JP2003502343A

JP2003502343A - インターロイキン−６から誘導されるレトロ−インベルソペプチド

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Publication number: JP2003502343A
Application number: JP2001503890A
Authority: JP
Inventors: イー．ライト，デイビッド; パークス，ディー．エリオット
Original assignee: マイアロスコーポレイション
Priority date: 1999-06-16
Filing date: 2000-06-16
Publication date: 2003-01-21
Anticipated expiration: 2020-06-16
Also published as: WO2000077033A1; EP1183267A1; CA2376479A1; AU6540500A; JP4786843B2; IL147094A; IL147094A0; EP1183267A4; IL190034A0

Abstract

(57)【要約】１７〜約４０アミノ酸をもち、かつ、配列番号Ｌに示す配列を含むインターロイキン−６（ＩＬ−６）由来のレトロ−インバーソ・ペプチド。これらのペプチドは、ＩＬ−６と同一の活性を有し、そしてまた神経栄養活性を有する。上記ペプチド内のＤ−アミノ酸結合に因り、それらは、インビボにおけるタンパク質溶解性分解に対する感受性が低い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、インターロイキン-6(IL-6)から誘導されるレトロ-インベルソ(retr
o-inverso)ペプチドに関する。これらのペプチドは、本来の親タンパク質と同様
の活性を有し、また神経栄養活性を有する。

【０００２】発明の背景サイトカインは、天然および特異的免疫のエフェクター相中に製造され、免疫
および炎症応答を仲介しかつ調節するように働くタンパク質である。サイトカイ
ンは、他のポリペプチドホルモンのように、標的細胞の表面上の特異的レセプタ
ーに結合することによってその作用を開始する。サイトカインの最もよく知られ
ている族の１つは、天然の免疫を仲介するインターロイキンである。インターロ
イキンの構造および機能の詳細な記載については、アバス(Abbas)ら、細胞およ
び分子の免疫学(Cellular and Molecular Immunology), W.B.サンダース社(Saun
ders Company)、フィラデルフィア、pp.225-243、1991参照。

【０００３】 IL-6は、リンパ様と非リンパ様細胞の両者により生産され、そして免疫応答、
急性反応、及び造血を調節する、26kDaの分子量をもつ多機能サイトカインであ
る。このサイトカインの構造および機能の詳細な概説は、ザサイトカインハ
ンドブック(The Cytokine Handbook）、第３版、トムソン(Thomson),A.編、アカ
デミックプレス(Academic Press)、サンディエゴ、CA、1998、及びBarton, Cl
in. Immunol. Immunopathol. 85 : 16-20, 1997に見出すことができる。

【０００４】多くの細胞がIL-6を産生し、かつこれに応答することができるので、それは、
多くの系において成長及び／又は分化のオートクリン調節物質であることができ
る。免疫系内では、それは、部分的に、IL-2を介して仲介される末梢Ｔ及びNK細
胞のオートクリン活性化物質であることが示されている（Garman et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 : 7629-7633）。胸腺発育過程においては、IL-6
は、胸腺発達においてIL-2、IL-4、及びIL-7とともに重要であることができる。
IL-6も、活性化されたＢ細胞によるIgG分泌を促進させる。さらに、IL-6は、肝
臓が、急性タンパク質、例えば、Ｃ−反応性タンパク質を生産することを誘導し
、そしてアルブミンの生産を阻害する（Morrone et al., J. Biol. Chem. 263 :
12554-12558, 1988）。

【０００５】 IL-6は、Ｔ細胞活性化、増殖、及び分化にも関わる。IL-6は、１のＴ細胞系（
Noma et al., 1987）及び胸腺細胞内でのIL-3レセプター（Tac抗原）発現を誘導
し、そしてＴ細胞によるIL-2生産のための第２のシグナルとして作用する（Garm
an et al., 1987）。IL-6は、PHAにより刺激されたヒトＴ細胞又はマウス末梢Ｔ
細胞の増殖を促進させる。

【０００６】 IL-6は、インビトロ及びインビボにおいて、LPS誘導IL-1及びTNFの合成を含む
いくつかの重要な炎症応答をも阻害する（Aderka et al., J. Immunol. 143 : 3
517-3523, 1989 ; Ulich et al., J. Immunol. 146 : 2316-2323, 1991）。IL-6
は、肺炎症の疾患モデルにおける肺損傷に対して保護することも発見されている
（Chen et al., Infect, Immun. 61 : 97-102, 1993）。

【０００７】ニューロトロフィン(neurotrophin)および神経栄養因子は、神経細胞母集団の
生存、標的神経支配および／または機能に影響を及ぼすことができるタンパク質
またはペプチドである（バルデ(Barde)、Neuron, 2:1525-1534, 1989）。ニュー
ロトロフィンのインビボ(in vivo)およびインビトロ(in vitro)での効力は
よく証明されている。例えば、毛様神経栄養因子(ciliary neurotrophic factor
)(CNTF)は、鶏の胚毛様神経節(ciliary ganglia)の生存をインビトロ(in vitr
o)で助長し、培養した交感神経、感覚および脊髄運動ニューロンの生存を助ける
（イプ(Ip)ら、J. Physiol. Paris, 85:123-130, 1991）。

【０００８】ペプチドのインビボ(in vivo)での治療上の使用に対する主な障害は、それ
らがタンパク質分解を受けやすいことである。レトロ-インベルソペプチドは、
配列の方向が逆（レトロ）で、各アミノ酸のキラリティー（DまたはL）が逆にさ
れた（インベルソ）、線状ペプチドの異性体である。幾つかのペプチド結合だけ
が逆にされており、逆にされた部分におけるアミノ酸残基のキラリティーが逆に
された、線状ペプチドの部分的に修飾されたレトロ-インベルソ異性体がまたあ
る。そのようなペプチドの主な利点は、タンパク質分解に対する改善された抵抗
性の故に、それらのインビボ(in vivo)での高められた活性である（概説のた
めには、チョレフ(Chorev)ら、Trends Biotech., 13:438-445, 1995参照）。そ
のようなレトロ-インベルソ類似体は、増加された代謝安定性を示すが、それら
の生物活性はしばしば大きく妥協される（ギチャード(Guichard)ら、Proc. Natl
. Acad. Sci. U.S.A. 91:9765-9769, 1994）。例えば、リッチマン(Richman)ら
（J. Peptide Protein Res., 25:648-662）は、Gly³-Phe⁴アミド結合において修
飾された線状および環状のリューエンケファリンの類似体は、本来のリューエン
ケファリンの6〜14％の範囲の活性を有することを決定した。チョレフ(Chorev)
ら（同書）は、ビトロネクチン(vitronectin)のそのレセプターへの結合を阻害
するペプチドのレトロ-反転が、50,000倍だけ親異性体より効かない１つのペプ
チドおよび、親環状ペプチドより4,000倍効く別のペプチドをもたらすことを示
した。ギチャード(Guichard)ら（TIBTECH 14, 1996）は、レトロ-インベルソ（
すべてD-レトロ）抗原擬態性が、ランダムコイル、ループまたは環状の配座のペ
プチドを用いてしか生じ得ないことを教示する。「らせん形」のペプチドの場合
には、抗原擬態性を査定するのに使用される溶媒条件下で、らせん性が実際に不
在でありさえしなければ、適切な機能の擬態性が期待される。

【０００９】生物活性を保持しながら、増加された代謝安定性を示す、IL-6誘導の神経栄養
ペプチドについての必要性がある。

【００１０】発明の概要本発明の１つの実施態様は、17〜約40個のアミノ酸を有する分離されたレトロ
-インベルソペプチドであり、該ペプチドはSEQ ID NO:1で示される配列を含む。
この好ましい実施態様の１つの態様においては、該配列の少なくとも１つの塩基
性に荷電したアミノ酸が、別の塩基性に荷電したアミノ酸で置換される。この好
ましい実施態様の別の態様においては、該配列の少なくとも１つの酸性に荷電し
たアミノ酸が、別の酸性に荷電したアミノ酸で置換される。有利には、該配列の
少なくとも１つの非極性アミノ酸が、別の非極性アミノ酸で置換される。好まし
くは、該配列の少なくとも１つの非荷電アミノ酸が、別の非荷電アミノ酸で置換
される。この好ましい実施態様の別の態様においては、該配列の少なくとも１つ
の芳香族アミノ酸が、別の芳香族アミノ酸で置換される。有利には、ペプチドが
、アミノ末端、カルボキシ末端またはアミノ末端とカルボキシ末端の両方にて、
CH₃CO、CH₃(CH₂)_nCO、C₆H₅CH₂COおよびH₂N(CH₂)_nCO（n=1〜10）からなる群より
独立して選択される部分で修飾される。好ましくは、ペプチドはグリコシル化さ
れている。この好ましい実施態様の別の態様においては、ペプチドの１つ以上の
アミド結合が還元されている。好ましくは、該ペプチド中の１つ以上の窒素がメ
チル化されている。この好ましい実施態様のなお別の態様においては、ペプチド
中の１つ以上のカルボン酸基がエステル化されている。好ましくは、ペプチドは
、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有する。

【００１１】本発明の他の態様は、約17〜約40アミノ酸をもつレトロ−インバーソ・ペプチ
ド、及び医薬として許容される担体を含む組成物であって、上記ペプチドが、配
列番号１に示す配列を含むものである。

【００１２】本発明はまた、必要とする哺乳動物において、軸索生長または髄鞘形成を促進
する方法を提供し、この方法は、哺乳動物に、軸索生長または髄鞘形成を促進す
るのに有効な量の、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列
を含むレトロ-インベルソペプチドを含む組成物を投与する段階を含む。好まし
くは、ペプチドはSEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有する。有利には、哺
乳動物はヒトである。この好ましい実施態様の１つの態様においては、投与段階
は、直接局所注入、全身、頭蓋内、脳脊髄内、局所または経口である。

【００１３】本発明はまた、Ｔ細胞活性化を促進させる方法を提供し、この方法は、Ｔ細胞
を、Ｔ細胞活性化促進有効量の、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で
示される配列を含むレトロ-インベルソペプチドを含む組成物と接触させること
を含む。

【００１４】本発明の別の態様においては、哺乳動物において軸索生長または髄鞘形成を促
進するのに使用するための、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示さ
れる配列を含むレトロ-インベルソペプチドが提供される。好ましくは、ペプチ
ドはSEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有する。好ましい態様の１の局面に
おいては、哺乳動物はヒトである。

【００１５】本発明はまた、その必要な哺乳動物におけるＴ細胞活性化の促進に使用するた
めの、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むレトロ-
インベルソペプチドを提供する。好ましくは、ペプチドはSEQ ID NO:1で示され
る配列を有する。有利には、上記哺乳動物はヒトである。

【００１６】本発明のさらに別の実施態様は、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1
で示される配列を含むレトロ-インベルソペプチドを、必要とする哺乳動物にお
いて、軸索生長または髄鞘形成を促進するための薬剤の製造に使用することであ
る。好ましくは、ペプチドはSEQ ID NO:1で示される配列を有する。有利には、
哺乳動物はヒトである。

【００１７】本発明はまた、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を
含むレトロ-インベルソペプチドを、必要とする哺乳動物において、Ｔ細胞活性
化を促進させるための薬剤の製造に使用することを提供する。好ましくは、ペプ
チドはSEQ ID NO:1で示される配列を有する。有利には、哺乳動物はヒトである
。

【００１８】好ましい実施態様の詳細な説明本発明は、免疫応答、急性反応、及び造血の調節を含む天然IL-6と同様の効果
を仲介する、インターロイキン-6(IL-6)から誘導されるレトロ-インベルソ(RI)
ペプチドを提供する。「から誘導される」という語は、ペプチドが、インターロ
イキン-6または以下に定義するその類似体の活性領域を含むことを示す。

【００１９】また、これらのRI IL-6由来ペプチドは、末梢Ｔ及びNK細胞を活性化し、活性
化されたＢ細胞によるIgG分泌を促進させ、肝臓が急性タンパク質を生産するこ
とを誘導し、ヒトＴ細胞の増殖を促進させ、そしてリポ多糖(LPS)-誘導IL-1及び
腫瘍壊死因子(TNF)の合成を含む炎症応答を阻害する。これらのRI IL-6由来ペ
プチドも、肺炎症における肺損傷に対して保護する。

【００２０】これらのペプチドはまた、末梢神経および中枢神経系に対する、毒性の、外傷
性の、虚血性の、変性の、かつ受け継がれた障害後の機能回復を促進することに
おいて、治療上の用途を有する。これらのペプチドはまた、増加された髄鞘形成
を促進し、かつ脱髄疾患の影響を打ち消すために有用である。これらのIL-6由来
ペプチドは、天然IL-6と同様の効果の仲介においても有用である。特定のレトロ
-インベルソペプチドの親ペプチドと同様の効果を仲介する能力は、以下の実施
例に記載された標準のIL-6アッセイを用いて、当業者が決定することができる。
これらのペプチドの使用は種々の疾患の治療を容易にする。というのは、それら
は、本来のサイトカインまたは組換えサイトカインより安定であり、かつ合成が
容易であるからである。

【００２１】本発明の特定のRI IL-6-誘導ペプチドおよび、それが誘導される親タンパク
質を表１に示す。

【００２２】

【表１】

【００２３】先に論じたように、これらRI IL-6-誘導ペプチドは、対応する全長のIL-6タ
ンパク質と同じ活性を有し、また神経栄養および髄鞘栄養(myelinotrophic)活性
を有する。本発明の１つの実施態様は、Ｔ細胞活性化有効量の、17〜約40個のア
ミノ酸を有しかつSEQ ID NO:1で示されるRIペプチドまたは同様の活性を有する
その類似体を含むRIペプチドを、Ｔ細胞に投与することによる、Ｔ細胞活性化の
促進方法である。

【００２４】そのような類似体としては、例えば１個以上のリシンおよび／またはアルギニ
ン残基のアラニンまたは別のアミノ酸での置換；１個以上のリシンおよび／また
はアルギニン残基の欠失；１個以上のチロシンおよび／またはフェニルアラニン
残基の置換；１個以上のフェニルアラニン残基の欠失；ならびにペプチド内の１
個以上のアミノ酸の保存的置換を含む。リシン／アルギニンおよびチロシン／フ
ェニルアラニン残基の置換または欠失は、トリプシンおよびキモトリプシンそれ
ぞれによるペプチド分解の受けやすさを減らす。

【００２５】本発明における使用のために企図されるこれらのペプチド配列の別の変更は、
重要でない挿入および欠失を含む。保存的アミノ酸置換が企図される。そのよう
な置換は、例えば、それらの側鎖の化学的性質に関連したアミノ酸の族内で生じ
る置換である。アミノ酸の族としては、塩基性に荷電したアミノ酸（リシン、ア
ルギニン、ヒスチジン）；酸性に荷電したアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミ
ン酸）；非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリ
ン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；非荷電の極性アミノ酸
（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チ
ロシン）；ならびに芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよび
チロシン）を包含する。特に、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの分離し
た置換または、アスパラギン酸のグルタミン酸での分離した置換または、スレオ
ニンのセリンでの分離した置換または、アミノ酸の構造的に関連のあるアミノ酸
での同様の保存的置換からなる保存的アミノ酸置換は、ペプチドの特性に大きな
影響を与えないことが、一般に受け入れられる。SEQ ID NO:1で示される配列を
含む任意のRIペプチドまたはその挿入物、欠失物または置換物の、軸索生長、髄
鞘形成、脱髄逆転および神経細胞死の阻止を促進する能力は、以下に示される実
施例において提供されるアッセイを用いて決定することができる。

【００２６】種々の化学的修飾は、安定性、生物活性およびペプチドの血液脳障壁(blood b
rain barrier)を越える能力を改善する。１つのそのような修飾は、脂肪族また
は芳香族の酸の誘導体での脂肪族アミノ末端修飾であり、アミド結合を形成する
。そのような誘導体としては、例えばCH₃CO、CH₃(CH₂)_nCO（n=1〜10）、C₆H₅CH₂ COおよびH₂N(CH₂)_nCO（n=1〜10）を包含する。別の修飾は、アミド／エステル結
合によりペプチドに結合される、脂肪族または芳香族アミン／アルコールの誘導
体でのカルボキシ末端修飾である。そのような誘導体としては先に挙げたものを
包含する。ペプチドはまた、アミノ末端およびカルボキシ末端の修飾の両方を有
することができ、誘導体は、先に挙げたものから独立して選択される。ペプチド
はまたグリコシル化されることができ、アルファアミノ基もしくはD-Asnまたは
その両方が、グルコースまたはガラクトースで修飾される。別の企図される修飾
においては、選択された主鎖アミド結合が還元される（NH-CH₂）。他の修飾とし
ては、アミド結合における選択された窒素のN-メチル化および、ペプチド上の酸
基の少なくとも１つが芳香族または脂肪族のエステルとして修飾されるエステル
化を含む。上記修飾の任意の組合せがまた企図される。

【００２７】本発明の別の実施態様は、細胞を、軸索生長促進有効量の、17〜約40個のアミ
ノ酸を有し、そしてSEQ ID NO:1で示される、RI IL-6-誘導ペプチドまたは上記
したのと同様の活性を有するその類似体を含むRIペプチドを投与することによる
、分化しているかまたは分化していない神経細胞における軸索生長を促進する方
法である。

【００２８】任意のそのようなペプチドの軸索生長を刺激する能力は、以下の実施例１〜９
に記載された方法を用いて、当業者が容易に決定することができる。任意の特定
のIL-6-誘導ペプチドの本来のIL-6の同じ活性を仲介する能力は、実施例10〜12
において論じられた親ペプチドについての標準アッセイを用いて決定することが
できる。

【００２９】細胞増殖培地中での神経栄養活性のための、本発明のRIペプチドの典型的最小
量は通常、少なくとも約５ng/mlである。インビトロ(in vitro)での使用のた
めに、この量またはそれ以上の量の本発明のRIペプチドが予想される。典型的に
は、0.1〜約10g/mlの範囲の濃度のこれらのペプチドが使用される。任意の特定
の組織のための有効量は、実施例１にしたがって決定することができる。

【００３０】Ｔ細胞、Ｂ細胞または神経細胞は、本発明のRIペプチドを細胞に直接投与する
ことによって、インビトロ(in vitro)またはイクスビボ(ex vivo)で処置さ
れることができる。これは、例えば細胞を特定の細胞タイプのために適当な増殖
培地中で培養し、次いでペプチドを培地に添加することによって行うことができ
る。典型的には脊椎動物、好ましくは哺乳動物において、処置されるべき細胞が
インビボ(in vivo)にあるときには、幾つかの技術のうちの１つによって組成
物を投与することができる。最も好ましくは、組成物は、ペプチドの所望の局所
濃度を与えるのに十分な量で、血液中に直接注射される。これらのRIペプチドは
、Dペプチド結合の故に、インビボ(in vivo)で長く持続する。リシンおよびア
ルギニン残基を欠くペプチドにおいては、タンパク質分解が減らされる。より小
さいペプチド（すなわち、50-mer以下）は、血液脳障壁を最も多く越えるようで
あり、CNS疾患の治療のために中枢神経系に入る（バンクス(Banks)ら、Peptides
, 13:1289-1294, 1992参照）。

【００３１】神経疾患の治療のためには、直接頭蓋内注入または脳脊髄流体中への注入をま
た、所望の局所濃度のニューロトロフィン(neurotrophin)を与えるのに十分な量
で使用することができる。両方の場合に、製薬上許容される注射用担体が使用さ
れる。そのような担体としては、例えばホスフェート緩衝塩水およびリンゲル溶
液が含まれる。あるいは、直接局所注入または全身投与によって、組成物を末梢
神経組織へ投与することができる。種々の慣用の投与方式が予想され、静脈内、
肺、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、硬膜外、鞘内、局所および経口を含む。局所
投与のための製薬上許容される担体としては、クリーム、ジェル、ペースト、軟
膏、ローション、懸濁液、エマルジョンおよび分散液を含む。

【００３２】本発明のペプチド組成物は、単位投与形態で、例えば注射用組成物または、患
者へ投与される毎日の投与量と等価な投与量での局所調製物で、または制御され
た放出組成物として、包装され、投与されることができる。PBS中または凍結乾
燥解形態で活性成分の毎日の投与量を含む中隔封止されたびんは、単位投与の例
である。好ましい実施態様においては、IL-6効果、例えばＴ細胞活性化を促進す
るため、および神経変性疾患または脱髄疾患の治療のための、脊椎動物の体重に
基づく、本発明のRIペプチドの毎日の全身投与量は、約0.01〜約10,000g/kgの範
囲にある。より好ましくは、毎日の全身投与量は、約0.1〜1,000g/kgである。最
も好ましくは、毎日の全身投与量は、約10〜100g/kgである。局所に投与される
物質の毎日の投与量は、ほぼより少ない大きさのオーダーである。ペプチドが胃
腸内系でのタンパク質分解に抵抗性であるので、経口投与が特に好ましい。

【００３３】本発明の１つの好ましい実施態様においては、ペプチドは局所的に、神経細胞
にインビボ(in vivo)で、その移植により投与される。例えば、ポリ乳酸、ポ
リガラクト酸(polygalactic acid)、再生コラーゲン、多層リポソームおよび多
くの他の慣用の蓄積処方物が、生物学的に活性な神経栄養ペプチド組成物と共に
処方することができる生物侵食性または生物分解性物質を含む。これらの物質は
、移植されると、徐々にこわれ、周囲の組織に活性物質を放出する。生物侵食性
、生物分解性および他の蓄積処方物の使用は、本発明において特に企図される。
注入ポンプ、マトリックス封鎖(entrapment)系および経皮デリバリー装置との組
合せがまた企図される。ペプチドはまた、米国特許第5,529,914号に記載されて
いるように、移植の前に、ポリエチレングリコール等角(conformal)コーティン
グ中に封入されることができる。

【００３４】本発明のペプチドはまた、ミセルまたはリポソーム中に封入されることができ
る。リポソーム封入技術はよく知られている。リポソームは、標的にした組織に
結合することができるレセプター、リガンドまたは抗体の使用によって、特定の
組織、例えば神経組織を標的にし得る。これらの処方物の製造は、当技術分野に
おいてよく知られている（ラディン(Radin)ら、Meth. Enzymol., 98:613-618, 1
983）。

【００３５】目下、神経系の構造完全性の完全な機能再生および回復を促進することができ
る、入手可能な薬剤がない。これは特にCNSの場合に本当である。神経栄養因子
の使用による末梢神経のどのような程度の再生も、本発明の範囲内にある。さら
には、神経栄養因子は、神経母集団または脳の特定領域の変性に関連する神経変
性疾患の治療において治療上有用であり得る。パーキンソン病の主な原因は、黒
質のドーパミン作用性のニューロンの変性である。プロサポシンに対する抗体は
、ヒト脳切片中の黒質のドーパミン作動性ニューロンを免疫組織学的に染色する
ので、本発明のRIペプチドは、パーキンソン病の治療において治療上有用であり
得る。年をとると視野の喪失に至る視覚神経変性疾患である、網膜神経障害がま
た、本発明のRIペプチドを用いて治療可能である。

【００３６】脳のニューロン母集団に到達するために、神経栄養因子は、大脳内に投与され
なければならない、というのは、これらのタンパク質は血液脳障壁を越えないか
らであると長く信じられてきた。米国特許第5,571,787号は、サポシンCから誘導
される、ヨウ素化した神経栄養18-merフラグメントが血液脳障壁を越えることを
開示する。このように、約22個までのアミノ酸を有するRIペプチドがまたこの障
壁を越え、かくして、静脈内投与することができる。他のニューロン母集団、例
えば運動ニューロンは、脳脊髄流体中への直接注入がまた代替経路として想像さ
れるが、これはまた静脈内注射によって処置することができる。

【００３７】細胞は、ミエリン形成を促進するかまたは脱髄を防止するように、インビボ
(in vivo)、イクスビボ(ex vivo)またはインビトロ(in vitro)で、上記した
方法で処置されることができる。神経繊維の脱髄をもたらす疾患［MS、急性転移
性白質脳炎、脳および／または脊髄への外傷、進行性多焦点白質脳炎、異染性白
質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィーおよび未成熟の幼児における白質の
悪展開(maldevelopment)（室周囲白軟化症(periventicular leucomalacia)）を
含む］は、本発明の神経栄養ペプチドを疾患に冒された細胞へ投与することによ
って、遅らせるか、または停止させることができる。

【００３８】本発明のRI IL-6誘導ペプチド組成物はまた、Ｔ細胞活性化を助け、培養され
た運動ニューロンの生存率を高め、かつ神経栄養因子およびミエリン促進物質の
効果を決定するために使用することができる。しかしながら、より実際には、そ
れらは、実験室試薬として、および造血を促進し、神経細胞をインビトロ(in
vitro)で維持するために、細胞増殖培地の成分としての即時用途を有する。

【００３９】本発明のペプチドは、当技術分野でよく知られている自動化された固相プロト
コールを用いて合成される。ペプチドはすべて、使用前に、逆相カラムでの高速
液体クロマトグラフィー(HPLC)により、約95％より上の純度まで精製される。

【００４０】以下の実施例は説明的なものにすぎず、本発明の範囲を限定することを意図し
ない。

【００４１】実施例１軸索生長の刺激 NS20Y神経芽腫細胞を、10％子牛胎児血清(FCS)を含むDMEM中で増殖させる。細
胞をトリプシンで除き、30mmペトリ皿中で、カバーガラス上で培養する。20〜24
時間後、培地を、0.5%FCSおよび0、0.5、1、2、4または8ng/mlのRI IL-6誘導ペ
プチド（17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む）を
含む2mlのDEMEと取り替える。細胞をさらに24時間培養し、PBSで洗浄し、ブワン
溶液(Bouin's solution)（飽和水性ピクリン酸／ホルマリン／酢酸15:5:1）で30
分間固定した。固定液をPBSで除き、位相差顕微鏡下で軸索生長について評点付
けをした。１つの細胞直径以上長いと明らかに定義された１つ以上の軸索を示す
細胞は、正であると評点をつけられた。各皿の異なる部分で、少なくとも200個
の細胞について評点を付けて、軸索を有する細胞のパーセンテージを決定し、ア
ッセイは二重に行った。

【００４２】実施例２細胞死の阻止 NS20Y細胞を実施例１のようにして培養し、８ng/mlのRI IL-6誘導ペプチド（
17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含む）の存在下ま
たは不在下にて0.5％ウシ胎児血清中のカバーグラス上で２日間増殖させる。培
地を除き、PBS中の0.2％トリパンブルーを各ウェルに加える。青色に染色された
死細胞を、倒立顕微鏡にて全体中のパーセンテージとして評点付けをし、各ウェ
ルの４領域で400個の細胞を数える。二重アッセイでの平均誤差は５％であった
。

【００４３】実施例３イクスビボ(ex vivo)での軸索生長の促進クフラー(Kuffler)ら（J. Neurobiol. 25:1267-1282, 1994）により記載され
たようにして、ラット成体から脊髄神経節を除き、感覚ニューロンを調製した。
ニューロンを0.5ng/mlのRI IL-6誘導ペプチド（17〜約40個のアミノ酸を有し、
SEQ ID NO:1で示される配列を含む）で処理する。処理の３日後、最長の軸索突
出の長さをマイクロメーターのグリッドで測定する。RIペプチドで処理したニュ
ーロン中の最長の軸索は、対照（非-RI）ペプチドで処理したものまたは未処理
の対照より約３倍長い。48時間の処理後、すべての細胞は、神経増殖因子(NGF)
に同様に応答し、そこで、広範囲の分岐が観察される。これらの結果は、IL-3誘
導ペプチドが感覚ニューロンの分化を促進することを示す。

【００４４】実施例４ラットモデルにおける脱髄の逆転実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)は、ヒト多発性硬化症(MS)のラットモデル
である。ラットにおいては、EAEは、外来タンパク質（モルモットの脊髄）を注
入することによって誘発され、それは、11日後に、白質における炎症および脱髄
をもたらす。この脱髄は、活発に脱髄しているヒトMS障害にみられるものと似て
いる（リュウ(Liu)ら、Multiple Sclerosis 1:2-9, 1995）。

【００４５】モルモットの脊髄および完全フロイントアジュバント(CFA)のエマルジョンの
注入によって、ルイス(Lewis)ラットにEAEが誘発される。14日目、弱っているの
が明らかなときに、RI IL-6誘導ペプチド（17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ
ID NO:1で示される配列を含む）での処置を開始し（200g/kg筋肉内）、毎日８日
間続ける。６匹のラットは、賦形剤のみを注入される。14日および22日に、１歩
の長さ（筋肉の弱りの尺度）を評点付けする。さらに、mm²当たりの脊髄におけ
る脱髄障害（斑）の数および大きさを、22日に評点付けする。最後に、脳中のコ
レステロールエステルの量（ミエリン破壊のマーカー）を、22日に評点付けする
。

【００４６】両群の１歩の長さは14日目に減少し、それに対して、８日間の処置後、IL-6誘
導ペプチドで処置した動物は正常に戻ったが、賦形剤処置した動物は戻らない。
コレステロールエステル含量の有意の減少が、処置群の脳において観察される。
さらに、脊髄障害の数は、IL-6誘導ペプチドでの処置の10日後に有意に減少する
。最後に、平均の障害の大きさは有意に減少する。対照動物と実験動物との間の
体重減少の差はない。これらの結果は、IL-6誘導ペプチドでの全身処置後に、EA
Eの有意の臨床的生化学的かつ形態学的な逆転を示す。この作用は、ミエリン修
復に直接作用しない、最近のMS薬の抗炎症効果とは違う。

【００４７】実施例５イクスビボ(ex vivo)の髄鞘形成アッセイ新生児マウスの小脳外植片を、サトミ(Satomi)（Zool. Sci. 9:127-137, 1992
）にしたがって調製する。軸索生長および髄鞘形成を、培養で22日間観察し、そ
の期間中に、新生児マウスの小脳は普通ニューロン分化し、髄鞘形成が開始する
。17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むRI IL-6誘
導ペプチドを、外植片の調製後第２日に加え（３つの対照および３つの処置外植
片）、軸索の生長および髄鞘形成を、ビデオカメラの付いた明視野顕微鏡(brigh
t field microscope)下で査定する。サポシンCを、約1〜10g/mlの濃度での正の
対照として使用する。髄鞘形成は、IL-6誘導ペプチドによって、サポシンCを用
いたときと同様の程度にまで刺激される。

【００４８】あるいは、髄鞘形成は、³⁵Sをスルホリピド（以下に記載するように、ミエリ
ンに限定的である）に組み込むことによってアッセイすることができる。

【００４９】実施例６ ³⁵Sのスルホリピドへの組み込み初代のミエリン含有シュヴァン(Schwann)細胞を、0.5％ウシ胎児血清(FBS)を
含む低サルフェート培地(DMEM)中で48時間インキュベートした後、³⁵S-メチオニ
ンおよび、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むRI
IL-6誘導ペプチドを添加する。サポシンCを正の対照として使用する。細胞をP
BSですすぎ、採取し、100リットルの蒸留水中で超音波処理する。一定分量の細
胞溶解物をタンパク質分析のために除き、残りを5mlのクロロホルム／メタノー
ル（2:1、体積／体積）で抽出する。脂質抽出物をクロマトグラフィーにかけ、
ヒライワ(Hiraiwa)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4778-4781に記載さ
れているようにして、抗スルファチドモノクローナル抗体を用いて免疫染色する
。ペプチドおよびサポシンC処置後、同様の量のスルファチドが観察される。

【００５０】実施例７外傷性虚血性CNS障害の治療におけるRIペプチドの使用脳または脊髄に外傷性障害を有するヒトが、滅菌塩水溶液または蓄積形態での
約100g/kgのRI IL-6誘導ペプチド（17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:
1で示される配列を含む）の全身注入を受ける。感覚または運動神経機能の獲得
による改善が査定される（すなわち、増加された手足の動き）。さらなる改善が
生じなくなるまで治療を続ける。

【００５１】実施例８脱髄疾患の治療におけるRIペプチドの使用初期段階のMSと診断された患者に、実施例７と同じ投与量範囲を用いた全身注
入によって、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を含むR
I IL-6誘導ペプチドが与えられる。投与は毎日または毎週繰り返され、筋肉の
強度の改善、筋骨格協調および髄鞘形成（MRIにより決定）が観察される。慢性
再発MSを有する患者を、次の再発が生じるときに、同じ方法で治療する。

【００５２】実施例９ IL-6増殖アッセイ IL-6に関するほとんどのバイオアッセイは、IL-6依存性ネズミ・ハイブリドー
マ細胞系、例えば、MH60 B9、及び7TD1（ATCC CRL 1851）に対するこのサイトカ
インの増殖効果に依存する。IL-6アッセイに関する詳細なプロトコールは、Cyto
kines, a Practical a pproach, Balkwill, F., ed., IRL Press, New York, se
cond edition, 1995, pp. 365-366中に見られる。この内容全体を本明細書中に
援用する。IL-6依存性ネズミ・ハイブリドーマ細胞系B9は、哺乳動物IL-6のため
の信頼でき、かつ、感度のよいアッセイを提供する。B9細胞を、75cm² フラスコ
内で、５％ FCSと約 100pg／ml（10IU／ml）のIL-6を補ったRPMI 1640培地中で
培養する。培養物を、２〜３日毎に、１：５〜１：10に分け、そしてその細胞密
度が約５×10⁵ 細胞／mlに達するときに、IL-6を再供給する。培養物を、湿度調
節されたCO₂ インキュベーター内で37℃で維持する。

【００５３】 B9細胞を、供給（feeding）から２日後に洗浄し、そして５％ FCSを補ったRPM
I 1640培地中に５×10⁴ 細胞／mlの密度に再懸濁させる。IL-6標準を、96ウェル
・マイクロタイテーション・プレート内で 100ｌ容量中３連で順次２倍希釈シリ
ーズとして、分配する。標準の力価測定を、 100pg／ml（10IU／ml）から開始し
、そして 0.1pg／ml（0.01IU／ml）まで希釈する。IL-6活性について計測される
予定の、17〜約40アミノ酸をもち、かつ、配列番号１に示す配列を含むRI IL-6
由来ペプチドの適当な希釈物を、 100ｌ容量において３連で作製する。ネガティ
ブ・コントロールとして、培養基単独を含ませる。細胞懸濁液(100ｌ）を、各ウ
ェルに添加し、そしてそのプレートを、湿度調節CO₂ インキュベーター内で37℃
で約72時間、インキュベートする。テトラゾリウム塩MTT(10ｌ）を各ウェルに添
加し、そして上記プレートをさらに 4.5時間インキュベートする。酸ドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）(25ｌ）を、ウェル当りに添加し、上記プレートを顕度調節
CO₂ インキュベーター内で一夜37℃でインキュベートし、そしてその吸収を、プ
レート・リーダーを用いて 620nmで測定する。吸収対IL-6の濃度の標準曲線をプ
ロットする。RI IL-6由来ペプチド・サンプル中の活性の測定のために、テスト
結果を上記標準曲線と比較して、上記特定のペプチドがIL-6活性を有するかどう
かを決定する。

【００５４】実施例10 IL-6 IgG分泌アッセイ IL-6を、EBV 形質転換ヒト・リンパ芽細胞系、例えば、CESS（ATCC TIB 190）
内での分化及びIgG分泌を高めるその能力により、評価することができる。CESS
細胞を、活発な長期増殖培養物から収穫する。上記細胞を、予め24〜48時間、サ
ブ培養する。多くの死細胞を含み、又は遅く増殖している培養物は、上記アッセ
イにおいてよく働かないであろう。細胞を、１回洗浄し、そして培養基中に10⁶
細胞／mlまで再懸濁させる。IL-6(100ｌ）、又は17〜約40アミノ酸をもち、かつ
、配列番号１に示す配列を含むRI IL-6由来ペプチドを、各細胞濃度において、
６つの複製培養物に添加する。培地だけを、ネガティブ・コントロールとして６
ウェルから成る１セットに添加する。細胞を、空気中５％ CO₂の雰囲気中、37℃
において５〜７日間、インキュベートする。細胞上清を収穫し、そして免疫グロ
ブリン含量についてアッセイする。

【００５５】アフィニティー精製されたヤギ抗−ヒトIgG(75ｌ）を、重炭酸塩コーティング
・バッファー中に小分けし、そして室温で一夜インキュベートする。抗血清の個
々のバッチを、事前滴定し、高、中、及び低濃度のIgG をもって、最適シグナル
対ノイズ比を決定する。ウェルを、PBS／Tween-20 で３回洗浄する。残存タンパ
ク質結合部位をブロックするために、100ｌ PBS／BSA／Tween-20を、各ウェルに
添加し、そして30〜90分間室温でインキュベートする。PBS 中で希釈した正常ヤ
ギ血清（４％）を、このステップにおいて使用することもできる。ウェルを、PB
S／Tweenで３回洗浄し、そして75ｌのテスト上清と標準を２連で添加する。プー
ルされた正常ヒト血清、又はPBS／BSA／Tween-20中 1,000ng／mlにおける部分精
製されたIgG のいずれかの倍化希釈を用いた11点の標準曲線を、バッファーだけ
のゼロ標準とともに、各プレートに対して、２連で設定した。プレートを、１〜
２時間室温でインキュベートする。ウェルをPBS／Tween-20で３回洗浄する。各
ウェルに、PBS／BSA／Tween-20中で希釈された、アルカリ性ホスファターゼ（AP
）−結合アフィニティー精製ヤギ抗−ヒトIgG のホースラディシュ・ペルオキシ
ダーゼ(HPO）75ｌを添加する。抗血清の個々のバッチを滴定して、最適希釈を決
定する。

【００５６】実施例11 IL-6由来ペプチドによるTNF 放出の阻害 17〜約40アミノ酸をもち、かつ、配列番号１に示す配列を含むRIペプチドを、
TNF のLPS 誘導放出を阻害するその能力についてアッセイする。マクロファージ
バクテリアのリポ多糖(LPS）の添加により活性化され、培養基中へのTNF の放出
をもたらし、これは、酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA）を用いて、
アッセイされることができる。IL-6は、TNF のLPS 誘導放出を阻害することが知
られている（Aderka et al., J. Immunol. 143 : 3517-3523, 1989）。LPS 刺激
前にIL-6由来ペプチドにより処理された培養物中、放出されたTNF の量は、上記
ペプチドを与えなかった培養物に比較して、有意に低下される。

【００５７】本発明は、上記詳細な説明中に記載されている態様のみに限定されるものでは
ないことはいうまでもない。本発明の本質を保持する態様の全ては、本発明の範
囲内にあると解釈されるべきである。しかしながら、本発明は、上記特許請求の
範囲のみにより限定される。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/04 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C084 AA02 AA03 AA07 BA01 BA09 BA18 BA19 BA31 BA34 CA59 MA52 MA55 MA65 MA66 NA14 ZA022 ZA202 ZB092 4H045 AA10 AA30 BA17 BA19 CA40 DA01 EA28 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列
を含むレトロ-インベルソペプチド。
【請求項２】該配列の少なくとも１つの塩基性に荷電したアミノ酸が、別
の塩基性に荷電したアミノ酸で置換されている請求項１記載のペプチド。
【請求項３】該配列の少なくとも１つの酸性に荷電したアミノ酸が、別の
酸性に荷電したアミノ酸で置換されている請求項１または２記載のペプチド。
【請求項４】該配列の少なくとも１つの非極性アミノ酸が、別の非極性ア
ミノ酸で置換されている請求項１〜３のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項５】該配列の少なくとも１つの非荷電アミノ酸が、別の非荷電ア
ミノ酸で置換されている請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項６】該配列の少なくとも１つの芳香族アミノ酸が、別の芳香族ア
ミノ酸で置換されている請求項１〜３のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項７】該ペプチドが、アミノ末端、カルボキシ末端または、アミノ
末端およびカルボキシ末端の両方で、CH₃CO、CH₃(CH₂)_nCO、C₆H₅CH₂COおよびH₂N
(CH₂)_nCO（n=1〜10）からなる群より独立して選択される部分を用いて修飾され
ている請求項１〜６のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項８】該ペプチドがグリコシル化されている請求項１〜７のいずれ
か１項記載のペプチド。
【請求項９】その１つ以上のアミド結合が還元されている請求項１〜８の
いずれか１項記載のペプチド。
【請求項１０】該ペプチド中の１個以上の窒素がメチル化されている請求
項１〜９のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項１１】該ペプチド中の１個以上のカルボン酸基がエステル化され
ている請求項１〜１０のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項１２】ペプチドが、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有す
る請求項１〜１１のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項１３】 17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配
列を含むレトロ-インベルソペプチドおよび製薬上許容される担体を含む組成物
。
【請求項１４】必要とする哺乳動物において軸索生長または髄鞘形成を促
進する方法であって、該哺乳動物に、軸索生長または髄鞘形成を促進する有効量
の、17〜約40個のアミノ酸を有しSEQ ID NO:1で示される配列を含むレトロ-イン
ベルソペプチドを含む組成物を投与する段階を含む方法。
【請求項１５】該ペプチドが、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有
する請求項１４記載の方法。
【請求項１６】該哺乳動物がヒトである請求項１４または１５記載の方法
。
【請求項１７】該投与段階が、直接局所注入、全身、頭蓋内、脳脊髄内、
局所および経口からなる群より選択される請求項１４〜１６のいずれか１項記載
の方法。
【請求項１８】Ｔ細胞活性化を促進させる方法であって、上記Ｔ細胞を、
Ｔ細胞活性化促進有効量の、17〜約40個のアミノ酸を有しSEQ ID NO:1で示され
る配列を含むレトロ-インベルソペプチドを含む組成物と接触させることを含む
方法。
【請求項１９】該ペプチドが、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有
する請求項１８記載の方法。
【請求項２０】哺乳動物において軸索生長または髄鞘形成を促進するのに
使用するための、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配列を
含むレトロ-インベルソペプチド。
【請求項２１】該ペプチドが、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を有
する請求項２０記載のペプチド。
【請求項２２】該哺乳動物がヒトである請求項２０または２１記載のペプ
チド。
【請求項２３】それを必要とする哺乳動物におけるＴ細胞活性化の促進に
おいて使用するための、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される
配列を含むレトロ-インベルソペプチド。
【請求項２４】該ペプチドが、SEQ ID NO:1で示される配列を有する請求
項２３記載のペプチド。
【請求項２５】前記哺乳動物がヒトである、請求項２３又は２４に記載の
ペプチド。
【請求項２６】必要とする哺乳動物において軸索生長または髄鞘形成を促
進するための薬剤の製造における、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1
で示される配列を含むレトロ-インベルソペプチドの使用。
【請求項２７】該ペプチドが、SEQ ID NO:1で示される配列を有する請求
項２６記載の使用。
【請求項２８】該哺乳動物がヒトである請求項２６または２７記載の使用
。
【請求項２９】必要とする哺乳動物におけるＴ細胞活性化の促進のための
薬剤の製造における、17〜約40個のアミノ酸を有し、SEQ ID NO:1で示される配
列を含むレトロ-インベルソペプチドの使用。
【請求項３０】該ペプチドが、SEQ ID NO:1で示される配列を有する請求
項２９記載の使用。
【請求項３１】該哺乳動物がヒトである請求項２９または３０記載の使用
。