JPH09503999A - 治療剤としてのプロサポシンおよびサイトカイン由来ペプチド - Google Patents
治療剤としてのプロサポシンおよびサイトカイン由来ペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
プロサポシンおよびそれから由来するペプチド誘導体は、インビトロでの神経突起伸長を促進する。ペプチドのコンセンサス配列が、活性な神経突起伸長誘導性サポシンＣペプチド配列と、種々の造血および神経生成性サイトカインのペプチド配列の比較により決定された。これらのサイトカイン由来ペプチドは、それらの対応するサイトカイン類と同じプロセスを促進する。さらに、プロサポシンおよびサポシンＣは、エクスビボで神経細胞ミエリン形成の増加を促進する。
Description
【発明の詳細な説明】
治療剤としてのプロサポシンおよびサイトカイン由来ペプチド
発明の分野
本発明は、治療特性を有するタンパク質およびペプチドを開示する。より特定
すれば、これらの分子は、成長促進および種々の細胞型の分化に有効である。
発明の背景
70キロダルトンの糖タンパク質であるプロサポシンは、リソソーム加水分解酵
素によるスフィンゴ糖脂質の加水分解に必要である一群の４つの小さな熱安定性
糖タンパク質の前駆体である(Kishimotoら、(1992) J．Lipid Res.，33;1255-12
67)。プロサポシンは、リソソームでタンパク質分解的にプロセッシングされ、
プロサポシンにおいて４つの近接した直列ドメインとして存在するサポシンＡ、
Ｂ、Ｃ、およびＤを生じる(O'BrienおよびKishimoto、(1991) FASEB J.，5:301-
308)。４つのサポシン全ては、６つのシステインの配置、グリコシル化部位、お
よび保存されたプロリン残基を含んで、互いに構造的に似ている。
プロセッシングされていないプロサポシンはまた、統合膜タンパク質、ならび
にヒト乳汁、脳脊髄液、および精漿に存在する分泌タンパク質として存在する。
高濃度の非プロセッシングプロサポシンの中枢神経系における存在は、それが、
リソソーム加水分解酵素の活性化に加えて重要な役割を果たし得ることを示す。
プロサポシンは、スフィンゴ糖脂質と呼ばれる膜脂質を結合する。スフィンゴ
糖脂質は、炭水化物の頭部の基および２つの炭化水素鎖(脂肪酸およびスフィン
ゴシン誘導体)からなるスフィンゴ脂質である。スフィンゴ糖脂質は、ミエリン
鞘の重要な成分であり、神経繊維を保護および隔離する構造である。ミエリン脱
落(髄鞘脱落)は、多くの中枢神経系疾患に共通する欠損であり、多発性硬化症(M
S)が最も一般的である。MSは、総廃疾を導き得る慢性疾患であり、軸索はほぼ完
全に残したままでミエリン鞘を損傷することにより特徴づけられる。おそらくウ
イルスに誘導された自己免疫機構が、この疾病の進展に役割を果たし得ると現在
考えられている。現在、MSに対する有効な処置はない。ミエリン脱落を含む他の
中枢神経系疾患は、急性播種性脳脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症、急性壊死出血性
白質萎縮症、進行性多病巣性白質脳炎、異染性白質萎縮症および副腎白質萎縮症
を含む。末梢神経系のミエリン脱落症の一例は、ギヤン−バレー症候群である(P athologic Basis of Disease
，Robbins，S．L.およびCotran，R．S.，編、W．B
．Saunders，Philadelphia，(1979)，pp.1578-1582)。
ポリオ後症候群は、筋衰弱および筋萎縮をともなう筋肉疲労および持続性の減
少により特徴づけられる。この疾病は、一部は、筋萎縮性側索硬化症で起こる損
傷と同じタイプの脊髄運動ニューロンの損傷により引き起こされると考えられて
いる。
糖尿病または化学療法からの結果生じるような末梢神経障害および末梢神経障
害は、最も流行している末梢神経系疾患(表１を参照のこと)を含む。末梢神経疾
患に対する現在の処置は、症状を処置するのみであり、疾病の原因を処置しない
。
プロサポシンは、ガングリオシド、セレブロシド、およびスルファチドのよう
なスフィンゴ糖脂質を高親和性で結合し、そしてミセルから膜へのそれらの輸送
を促進する(Suedaら、(1993) J．Biol．Chem.印刷中；Hiraiwaら、(1992) Proc ．Natl．Acad．Sci．USA.
，89: 11254-11258)。ガングリオシドは、１またはそ
れ以上のシアル酸残基を含み、そしてニューロンの原形質膜に最も豊富にあって
、そこでは総脂質量の約６％を構成する。ガングリオシドの機能は、十分に知ら
れていないが、それらは、ニューロン分化、神経突起形成(neuritogenesis)、お
よ
び神経系の修復の刺激に関係している。
ニューロトロフィン(neurotrophin)は、ニューロン細胞集団の生存、標的神経
支配、および／または機能に影響し得るようなタンパク質として定義され得る(B
arde，(1989) Neuron，2: 1525-1534)。ニューロトロフィンの効力は、インビト
ロおよびインビボの両方で詳細に報告されている。このようなタンパク質の中で
最もよく特徴づけられているのは、交感神経および知覚ニューロンの標的細胞に
より合成され、そして前脳コリン作動性ニューロン、末梢ニューロン、および知
覚ニューロンに対して栄養因子として働く神経成長因子(NGF)である(Heftiら、(
1989) Neurobiol．Aging，10: 515-533)。インビボでの実験では、NGFが天然に
生じる損傷および物理的な外傷損傷を末梢神経に復帰させ得ることが示されてい
る。例えば、NGFの局所適用は、成熟ラットで、座骨神経の離断(transection)か
ら生じる知覚ニューロン節の萎縮を阻害することが示された(Richら、(1987) J ．Neurocytol.
，16: 261-268)。さらに、NGFは、発達している交感神経および知
覚ニューロンの神経突起の拡張を促進するので、神経の再生プロセスにおいて役
割を演じている(Purvesら、(1988) Nature，336: 123-128)。さらに、NGFがアル
ツハイマー病の患者で失われている前脳コリン作動性ニューロンの機能を支持し
ているので、このことは、NGFがこれらの疾病の処置で臨床的に使用され得るこ
とを示している(Heftiら、(1989) Neurobiol．Aging，10: 515-533)。
脳由来の神経栄養因子(BDNF)は、中枢神経系で合成され、そして末梢知覚ニュ
ーロン、黒質のドーパミン作動性ニューロン、中枢コリン作動性ニューロン、お
よび網膜神経節のための栄養因子である(Hendersonら、(1993) Restor．Neurol ．Neurosci.
，5: 15-28)。BDNFは、普通に起こる細胞死をインビトロおよびイン
ビボの両方で阻害することもまた示された(HoferおよびBarde，(1988) Nature,3
31: 261-262)。
NGFおよびBDNFは、相同性である(約50％)大きな領域を共有するので、これら
の領域の４つに対応する縮重オリゴヌクレオチドプライマーをPCR反応で用いて
、新規な関連配列が増幅された。ニューロトロフィン３(NT-3)と呼ばれる関連す
る神経栄養因子がクローン化された(Maisonpierreら、(1990) Science，247: 14
46-1451)。NT-3は、中枢および末梢の両方で見い出され、そして後根神経節(DRG
)
体外移植片を含む知覚ニューロンおよび交感神経ニューロンの生存を促進し得る
。
上記の３つのニューロトロフィンは、異なるニューロン特異性を有する。全て
の３つのニューロトロフィンはDRG体外移植片から神経突起伸長を誘導した。NGF
は、交感神経節(SG)から神経突起伸長を誘導するが、結節性神経節(NG)から神経
突起伸長を誘導せず、一方BDNFは、NGから神経突起伸長を誘導するが、SGから神
経突起伸長を誘導しない。NT-3は、NGからの神経突起伸長を、そしてより少ない
程度でSGから神経突起伸長を促進し、NGFまたはBDNFのいずれよりもより広い特
異性を示唆する(Lindsayら、(1991 )Restor．Neurol．Neurosci.，2:211-220)。
毛様体神経栄養因子(Ciliary Neurotrophic Factor)(CNTF; Linら、(1989) Sc ience
，246: 1023)は、インビトロでニワトリ胚毛様体神経節の生存を促進し、
そして培養された交感神経、知覚ニューロンおよび脊髄運動ニューロンの生存を
支援することも見い出された(Ipら、(1991) J．Physiol.，Paris，85: 123-130)
。新生児ラットの外傷部位に対するこのタンパク質の局所投与は、相当する運動
ニューロンの変性を阻害することを示した。CNTFはまた、細胞死の発生から運動
ニューロンを救援する(Hendersonら、(1993) Restor．Neurol．Neurosci.，5: 1
5-28)。CNTFは、残基43で開始し、CNTFのＣ末端ドメインへの結合において重要
であり、それ故サイトカインの機能的活性化を導くと考えられているABループと
呼ばれる構造要素を含む(Bazan，(1991) Neuron，7: 197-208)。CNTFおよび他の
神経生成性(neuropoietic)サイトカインは、インターロイキン-6および顆粒球コ
ロニー刺激因子を含む造血サイトカインと、配列／構造モチーフを共有する。こ
れらのサイトカイン類のＣ末端における優勢な配列モチーフは、サイトカインレ
セプターと相互作用し得る正確な三次構造を採用すると推測されている(Bazan,
同上)。
サイトカインレセプター結合の現在のモデル(SprangおよびBazan，(1993) Cur
r．Opin．Struct．Biol.，3: 816)は、レセプター複合体の主要部を形成するサ
イトカインタンパク質の束(bundle)のコアのＡヘリックスとＤヘリックスとの間
の特異的なパッキングジオメトリーの進化的保存を強調している。この構造は、
ほとんどのサイトカインに共通する。結合に必要であると提案されているABルー
プおよびヘリックスＤは、全てのサイトカイン類においてアミノ酸の大きな伸長
(50アミノ酸以上)により分離されている。このことは、約20アミノ酸の小さなペ
プチドがレセプターリガンドとして不活性であり得そして細胞応答を惹起しない
ことを意味する。
図面の簡単な説明
図１ａは、0.01〜0.5μg/mlの範囲にわたる、組換えプロサポシン(prosap-r)
、乳汁から単離したプロサポシン(prosap-m)、サポシンＣ、サポシンＣ由来の活
性22マーペプチド、およびサポシンＣ由来のヨウ素標識した18マーペプチドで処
理したNS20Y神経芽腫細胞の神経突起伸長応答を示すグラフである。エフェクタ
ータンパク質の濃度(μg/ml)をｘ軸に示し、そして神経突起を有する細胞の百分
率をｙ軸に示す。
図１ｂは、プロサポシンおよびサポシンＣで処理したNS20Y細胞における神経
突起伸長に対する５μg/ml NGFの影響を示す棒グラフである。ｙ軸は、神経突起
を有する細胞の百分率を示す。
図１ｃは、NS20Y神経芽腫細胞の神経突起伸長に対するペプチド９(配列番号２
)と呼ばれるCNFT由来の20残基ペプチドの影響を示すグラフである。ペプチドの
濃度をｘ軸に示し、そして神経突起を有する細胞の百分率をｙ軸に示す。
図１ｄは、 NS20Y神経芽腫細胞における神経突起伸長に対するCNTFおよびペプ
チド９(単独または糖タンパク質130(gp130)に対するモノクローナル抗体である
抗体AM64の存在下のいずれかで)の影響を示す棒グラフである。CNTFおよびペプ
チド９をそれぞれ100ng/mlおよび20ng/mlで培地に添加した。エフェクターをｘ
軸に示し、そして神経突起伸長する細胞の百分率をｙ軸に示す。
図２は、種々のエフェクターにより誘導されたコリンアセチルトランスフェラ
ーゼ(ChAT)を示す棒グラフを示す。SKNMC神経芽腫細胞を、エフェクター(200ng/
ml)の存在下0.5％ウシ胎児血清(FCS)を含有するDMEMで、48時間成長させ、そし
てChAT活性を測定した。エフェクターをｘ軸に示し、そして標識(cpm/mgタンパ
ク質/分)の取り込みをｙ軸に示す。
図３ａは、ヒトサポシンＣ配列のハイドロパシー図を示す。アミノ酸残基の位
置をｘ軸に示し、そしてハイドロパシー指数をｙ軸に示す。
図３ｂは、４つの他の種由来の同じ配列を有する活性な22マーヒトサポシンＣ
配列の配列のならびを提供する。コンセンサス(完全に保存された)残基を配列の
ならびの下に示す。同じ領域におけるヒトサポシンＡの配列(不活性である)が提
供され、サポシンＡにおける同じ親水性領域(18〜29)の最初の４残基のうち３つ
の配列の間の相違と残りの残基の保存を示す。
発明の要旨
本発明の１つの実施態様は、神経細胞成長またはミエリン形成の増加を促進す
るための方法であって、ニューロン細胞と、プロサポシン、サポシンＣ、もしく
は神経成長の増加またはミエリン形成活性の増加を促進する能力を有する本明細
書で以下に記載のコンセンサス配列に適合するペプチドを含む組成物とを接触さ
せる工程を包含する。好ましくは、プロサポシンはネイティブである；最も好ま
しくは、プロサポシンは組換え的に産生される。ペプチドは、有利にはサポシン
Ｃ、サポシンＣの８〜29のアミノ酸を含むペプチド、またはサポシンＣの８〜29
アミノ酸内に位置する活性な神経栄養フラグメントであり得る。好ましくは、ニ
ューロン細胞は神経芽腫細胞であり、そしてペプチドは、本質的に配列番号２ま
たは配列番号７〜14からなる。これらのニューロン細胞は、好ましくはインビト
ロで接触させ、そして最も好ましくはインビボで接触させる。この好ましい実施
態様の他の局面では、細胞は、マウス小脳体外移植片由来である。
本発明の他の局面は、哺乳動物におけるミエリン脱落疾患を処置するための方
法に関し、疾患で苦しむ哺乳動物を同定する工程、およびこの哺乳動物にミエリ
ン脱落を阻害する薬学的有効量のプロサポシン、その神経栄養フラグメント、ま
たは本明細書で以下に記載の法則に適合するコンセンサスペプチドを投与する工
程を包含する。好ましくは、このフラグメントは、サポシンＣであり、そしてミ
エリン脱落疾患は、多発性硬化症、急性播種性白質脳炎、進行性多病巣性白質脳
炎、または副腎白質萎縮症のいずれかである。好適には、投与の方法は、生物学
的に適合するキャリアを用いて、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、脳脊髄内、また
は局所のいずれかである。プロサポシンまたはそのフラグメントは、リポソーム
様(層状)構造で有利に封入され得る。
本発明は、神経組織において、神経変性またはミエリン変性の進行を停止また
は遅延するための方法をさらに含み、このような変性を受けやすいニューロン組
織とプロサポシンまたはその活性な変性阻害フラグメントを接触させる工程を包
含する。好ましくは、このフラグメントはサポシンＣであり、そして組織はイン
ビトロである；最も好ましくは、組織はインビボである。
本発明の他の局面は、中枢または末梢神経系のニューロン変性疾病を処置する
ための方法であって、このような疾病にかかった哺乳動物にニューロン変性を遅
延または停止するに有効な量のプロサポシンフラグメントを投与する工程を包含
する。好ましくは、このフラグメントは、配列番号１のペプチドの神経栄養活性
を含み、そして静脈内、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、脳脊髄内、局所、または
経口投与される。好適には、この疾病は、中枢神経系の疾病であり、そしてフラ
グメントは、血液脳関門を横切るために選択される。この好ましい実施態様の他
の局面では、この疾病は、アルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、ポリオ後
症候群、または筋萎縮性側索硬化症である。
さらに、本発明は、患者に有効量のプロサポシンまたはその神経栄養フラグメ
ントを投与する工程により、患者の網膜神経障害の進行を遅延するための方法を
含む。好ましくは、この網膜神経障害は、黄斑変性であり、この患者は65歳以上
であり、そして投与は、局所、静脈内、眼球内、または経口のいずれかである。
本発明の他の局面は、単位用量形態でプロサポシンまたはその神経栄養フラグ
メントを含む薬学的組成物である。
本発明のさらに他の局面は、制御される放出物質とともに製剤化されるプロサ
ポシンまたはその神経栄養フラグメントを含む薬学的組成物である。
本発明はまた、単離または精製された形態のニューロンプロサポシンレセプタ
ータンパク質を含む。好ましくは、このレセプタータンパク質は、固体支持体に
結合したサポシンＣ配列内に含まれる神経突起伸長誘導ペプチドを用いるアフィ
ニティー精製により、p100原形質膜から単離され、そして約60kDaの分子量を有
する。
本発明の他の局面によれば、約15〜約50のアミノ酸を有し、そしてコンセンサ
ス配列XNNYZを含む活性な神経栄養ペプチドが提供され、ここで、Nはアスパラギ
ンであり、そしてX、Y、およびZは、哺乳動物のタンパク質で天然に存在するア
ミノ酸であり、このコンセンサス配列は以下を含む：
２つの隣接または次に隣接するアスパラギン残基；
このアスパラギン残基からＮ末端方向に向かって３または４残基であるロイシ
ンまたはイソロイシン残基X；
１またはそれ以上の荷電アミノ酸残基Y、ここで、Yは、前記アスパラギン残基
からＣ末端方向に向かって２〜８残基に位置する；および
１またはそれ以上の疎水性残基Z、ここで、Zは、前記アスパラギン残基のＣ末
端方向に向かって６〜10残基に位置する。そしてこのペプチドは細胞中に神経突
起形成を誘導する。
この好ましい実施態様の他の局面では、このアスパラギン残基は、１つのアミ
ノ酸により分離されている。好ましくは、このペプチドはサイトカイン由来であ
り、そしてそれが由来するサイトカインとして同じプロセスを促進する。好適に
は、このサイトカインは、インターロイキン-1、インターロイキン-2、インター
ロイキン-3、白血球阻害因子、エリトロポイエチン、インターロイキン-6、また
はオンコスタチン-Mである。さらに、このペプチドは、配列番号２、７、８、９
、10、11、または12の活性を含み、そしてCNTFのABループの約15〜約50アミノ酸
、インターロイキン-6、インターロイキン-2、インターロイキン-3、インターロ
イキン-1γ、エリトロポイエチン、または白血球阻害因子をそれぞれ含む。この
実施態様の他の局面では、このペプチドは配列番号13または14の活性を含み、そ
してIL-1βのヘリックスＣまたはオンコスタチン-Mそれぞれ由来の約15〜約50ア
ミノ酸を含む。
本発明の他の実施態様は、神経細胞成長を刺激するための方法であり、この方
法は、神経細胞を本明細書中で上記に記載のコンセンサス配列を有する活性ペプ
チドを含む組成物と接触させる工程を包含する。好ましくは、神経細胞は、神経
芽腫細胞であり、そして細胞はインビトロで接触させる；最も好ましくは、細胞
はインビボで接触させる。
発明の詳細な説明
上部および下部運動ニューロンを含むニューロンの大集団の細胞体に存在する
神経栄養因子としてのプロサポシン自身の同定、およびそのマウス小脳体外移植
片でミエリン形成を誘導する能力は、このタンパク質の重要な新規な機能を示す
。
さらに、細胞成長および分化を促進するプロサポシンペプチドの使用は、記載さ
れたことがない。さらに、サイトカイン自身として働く神経生成性および造血サ
イトカイン由来の小ペプチド(以下に記載のコンセンサス配列に適合する)の能力
は証明されていなかった。従って、本発明は、治療剤として使用するためのプロ
サポシン、その誘導体、および種々の神経栄養および造血サイトカイン由来のペ
プチドを提供する。
本発明は、多くの神経栄養および造血サイトカインにおいて見い出される神経
栄養ペプチドのコンセンサス配列を開示し、このコンセンサス配列は両方の神経
突起伸長を刺激し、そしてそれが由来する分子の活性を模倣する。このコンセン
サス配列は、プロサポシン、サポシンＣ、サポシンＣのアミノ酸８〜29を含むペ
プチド、およびCNTFのアミノ酸38〜57を含む20マーペプチド中に見い出された(
それら全ては神経突起形成活性を示した)。サポシンＣの活性22マーは、CNTF20
マー、およびインターロイキン(IL)-1、IL-2、およびエリトロポイエチン(EPO)
を含む多くの造血サイトカイン由来のペプチドと配列類似性を示したので、これ
らのペプチドもまた、サイトカインアナログとして有用であり得る。さらに、プ
ロサポシン、サポシンＣ、およびサポシンＣペプチドは、ミエリン形成の増加を
促進するために使用され得る。
プロサポシン、その誘導体、他のニューロトロフィン由来の20マーCNTFペプチ
ドおよびコンセンサスペプチド、サイトカイン、ならびに成長因子は、末梢およ
び中枢神経系に対して毒性、外傷性、虚血性、変質性および先天性傷害の後の、
機能的な回復を促進することにおいて、顕著な治療用途を有する。サイトカイン
由来の小ペプチドはまた、サイトカイン自身と同様の効果を仲介することで有用
性を有する。これらのペプチドの使用は、それらが天然または組換えサイトカイ
ンのいずれに比べても合成がより安定で、かつより容易であるので、種々の疾患
の治療を促進し得る。さらに、プロサポシンおよびその誘導体は、ミエリン脱落
疾病の影響を打ち消すために用いられ得る。
プロサポシンおよびその誘導体は、多くのタイプのニューロンに存在すること
が知られ、水溶性であり(スフィンゴ糖脂質と対照的に)、そしてガングリオシド
ミセルより免疫原性が少ない。それ故、ヒトの治療には免疫応答を起こさないヒ
ト配列が使用される。
サポシンＣ由来の活性な22マーペプチドは、配列番号１(CEFLVKEVTKLIDNNKTEK
EIL)に示されるアミノ酸配列を有する。20マーのCNTFペプチドは配列番号２(YVK
HQGLNKNINLDSVDGVP)に示されるアミノ酸配列を有する。ヒトプロサポシンは、配
列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。サポシンＣは、配列番号４に示され
るアミノ酸配列を有する。プロサポシンに対するヒトcDNA配列は、配列番号５に
示される。活性な22マーフラグメント由来の活性18マーフラグメントは、配列番
号６(YKEVTKLIDNNKTEKEIL)として示される。実施例でさらに詳細に記載されるよ
うに、プロサポシン、サポシンＣ、少なくともアミノ酸８〜29を含むサポシンＣ
のアミノ酸およびCNTFの20マーペプチドは、神経栄養因子として活性である。さ
らに、少なくともアミノ酸12〜29を含むペプチド(12位でバリンからチロシンへ
の置換を有する)もまた、活性な神経栄養因子である。サポシンＣ配列のアミノ
酸残基８〜29は、CNTFの残基44〜57に配列類似性を有することが観察された。
20の異なるサイトカインおよび成長因子とCNTFの配列のならびは、ヒト(h)IL-
6、 IL-2、 IL-3、 IL-１γ鎖、エリトロポイエチン(EPO)、ヒト白血球阻害因子
(LIF)、 IL-1β鎖、オンコスタチン-MおよびサポシンＣと配列類似性を示した(
表２)。
配列の並びは、コンセンサス配列XNNYZを規定する。このコンセンサス配列は
、最初、異なる種由来のプロサポシンの22マーの比較を基に、そして神経栄養因
子として不活性であるサポシンＡ由来の類似の配列を用いて発見された。
このコンセンサス配列(独特の刺激性配列またはPSS)の最も重要な特徴は、２
つのアスパラギン(N)残基(隣接するかまたは１個のアミノ酸残基により分離され
るかのいずれか)、この２つのアスパラギン残基の(Ｎ末端に向かって)３〜４残
基上流のロイシン(L)またはイソロイシン(I)残基X、この２つのアスパラギン残
基の(Ｃ末端に向かって)２〜８残基下流の１つまたはそれ以上の荷電残基Y(アス
パラギン酸(D)、リジン(K)、グルタミン酸(E)、またはアルギニン(R))、および
この２つのアスパラギン残基の６〜10残基下流の１つまたはそれ以上の疎水性残
基Z(アラニン(A)、L、Iまたはバリン(V))を含む。CNTF、IL-6、IL-2、IL-3およ
びIL1-γ配列は、最も厳密にPSSに一致し、その一方、EPOおよびLIF配列は、−
４位のロイシンまたはイソロイシンを欠いている。IL-1βおよびONC-M配列はAB
ループ中にない。上記に記載された規則に一致する任意のペプチドは、本発明の
範囲内にあることが意図される。
上記の表中に列挙されたペプチドは、当業者により、従来の自動化されたペプ
チド合成により調製され得、そして実施例１に記載されるように神経栄養活性に
ついてスクリーニングされ得る。プロサポシンまたはサポシンＣ由来の類似の活
性ペプチドもまた、本発明の範囲内であり、同様に調製されそしてスクリーニン
グされ得る。さらに、サイトカイン由来ペプチドは、それらの対応するサイトカ
インの活性についてアッセイされ得る。このことは、IL-6およびEPOについて、
実施例11および12にそれぞれ記載されている。これらのペプチドは、対応する完
全長タンパク質が促進する細胞プロセスと同一の細胞プロセスを促進する。例え
ば、IL-6ペプチドは、活性化マクロファージからの腫瘍壊死因子(TNF)放出を阻
害することにより抗炎症活性を示し、そしてEPOペプチドは、幹細胞(赤血球コロ
ニー形成細胞)の赤血球細胞への分化を刺激する。神経栄養活性を有するサイト
カイン由来のこれらのペプチドは、神経突起(neurites)の伸長もまた刺激し得、
ならびに髄鞘形成を促進し得またニューロン組織におけるプログラムされた細胞
死を予防し得る。
さらに、約15〜約50のアミノ酸を有するこれらのペプチドは、配列番号１およ
び２の配列と同じカテゴリーの活性を有し、そしてこれら分子と一般的に同一の
方法で使用され、および一般に同一形態で提供され得るようである。従って、プ
ロサポシン、サポシンＣおよびそれらの神経栄養性フラグメントに関する本発明
の開示は、配列番号２および７〜14のペプチドに拡張されるべきである。さらに
、これらの配列は、それぞれのサイトカインのABループまたはヘリックスＣのい
ずれかに由来するとして表２中に開示されている。記載されるペプチドの活性を
維持するネイティブな分子のこれらの部分由来の約15〜約50のアミノ酸を有する
ペプチドもまた、本発明の範囲内である。目的の任意のペプチドの活性の測定は
、実施例に呈示されるように、またはペプチドが由来する分子の活性について確
立されたアッセイを用いて達成され得る。
本発明の１つの局面は、分化または未分化神経細胞において神経突起の伸長を
促進する方法である。この方法は、有効な神経突起伸長促進量のプロサポシン、
サポシンＣ、それらの18または22個のアミノ酸フラグメント、CNTF20マーペプチ
ド、または問題の細胞に対する上記の規則に対応する任意のペプチドの投与を必
要とする。細胞生長培地中の神経栄養因子活性のためのプロサポシンの代表的な
最小量は、通常、少なくとも約1.4×10-11M、または約10 ng/mlである。この量
、またはより多いサポシンＣ、その活性な18または22個のアミノ酸フラグメント
、CNTF20マーまたは本発明の任意の他のペプチドがまた用いられ得る。通常、任
意のこれら物質の濃度は、0.1μg/ml〜約10μg/mlの範囲が用いられる。任意の
特定の組織に対する有効量は、実施例１に従って決定され得る。
神経細胞または造血細胞は、インビボまたはエクスビボで、本発明のタンパク
質またはペプチド因子を細胞に直接に投与することにより処置され得る。これは
、例えば、特定の細胞タイプに適切な生長培地中で細胞を培養し、次いで、培地
に因子を添加することによりなされ得る。
処置されるべき細胞がインビボの場合、代表的には、脊椎動物、好ましくは哺
乳動物または鳥類内の場合、上記組成物は、いくつかの技法のうちの１つにより
処置されるべき細胞に投与され得る。最も好ましくは、上記組成物は、所望の神
経栄養性または造血サイトカイン由来ペプチドの濃度を与えるに十分な量で血液
中に直接注入され得る。何故なら、22マーのアミノ酸12位〜29位からなり、アミ
ノ酸12位でバリンに代えてチロシンを置き換えたヨード化18マーペプチド(分子
量＝2000)は、実施例７に記載のように、血液脳関門を横切りそして中枢神経系
に入る(Banksら、(1992) Peptides、13：1289−1294参照)。脳による摂取は、約
0.03％であり、血液脳関門を横切るその近似したサイズのペプチドに対する値の
中間の範囲であった。これは、静脈内に投与された場合に、血液脳関門を横切る
、今までに記載された唯一の神経栄養因子であるが、本発明の任意のペプチドの
静脈内投与が予期される。
直接頭蓋内注入または脳脊髄液への注入もまた、タンパク質またはペプチドの
所望の局所濃度を与える十分量で使用され得る。両方の場合において、周知のタ
イプの薬学的に受容可能な注入可能なキャリアが使用され得る。そのようなキャ
リアは、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を含む。あるいは、上記組成物
は、直接局所注入または全身投与により末梢神経組織に投与され得る。種々の従
来の投与様式が予期され、これは静脈内、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、硬膜外
、局所および経口投与を含む。
組成物は、注入可能な、組成物または患者に投与される日用量に相当する用量
の量の局所調製物、または制御された放出組成物のような単位用量形態で、バッ
ケージされおよび投与され得る。PBSまたは凍結乾燥形態のいずれかで活性成分
の日用量を含む、隔膜でシールされたバイアルは、単位用量の例である。
活性な22マーの分子量は約2600であり、そしてこの配列内に含まれるヨード化
18マーは、血液脳関門を横切るので、22マーもまた、恐らくは中枢神経系を横切
りそして入り込む(Banksら、(1992) Peptides、13：1289-1294)。CNTF20マーお
よび他のサイトカイン由来のペプチドも、この関門を横切ることがまた予期され
る。約0.1〜約1000μg/kgの用量がまた予期されるが、脊椎動物の体重に基づく
適切な日々の全身用量は約10〜約100μg/kgの範囲内である。局所的に投与され
る物質の日用量は、ほぼ１桁大きさが小さい。ペプチドが胃腸管分解に安定でか
つ容易に吸収される場合、経口投与が可能であり得る。
本発明の１つの好ましい実施態様において、タンパク質またはペプチド因子が
この物質の移植によりインビボで局所的に神経細胞に投与される。例えば、ポリ
乳酸、ポリガラクティック酸(polygalactic acid)、再生コラーゲン、多重層リ
ポソームおよび多くの他の従来のデポー剤処方物は、生物学的に活性な組成物で
処方され得る生腐食性または生分解性物質を含む。これらの物質は、移植される
場合、徐々に分解し、そして周辺組織に活性物質を放出する。生腐食性、生分解
性および他のデポー剤処方物の使用は、本発明において特に予期される。注入ポ
ンプ、マトリックス包括系、および経皮送達デバイスとの組み合わせもまた予期
される。
本発明のタンパク質およびペプチド因子はまた、ミセルまたはリポソーム中に
有利に含まれ得る。リポソームカプセル化技術は周知である。リポソームは、標
的組織に結合し得る、レセプター、リガンドまたは抗体の使用を通じて、神経組
織のような特定の組織に標的され得る。これらの処方物の調製は当該技術分野で
周知である(すなわち、RadinおよびMetz、(1983)) Methods Enzymol.，98：613-
618)。
現在、神経系の十分な機能的再生および構造的完全性の回復を促進し得る入手
可能な薬剤はない。このことは、中枢神経系について特に真実である。神経栄養
因子の使用による末梢神経の再生は、より直接に論証し得るゴールである。その
ような処置は、本発明の範囲内にある。さらに、神経栄養因子は、脳の神経集団
または特定領域の変性に関連する神経変性疾患の処置に治療的に有用であり得る
。パーキンソン病の主要な原因は、黒質のドパミン作用性ニューロンの変性であ
る。プロサポシンに対する抗体は、ヒト脳切片における黒質のドパミン作用性ニ
ューロンを免疫組織化学的に染色するので、プロサポシンおよびその活性フラグ
メントは、パーキンソン病の処置において治療的に有用であり得る。新生ラット
の損傷部位に対するCNTFの局所投与は、対応する運動ニューロンの変性を予防す
ることが示されており、そしてCNTFはまた、進行する細胞死から運動ニューロン
を救い、CNTFペプチドまたは本発明の任意のペプチドの使用は、神経変性疾患に
おいて治療的利用を有し得る。
脳内のニューロン集団に到達するために、これらのタンパク質は血液脳関門を
横切らないので、神経栄養因子が脳内に投与されなければならないと長い間信じ
られていた。。しかし、先に述べたように、活性なヨード化18マーはこの関門を
横切り、そして活性な22マーは、多分この関門を横切り、そしてそれ故、静脈内
に投与される。脳脊髄液中への直接注入もまた別の経路として想像されるが、運
動ニューロンのような他のニューロン集団もまた静脈内注入により処置され得る
。
細胞は、インビトロ、エクスビボおよびインビボの両方で、上記の方法で、ミ
エリン形成を促進するために、またはミエリン脱落を予防するために処置され得
る。神経線維のミエリン脱落の結果を生じるいくつかの疾患があり、多発性硬化
症、急性散発性白質脳炎、進行性多病巣性白質脳炎、異染性白質萎縮症、および
副腎白質萎縮症を含む。これらの疾患は処置され得、そしてミエリン脱落の進行
は、疾患により影響される細胞への本発明の神経栄養因子の投与により遅延され
または停止され得る。ミエリン形成アッセイではプロサポシンおよびその誘導体
のみが試験されているけれども(実施例２)、20マーCNTFペプチドもまたミエリン
形成の増加を促進することが予期される。
本発明の組成物は、サイトカイン、神経栄養因子、およびミエリン形成促進物
質の影響を研究するための研究ツールとしてインビトロで使用され得る。しかし
、より実際的には、それらは、実験室試薬およびインビトロで細胞のより良好な
生育を可能にするために細胞生育培地の成分としての直接用途を有する。
本発明において用いられるプロサポシンは、種々の供給源から得られ得、そし
てヒト乳または精液プラスマから単離された天然に存在するタンパク質、あるい
は(Dewjiら、(1987) Proc．Natl．Acad．Sci．USA、84：8652-8656)、O'Brienら
、(1988) Science、241：1098-1011)；Hiraiwaら、(1993) Arch．Biochem．Biop hys.
，304、110-116)に記載されるように、ヒトプロサポシンのための完全長cDN
Aを含むバキュロウイルス発現ベクターに感染したSpodoptera frugiperda（Sf9
）細胞の消費培地から精製された組換えヒトプロサポシンであり得る。サポシン
Ｃは、リソソーム貯蔵障害であるGaucher病の患者の脾臓から精製形態で単離さ
れている(Morimotoら、(1990) Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87：3493-3497)。
サポシンＣ(80アミノ酸)はまた、化学的に合成されそして折り畳まれ得る(Weile
rら、(1993) J．Mol．Neurosci.，４：161-172)。
サポシンＣ内の配列に相当するペプチド、および本明細書で上記のその他のペ
プチドは、Applied Biosystems Model 430 ペプチド合成機を用いた自動化固相
プロトコールを用いて合成され得る。合成後、ペプチドは使用前セファデックス
Ｇ-75カラムで脱塩される。
実施例１ NS20Y神経突起伸長およびコリンアセチルトランスフェラーゼ活性に対する、プ ロサポシン、サポシン、CNTFおよびNGFの影響
NS20Y神経芽細胞を、10％のウシ胎児血清(FCS)および１mMのピルビン酸ナトリ
ウムを含むDulbecco改変Eagle培地(DMEM)中で生育させた。細胞をトリプシンを
用いて取り出し、そして30mmのペトリ皿中のスライドグラス上に置いた。20〜24
時間後、培地を、0.5％ウシ胎児血清とエフェクタータンパク質を含むDMEMで置
き換えた。細胞をさらに24時間培養し、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄し
、そしてブワン溶液(ピクリン酸飽和水溶液/ホルマリン/酢酸 15:5:1)で30分間
固定した。固定液をPBSを用いて除去し、そして神経突起伸長を位相差顕微鏡下
でスコア付けした。１つの細胞の直径に等しいまたより長いと明らかに規定され
る１つまたはそれ以上の神経突起を示す細胞を、ポジティブであるとスコア付け
した。各皿の異なる部分にある少なくとも200個の細胞をスコア付けし、神経突
起を有する細胞の百分率を測定し、そしてアッセイは２回行った。
用量応答曲線(図１a)は、プロサポシンがNS20Y神経芽細胞における可逆的な神
経突起伸長を促進することを示した。活性の最低濃度は、1.4×10-11M(10 ng/ml
)であり、これは他のニューロトロフィンの有効濃度範囲である。プロサシポシ
ンを取り除いた場合、神経突起伸長の退縮は36時間で終了し、このことは神経突
起伸長を維持するためにその連続的な存在が必要であることを示した。さらに、
サポシンＣは、サポシンＣ配列に由来する22マーおよびヨード化18マーペプチド
がそうであったように、神経突起原性(neurotogenic)活性を有することが見い出
されたプロサポシンの唯一のフラグメントであった。
神経成長因子(NGF)は、種々の細胞タイプに対して作用するので、本発明者ら
は、それが神経芽細胞におけるプロサポシン介在伸長に関与するかどうかを決定
することを試みた。NGFそれ自身は、NS20Y細胞における神経突起伸長に対して影
響を与えず、そしてプロサポシン応答を増強しなかった(図１b)。PC12Mクロム親
和性細胞腫細胞においてNGFで誘導される神経突起発生(neuritogenesis)を特異
的に阻害する、５'-メチルアデノシン(MeSAdo)を添加した場合、MeSAdoは、プロ
サポシンが誘導するNS20Y神経突起伸長を阻害しなかった。さらに、プロサポシ
ンは、高濃度(２mg/ml)でNGF応答性PC12M細胞からの神経突起伸長を阻害しなか
った。NS20Y細胞は、NGF応答性ではないので、このことは、NGF応答とプロサポ
シン応答とが異なることを示す。
CNTF由来の20マーペプチド(配列番号２)であるペプチド９もまた、NS20Y神経
芽細胞における神経突起伸長を刺激した(図１ｃ)。事実、ペプチド９は、モルベ
ースでCNTFに比べ約10倍高い濃度で神経突起伸長を刺激した。
ペプチド９およびCNTFによる神経突起伸長の刺激は、細胞表面糖タンパク質gp
130に対するモノクローナル抗体AM64により完全にブロックされた(図１d)。この
タンパク質はCNTFレセプター複合体のβレセプター成分であり、そしてCNTF誘導
信号変換に必要である。
次いでプロサポシン、その誘導体、CNTFおよびCNTF20マーのコリンアセチルト
ランスフェラーゼ(ChAT)を刺激する能力を測定した。ChATは、神経伝達物質アセ
チルコリンの合成を触媒する酵素であり、そしてこの酵素レベルの増加は、ニュ
ーロン分化の増加レベルを示す。
SKNMC神経芽細胞(American Type Culture Collection，Rockville，MD；ATCC
HTB 10)を、サポシンＣ、サポシンＣ22マー、プロサポシン、CNTF、CNTGペプチ
ド、ペプチド９またはサポシンＡのいずれかの200 ng/ml存在下で、48時間培養
した。次いでChAT活性を、アセチルCoAからコリンへの[14Ｃ]アセチル基の転移
により測定した(Fonnun、(1975) J．Neurochem.，24：407-409)。結果は、サポ
シンＡを除いてすべてのペプチドがChAT活性を刺激することを示した。
サポシンＣの異なる領域からの合成ペプチドのセットを利用して、活性配列を
さらに規定した。アミノ末端ペプチド(１〜40位)は活性で、そしてカルボキシ末
端ペプチド(41〜82位)は、非活性であった。さらなる４つのペプチドの試験(表
３)により、残基８〜29の間の領域に活性な配列をさらに狭めた。この領域は、
単一のグリコシル化部位(Asn22)をまた含むサポシンＣドメイン中で最も親水性
の領域である(図３a)。より高濃度の活性な22マー(残基８〜29位)が活性のため
に必要であったが、神経突起伸長の程度は、プロサポシンまたはサポシンＣより
大きかった(図１a)。残基18位と29位との間の配列は、高度に保存されていた(図
３b)。興味深いことに、ヒトサポシンＡは、この領域において、最初の４つの残
基を除いてサポシンＣとほぼ同一であり、このことは活性配列が、18位のロイシ
ン、ならびに残基21位および22位のアスパラギンまたはその両方の存在を必要と
することを示す。
応答にガングリオシドが関係するか否かを試験するために、当該技術分野で周
知の方法により、プロサポシン-ガングリオシドGM1複合体(4:1)を生成した。神
経突起伸長アッセイで試験したとき、この複合体は、無視し得るほどの活性を示
した。同様の結果が、ガングリオシドGM3-サポシンＣ複合体を用いて得られた。
このことは、神経突起原性効果が、ガングリオシド輸送の結果ではないことを示
し、その代わりにプロサポシンおよびサポシンＣに個別に起因することを示した
。
プロサポシンまたはそのフラグメントが非形質転換細胞における神経突起伸長
に対して影響するか否かを決定するために、新生マウス小脳の外植片を以下の実
施例に記載されるように用いた：
実施例２ マウス小脳の外植片における神経突起伸長に対するプロサポシンおよびその活性 フラグメントの影響
新生マウス小脳の外植片を、Satomi(Zool．Sci．９，127−137(1992))に従っ
て調製した。神経突起伸長およびミエリン形成が培養において22日間観察され、
その期間の間に新生マウス小脳は正常にニューロン分化を経験しそしてミエリン
形成が始まる。プロサポシン(５μg/ml)ならびにサポシンＡ、ＢおよびＣ(10μg
/ml)を、外植片調製後第２日目に添加し(３つのコントロールおよび３つの処理
外植片)、そして神経突起の伸長およびミエリン形成をビデオカメラを備えた明
視野顕微鏡下で評価した。第８日目に、プロサポシンおよびサポシンＣを含む培
養物は、コントロール培養より薄くそしてより広がった。15日目に、プロサポシ
ンおよびサポシンＣ処理培養物は、外植片の周縁で長い突起を有する多くの細胞
を含んでおり、それはコントロールまたはサポシンＡまたはＢで処理された外植
片ではより少なかった。サポシンＣ処理培養物は、22日目で、コントロールある
いはサポシンＡまたはＢで処理された培養物に比べ、皮質下白質中に２倍多いミ
エリン化軸索を含んでいた。視野あたり肉眼で観察されるミエリン化線維の数、
およびミエリンマーカー酵素CNPの活性の両方は、コントロール値の２倍であっ
た。これらの結果は、プロサポシンおよびサポシンＣの神経栄養効果が分化して
いる小脳、すなわちエクスビボでも起こることを示す。これらの結果は、プロサ
ポシンおよびサポシンＣの分化している小脳、すなわちエクスビボで増加するミ
エリン形成を誘導する能力をさらに示す。本明細書で上記に述べた規則に一致す
る任意のペプチド配列が、インビボでミエリン形成の増加を促進することに有用
であることがまた予期される。
プロサポシンは原形質膜で活性であるようなので、それは以下の実施例で示さ
れるように応答性細胞の原形質膜に存在すべきである。
実施例３
NS20Y細胞からのプロサポシンおよびサポシンＣのウェスタンブロット
NS20Y細胞を、生長培地の存在下75cmフラスコで集密まで生長させた。細胞を
かきとることにより回収し、そして表面膜を、50、48、45、43、40および35％シ
ュークロースの不連続勾配を用いてWarrenおよびGlick(1969)の亜鉛イオン法に
より単離した；表面膜は、40および43％シュークロース画分中に局在化する。こ
れらの画分、ならびにこれら画分を境する下(infranant)画分および上清画分を
、全細胞抽出物とともに10％SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニト
ロセルロースフィルター上に転移し、そしてサポシンＣに対するモノクローナル
抗体を用いて、当該技術分野で周知の方法によりプローブした。
ウェスタンブロット試験は、SDSポリアクリルアミドゲル上で68kDaバンドとし
て移動するプロサポシンが、NS20YおよびNeuro ２Ａ細胞の両方からの表面膜画
分に局在化していることを示した。成熟サポシンＣおよび中間分子量サポシン誘
導体は、膜画分の小数な成分であるが、全細胞抽出物では豊富であった。このこ
とは、プロサポシンが応答性細胞の原形質膜中に局在していることを示す。
プロサポシンを組織化学的に局在化するために、神経芽細胞株を以下の実施例
に例示するようにプロサポシン特異的抗体(JP-1)で免疫染色した：
実施例４
プロサポシンの免疫組織化学的局在化
細胞を、カバーグラス上で生育させ、PBSで３回洗浄し、そして室温で１時間
ブワン溶液で固定した。次いでブワン溶液を、PBSで５回洗浄してすすぎ落とし
、そしてカバーグラスを30％ヤギ血清、0.5％Tween 20を含むPBS中でインキュベ
ートし、非特異的結合をブロックした。そしてすすいだ後、４℃で一晩１：100
希釈のIgG精製ウサギJP-1中でインキュベートした。0.1％ Triton X-100を含むP
BSですすいだ後、調製物を、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG(BioRad，１
:2000)またはFITC結合ヤギ抗ウサギIgG(Cappel，１:2000)のいずれかとインキュ
ベートした。すすいだ後、ペルオキシダーゼ免疫染色をイミダゾールジアミノベ
ンジジン-H2O2反応を用いて検出した。蛍光免疫染色を、消光抑制剤としてNofad
eを用いて蛍光顕微鏡下で検出した。免疫前ウサギIgG(１：100)を、非特異的結
合のコントロールとして用いた。伸長した神経突起、原形質膜および成長円錐の
免疫染色が観察された。
同様の方法が死後のヒト脳切片を免疫染色するために使用され、反応性の細胞
タイプを検出した。前頭皮質において、大きなサイズおよび中程度のサイズのGo
lgiタイプ１ニューロンの核周囲部(perikarya)の強い染色が観察された。小丘(h
illock)領域で、ニューロンの核周囲部の表面および軸索丘領域での軸索の近位
セグメントもまた、いくつかの伸展した軸索でそうであったように、強く染色さ
れた。小脳において、Purkinje細胞および星状細胞の強い染色が、小脳核(歯状
核、栓状核、および球形核)における大ニューロンと同様に観察された。小脳顆
粒細胞は、中程度に染色された。中脳においては、黒質のドーパミン作用性ニュ
ーロンにおいて中程度の染色が観察された。赤核中の大ニューロン、動眼神経核
中のニューロン、類扁桃核および側脳室を裏打ちする上衣細胞もまた中程度に染
色された。海馬においては、錐体細胞および歯状回の顆粒細胞が強く染色された
。脊髄においては、α運動ニューロンが強く染色された。この測定はプロサポシ
ンが、上位および下位運動ニューロンを含む大ニューロンの集団に局在すること
を示した。
ここまで同定されたすべてのニューロトロフィンは、細胞表面レセプターに結
合し、そしてキナーゼのカスケードを開始することによりそれらの効果を奏する
ので、以下の実施例に記載されるように、プロサポシンまたはそのフラグメント
で処理されたNS20Y細胞において、リン酸化アッセイを行った：
実施例５ プロサポシンまたはその活性フラグメントによる処理後のNS20Yタンパク質中へ の32Ｐの取り込み
NS20Y細胞を、2.5μg/mlアクチノマイシンＤ、キャリアを含まない80〜100μC
i/mlの[32Ｐ]オルトリン酸(New England Nuclear)、およびエフェクタータンパ
ク質(0.5〜1.0μg/ml)を含む、無リン酸のHanks平衡塩類溶液中でインキュベー
トし、そして室温で10〜15分間インキュベートした。細胞をSDS-PAGE試料緩衝液
で可溶化し、SDS-PAGEで分析し、そしてオートラジオグラフを行った。
プロサポシン、サポシンＣおよび配列番号１は、148、100、80、68、50、38お
よび34KDaのタンパク質のリン酸化を、コントロールまたは類似濃度のサポシン
Ａ、ＢまたはＤで処理された細胞に比べより強く刺激することが見い出された。
この148KDaのタンパク質は、ホスホリピドの代謝に関与することが知られている
タンパク質ホスホリパーゼＣ-γであり得、そしてそれは多くの成長因子に応答
してチロシン残基でリン酸化される。デンシトメーターによる分析は、10分後リ
ン酸化の３〜５倍の刺激を示した。ゲルをアルカリで処理することにより、顕著
なリン酸化タンパク質はアルカリ耐性であることを示し、それらがホスホチロシ
ンおよび/またはホスホスレオニン(プロリンの次に位置する)残基を含むことを
示した。これらの結果は、他のニューロトロフィンおよび成長因子と同様に、プ
ロサポシンおよびその活性なフラグメントが細胞表面レセプターに結合し、そし
てキナーゼカスケードを活性化することを示す。
プロサポシン-ガングリオシドGM1複合体またはサポシンＣ-ガングリオシドGM3
複合体は、神経突起発生を阻害し、その一方プロサポシンまたはサポシンＣ単独
は、このプロセスを促進するので、このことは、ガグリオシドがニューロトロフ
ィン上のレセプター結合部位をマスクすることにより神経突起原性活性をなくし
得ることを示す。さらに、プロサポシンおよびその活性なフラグメントは、応答
性細胞の細胞質タンパク質のチロシンリン酸化を誘導するので(恐らくサイトカ
インおよび成長因子と同様にチロシンキナーゼ(類)の活性化により)、このこと
は、細胞表面レセプターが関係することの証拠をさらに提供する。
20KDaタンパク質が、以下の実施例に記載されるように、プロサポシンの推定
レセプターとして同定された：
実施例６
プロサポシンレセプターの単離
推定プロサポシンレセプタータンパク質を、原形質膜P-100画分を用いて、ラ
ット全脳、ラット小脳およびマウス神経芽細胞から単離した。簡単に述べれば、
細胞または組織を可溶化し、そして14,000rpmで遠心分離して残渣を除去した。
上清を40,000rpmで１時間４℃で遠心分離した。原形質膜が濃縮されたペレット
を、RIPA緩衝液(10 mM MOPS、pH7.5、0.3Mスクロース、５mM EDTA、１％ Trasyl
ol、10μMロイペプチンおよび10μMアンチペイン)中で可溶化した。このP-100画
分を、サポシンＣの結合した活性な22マーフラグメントを含むアフィニティーカ
ラムに付与した。カラムを0.05M NaClで洗浄してゆるく結合したタンパク質を溶
出し、次いで0.25M NaClで洗浄して、推定の60kDaプロサポシンレセプターを溶
出した。さらに、60kDaタンパク質を、100倍過剰の非結合ペプチドを用いて溶出
し得ることが決定され、それ故特異的溶出を示した。60kDaタンパク質は、SDS-P
AGEにより判定されるように、約90％純粋であった。このタンパク質を、HPLCを
用い均質に精製し、そしてVydac C4カラム上のアセトニトリル/水勾配中50％ア
セトニトリルで溶出した。架橋剤ジサクシンイミジルスベレート(DSS；Pierce、
Rockford、IL)で処理した後、60kDaタンパク質を、複合体の72kDaの分子量(60kD
a＋12kDa)により証明されるように、不可逆的に125Ｉ標識サポシンＣに結合させ
た。
実施例７
中枢神経系によるインビボペプチド取り込み
サポシンＣのアミノ酸12〜29位からなり、12位のバリンをチロシンに置き換え
た18マーペプチドを、Applied Biosystems Model430ペプチド合成機を用いて化
学的に合成した。次いでこのペプチドを、ラクトペルオキシダーゼ法により、放
射性ヨード処理し、そして20×106cpmをラット耳介(auricle)中に注入した。動
物を、１時間および24時間後に屠殺し、そして脳から血液を除去するために等張
生理食塩水で心臓を潅流した。次いで脳を、ペプチド取り込みのパーセントを測
定するためにγカウンターで計測した。さらに、24時間実験で、脳をホモゲナイ
ズし、そしてデキストラン遠心分離(Trigueroら、(1990) J.Neurochem.，54：18
82-1888)後、毛細管豊富な画分(ペレット)および脳実質画分(上清)に分離した。
この方法は、血管内の放射標識ペプチドと脳内のそれとの区別を可能にする。24
時間実験で、注入ペプチドの0.017％が脳全体で検出された；この標識の75％が
実質画分で、そして25％が毛細管画分で検出された。１時間では、注入用量の0.
03％が脳全体に存在した。
実施例８ インビボにおけるCNSに対する外傷性虚血性損傷の治療におけるプロサポシンお よびその活性フラグメントの使用
脊髄に外傷性損傷を有するラットに、プロサポシン、その活性フラグメントま
たは本明細書で上記に記載したコンセンサス配列に一致するペプチドを、殺菌生
理食塩水中または遅延放出を可能にするためにデポー剤形態中、10ng〜10mg/ml
の範囲で、直接または静脈内投与する。同数の動物に生理食塩水のみを投与する
。脊髄の外科的な部分的切断または挫傷性損傷の後、プロサポシンまたはその神
経栄養性フラグメントを、同一用量範囲(コントロール動物は、生理食塩水注入
を受ける)を用いて損傷部位に直接注入し、そして改善を、運動ニューロン機能
の獲得(即ち、四肢の動きの増加)により評価する。さらなる改善が生じなくなる
まで処置を続ける。プロサポシンおよびその活性フラグメントは非常に水溶性な
ので、調製のための特別な送達系は不要である。分解の機会が少ないので、ペプ
チ
ドの注入が好ましく、そして拡散はより大きくなる。さらにこれらのフラグメン
トは、大量に化学的に合成し得る。
実施例９ ミエリン脱落疾患の治療におけるプロサポシンおよびその活性フラグメントの使 用
初期段階のMS(またはその他のミエリン脱落疾患)と診断された患者に、サポシ
ンＣの活性18マーまたは22マーフラグメント、あるいは任意のサイトカイン由来
のコンセンサスペプチド(生理食塩水中)を、実施例７と同一用量範囲を用いて、
直接静脈内注入または脳脊髄液中への注入により投与する。コントロール患者に
は、生理食塩水のみを投与される。処置は、毎週または毎月投与され、そして任
意の改善を、筋肉強度、筋骨格協調の増加により評価し、そして磁気共鳴画像に
よりミエリン形成を評価する。
実施例１０ 網膜神経障害の治療におけるプロサポシンまたはその活性フラグメントの使用
網膜神経障害は、老人において視力の喪失に至る視神経変性疾患であり、プロ
サポシンおよびその活性フラグメントにより処置可能な疾患であると考えられる
。プロサポシン、その活性な神経栄養性フラグメント、または本明細書で上記に
記載されたコンセンサスペプチドの１つを、局所的、全身的または眼内のいずれ
かで、約10ng/ml〜約10μg/mlのニューロトロフィンの局所濃度を生じるに十分
な量で投与する。投与を、視力喪失が遅延されるか視力のさらなる増加が認めら
れなくなるまで毎週継続する。
実施例１１ IL-6由来のペプチドによるTNF放出の阻害
表２に記載されたIL-6由来のペプチド(配列番号９)、上流アスパラギンの代わ
りにアスパラギン酸残基を含む変異PSSペプチド、またはかき集めた(scrambled)
コントロールペプチドを、培養中のマクロファージに添加する。非処理の培養は
コントロールとして作用する。マクロファージを細菌性リポポリサッカライド(L
PS；Sigma，St．Louis，MO)の添加により活性化し、炎症カスケードを開始するT
NFを培養培地中に放出させる。IL-6は、TNFのLPS誘導放出を阻害することが知ら
れている(Aderkaら、(1989) J.Immunol.，143：3517−3523)。LPS刺激に先だっ
て、IL-6ペプチドで処理した培養では、放出TNF量は、このペプチドを与えられ
なかった培養に比べて有意に減少した。TNF放出の阻害の程度は、IL-6およびIL-
6由来ペプチドの両方について同様であり、その一方変異およびかき集めたペプ
チドはTNF放出を阻害しない。
実施例１２ EPO由来のペプチドによる赤血球生成の刺激
フェニルヒドラジン処理マウスからの脾臓由来の赤血球始原細胞を、周知の技
法を用いて培養する。次いで細胞を、組換えヒトEPO、EPO由来のペプチドまたは
上流アスパラギンの代わりにアスパラギン酸残基を含む変異EPOペプチドのいず
れかで処理する。細胞増殖を、培養３日後のDNA中への[3H]-チミジンの取り込み
により測定する(Krystal，(1983) Exp．Hemotol.，11：649-654)。次いで細胞を
洗浄し、溶解し、そして取り込まれたチミジンをシンチレーション計測により測
定する。EPOおよびEPO由来のペプチドは、[3H]-チミジン取り込みを有意に刺激
するが、変異ペプチドはコントロールレベルを超えて取り込みを刺激しない。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 1/22 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/52
7/08 8517−4Ｈ 14/54
14/475 ＺＮＡ 8517−4Ｈ 14/545
14/52 8517−4Ｈ 14/55
14/54 8517−4Ｈ 14/71
14/545 8517−4Ｈ 14/715
14/55 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ
14/71 ＡＡＭ
14/715 ＡＥＤ
Ｃ１２Ｎ 5/06 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ
(72)発明者 オーブリエン，ジョン エス.
アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122,
サン ディエゴ，エンジェル アベニュー
2753
(72)発明者 キシモト，ヤスオ
アメリカ合衆国 カリフォルニア 92128,
サン ディエゴ，ロイヤル メルボルン
スクウェア 13771
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．神経細胞の成長またはミエリン形成の増加を刺激する方法であって、ニュー ロン細胞を、プロサポシン、サポシンＣ、もしくは神経成長の増加またはミエリ ン形成活性の増加を促進する能力を有する能力を有する請求項２６に記載のペプ チドと接触させる工程を包含する、方法。 ２．前記プロサポシンがネイティブである、請求項１に記載の方法。 ３．前記プロサポシンが組換え生産される、請求項１に記載の方法。 ４．前記組成物がサポシンＣを包含する、請求項１に記載の方法。 ５．前記ペプチドがサポシンＣのアミノ酸８〜29を包含する、請求項１に記載の 方法。 ６．前記フラグメントが、配列番号１のアミノ酸８〜29内に位置する活性な神経 栄養フラグメントから本質的になる、請求項５に記載の方法。 ７．前記ニューロン細胞が神経芽腫細胞である、請求項１に記載の方法。 ８．前記ペプチドが、配列番号２または７〜14から本質的になる、請求項１に記 載の方法。 ９．前記ニューロン細胞がインビトロで接触される、請求項１に記載の方法。 １０．前記ニューロン細胞がインビボで接触される、請求項１に記載の方法。 １１．前記細胞がマウス小脳体外移植片由来である、請求項１に記載の方法。 １２．神経組織における神経またはミエリン脱落疾患の治療のための薬学的調製 物であって、薬学的に受容可能な賦形剤とともにプロサポシン、その神経栄養フ ラグメント、または請求項２６に記載のペプチドを含む、調製物。 １３．前記フラグメントがサポシンＣを含む、請求項１２に記載の調製物。 １４．前記ミエリン脱落疾患が、多発性硬化症、急性播種性白質脳炎、進行性多 病巣性白質脳炎、および副腎白質萎縮症からなる群から選択される、請求項１２ に記載の調製物。 １５．前記プロサポシンまたはそのフラグメントが層状構造に封入される、請求 項１２に記載の調製物。 １６．プロサポシンのフラグメントを含む中枢神経系または末梢神経系のニュー ロン変性疾病の治療のための薬学的調製物であって、ここで、該フラグメントが 薬学的に受容可能な賦形剤とともに配列番号１のペプチドの神経栄養活性を含む 、調製物。 １７．前記疾病が中枢神経系の疾病であり、そして前記フラグメントが血液脳関 門を横切るために選択される、請求項１６に記載の調製物。 １８．前記疾病がアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、ポリオ後症候群、 および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、請求項１７に記載の調製 物。 １９．網膜神経障害の治療のための薬学的調製物であって、薬学的に受容可能な 賦形剤とともにプロサポシンまたはその神経栄養フラグメントを含む、調製物。 ２０．前記網膜神経障害が黄斑変性である、請求項１９に記載の調製物。 ２１．薬学的に受容可能な賦形剤とともにプロサポシンまたはその神経栄養フラ グメントを単位用量形態で含む、薬学組成物。 ２２．制御される放出物質とともに製剤化されたプロサポシンまたはその神経栄 養フラグメントを含む、薬学組成物。 ２３．単離されたまたは精製された形態の神経のプロサポシンレセプタータンパ ク質。 ２４．前記レセプターが、固体支持体に結合したサポシンＣ配列内に含まれる神 経突起伸長誘導ペプチドを用いるアフィニティー精製により、P100原形質膜から 単離される、請求項２３に記載のレセプタータンパク質。 ２５．前記レセプターが約60kDaの分子量を有する、請求項２３に記載のレセプ タータンパク質。 ２６．約12と約50との間のアミノ酸を有し、そしてコンセンサス配列XNNYZを含 む活性な神経栄養ペプチドであって、ここで、Nはアスパラギンであり、そしてX 、Y、およびZは、哺乳動物タンパク質において天然に存在するアミノ酸であり、 該コンセンサス配列は以下を含み： ２つの隣接するまたは次に隣接するアスパラギン残基； 該アスパラギン残基からＮ末端方向に向かって３または４残基であるロイシン またはイソロイシン残基X； １またはそれ以上の荷電アミノ酸残基Y、ここで、Yは、該アスパラギン残基か らＣ末端方向に向かって２〜８残基に位置する；および １またはそれ以上の疎水性残基Z、ここで、Zは、該アスパラギン残基のＣ末端 方向に向かって６〜10残基に位置し、ここで、該ペプチドは細胞中に神経突起形 成を誘導する。 ２７．前記アスパラギン残基が１つのアミノ酸により分離されている、請求項２ ６に記載のペプチド。 ２８．前記ペプチドがサイトカイン由来である、請求項２６に記載のペプチド。 ２９．約12と約50との間のアミノ酸を有し、そしてコンセンサス配列XNNYZを含 むペプチドであって、ここで、Nはアスパラギンであり、そしてX、Y、およびZは 、哺乳動物タンパク質において天然に存在するアミノ酸であり、該コンセンサス 配列は以下を包含する： ２つの隣接または次に隣接するアスパラギン残基； 該アスパラギン残基からＮ末端方向に向かって３または４残基のロイシンまた はイソロイシン残基X； １またはそれ以上の荷電アミノ酸残基Y、ここで、Yは、該アスパラギン残基の Ｃ末端方向に向かって２または８残基に位置し；および １またはそれ以上の疎水性残基Z、ここで、Zは、該アスパラギン残基からＣ末 端方向に向かって６〜10残基に位置し、ここで、該ペプチドはサイトカイン由来 であり、そしてそれが由来するサイトカインとして同じプロセスを促進する。 ３０．前記サイトカインがインターロイキン-1、インターロイキン-2、インター ロイキン-3、白血球阻害因子、エリトロポイエチン、インターロイキン-6、また はオンコスタチン-Mである、請求項２９に記載のペプチド。 ３１．配列番号２、７、８、９、または10の活性を含み、そしてそれぞれCNTF、 IL-6、IL-2、IL-3、またはIL-γのABループの約12〜約50アミノ酸を含む、請求 項２９に記載のペプチド。 ３２．配列番号13または14の活性を含み、そしてそれぞれIL-1βのヘリックスＣ またはオンコスタチン-M由来の約12〜約50アミノ酸を含む、請求項２９に記載の ペプチド。 ３３．前記次に隣接するアスパラギン残基を分離する１つのアミノ酸がイソロイ シンではない、請求項２７に記載のペプチド。 ３４．配列番号１１または配列番号１２の活性を有し、それぞれエリトロポイエ チンまたは白血球阻害因子のABループの約12〜約50のアミノ酸を含む、活性な神 経栄養ペプチド。
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