SK283677B6

SK283677B6 - Použitie dipeptidu R'-Glu-Trp-R'' na liečenie neovaskularizácie

Info

Publication number: SK283677B6
Application number: SK423-98A
Authority: SK
Inventors: Lawrence R. Green; John W. Blasecki
Original assignee: Cytran, Ltd.
Priority date: 1995-10-03
Filing date: 1996-10-02
Publication date: 2003-11-04
Also published as: IL123889A0; CZ298345B6; BR9610838A; AU714846B2; EA001146B1; JPH11504943A; PL186123B1; US6096713A; NZ319907A; MX9802564A; EP0869808B1; ES2268710T3; NO981436D0; CZ91398A3; US20060094665A1; EP0869808A1; CA2233457A1; DE69636343D1; SK42398A3; US5902790A

Abstract

Použitie dipeptidu R'-Glu-Trp-R'', analógu dipeptidu R'-Glu-Trp-R'' alebo ich farmaceuticky prijateľnej soli na výrobu farmaceutického prostriedku na inhibíciu neovaskularizácie v subjekte, pričom R' a R'' chýbajú alebo znamenajú zvyšok nezávisle vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje amid, imid, ester, anhydrid, éter, metyl-alkyl, etyl-alkyl ester, alkylovú skupinu a arylovú skupinu, kde R' môže znamenať aj amidovú väzbu medzi amínom uvedeného Glu a bočným reťazcovým karboxylátom uvedeného Glu, pričom pomerná molekulová hmotnosť uvedenej zlúčeniny je menšia ako približne 5000 Daltonov. ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa všeobecne vzťahuje na použitie peptidov s angiostatickými vlastnosťami na výrobu farmaceutických prostriedkov na liečenie neovaskularizácie, pričom sa týka najmä použitia angiostatických dipeptidov obsahujúcich tryptofán alebo jeho analóg.

Doterajší stav techniky

Neovaskularizácia, vznik nových krvných ciev, sa začína v raných štádiách embryogenézy a tiež počas hojenia rán, remodelovania tkanív a pravdepodobne počas normálneho chodu udržiavania cievnej sústavy. Procesy zúčastňujúce sa neovaskularizácie zahŕňajú prinajmenšom aktiváciu endotelových buniek a pericytov; degradáciu bazálnej membrány; migráciu a proliferáciu endotelových buniek a pericytov; tvorbu nového lumenu kapilárnej cievy; objavenie sa pericytov okolo nových ciev; vývoj novej bazálnej membrány; tvorbu kapilárnej slučky; pretrvávanie involúcie s diferenciáciou nových ciev; tvorbu kapilárnej siete; a prípadne organizovanie siete do väčších mikrociev.

Je známe, že určité cytokíny neovaskularizáciu deregulujú. Patrí sem interleukín-12 (IL-12), transformujúci rastový faktor-β (TGF-β), interferon-α (IFN-a) a trombocytámy faktor 4 (PF-4). Ukázalo sa však, že klinické skúsenosti s cytokínovou terapiou sú problematické v dôsledku toxicity niektorých z týchto zlúčenín.

Je množstvo patologických stavov, v ktorých angiogenéza buď hrá nejakú úlohu alebo je priamo zahrnutá do rôznych následných komplikácií ochorenia. Patrí sem napríklad neovaskularizácia nádorov v prípade rakoviny; vznik hemangiómov; neovaskularizácia spojená s rôznymi chorobami pečene; angiogénna dysfunkcia v dôsledku hormonálneho nadbytku; neovaskuláme komplikácie cukrovky; neovaskulárne komplikácie zvýšeného krvného tlaku; neovaskularizácia počas zotavovania z mozgovocievnej príhody; neovaskularizácia v dôsledku úrazov hlavy; neovaskularizácia pri chronickej infekcii pečene; restenóza po angioplastike; a neovaskularizácia po traumách z tepla alebo chladu.

Hoci angiogenéza je bezpochyby vítaná na udržiavanie zdravej cievnej sústavy , klinická medicína by ocenila možnosť netoxickej prechodnej deregulácie neovaskularizácie, čiže zavedenie dočasnej angiostázy.

Podstata vynálezu

Je známe, že L-Glu-L-Trp stimuluje produkciu imunitných buniek a normalizuje pomer ich počtu pri imunodeficientných stavoch. (Pozri napríklad WO 89/06134, WO 92/17191 a WO 93/08815.) Bolo však zistené, že dipeptid má aj angiostatickú aktivitu nezávislú od jeho účinkov pri imunodefícientných stavoch. Výsledky in vitro štúdií ukázali, že nízke hladiny dipeptidu L-Glu-L-Trp potláčajú neovaskularizáciu kuracích chorioalantoických membrán počas embryogenézy. V štúdiách na zvieratách L-Glu-L-Trp potláčal neovaskularizáciu Lewisovho pľúcneho nádoru, ak bol injikovaný intradermálne do myší kmeňa C57BL/6, a potláčal rast Sarkómu 180 v myšiach kmeňa Swiss-Webster.

Predmetom vynálezu je použitie dipeptidu R’-Glu-Trp-R”, analógu dipeptidu R’-Glu-Trp-R” alebo ich farmaceutický prijateľnej soli na výrobu farmaceutického prostriedku na inhibíciu neovaskularizácie v subjekte, pričom R' a R chýbajú alebo znamenajú zvyšok nezávisle vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje amid, imid, ester, anhydrid, éter, metyl-alkyl ester, etyl-alkyl ester, alkylovú skupinu a arylovú skupinu, kde R' môže znamenať aj amidovú väzbu medzi amínom a uvedený Glu a bočný reťazcový karboxylát uvedeného Glu, pričom pomerná molekulová hmotnosť uvedenej zlúčeniny je menšia ako približne 5000 Daltonov.

Neovaskularizácia zahŕňa: hemangiómy; vaskularizované malígne a benígne nádory vrátane nádorov blán ústredného nervstva, vnútromozgových nádorov, sarkómov, osteosarkómov, nádorov mäkkých tkanív, ako sú nádory hltanu a hrtanu; látkami indukovaná neovaskularizácia pečene vrátane tej, ktorá bola indukovaná sekundárne po požití lieku, alkoholu alebo návykových látok; angiogénna dysfunkcia v dôsledku hormonálneho nadbytku, napríklad estrogénu; neovaskulárne komplikácie cukrovky, napríklad centrálna serózna chorioretinopatia; neovaskuláme komplikácie zvýšeného krvného tlaku; neovaskularizácia počas zotavovania z mozgovocievnej príhody; neovaskularizácia v dôsledku úrazov hlavy; chronická infekcia pečene (napríklad chronická hepatitída); restenóza po angioplastike; a neovaskularizácia v dôsledku tráum z tepla alebo chladu, ako je napríklad úpal alebo omrzliny. Dipeptid má túto aktivitu aj u subjektov so zdravým imunitným systémom, čiže tak u tých, ktorí nie sú imunologický oslabení, ako aj u tých, ktorí majú oslabený imunitný systém.

Súčasný vynález poskytuje farmaceutické Glu-Trp prostriedky zahŕňajúce dipeptid R’-Glu-Trp-R” a farmaceutický prijateľný nosič. Dipeptid R’-Glu-Trp-R”, ako sa používa tu, sa vzťahuje na dipeptid L-Glu-L-Trp a na jeho deriváty a analógy.

Ako sa používa tu, derivát dipeptidu R’-Glu-Trp-R” zahŕňa tie deriváty', v ktorých je dipeptid odvodený kovalentným pripojením časti na R’ a/alebo R”. Toto zahŕňa napríklad farmaceutický prijateľné soli dipeptidu, amidy, imidy, estery, anhydridy, étery, metyl- alebo etylalkylestery, alkyl, aryl alebo zmiešané alkyl/aryl-deriváty, v ktorých molekulová hmotnosť je nižšia ako asi 5000 daltonov alebo menej ako 1000 daltonov, multiméme alebo cyklické verzie dipeptidu a peptidov obsahujúcich menej ako asi 20 aminokyselín alebo menej ako asi 10 aminokyselín ktoré obsahujú vo svojej aminokyselinovej sekvencii Glu-Trp. Reprezentatívne príklady zahŕňajú HEW, EWEW, GEW, EWKHG, EWKKHG, EW-NH-NH-GHK-NH₂, Ac-L-GluL-Trp-OH, Suc-EW, Cpr-EW, But-EW, RKEWY, RKEW, KEWY, KEWapEW.

Ako sa tu používajú, analógy dipeptidu R’-Glu-Trp-R” zahŕňajú analógy, v ktorých L-aminokyseliny sú substituované D-aminokyselinami, ako je napríklad L-Glu-D-Trp, D-Glu-L-Trp alebo D-Glu-D-Trp, a analógy tryptofánu ako je napríklad 5-hydroxy-tryptamín, kyselina 5-hydroxyindoloctová a analógy pyrolu, v ktorých je dusík v pyrolovom prstenci nahradený uhlíkom.

L-Glu-Trp-L je v súčasnosti najvýhodnejší dipeptid R’-Glu-Trp-R”. L-Glu-L-Trp sa tu tiež striedavo spomína ako „EW“ a „dipeptid EW“ s použitím konvencie jediného písmena, kde prvá uvedená aminokyselina je amino-koniec a posledná uvedená aminokyselina je karboxylový koniec.

Ako sa používa tu, „neovaskularizácia“ sa vzťahuje na vznik nových krvných ciev. Proces, v ktorom nové krvné cievy vznikajú, môže zahŕňať proces aktivácie endotelových buniek a pericytov; degradáciu bazálnej membrány; migráciu a proliferáciu (t. j. bunkové delenie) endotelových buniek a pericytov; tvorbu nového lumenu kapilárnej cievy; objavenie sa pericytov okolo nových ciev; vývoj novej bazálnej membrány; tvorbu kapilárnej slučky; pretrvávanie involúcie s diferenciáciou nových ciev; tvorbu kapilárnej siete, a prípadne organizovanie siete do väčších mikrociev. Ako je to spomínané tu, proces proliferácie endotelových buniek, napríklad v cievnom zárodku, sa nazýva „angiogenéza“ a vzťahuje sa na neovaskularizáciu ako na podproces. Reprezentatívne klinické diagnostické prejavy ochorení už boli klasifikované a kodifikované (pozri napríklad International Classification of Diseases, ICD-9-CM, Washington,

D. C., 1989). Reprezentatívne laboratórne indície neovaskularizácie zahŕňajú (ale nie sú obmedzené iba na) údaje napríklad pochádzajúce z angiogramov, z obrázkov počítačovej tomografie a zo sonogramov, ako aj z vizuálneho vyšetrenia pomocou endoskopických a/alebo kapilaroskopických postupov.

Ako sa tu používajú, výrazy „angiostáza“, „angiostatický“ a „inhibícia neovaskularizácie“ znamenajú, že pomer alebo rozsah neovaskularizácie v tkanive je znížený z hodnoty pred liečbou na hodnotu po liečbe. Angiostáza môže byť určená pomocou laboratórnych alebo klinických indícií aktivity choroby. Angiostáza môže zahŕňať inhibíciu jedného alebo viacerých podprocesov zúčastňujúcich sa neovaskularizácie, napríklad proliferáciu alebo migráciu endotelových buniek alebo buniek hladkého svalstva ciev.

Ako sa tu používa, výraz „subjekt“ sa vzťahuje na cicavcov vrátane ľudoopov a iných primátov, domácich zvierat a dobytka, kožušinových zvierat a pod., napríklad psov, mačiek, hlodavcov, vtákov, koní, kráv, ošípaných, rýb, a pod. Aplikácia vynálezu zahŕňa terapeutické a profylaktické liečebné postupy na použitie u subjektov, ktoré to potrebujú.

Ako sa tu používa, výraz „imunologický oslabený“ sa vzťahuje na osobu, ktorá má menší než normálny počet jedného alebo viacerých druhov buniek imunitného systému, ako sú napríklad NK bunky, T4 alebo T8 T lymfocyty, B lymfocyty alebo fagocyty stanovené pomocou štandardných klinických diagnostických indícií. Zahŕňa aj jednotlivcov so zníženou funkciou imunitných buniek stanovenou štandardnými funkčnými testami takých buniek, ako je napríklad produkcia imunoglobulínov, chemotaxia, zmiešaná leukocytáma reakcia alebo test oneskorenej hypersenzitivity. Imunologický oslabení jedinci majú často neobvyklé alebo neočakávané oportunistické infekcie.

„Polypeptid“ bude znamenať sériové usporiadanie 16 a viac aminokyselín a až do stoviek čo sa týka dĺžky, napríklad proteín.

„Abnormálny“, ako sa používa tu, sa vzťahuje na laboratórne indície neovaskularizácie, ktoré sú mimo rozsah hodnôt zaznamenaných u zdravých jedincov.

„Normalizovaný“, ako sa používa tu, sa vzťahuje na zmeny v laboratórnych alebo klinických indíciách neovaskularizácie, ktoré sú po liečbe vrátené do normálneho rozpätia hodnôt známych u zdravých jedincov. Subjekt bez cievneho defektu a bez známej dcficiencie v koagulačnom, fibrinolytickom alebo cievnom systéme sa tu označuje striedavo aj ako „normálny subjekt“.

Ako sa používajú tu, výrazy „modulátor“ a modulačný“ znamenajú prostriedok a proces znižovania neovaskularizácie alebo angiogenézy u normálneho subjektu alebo u subjektu so zníženou schopnosťou.

Liečba R’-Glu-Trp-R” bude znamenať spôsob podania farmaceutického prostriedku R’-Glu-Trp-R” subjektu, ktorý to bude potrebovať, s cieľom indukovať zníženie pomeru alebo rozsahu neovaskularizácie alebo angiogenézy.

V jednej súčasne výhodnej aplikácii farmaceutický prostriedok R’-Glu-Trp-R” sa podáva onkologickému pacientovi v množstve a trvaní, ktoré sú dostatočné na zníženie jednej alebo viacerých laboratórnych indícií neovaskularizácie alebo angiogenézy, tým umožňujúc zlepšenie kli nického stavu takto liečeného pacienta. Tento postup znižuje neovaskularizáciu v nádore, potláča zásobovanie nádoru krvou, a tým potláča aj rast nádoru.

Vo výhodnej aplikácii terapeutický režim pozostáva z podávania subjektu dávky asi 0,5 pg na 1 kilogram telesnej hmotnosti až 1 mg na 1 kg telesnej hmotnosti denne počas 1 dňa až asi 30 dní. Vo výhodných aplikáciách sa dávka aplikuje buď ako jednorazová vnútrosvalová dávka farmaceutického prostriedku R’-Glu-Trp-R” (intramuskuláme), alebo ako jednorazová denná vnútronosová dávka farmaceutického prostriedku R’-Glu-Trp-R” (intranazálne). Dávka sa výhodne formuluje ako sterilné, injikovateľné, inhalačné nosové kvapky, alebo ako roztok sliznicového spreja s obsahom asi 0,001 % až asi 0,01 % farmaceutického prostriedku R’-Glu-Trp-R”. Podobne, formulácia farmaceutického prostriedku R’-Glu-Trp-R” sa môže výhodne začleniť do jednotkovej dávky formy podania, ako napríklad do tabletky, čapíku, tobolky, očného filmu, do pasty alebo masti, napríklad do zubnej pasty, kožnej masti alebo základu pasty rozpustnej vo vode. Najvýhodnejšia forma jednotkovej dávky na podanie je približne 0,01 mg farmaceutického prostriedku R’-Glu-Trp-R”.

Predmetné použitia vynálezu nachádzajú veľké množstvo rôznych foriem uplatnení v profylaxii a terapii v liečbe patofyziologických stavov u človeka a domácich zvierat. V určitých aplikáciách sa spôsoby vynálezu uplatňujú počas in vitro údržby kultúr endotelových buniek a cievnych tkanív. ktoré sa napríklad môžu vyskytnúť pred autológnou alebo alogénnou transplantáciou. Spôsoby zahŕňajú udržiavanie kultúr endotelových buniek alebo kultúr cievneho tkaniva in vitro kultiváciou týchto tkanív v kultivačnom médiu obsahujúcom zlúčeninu R’-Glu-Trp-R”. Predmetný spôsob údržby má výhodu udržania cievnych tkanív a zníženia zápalových zmien vyvolaných traumou tkanív, ktoré sa vyskytujú počas chirurgického odstraňovania a uchovávania v tkanivovej kultúre.

V reprezentatívnom profylaktickom režime liečby sa predmetné zmesi vynálezu podávajú pacientovi, ktorý je citlivý alebo inak rizikový na vznik neovaskularizácie, napríklad v pooperačnom použití na zabránenie vzniku neovaskularizácie pri opätovnom výskyte primárneho nádoru alebo jeho metastázujúcich buniek. „Profylaktický účinná dávka“ sa tu používa vo význame dávky, ktorá je dostatočná na vyvolanie angiostatického účinku v tkanive, pričom množstvo bude závisieť od zdravotného stavu pacienta a jeho hmotnosti, ale bude všeobecne v tom rozmedzí, ako to bolo opísané na terapeutické použitie. Profylaktické podanie môže byť osobitne žiaduce pre subjekty, u ktorých je vysoké riziko vzniku komplikácií ochorenia vrátane neovaskularizácie alebo angiogenézy, napríklad vznik diabetickej retinopatie.

Aplikácia vynálezu zahŕňa terapeutické liečebné režimy, kde farmaceutický prostriedok R’-Glu-Trp-R” sa podáva samostatne alebo v kombinácii s ďalším farmaceutickým činidlom, t. j. „kombinovaná terapia“. Reprezentatívne kombinované terapie zahŕňajú terapie, v ktorých zmes R’-Glu-Trp-R” sa podáva s jedným alebo viacerými antibiotikami, protizápalovým činidlom, alebo s chemoterapeutickými zlúčeninami. Predmetné zmesi sa môžu podávať buď spolu s inými liečebnými modalitami alebo samostatne, napríklad v rôznych časoch alebo v rôznych striekačkách alebo tabletách. Často sa R’-Glu-Trp-R” podáva v kombinovanej terapii s protizápalovými činidlami, antihistamínmi, chemoterapeutickými činidlami a pod. Ilustratívne kombinované liečby s R’-Glu-Trp-R” môžu zahŕňať napríklad protizápalové činidlá dobre známe v tejto problematike.

Ilustratívne kombinované liečby s R’-Glu-Trp-R” môžu zahŕňať aj podávanie vazoaktívneho lieku ako druhého liečiva. Reprezentatívne vazoaktívne liečivá zahŕňajú liečivá v skupine inhibítorov enzýmu konvertujúceho angiotenzín (ACE), otváračov draslíkových kanálov (PCO) a podobne.

Ilustratívne kombinované liečby rakoviny s R’-Glu-Trp-R” zahŕňajú podávanie chemoterapeutického prostriedku ako druhého liečiva. Liečby s R’-Glu-Trp-R” môžu byť účinné pri znižovaní nežiaducich vedľajších účinkov spojených s liečbou kortikosteroidmi, napríklad pri neovaskularizácii. Reprezentatívne chemoterapeutické prostriedky sú v problematike dobre známe.

Skúsení praktickí lekári nastavia časovanie a dávky tak, aby zodpovedali klinickým symptómom pacientov. Takéto vedomosti boli zhromažďované po desaťročia, a sú uvádzané v lekárskej literatúre, ako aj v lekárskych učebniciach. Načasovanie začatia predmetných spôsobov buď v rámci kombinovanej alebo samostatnej terapie závisí od klinického úsudku lekára.

Empirická terapia je terapia určená na liečbu najbežnejšej alebo najpravdepodobnejšej príčiny na základe historických, demografických a epidemiologických informácií. Empirická terapia môže často zahŕňať aplikáciu mnohých terapeutických prostriedkov určených na pokrytie širokého spektra terapeutických možností. Ak sú k dispozícii výsledky laboratórnych vyšetrení, voľba terapie sa môže v záujme efektívnejšej liečby nastaviť presnejšie. Pretože liečba klinických syndrómov sa veľmi často začína empiricky, je lepšie, ak sa nový spôsob liečby musí otestovať v súvislosti s osobitným klinickým syndrómom.

Vo vývoji farmaceutických liečiv predklinické štúdie nejakej liečby vyhodnocujú účinky liečby nielen na jeden klinický stav, ale na viacero stavov. Výsledky rôznych (niekedy rozporuplných) štúdií sa zvažujú z hľadiska ich prínosu aj rizík konkrétnej terapie, pokiaľ lekárske vedomosti o rizikách sú spojené s konkrétnou chorobou.

Je bežné, že nie všetci pacienti s konkrétnym syndrómom sú liečení jedinou terapeutickou modalitou, ale tak, že môže byť podskupina pacientov, u ktorých terapia dáva pozitívne a priaznivé výsledky. Príklady klinických syndrómov, u ktorých podskupiny pacientov môžu očakávať priaznivé výsledky z predmetných foriem terapie podľa tohto vynálezu, sú uvedené v niekoľkých nasledovných odsekoch.

Farmaceutické zmesi vynálezu sú určené na parenterálnc, topické, podkožné, vnútrosvalové, vnútropuzdrové, ústne, vnútronosové, intraperitoneálne alebo miestne podávanie (napríklad na pokožku v rámci krému), alebo na profylaktickú a/alebo terapeutickú liečbu. Výhodne, zmesi súčasného vynálezu sa podávajú parenterálne, vnútrosvalovo alebo vnútronosovo. Predmetné R’-Glu-Trp-R” zmesi tu majú výhodu, že dávajú požadovaný účinok pri veľmi nízkych dávkach a bez toxicity. Takže cieľom terapie v akútnej variante môže byť rýchle zvýšenie koncentrácie R’-Glu-Trp-R” v tkanive, napríklad bolusovou vnútrožilovou injekciou alebo infúziou. Podobne, v iných prípadoch môže byť žiaduce podávať R’-Glu-Trp-R” počas dlhšieho obdobia.

Predmetné zmesi obsahujúce R’-Glu-Trp-R” môžu byť naformuiované tak, aby sa umožnila absorpcia do krvného riečiska. Súčasné zmesi sú modulátory ciev, ktoré indukujú zmeny na bunkovej úrovni, ktoré následne vyvolávajú zmeny v bunkových procesoch, ktoré potom už nebudú závislé od prítomnosti zmesi. Bolo zistené, že účinky peptidu môžu byť dlhotrvajúce, napríklad niekoľko týždňov alebo mesiacov, napriek dosť rýchlej degradácii peptidu, naprí klad do 5 minút. Hoci predmetné R’-Glu-Trp-R” zlúčeniny sú samy rozpustné vo vode v nízkych koncentráciách, v ktorých sa obvykle aplikujú, výhodne sa aplikujú vo forme ich kyslých alebo bázických solí vytvorených pomocou farmaceutický prijateľných činidiel, napríklad pomocou kyseliny octovej, citrónovej, maleínovej, jantárovej, sodíka, draslíka, amónia alebo zinku. Voľne rozpustné soli predmetných R’-Glu-Trp-R” zmesi sa môžu tiež prekonvertovať na soli s nízkou rozpustnosťou v telesných tekutinách, napríklad modifikáciou pomocou mierne rozpustnej farmaceutický prijateľnej soli, ako je napríklad kyselina trieslová alebo palmová, alebo zahrnutím do časovanej formulácie kovalentným naviazaním na väčší nosič, alebo zahrnutím do časovanej tobolky, a podobne.

Predmetné farmaceutické prostriedky obsahujúce R’-Glu-Trp-R” možno použiť ako voľné peptidy alebo vo forme farmaceutický prijateľných solí rozpustných vo vode, ako je napríklad sodná, draselná, amónna alebo zinočnatá soľ. Rozumie sa, že predmetné dipeptidy sa môžu podávať s inými aktívnymi zložkami, ktoré nezávisle od seba dodávajú zmesi aktivitu. Farmaceutický prijateľné soli možno ľahko pripraviť z dipeptidu R’-Glu-Trp-R” (alebo jeho agonistu) konvenčnými postupmi. Takže takéto soli možno pripraviť napríklad vystavením dipeptidu R’-Glu-Trp-R” účinkom vodného roztoku požadovaného farmaceutický prijateľného hydroxidu kovu alebo inej kovovej zásady a odparením výsledného roztoku dosucha, výhodne za zníženého tlaku v dusíkovej atmosfére. Podobne, roztok dipeptidu R’-Glu-Trp-R” sa môže zmiešať s alkoxidom požadovaného kovu, a roztok sa následne odparil dosucha. Farmaceutický prijateľné hydroxidy, zásady a alkoxidy zahŕňajú hydroxidy, zásady a alkoxidy s katiónmi s cieľom, vrátane (ale nielen) draslíka, sodíka, amónia, vápnika a horčíka. Iné reprezentatívne farmaceutický prijateľné soli zahŕňajú hydrochlorid, hydrobromid, síran, hydrosíran, octan, šťavelan, valeran, olejan, lauran, boritan, benzoan, mliečnan, fosforečnan, tozulan, citrónan, maleínan, fumaran, jantáran, vínan a podobne.

Na parenterálne podávanie súčasný vynález poskytuje farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú roztok dipeptidu R’-Glu-Trp-R”, alebo jeho polymérne, multiméme alebo cyklické formy alebo deriváty rozpustené vo farmaceutický prijateľnom nosiči, výhodne vo vodnom nosiči. Možno použiť rôzne vodné nosiče, napríklad vodu, pufrovanú vodu, 0,4 %-ný fyziologický roztok, 0,3 %-ný glycín, a podobne, vrátane proteínov a/alebo glykoproteínov kvôli zvýšenej stabilite, ako je napríklad albumín, lipoproteín, globulín a podobne. Tieto zmesi možno sterilizovať konvenčnými, dobre známymi sterilizačnými postupmi. Výsledné vodné roztoky možno obaliť alebo prefiltrovať za aseptických podmienok a lyofilizovať, lyofilizovaný prostriedok sa potom pred aplikáciou skombinuje so sterilným vodným roztokom. Zmesi môžu obsahovať farmaceutický prijateľné pomocné látky podľa približných fyziologických podmienok, ako sú napríklad tlmivé látky, látky na úpravu pH, látky na úpravu tonicity a podobne, napríklad octan sodný, mliečnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, atď. Môže sa stať, že bude potrebné stabilizovať dipeptidy R’-Glu-Trp-R”, analógy, deriváty, agonisty, a podobne, aby sa zvýšila ich skladovateľnosť a farmakokinetický polčas. Skladovateľnosť sa dá zlepšiť pridaním excipientov, ako sú napríklad a) hydrofóbne látky (napríklad glycerol); b) cukry (napríklad sacharóza, mannóza, sorbitol, ramnóza, xylóza); c) komplexné uhľohydráty (napríklad laktóza); a/alebo d) bakteriostatické látky. Farmakokinetický polčas peptidov sa modifikuje napojením na nosičové peptidy, polypeptidy, a uhľovodíky chemickým odvádza ním (napríklad pospájaním N- alebo C-terminálových zvyškov bočných reťazcov), alebo chemickou zmenou aminokyseliny na inú aminokyselinu (pozri skôr). Farmakokinetický polčas a farmakodynamika sa dá tiež modifikovať a) opuzdrením (napríklad v lipozómoch); b) kontrolou stupňa hydrácie (napríklad kontrolou rozsahu a typu glykozylácie peptidu); a napokon c) kontrolou elektrostatického náboja a hydrofóbnosti peptidu.

Zmesi obsahujúce dipeptid R’-Glu-Trp-R” podľa súčasného vynálezu sa môžu podávať v kompatibilnom liečive vhodnom na parenterálne podávanie (napríklad vnútrožilové, podkožné, vnútrosvalové podávanie). Prostriedky možno upraviť konvenčnými farmaceutickými postupmi, ako je napríklad sterilizácia, a môžu obsahovať adjuvantné látky, ako sú konzervačné látky, stabilizátory, zvlhčovadlá, a podobne.

Zmesi obsahujúce dipeptid R’-Glu-Trp-R” sú typicky biologicky aktívne v dávkach okolo 0,5 pg/kg až 1 mg/kg, výhodne okolo 1 pg/kg až 50 pg/kg. Koncentrácia dipeptidov R’-Glu-Trp-R” sa vo farmaceutických zmesiach môže meniť, t. j. asi od 0,001 % až po 15 alebo 20 hmotnostných %, a bude sa voliť hlavne podľa objemov, viskozity, atď. kvapalín, podľa špecifických požiadaviek liečby a spôsobu podania subjektu. Ak sa použije vnútrosvalovo ako injekčný roztok s aktívnou látkou v účinnom množstve na inhibíciu neovaskularizácie, je výhodné, aby aktívna látka bola prítomná v množstve napríklad asi 0,001 až 0,01 hmotnostných % R’-Glu-Trp-R”. Ak sa použije vo forme tabletky, tobolky alebo čapíku, je výhodné, aby aktívna látka bola prítomná v množstve približne 0,1 mg R’-Glu-Trp-R” na tabletku, čapík alebo tobolku. Farmaceutický prijateľné vehikulum pre túto injekčnú formu môže byť akékoľvek farmaceutický prijateľné rozpúšťadlo, ako napríklad 0,9 %-ný vodný roztok chloridu sodného, destilovaná voda, roztok Novocainu, Ringerov roztok, roztok glukózy, a podobne. V takejto forme tobolka, čapík alebo tabletka môže tiež obsahovať iné konvenčné excipienty a vehikulá, ako sú plnivá, škrob, glukóza, atď. V topických preparátoch sú dipeptidy R’-Glu-Trp-R” všeobecne obsiahnuté v zmäkčujúcich prostriedkoch na báze močoviny, mastiach na báze ropy, a podobne, v koncentráciách asi od 0,1 do 10000 častí na milión, výhodne asi 1 až 1000 častí na milión, a najvýhodnejšie asi 10 až 100 častí na milión. Aktuálne spôsoby na prípravu parenterálne, ústne a topicky podateľných zlúčenín budú známe alebo zrejmé pre osoby oboznámené s problematikou a sú detailne opísané napríklad v publikácii Remington’s Pharmaceutical Science, 17. vydanie, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985), ktorá je tu referenčne začlenená.

Vnútrosvalová a vnútronosová cesta podania je výhodná na podávanie predmetných zmesí obsahujúcich R’-Glu-Trp-R”. Jedna výhodná dávka predmetnej zmesi na vnútrosvalové podanie je asi 50 pg až 100 pg R’-Glu-Trp-R” na dávku pre dospelých (300 pg až 1000 pg na celkovú terapiu); pre deti do veku 1 roka je to asi 10 pg na dávku, pre deti od 1 do 3 rokov asi 10 pg až 20 pg na dávku; pre deti od 4 do 6 rokov asi 20 pg až 30 pg na dávku, pre deti od 7 až 14 rokov asi 50 pg na dávku. Všetky predchádzajúce dávky sú vhodné na liečbu v trvaní od 3 do 10 dní, v závislosti od potrieb pacienta. Liečba sa môže podľa potreby zopakovať, obyčajne do 1 až 6 mesiacov. V inej výhodnej aplikácii sa podáva pacientovi liečebná dávka asi 10 pg/kg až asi 1 mg/kg farmaceutického prostriedku R’-Glu-Trp-R” denne asi 6 dní až 10 dní, ale voliteľne na rozhodnutie ošetrujúceho lekára až 30 dní. V jednom výhodnom terapeutickom cykle sa R’-Glu-Trp-R” podáva vnútrosvalovo denne v dávke 1 až 100 pg/kg 5 až 7 dní, potom je prestáv ka 1 až 6 mesiacov pred zopakovaním rovnakého injekčného režimu.

Zmes obsahujúca R’-Glu-Trp-R” sa môže podávať samostatne alebo sa môže naformulovať s farmaceutický prijateľnými nosičmi, buď jednorazovo alebo v opakovaných dávkach. Vhodné farmaceutické nosiče zahŕňajú inertné tuhé rozpúšťadlá alebo plnivá, sterilné vodné roztoky a rôzne netoxické organické rozpúšťadlá. Farmaceutické zmesi tvorené kombináciou dipeptidu R’-Glu-Trp-R” s farmaceutický prijateľným nosičom a voliteľne s antibiotikom. Predmetné kombinované terapeutické prostriedky sa potom ľahko podávajú v rôznych dávkových formách, ako sú tabletky, pastilky, sirupy, injikovateľné roztoky, a podobne. Kombinované terapeutické prostriedky môžu tiež zahŕňať dipeptid R’-Glu-Trp-R”, napríklad L-Glu-L-Trp, v rovnakej jednotkovej dávkovej forme. V prípade potreby farmaceutické nosiče môžu obsahovať ďalšie dodatočné prísady, ako sú príchuti, spojivá, excipienty, a podobne.

Takže na účely ústneho podania sa môžu použiť tabletky obsahujúce rôzne excipienty, ako sú napríklad citrónan sodný, uhličitan vápenatý a fosforečnan vápenatý spolu s rôznymi dezintegrátormi, ako je napríklad škrob, a výhodne zemiakový alebo maniokový škrob, kyselina alginová, a určité komplexné silikáty spolu so spojivami, ako je napríklad polyvinylpyrolidon, sacharóza, želatína a arabská guma. Okrem toho sú na tabletovacie účely často užitočné aj mazacie prostriedky, ako je stearan horečnatý, laurylsulfát sodný a mastenec. Tuhé zmesi podobného typu sa môžu tiež použiť ako plnivá v slaných a tvrdých želatínových tobolkách. Výhodné materiály s týmto cieľom zahŕňajú laktózu alebo mliečny cukor a vysokomolekulové polyetylénglykoly. Ak sú na ústne podanie požadované vodné suspenzie elixírov, základné zložky aktívneho dipeptidu R’-Glu-Trp-R” sa môžu skombinovať s rôznymi sladidlami alebo chuťovými prísadami, farbivami, a v prípade potreby emulzifikačnými alebo suspendujúcimi látkami spolu s riedidlami, ako je napríklad voda, etanol, propylénglykol, glycerín a ich kombinácie.

Na parenterálne podanie sa môžu použiť roztoky R’-Glu-Trp-R” v sezamovom alebo arašidovom oleji alebo vo vodnom roztoku polypropylénglykolu, ako aj vodné fyziologické roztoky príslušných farmaceutický prijateľných solí kovov rozpustných vo vode, ako to bolo opísané. Taký vodný roztok by sa mal v prípade potreby vhodne tlmiť a tekuté riedidlo by sa malo najprv upraviť izotonicky s vhodným množstvom fyziologického roztoku alebo glukózy. Tieto osobitné vodné roztoky sú zvlášť vhodné pre vnútrožilové, vnútrosvalové, podkožné a intraperitoneálne injekcie. Všetky použité sterilné vodné médiá sa dajú získať štandardnými postupmi dobre známymi pre všetkých, ktorí sú s touto problematikou oboznámení. Okrem toho, je možné podávať uvedené zlúčeniny topicky (napríklad cez zavedený katéter) pomocou primeraného roztoku vodného na daný účel.

Množstvo adekvátne na dosiahnutie terapeutického výsledku u viac ako 50 % takto liečených subjektov sa definuje ako „terapeuticky efektívna dávka“. Vyliečenie akútnych stavov sa všeobecne dostaví asi za 3 až 10 dni. Liečba chronických stavov alebo profylaktická liečba majú rovnaký priebeh, ale sa môže zopakovať až po 1 až 6 mesiacoch alebo ešte dlhšie. V niektorých prípadoch môže byť žiaduce podať tieto zmesi prerušovane na dennej báze asi 2 až 20 dní, výhodne asi 3 až 14 dní, výhodnejšie 4 až 10 dní, čo sa opakuje aspoň 15 dní, výhodne asi 20 dní, alebo až 1 až 6 mesiacov alebo viac.

Spôsob podania zmesi obsahujúcej R’-Glu-Trp-R” je určený chorobou a miestom, kde sa liečba požaduje. Na to pické podanie môže byť želateľné podať zmes obsahujúcu R’-Glu-Trp-R” lokálne (napríklad zavedením ihly do tkaniva v tom mieste) alebo umiestnením impregnovaného obväzu napríklad v mieste nádoru po jeho chirurgickom odstránení; kým v prípade ostatných chorôb môže byť potrebné podať zmes obsahujúcu R’-Glu-Trp-R” systémovo. Pre iné indikácie zmesi obsahujúce R’-Glu-Trp-R” a podobne sa môžu podať vnútrožilovou, intraperitoneálnou, vnútrosvalovou, podkožnou, vnútronosovou a intradermálnou injekciou, ako aj intrabronchiálnou instiláciou (napríklad pomocou rozprašovača), transdermálnym podaním (napríklad pomocou nosiča rozpustného v tukoch v rámci kožnej náplasti), alebo gastrointestinálnym podaním (napríklad pomocou tobolky alebo tabletky).

Vo všeobecnosti, kyslé adičné soli predmetnej zmesi obsahujúcej R’-Glu-Trp-R”, napríklad L-Glu-L-Lys, zmesi s farmaceutický prijateľnými kyselinami budú biologicky ekvivalentné so samotnými zmesami obsahujúcimi R’-Glu-Trp-R”.

Výhodné terapeutické zmesi, inokulum, spôsob podania a dávkovanie sa bude samozrejme líšiť podľa klinickej indikácie. Na vnútrosvalovú injekciu sa inokulum typicky pripravuje zo sušeného peptidu (alebo peptidového konjugátu) suspendovaním peptidu vo fyziologicky prijateľnom riedidle, ako je napríklad voda, fyziologický roztok, alebo fosfátmi tlmený fyziologický roztok. V dávkovaní sa nevyhnutne vyskytnú aj variácie, a to v závislosti od stavu liečeného pacienta, a v každom prípade správnu dávku pre jednotlivých pacientov určí lekár. Účinné množstvo peptidu na jednotkovú dávku závisí okrem iného aj od telesnej hmotnosti, fyziológie a zvoleného inokulačného režimu. Jednotková dávka peptidu sa vzťahuje na hmotnosť peptidu bez hmotnosti nosiča (v prípade, že sa aplikuje aj nosič). Účinná liečba sa dosiahne, ak koncentrácia dipeptidu R’-Glu-Trp-R”, napríklad L-Glu-L-Trp, v tkanive v mikroprostredí buniek sa priblíži koncentrácii 10'⁵ M až 10'⁹ M. Skúsení praktickí lekári môžu využiť klinické a laboratórne indície (pozri skôr) na monitorovanie odpovede pacienta na danú terapiu a môžu podľa toho nastaviť dávkovanie. Pretože farmakokinetika a farmakodynamika dipeptidov R’Glu-Trp-R”, agonistov, antagonistov, a podobne, sa bude u rôznych pacientov líšiť, najvýhodnejším spôsobom ako dosiahnuť terapeutickú koncentráciu v tkanive je postupné zvyšovanie dávkovania a monitorovanie klinických a laboratórnych indícií (pozri skôr). Počiatočná dávka na takúto terapiu s režimom zvyšovania dávky bude závisieť od spôsobu podania. Na vnútrožilové podanie dipeptidu R’-Glu-Trp-R” s približnou molekulovou hmotnosťou 200 až 400 daltonov sa podáva počiatočná dávka približne 0,5 pg/kg telesnej hmotnosti a dávka sa zvyšuje v desaťnásobných prírastkoch koncentrácie na každý interval režimu zvyšovania dávky.

Ak sa prezentuje vo forme tabletky, tobolky alebo čapíku, je výhodné, aby aktívna látka bola prítomná v množstve asi 0,1 mg na tabletku, čapík alebo tobolku. Ak sa prezentuje v takej forme, tobolka, čapík alebo tabletka môže obsahovať aj iné konvenčné excipienty a vehikulá, ako sú napríklad plnivá, škrob, glukóza, atď.

Výhodne, predmetný dipeptid R’-Glu-Trp-R” sa syntetizuje ktorýmkoľvek z množstva automatizovaných postupov, ktoré sú dnes dostupné. Vo všeobecnosti, tieto postupy obsahujú postupnú syntézu pridávaním aminokyselín s cieľom vytvárať stále väčšie molekuly. Aminokyseliny sa spájajú kondenzáciou medzi karboxylovou skupinou jednej aminokyseliny a aminoskupinou druhej aminokyseliny za vzniku peptidickej väzby. Na kontrolu týchto reakcií je potrebné zablokovať aminoskupinu jednej aminokyseliny a karboxylovú skupinu druhej aminokyseliny. Blokujúce skupiny by sa mali voliť tak, aby sa dali ľahko odstrániť bez nepriaznivého ovplyvnenia peptidov, čiže racemizáciou alebo hydrolýzou vzniknutých peptidických väzieb. Aminokyseliny s karboxylovými skupinami (napríklad Asp, Glu) alebo hydroxylovými skupinami (napríklad Ser, homoserín, tyrozín) tiež vyžadujú pred kondenzáciou blokovanie.

K dispozícii je veľké množstvo postupov na syntézu peptidov, obvykle sú výhodne syntézy v tuhej fáze. V tomto postupe sa aminokyselina viaže k živicovej častici, a peptid sa vytvára postupným pridávaním zablokovaných aminokyselín k rastúcemu reťazcu. Bežne sa používajú modifikácie postupu, ktorý bol opísaný Merrifieldom. Vo vzorovom automatickom postupe v tuhej fáze sa peptidy syntetizujú nanesením aminokyseliny s karboxyterminálom na organický spájač (napríklad PAM, 4-oxymetyi fenylacetamidometyl) kovalentne napojený na nerozpustnú polystyrénovú živicu, ktorá má priečne väzby s divinylbenzénom. Na zablokovanie terminálneho amínu sa používa t-Boc, a hydroxylové a karboxylové skupiny sú obvykle blokované O-benzylovými skupinami. Syntéza prebieha v automatickom syntetizátore peptidov (Applied Biosystems, Foster City, CA, napríklad model 430-A). Po syntéze sa produkt môže odstrániť zo živice a blokujúce skupiny sa môžu odstrániť pomocou kyseliny fluorovodíkovej alebo kyseliny trifluórmetylsulfónovej podľa zavedených postupov (Bergot, B. J. a S. N. McCurdy, Applied Biosystems Bulletin, 1987). Rutinnou syntézou sa môže vyprodukovať 0,5 mmol komplexu peptid-živica. Výťažok po odštiepení a purifikácii je približne 60 až 70 %. Napríklad derivát aktivovaného esteru Glx s blokovanou aminoskupinou a bočným reťazcom reaguje s Trp, ktorý má blokovanú bočnú skupinu a je pripojený k tuhej fáze na C-terminálovom konci. Po eliminácii alfa-amino ochrannej skupiny peptid môže byť odštiepený od tuhej fázy alebo sa podobným spôsobom môže pridať ďalšia aminokyselina. Ďalšie aminokyseliny sa pridávajú sériovo. Peptidy sa štiepia vysoko kyslým štiepením, ktoré typicky odstraňuje aj ochranné skupiny.

Peptidy sa potom môžu izolovať, lyofilizovať a skladovať na budúce použitie. Vhodné postupy na syntézu peptidov podrobne opísali Stewart a Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. vydanie, Pierce Chemical Company, 1984; a Tam a spol., J. Am. Chem. Soc., 105: 6442 (1983).

Purifikácia výsledných peptidov sa robí napríklad vykryštalizovaním peptidu z organického rozpúšťadla, ako je napríklad metylbutyléter, a potom rozpustením v destilovanej vode a dialýzou (ak je molekulová hmotnosť väčšia ako asi 500), chromatografiou na tenkej vrstve, gélovou chromalografíou, lyofilizáciou alebo obrátenou HPLC ( napríklad s použitím kolóny C18 s 0,1 % kyselinou trifluóroctovou a acetonitrilom ako rozpúšťadlami) ak je molekulová hmotnosť menšia ako 500. Purifikovaný peptid sa lyofilizuje a skladuje v suchom stave až do použitia. Reprezentatívny farmaceutický prostriedok obsahujúci R’-Glu-Trp-R” je purifikovaný dipeptid L-Glu-L-Trp, ktorý je biely prášok (ak je lyofilizovaný; inak je kryštalický) rozpustný vo vode, DMF; nerozpustný v chloroforme a éteri. alfa22_D = +12,6; C = 0,5 H₂O. R_f= 0,65 (butanol : kyselina octová : voda = = 3:1:1). UV (275 ± 5 nm, max). NMR (500 MHz): 0,001 mol/1 roztoku peptidu, Trp (3,17; 3,37; 4,57; 7,16; 7,24; 7,71; 7,49); Glu (1,90; 1,96; 2,21; 3,72).

Typicky, derivát s blokovanou aminoskupinou a bočným reťazcom aktivovaného esteru kyseliny glutamovej reaguje s blokovaným L-tryptofánom. Po eliminácii ochranných skupín a konvenčnej purifikácii, ako je napríklad chromatografia na tenkej vrstve alebo gélová chromatografia, peptid sa môže purifikovať ešte napríklad lyofilizáciou, gélovou purifikáciou, a podobne.

Ak sa nechceme viazať na žiadny konkrétny mechanizmus pôsobenia, predpokladá sa, že je možné, že predmetné peptidy obsahujúce tryptofán môžu byť reverzibilné asociované so špecifickými bunkovými EW receptormi na endotelových bunkách, pričom jeden taký receptor sa definuje ako všeobecne rozšírený „CD2“ determinant bunkového povrchu prítomný aj na lymfocytoch, endotelových bunkách a určitých epitelových bunkách. Považuje sa za možné, že väzba EW dipeptidu na CD2 (a iné EW receptory) spúšťa v receptore konformačnú zmenu, ktorá môže iniciovať up-reguláciu adenylátcyklázy a zvýšený vnútrobunkový cAMP. V súčasnosti sa predpokladá, že je možné, že L-Glu-L-Trp realizuje svoj vplyv down-reguláciou bunkových mechanizmov, ktorými zápalové mediátory ako TNF-a a IL-1 spúšťajú aktiváciu a proliferáciu endotelových buniek a pericytov. Výsledkom aktivácie sú zmeny v expresii adhezínov na povrchu bunky, ktoré sa zúčastňujú na viazaní zápalových buniek vo vaskulitíde, kým proliferácia hrá úlohu v neovaskularizácii. L-Glu-L-Trp down-regulácia endotelových účinkov indukovaných zápalovými mediátormi môže zahrnúť defosforyláciu jednej alebo viacerých bunkových tyrozínkináz. Považuje sa za pravdepodobné, že výsledkom takej down-regulácie môžu byť zmeny v syntéze alebo na bunkovom povrchu v expresii endotelových adhezínov, selektínov a/alebo integrínov, napríklad ELAM, VCAM, a podobne. Neskoršie bunkové zmeny indukované dipeptidmi obsahujúcimi tryptofán môžu viesť k zníženej schopnosti zápalových buniek (napríklad lymfocytov, neutrofilov, a/alebo monocytov) lokalizovať sa na miestach vaskulitídy.

Ako je to používané tu, symboly aminokyselín sú uvedené podľa odporúčaní IUPAC-IUB, ktoré boli publikované v Árch. Biochem. Biophys. 115: 1-12, 1966 s nasledovnými jednopísmenovými symbolmi aminokyselín: L, Leu, leucín; V, Val, valín; Y, Tyr, tyrozín; D, Asp, kyselina asparágová; W, Trp, tryptofán; P, Pro, prolín; I, Ileu, izoleucín; G, Gly, glycín; M, Met, metionín; E, Glu, kyselina glutámová; T, Thr, treonín; K, Lys, lyzín, N, Asn, asparagín; R, Arg, arginín; Q, Gin, glutamín; A, Ala, alanin; C, Cys, cystein; S, Ser, serín; F, Phe, fenylalanín; H, His, histidín; C, Cys, cystein; S, Ser, serín.

Nasledujúce príklady sú uvedené na ďalšie vysvetlenie vynálezu, a nie sú nijakým spôsobom určené na obmedzenie vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Neprítomnosť mutagenicity a toxicity L-Glu-L-Trp: Farmakokinetika a biodistribúcia

Protokol A

Štúdie akútnej toxicity

Súhm; L-Glu-L-Trp injikovaný vnútrosvalovo v dávkach vypočítaných asi na 10000-násobok terapeutickej dávky nebol toxický v myšiach, morčatách, kurčatách a psoch, ako to bolo zistené na základe monitorovania ich celkového stavu, správania, pohybovej aktivity, srdcovej a respiračnej fyziológie a makroskopickej patológie.

Protokol B

Štúdie chronickej toxicity

Súhrn.· L-Glu-L-Trp injikovaný denne ako jednorazová vnútrosvalová alebo vnútrožilová injekcia počas 28 dní nemal nepriaznivé účinky, ako to bolo zistené na základe monitorovania správania, prijímania potravy, telesnej hmotnosti, stavu srsti, slizníc, počtov červených a bielych krviniek, srdcovej a respiračnej fyziológie, pečeňových a obličkových funkcií, a makroskopickej patológie. Obličkové funkcie boli stanovené vyhodnotením diurézy po prijatí vody; pre určité iné experimenty boli psy a potkany usmrtené a vyšetrené po 10, 20, 30 a 60 dňoch.

Protokol C

Farmakokinetika a biodistribúcia: Štúdia v podmienkach GLP

L-Glu-L-Trp značený uhlíkom ^l4C (110 pg/kg) sa podával vnútronosovo potkanom kmeňa Sprague-Dawley. Vzorky krvi a tkanív sa odoberali v intervaloch 0,5, 2, 8 alebo 24 hodín a množstvo intaktného L-Glu-L-Trp sa stanovil pomocou HPLC. Vzorky tkanív zahŕňali červené krvinky, biele krvinky, pečeň, obličky, srdce, pľúca, slezinu, týmus, mozog, svaly, pokožku, tuk, oči, vaječníky, semenníky, submandibuláme lymfatické uzliny a gastrointestinálny trakt aj s obsahom. Vnútronosovo podaný ¹⁴C-L-Glu-L-Trp sa rýchlo absorboval s plazmatickým C_nM = 0,349 pg*eq.*h/g uhlíka ¹⁴C. Nijaká intaktná zlúčenina nebola v krvi zistená po 30 minútach pri citlivosti v rozsahu 5 až 101 ng/ml, čo naznačovalo, že krvný polčas je nižší ako 30 minút. Eliminačný polčas v tkanivách bol stanovený na 18,7 h.

Príklad 2

Inhibičné účinky L-Glu-L-Trp na angiogenézu v testoch s chorioalantoickou membránou (CAM)

Osemdňové kuracie embryá sa odstránili z vajec a umiestnili sa do sterilných Petriho misiek. Jednotlivé terčíky z filtračného papiera sa saturovali objemom 7,5 pl rôznych zásobných roztokov L-Glu-L-Trp rozpusteného v sterilnom 0,14 M NaCl tak, aby konečné testovacie koncentrácie boli 0,001; 0,01; 0,1; 1,0; 10; 100; 500; a 1000 pg na terčík. Terčíky sa vysušili na vzduchu a boli potom invertované na povrch jednotlivých embryí. Vaskularizácia embryí bola vyhodnotená po 48 hodinách inkubácie pomocou stupnice uvedenej v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Vyhodnotenie vaskularity kuracích embryí: CAM test

Stupeň inhibície	Opis	Percento inhibície
0	Rozdiel vizuálne neodlíšiteľný od negatívnej kontroly	0
1	Slabá inhibícia tvorby ciev	25
2.	Mierna inhibícia tvorby ciev	50
3,	Takmer úplná inhibícia tvorby ciev	75
4	Úplná inhibícia tvorby ciev	100

V tomto experimente fyziologický roztok sa použil ako negatívna kontrola a 10 pg/terčík heparínu sa použil ako pozitívna kontrola. Pentapeptid Tyr-Ala-Glu-Glu-Lys (TAEEK) bol použitý ako kontrola špccificity (t. j. kvôli možným nešpecifickým účinkom peptidov na neovaskularizáciu pri použitých koncentráciách). 9 až 12 testovacích terčíkov a príslušný počet rôznych embryí sa použilo na každú testovanú koncentráciu spolu s 82 pozitívnymi a negatívnymi kontrolnými embryami. Výsledky sú zhrnuté v nasledovnej tabuľke 2.

Tabuľka 2

Výsledky CAM testu na kuracích embryách

Testovaná látka	Číslo embrya	Koncentrácia (pg/terčík)	Inhibícia neovaskularizácie Stupeň/rozsah Stupeň/priemer Priemerné percento inhibície ± SD*
Fyziologický roztok	82	0	0-0	0±0	0±0
Heparín	82	10	1-4	3,26 ±0,73	81 ± 18
L-Glu-L-Trp	10	1000	2-4	3,3 ±0,82	83 ±20
10	500	1-4	2,4 ± 0,84	60 ±20
9	100	3-4	3,44 ± 0,73	85 ± 18
11	10	1-4	3,09 ±1,14	78 ±28
12	1	1-4	2,33 ± 0,89	58 ±23
10	o,l	0-3	1,9 ±0,88	48 ±23
10	0,01	1-2	1,5 ±0,53	38 ±13
10	0,001	0-2	1,3 ±0,82	33 ±20
TAEEK	10	1000	0-2	0,7 ± 0,82	18 ± 20
10	500	0-1	0,3 ± 0,48	9± 13
9	100	0-2	0,67 ± 0,87	18 ± 23
11	10	0-1	0,18 ±0,40	5 ± 10
12	1	0-1	0,33 ± 0,49	8 ±10
10	0,1	0-0	0±0	0
10	0,01	0-0	0±0	0
10	0,001	0-0	0±0	0

*Priemer ± SD = priemer ± smerodajná odchýlka, n = 10 pre test a n = 80 pre fyziologický roztok a heparín.

Výsledky ukazujú 30 až 88 %-ný pokles vaskularity v embryách ovplyvnených s 10 ng až 1000 pg L-Glu-L-Trp vo fyziologickom roztoku. Hladina inhibície dosiahnutá pri dávkach 10 až 1000 pg bola približne taká ako u heparínu (10 pg). Hoci pri vyšších dávkach (t. j. 100 až 1000 pg) sa pozorovali niektoré predpokladané nešpecifické účinky kontrolného pentapeptidu TAEEK na vaskularitu embryí, účinok nebol taký výrazný ako účinok dosiahnutý s L-GluL-Trp, a predpokladaný nešpecifický účinok sa pri nižších dávkach nepozoroval. Všetky tieto výsledky spolu naznačujú určitý účinok L-Glu-L-Trp na proces tvorby ciev v tkanivách kuracích embryí.

Príklad 3

Inhibícia neovaskularizácie Lewisovho karcinómu

Bunky Lewisovho pľúcneho karcinómu (5 X 10⁷) injikované v objeme 0,1 ml vnútrokožne do oboch bokov myší kmeňa C57BL/6 (deň 0) produkujú do 7 dní vysoko vaskularizované viditeľné nádorové uzlíky. Odstránením týchto nádorov možno mikroskopicky určiť stupeň ich vaskularizácie, a to spočítaním počtu veľkých ciev lúčovito vychádzajúcich z nádorovej masy. Vykonala sa aj nezávislá štúdia (pozri neskôr) v podmienkach GLP na objednávku v jednej výskumnej organizácii.

Fyziologický roztok bol použitý ako negatívna kontrola a Cytoxan ako pozitívna kontrola. Pozitívna kontrola, Cytoxan (200 mg/kg) sa podal iba v deň 2. Testovacie podávanie L-Glu-L-Trp sa uskutočnilo vnútrosvalovo denne počnúc dňom 1 po injikovaní nádoru a pokračovalo 5 dní (t. j. až po deň 6). L-Glu-L-Trp sa podal v dávkach 125, 250, 500, 1000 a 2000 pg/kg/dávka. Negatívna kontrola (fyziologický roztok) sa podala intraperitoneálne podľa rovnakého režimu (denne počas 5 dní). Desať myší (20 nádorov) sa vyhodnotilo pre každú dávku testovacieho aj kontrolného činidla. Výsledky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 3.

Tabuľka 3

Inhibícia neovaskularizácie u Lewisovho pľúcneho nádoru

Číslo skupiny	Ovplyvnenie	Dávka (pg/kg/dávka)	Počet ciev (Priemer ± SD*
1	Žiadne	0	19 ±6
2	Cytoxan	200	9±5*
3	L-Glu-L-Trp	2000	17 ±7
4	1000	12±5*
5	500	9 ±4*
6	250	7 ±2*
7	125	6 ±3*

♦Porovnanie podľa testu Student-Newman-Keuls; štatisticky odlišné od skupiny 1 pri hladine p < 0,05.

Výsledky ukazujú jasnú štatisticky významnú inhibíciu neovaskularizácie ako výsledku ovplyvnenia buď Cytoxanom alebo L-Glu-L-Trp. Nízke dávky L-Glu-L-Trp boli účinnejšie v potláčaní angiogenézy (skupiny 4 až 7) ako vyššie dávky (skupina 3). Obrátený profil odpovede v závislosti od dávky, t. j. s nižšou aktivitou pri vyšších dávkach, je v súlade s pozorovanou účinnosťou iných biologických modifikátorov odpovede v tomto teste (napríklad IFN-α alebo IL-12).

Všetky aplikácie boli dobre tolerované a nezaznamenal sa nijaký úbytok hmotnosti ani uhynutie zvierat.

Príklad 4

Protinádorová aktivita L-Glu-L-Trp: Sarkóm 180

Neovaskularizácia je potrebná na rast nádoru. Protinádorová aktivita L-Glu-L-Trp bola vyhodnotená na objednávku v jednej nezávislej výskumnej organizácii. Nádory Sarkómu 180 (ATCC CCL-8 CCRF S-180 II) boli indukované injikovaním 2 X 10⁶ buniek/0,1 ml vnútrosvalovo do zadnej časti bokov myší kmeňa Swiss-Webster. Skupiny

SK 283677 Β6 myší pozostávali z 10 zvierat (20 nádorov). L-Glu-L-Trp sa podával v jednorazovej dávke 0,1 ml buď 10 pg'kg, 75 pg/kg, 250 pg/kg alebo 1000 pg/kg. Veľkosť nádoru bola vyhodnotená po chirurgickom odstránení a odvážení postihnutých končatín porovnaním ich hmotnosti s hmotnosťou normálnych kontrolných (nenádorových) končatín. Prvý profylaktický režim liečiva (PDR-1) pozostával z 5 následných denných intraperitoneálnych dávok počnúc dňom -5 a končiac dňom -1. Druhý profylaktický režim liečiva (PDR-2) pozostával z 5 následných denných vnútrosvalových injekcií do ľavého boku myší (miesto nádoru) počnúc dňom -5 a končiac dňom -1. Bunky Sarkómu 180 boli injikované vnútrosvalovo v deň 0. Fyziologický roztok v objeme 0,1 ml bol negatívna kontrola.

Tabuľka 4

Účinok L-Glu-L-Trp na veľkosť nádorov Sarkómu 180

Skupina	Režim	Dávka (ftg/kg)	Hmotnosť končatiny Ľavá Pravá	Priemerná hmotnosť nádoru“ Ľavý Pravý	Percento hmotnosti kontrolného nádoru^b
1A (normálna)	Žiaden	0	1,2 ±0,1	1,2 ±0,2	0	0	-	-
IB (nádorová)	Žiaden	0	3,7 ± 0,6	3,5 ±0,7	2,5	2,3	0	0
2	PDR-1	10	4,2 ± 0,9	4,1 ±0,7	3,0	2,9	120	126
3	PDR-1	75	4,2 ± 0,8	4,2 ± 0,8	3,0	3,0	120	130
4	PDR-1	250	3,5 ± 1,0	3,1 ±0,6	2,3	1,9	92	83
5	PDR-1	1000	2,5 ± 0,7	2,2 ± 0,5	1,3	1,0	52	43
6	PDR-2	10	3,6 ±0,7	3,8 ±0,7	2,4	2,6	96	113
7	PDR-2	75	3,6 ± 0,7	3,5 ± 0,3	2,4	3,3	96	143
8	PDR-2	250	3,0 ±0,1	2,3 ± 0,5	1,8	1,1	72	48
9	PDR-2	1000	2,4 ± 0,5	2,5 ± 0,5	1,2	1,3	48	57

a) Priemerná hmotnosť nádoru = (priemerná hmotnosť ovplyvnenej končatiny - priemerná hmotnosť končatiny normálnej kontroly);

b) Inhibícia = (hmotnosť nádoru ovplyvnených/hmotnosť nádoru kontroly) X 100 %

Tabuľka 5

Ilustračné chorobné stavy, ktoré môžu byť prístupné liečbe predmetnými terapeutickými metódami podľa vynálezu

ochorenie	tkanivo: stav	citácia č.
komplikácie liečby (Tx);	sietnica: centrálna serózna chorioretinopatia, bilaterálna	10
kortikosteroid Tx	bulózne exsudatívne odlúčenie sietnice
nesteroidný protizápalový Tx	cievy: chronická ulcerácia	33
dedičné ochorenia:
retinálna teleangiektázia	sietnica: proliferatívna retinopatia	11,48
retinochorioiditída	sietnica: multifokálna chorioiditida a panuveitída	17
syndróm nekrózy	sietnica: papiláma/terčová neovaskularizácia	19
von Hippcl-Lindauov syndróm	vaskuláme tumory: hemangioblastómy	41
idiopatické ochorenia:
retinálna vaskulitída	sietnica: neovaskularizácia	21
periférna neuropatia	CNS: epineurálna kapilárna a arteriálna hypervaskularizácia	22
autoimúnne ochorenia:
artritída	kĺbové tkanivá: reumatoidná artritída (RA), juvenilná osteoartritída	23, 24, 43
diabetická retinopatia	sietnica: neovaskularizácia papily/terča zrakového nervu: neuropatia	20
skleróza multiplex	sietnica: periférna retinálna neovaskularizácia	14
sarkoidóza	sietnica: retinálna neovaskularizácia	21
Bechetova choroba	sietnica: retinálna neovaskularizácia	21
systémový lupus erythematosus	sietnica: vaskulitída a neovaskularizácia, vazookluzívna retinopatia cievy: periférny vaskulámy syndróm, systémová vaskulitída, polyarteritída, difúzna proliferatívna glomerulonefritída	12, 42 13,42
Sjôrgenov syndróm	sietnica: vaskulitída, neovaskularizácia	25,45
dermatologické ochorenia	integumentum: bulózne kožné ochorenia s angiogenézou	51,54
systémová vaskulitída	cievna vaskulitída s angiogenézou	47
sklerodermia	spojivové tkanivo: systémová skleróza s angiogenézou	46
zápalové myopatie	sval: dermatomyozitída/polyomyozitída s angiogenézou	44
rakovina:	progresia a metastáza - prehľad pľúca: angiogenéza	27, 36, 39, 40 35

	pečeň: metastázy	38
anaplastický astrocytóm	CNS: exuberantný rast endotelových buniek, demyelinizačné ochorenia	15,52
ateroskleróza	cievy: aneuryzma, ateróm	28
hypertenzia	pľúca: exuberantný rast endotelových buniek vaskuláme: prestavba ciev pri hypertenzii	15 31
ľudské infekcie.·
toxoplazmóza	sietnica: arteritída a retinochorioiditída	16
Treponema pallidum	sietnica: cievovková neovaskularizácia, 2. štádium/ 3. štádium syfilis	18
HIV infekcia	imunita: AIDS, Tat angiogenetická aktivita Kaposiho sarkóm	34 55,56
vírus hepatitídy	pečeň: zápal s angiogenézou	50

Výsledky uvedené v tabuľke 5 ukazujú, že profylaktické ovplyvnenie s L-Glu-L-Trp intraperitoneálne alebo vnútrosvalovo v dávkach 250 pg/kg a 1000 pg/kg potláčalo následný vnútrosvalový rast nádoru. Je zaujímavé, že sa zdá byť možné vyvolať systémové inhibičné účinky ovplyvnením v lokálnom vnútrosvalovom mieste, pretože vnútrosvalové podanie aplikované do ľavého boku potláčalo následný rast nádoru v pravom boku (t. j. skupiny 8 a 9). Výsledky sú v súlade s inhibíciou neovaskularizácie zistenou v príkladoch 2 a 3 (pozri skôr).

Tento vynález poskytuje zásadne nový spôsob inhibície neovaskularizácie. Kým boli uvedené špecifické príklady, uvedený opis je ilustratívny a nie obmedzujúci. Mnohé varianty vynálezu budú po prezretí tejto špecifikácie jasné pre tých, ktorí sa v problematike vyznajú. Rozsah vynálezu by preto mal byť určený nie vo vzťahu k uvedenému opisu, ale by mal byť určený vo vzťahu k priloženým nárokom spolu s plným rozsahom ekvivalentov.

Claims

1. Použitie dipeptidu R’-Glu-Trp-R”, analógu dipeptidu R’-Glu-Trp-R” alebo ich farmaceutický prijateľnej soli na výrobu farmaceutického prostriedku na inhibíciu neovaskularizácie v subjekte, pričom R' a R chýbajú alebo znamenajú zvyšok nezávisle vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje amid, imid, ester, anhydrid, éter, mctyl-alkyl ester, etyl-alkyl ester, alkylovú skupinu a arylovú skupinu, kde R¹môže znamenať aj amidovú väzbu medzi amínom a uvedený Glu a bočný reťazcový karboxylát uvedeného Glu, pričom pomerná molekulová hmotnosť uvedenej zlúčeniny je menšia ako približne 5000 Daltonov.

2. Použitie podľa nároku 1, kde dipeptidom R’-Glu-Trp-R” alebo jeho farmaceutický prijateľnou soľou je L-Glu-L-Trp alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.

3. Použitie analógu dipeptidu R’-Glu-Trp-R” alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli, podľa nároku 1, kde v analógu je v pyrolovom kruhu ttyptofánu dusík nahradený uhlíkom.

4. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde neovaskularizácia vyplýva z hemangiómu.

5. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde neovaskularizácia vyplýva z vaskularizovaného malígneho nádoru alebo vaskularizovaného beníneho nádoru.

6. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde neovaskularizácia vyplýva z mozgovocievnej príhody po zotavení; neovaskularizácie v dôsledku úrazu hlavy; restenózy po angioplastike; alebo traumy z tepla alebo chladu.

7. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde neovaskularizácia je spojená s neovaskularizáciou pečene indukovanou chemickou látkou, angiogénnou dysfunkciou súvisiacou s nadbytkom hormónu; neovaskulámymi následkami cukrovky; neovaskulámymi následkami hypertenzie; alebo s chronickou infekciou pečene.

8. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde prostriedok je vhodný na použitie v subjekte v dávke približne 0,5 pg až približne 1 mg farmaceutického prostriedku na 1 kg telesnej hmotnosti subjektu.

9. Použitie podľa nároku 8, kde dávka je približne 1 pg/kg až približne 50 pg/kg telesnej hmotnosti.

10. Použitie podľa nároku 8, kde prostriedok je vhodný na použitie denne počas 1 dňa až približne 30 dní.

11. Použitie podľa nároku 8, kde farmaceutický prostriedok je vo forme vhodnej na intramuskuláme, transdermálne alebo intranazálne použitie alebo vo forme vhodnej na intrabronchiálnu instiláciu.

12. Použitie podľa nároku 2, kde farmaceutický prostriedok je vhodný na použitie vo forme injektovateľného roztoku obsahujúceho 0,001 % až 0,01 % L-Glu-L-Trp alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli.

13. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde prostriedok je vhodný na použitie v jednotkovej dávkovej forme zahŕňajúcej tabletku, čapík, kapsulu, očný film, inhalačný prostriedok, sliznicový sprej, nosné kvapky, očné kvapky, zubnú pastu, masť alebo krém s vo vode rozpustným základom.

14. Použitie podľa nároku 13, kde uvedená jednotková dávková forma pozostáva v podstate z 0,01 mg uvedeného L-Glu-L-Trp alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli.

15. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde prostriedok je vhodný na použitie v subjekte v kombinácii s vazoaktívnym liečivom.

16. Použitie podľa nároku 15, kde vazoaktívne liečivo je inhibítor enzýmu konvertujúceho angiotenzín (ACE) alebo otvárač draslíkových kanálov (PCO).

17. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde subjekt trpí nádorovým ochorením a prostriedok je vhodný na použitie v kombinácii s chemoterapeutickým činidlom.

18. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde subjekt nie je imunologický oslabený.

19. Použitie podľa nároku 1, kde dipeptidom R’-Glu-Trp-R” alebo jeho farmaceutický prijateľnou soľou je cyklický L-Glu-L-Trp alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.

20. Použitie podľa nároku 1, kde dipeptidom R’-Glu-Trp-R” alebo jeho farmaceutický prijateľnou soľou je muitimér L-Glu-L-Trp dipeptidu alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ s obsahom do 10 aminokyselín.

21. Použitie dipeptidu L-Glu-L-Trp, cyklického dipeptidu, lineárneho alebo cyklického polyméru dipeptidu s obsahom do 20 aminokyselín, analógu dipeptidu v ktorom je dusík v pyrolovom kruhu triptofánu substituovaný uhlíkom, alebo ich farmaceutický prijateľnej soli, v množstve účinnom na inhibíciu neovaskularizácie v subjekte.

22. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde farmaceutický prijateľná soľ dipeptidu R'-Glu-Trp-R alebo analógu dipeptidu R'-Glu-Trp-R je vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje soli sodíka, draslíka, amónia alebo zinku.

23. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, farmaceutický prijateľná soľ dipeptidu R'-Glu-Trp-R alebo analógu dipeptidu R'-Glu-Trp-R je vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje hydrochlorid, hydrobromid, síran, hydrosíran, octan, šťavelan, valeran, olejan, lauran, boritan, benzoan, mliečnan, fosforečnan, tozulan, citrónan, maleínan, fumaran, jantáran alebo vínan.

24. Použitie podľa nároku 2, kde dipeptidom je sodná soľ L-Glu-L-Trp.

25. Použitie podľa nároku 2, kde L-Glu-L-Trp je vo forme soľného roztoku.

26. Použitie podľa nároku 2, kde sodná soľ L-Glu-L-Trp je vo forme vhodnej intranazálne použitie alebo vo forme vhodnej na intrabronchiálnu instiláciu.

27. Použitie podľa nároku 5, kde nádorom je nádor meninga, intracerebrálny nádor, sarkóm, osteosarkóm, ezofagový nádor, nádor priedušnice.

28. Použitie podľa nároku 5, kde nádorom je Lewisov karcinóm.

29. Použitie podľa nároku 5, kde nádorom je Kaposiho sarkóm.

30. Použitie podľa nároku 8, kde L-Glu-L-Trp alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ vo forme vhodnej na intravenózne, intraperitoneálne alebo subkutánne použitie alebo vo forme vhodnej na gastrointestinálne dodávanie.

31. Použitie podľa nároku 21, farmaceutický prijateľná soľ dipeptidu R'-Glu-Trp-R alebo analógu dipeptidu R'-Glu-Trp-R je vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje soli sodíka, draslíka, amónia alebo zinku.