記ペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８お
    よび配列番号１１に示される配列から選択される配列を有する、請求項２７に記
    載のペプチド。
  29. 【請求項２９】 １１個〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドであっ
    て、痛みの処置を必要とする哺乳動物において痛みを処置するための、配列番号
    １２に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
  30. 【請求項３０】 前記ペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８お
    よび配列番号１１に示される配列から選択される配列を有する、請求項２９に記
    載の使用。
  31. 【請求項３１】 １１個〜約４０個の間のアミノ酸を有するペプチドであっ
    て、ミエリン形成の刺激または脱髄の阻害を必要とする哺乳動物において、ミエ
    リン形成を刺激するか、または脱髄を防止するための、配列番号１２に示される
    アミノ酸配列を含むペプチド。
  32. 【請求項３２】 前記ペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８お
    よび配列番号１１に示される配列から選択される配列を有する、請求項３１に記
    載の使用。
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