ES2268710T3 - Uso de los dipeptidos glu-trp para la elaboracion de un medicamento para el tratamiento de diferentes condiciones que involucran neovasculacion. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA INHIBIR LA NEOVASCULARIZACION EN UN SUJETO MEDIANTE LA ADMINISTRACION AL SUJETO DE UNA PREPARACION FARMACEUTICA DE R - GLU - TRP - R .

Description

Uso de los dipéptidos Glu-Trp para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de diferentes condiciones que involucran neovascularización.

La presente invención se relaciona generalmente con el uso de péptidos que tienen propiedades angiostáticas y más particularmente con el uso de dipéptidos que contienen triptófano que tienen propiedades angiostáticas.

La neovascularización, la génesis de nuevos vasos sanguíneos, se desencadena temprano en la embriogénesis y también durante la cicatrización de heridas, la remodelación de tejidos y probablemente en el curso normal del mantenimiento del sistema vascular. Los procesos involucrados en la neovascularización incluyen al menos una activación pericítica y de células endoteliales; degradación de lámina basal; migración y proliferación de células endoteliales y de pericitos, formación de nuevo lumen de vasos capilares; aparición de pericitos alrededor de los nuevos vasos; desarrollo de una nueva lámina basal; formación de un bucle capilar; persistencia de involución con diferenciación de nuevos vasos; formación de una red capilar; y, eventualmente, de la organización de la red en microvasos más grandes.

Se sabe que ciertas citoquinas reducen la expresión de la neovascularización, incluida la interleuquina-12 (IL-12), el factor de crecimiento transformante tipo \beta (TGF-\beta), interferón \alpha (IFN-\alpha) y factor plaquetario 4 (PF-4). Sin embargo, la experiencia clínica con terapia de citoquina ha mostrado ser problemática debido a la toxicidad de algunos de estos compuestos.

Existe un cierto número de condiciones patológicas en las cuales la angiogénesis o bien juega un papel o está involucrada directamente en diferentes secuelas de la enfermedad. Estas incluyen, por ejemplo, neovascularización de tumores en cáncer; creación de hemangiomas; neovascularización asociada con diferentes enfermedades del hígado; disfunción angiogénica relacionada con un exceso de hormona, secuelas neovasculares de la diabetes; secuelas neovasculares para hipertensión; neovascularización en la recuperación posterior de un accidente cerebrovascular; neovascularización debida a un trauma en la cabeza; neovascularización en infección crónica del hígado; restenosis después de una angioplastia; y neovascularización debida a un trauma frío o caliente.

Mientras que indudablemente se requiere de angiogénesis por el mantenimiento de un sistema vascular sano, la medicina clínica estimaría la eficacia de un tratamiento no tóxico para la neovascularización temporalmente reductora de la expresión, esto es, incluyendo angistasis temporal.

L-Glu-L-Trp se sabe que estimula la producción de células inmunes y para normalizar su relación numérica en condiciones de deficiencia inmune (Ver, por ejemplo, WO 89/06134, WO 92/17191 y WO 93/08815). Sin embargo, se ha descubierto aquí que el dipéptido también tiene actividad angiostática independientemente de su efecto en condiciones de deficiencia inmunológica. Los resultados de los estudios in vitro mostraron que los bajos niveles del dipéptido L-Glu-L-Trp inhiben la neovascularización de las membranas coroalantóicas del pollo durante la embriogénesis. En estudios con animales, L-Glu-L-Trp inhibió la neovascularización del tumor de pulmón de Lewis cuando se lo inyectó en forma intradérmica en ratones C57BU6, e inhibió el desarrollo del Sarcoma 180 en ratones Swiss-Webster.

En un aspecto, la presente invención provee el uso de un agente activo que contiene al dipéptido antiangiogénico Glu-Trp o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una condición patológica que involucra neovascularización.

En una modalidad preferida, el agente activo contiene análogos de aminoácido del dipéptido antiangiogénico Glu-Trp.

En otra modalidad preferida, al agente activo contiene análogos de ese aminoácido que incluyen R'-Glu-Trp-R'', R' y/o R'' independientemente seleccionados de las sales farmacéuticamente aceptables del dipéptido, amidas, imidas, ésteres, anhídridos, éteres, metil o etil-alquil ésteres, derivados de alquilo, arilo o de mezclas de alquilo/arilo, en donde el peso fórmula es aproximadamente menor a 5000 Daltons.

En otra modalidad preferida el agente activo contiene una forma cíclica del dipéptido, polímeros lineales o cíclicos del dipéptido que tiene no más de 20 aminoácidos o péptidos o no más de 20 aminoácidos incluido al menos un dipéptido dentro de su secuencia de aminoácidos.

En otra modalidad preferida, los aminoácidos Glu y Trp del agente activo son independientemente L-Glu y/o L-Trp.

En otra modalidad preferida, el agente contiene no más de 10 aminoácidos.

En otra modalidad preferida, el análogo de Trp es un análogo de pirrol en el cual el nitrógeno en el anillo de pirrol se reemplaza con carbono, 5-hidroxi-triptamina o ácido 5-hidroxi-indol-acético.

En otra modalidad preferida, el agente activo se selecciona entre HEW, EWEW, GEW, EWKHG, EWKKHG, EW-NH-NH-GHK-NH_{2}, Ac-L-Glu-L-Trp-OH, Suc-EW, Cpr-EW, But-EW, RKEWY, RKEW, KEWY KEW o pEW.

Las condiciones patológicas que involucran neovascularización son hemangioma, tumor maligno vascularizado, tumos benigno vascularizado, un tumor de las meninges, un tumor intracerebral, un sarcoma, por ejemplo sarcoma de Lewis, un osteosarcoma, un tumor en tejido blando, por ejemplo un tumor del esófago o de la traquea, neovascularización posterior a la recuperación en un accidente cerebrovascular, neovascularización debido a un trauma de cabeza, restenosis después de una angioplastia, neovascularización asociada con neovascularización del hígado inducida por una sustancia, disfunción angiogénica relacionada con un exceso de hormona, secuelas neovasculares de la diabetes o secuelas neovasculares por hipertensión.

En otra modalidad preferida de la invención el medicamento es para administrarle al individuo una dosis aproximadamente de 0,5 \mug por 1 kg de peso corporal hasta aproximadamente 1 mg por 1 kg de peso corporal, preferiblemente aproximadamente 1 \mug/kg hasta aproximadamente 50 \mug/kg de peso corporal.

En otra modalidad preferida, el medicamento es para administración de la dosis en forma diaria durante un período de 1 día hasta aproximadamente 30 días.

En otra modalidad preferida, el medicamento es para administración intramuscular o intranasal.

En otra modalidad preferida, el medicamento es para administración en la forma de una solución inyectable que contiene 0,001% hasta 0,01% del agente activo, preferiblemente L-Glu-L-Trp.

En otra modalidad preferida, el medicamento es en una forma de dosis unitaria que comprende una tableta, un supositorio, una cápsula, una película ocular, un inhalador, un nebulizador para mucosa, gotas para la nariz, gotas para los ojos, un dentífrico, un ungüento, o una crema soluble en base acuosa; opcionalmente dicha forma de dosis unitaria consiste esencialmente de 0,01 mg de dicho agente activo.

En otra modalidad preferida, el medicamento comprende además una droga vasoactiva, por ejemplo, un inhibidor de la enzima de conversión de la angiotensina (ECA) o en un abridor del canal de potasio (ACP).

En otra modalidad preferida, ya sea que el individuo sufra de un tumor y el medicamento contenga además un agente quimioterapéutico, o el individuo no esté comprometido en su sistema inmunológico.

La presente invención permite por lo tanto que el tratamiento de un individuo que tenga una condición patológica que involucre neovascularización por medio de la administración de una preparación farmacéutica que contiene un dipéptido R'-Glu-Trp-R'' y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el individuo en una cantidad efectiva para inhibir la neovascularización.

Las condiciones patológicas particulares que involucran neovascularización y dentro del alcance de la invención consisten de hemangiomas; los tumores maligno y benigno vascularizados, incluyen como tumores de las meninges, tumores intracerebrales, sarcomas, osteosarcomas, tumores de tejido blando tales como aquellos del esófago y la traquea; neovascularización del hígado inducida por la sustancia, incluida aquella secundaria inducida por la ingestión de droga, alcohol o sustancias de abuso; disfunción angiogénica relacionada con un exceso de hormona, por ejemplo, estrógeno; secuelas neovasculares de la diabetes, tal como corioretinopatía serosa central; secuelas neovasculares de hipertensión; neovascularización en la recuperación posterior de un accidente cerebrovascular; neovascularización debida a un trauma de cabeza; infección crónica del hígado (por ejemplo, hepatitis crónica); restenosis posterior a una angioplastia; y neovascularización debida a trauma por calor o por frío, tal como una quemadura o congelación. El dipéptido exhibe esta actividad tanto en individuos con sistemas inmunológicos sanos, esto es, que no están inmunológicamente comprometidos, así como en aquellos individuos que están inmunológicamente comprometidos.

Estos y otros aspectos de la invención se harán evidentes con referencia a la siguiente descripción detallada de la invención.

La presente invención provee preparaciones farmacéuticas Glu-Trp que contienen a un dipéptido R'-Glu-Trp-R'' y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El dipéptido R'-Glu-Trp-R'', como se lo utiliza aquí, se refiere al dipéptido L-Glu-L-Trp y a los derivados y análogos del mismo.

Como se lo utiliza aquí, un derivado del dipéptido R'-Glu-Trp-R'' incluye a aquellos en los cuales el dipéptido se derivatiza por medio de la unión covalente de una fracción en R' y/o R''. Esto incluye, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables del dipéptido, amidas, imidas, ésteres, anhídridos, éteres, metil o etil-alquil ésteres, derivados de alquilo, arilo o de mezclas de alquilo/arilo, en donde el peso fórmula es aproximadamente menor a 5000 Daltons o menor a 1000 Daltons, versiones multiméricas o cíclicas del dipéptido y péptidos aproximadamente de menos de 20 aminoácidos o aproximadamente de menos de 10 aminoácidos que incluyen glu-trp dentro de su secuencia de aminoácidos. Los ejemplos representativos incluyen HEW, EWEW, GEW, EWKHG, EWKKHG, EW-NH-NH-GHK-NH_{2}, Ac-L-Glu-L-Trp-OH, Suc-EW, Cpr-EW, But-EW, RKEWY, RKEW, KEWY, KEW y pEW.

Como se lo utiliza aquí, los análogos del dipéptido R'-Glu-Trp-R'' incluyen a aquellos en los cuales los L-aminoácidos se sustituyen por D-aminoácidos, tales como L-Glu-D-Trp, D-Glu-L-Trp o D-Glu-D-Trp, y análogos de triptófano tales como 5-hidroxi-triptamina , ácido 5-hidroxi-indol-acético y análogos de pirrol en los cuales el nitrógeno en el anillo de pirrol se reemplaza con carbono.

Actualmente L-Glu-Trp-L es el dipéptido R'-Glu-Trp-R'' más preferido. L-Glu-L-Trp también se lo menciona aquí en forma intercambiable como "EW" y "dipéptido EW", utilizando la convención de una sola letra en donde el primer aminoácido mencionado es el amino terminal y el último aminoácido mencionado es el carboxilo terminal.

Como se lo utiliza aquí, "neovascularización" se refiere a la generación de nuevos vasos sanguíneos. El proceso por medio del cual se forman nuevos vasos sanguíneos puede involucrar procesos de activación pericítica y de células endoteliales; degradación de lámina basal; migración y proliferación (esto es, división celular) de células endoteliales y de pericitos; formación de nuevo lumen de vasos capilares; aparición de pericitos alrededor de los nuevos vasos; desarrollo de una nueva lámina basal; formación de un bucle capilar; persistencia de involución, y diferenciación de nuevos vasos; y, formación de una red capilar y, eventualmente, organización dentro de microvasos más grandes. Como se menciona aquí, el proceso de proliferación de células endoteliales, por ejemplo, en una germinación vascular, se llama "angiogénesis" y se relaciona con neovascularización como subproceso. Las manifestaciones diagnósticas clínicas representativas de las enfermedades han sido clasificadas y codificadas (ver, por ejemplo, Clasificación Internacional de Enfermedades, ICD-9-CM, Washington, D.C. 1989). Los indicios representativos de laboratorio de neovascularización incluyen (pero no se limitan a) datos, por ejemplo, recolectados en agiogramas, TAC y monogramas, así como examen visual por medio de procedimientos endoscópicos y/o capilaroscópicos.

Como se lo utiliza aquí, los términos "angiostasis", "angiostático" e "inhibición de neovascularización" significa que la velocidad o grado de neovascularización en un tejido disminuye a partir del valor de un tratamiento previo hasta el valor de un tratamiento posterior. La angiostasis se puede determinar utilizando indicios clínicos o de laboratorio anteriores de actividad de la enfermedad. La angiostasis puede involucrar la inhibición de uno o más subprocesos involucrados en neovascularización, por ejemplo, proliferación o migración de células endoteliales o vasculares de músculo liso.

Como se la utiliza aquí, una "condición patológica que involucra neovascularización" se refiere a una condición patológica en la cual la neovascularización o el riesgo de ésta es un componente. Esto incluye, sin limitación, patologías en las cuales la neovascularización es la patología primaria, tal como hemangiomas; las patologías en las cuales la neovascularización no es la patología primaria pero contribuye a ella, tal como la neovascularización de tumores; y patologías n las cuales la neovascularización es una secuela de la enfermedad primaria, tal como la retinopatía serosa central en diabetes.

Como se lo utiliza aquí, el término "individuo" se refiere a un mamífero, incluidos primates humanos y no humanos, animales domésticos y ganado, animales de peletería, y similares, por ejemplo, perros, gatos, roedores, aves, caballos, vacas, cerdos, peces, y similares. Las modalidades de la invención abarcan métodos de tratamiento terapéutico y profiláctico para uso en individuos que necesiten de ellos.

Como se lo utiliza aquí, el término "comprometido inmunológicamente" se refiere a una persona que tiene un número inferior al normal de una o más células inmunológicas, tales como las células NK, linfocitos T, T4 o T8. Linfocitos B, o fagotitos, como se mide por medio de indicios estándar de diagnóstico clínico. También incluye individuos que tienen disminuida la función de las células inmunes como se determina por medio de ensayos estándar de funcionalidad de tales células, por ejemplo, producción de inmunoglobulinas, quimiotaxia, reacción mezclada de leucocitos o ensayos de hipersensibilidad retardada. Los individuos inmunológicamente comprometidos a menudo presentan infecciones oportunistas inusuales o inesperadas.

"Polipéptido" quiere decir una disposición serial de aminoácidos de más de 16 hasta muchos cientos de aminoácidos de longitud, por ejemplo, una proteína.

"Anormal" como se lo utiliza aquí, se refiere a indicios de laboratorio de neovascularización que están por fuera del rango de valores registrados en individuos sanos.

"Normalizado" como se lo utiliza aquí, se refiere a cambios en los indicios clínicos o de laboratorio de neovascularización que, después del tratamiento, se devuelven al rango normal de valores registrados para los individuos con salud normal. Un individuo sin un defecto vascular y sin una deficiencia conocida en cualquier sistema de coagulación, fibrinolítico, o vascular, se lo menciona aquí en forma intercambiable como "un individuo normal".

Como se lo utiliza aquí, los términos "modulador" y "modulante" significan el agente y el proceso de disminución de la neovascularización o angiogénesis en un individuo normal o en un individuo comprometido.

El tratamiento con R'-Glu-Trp-R'' se entiende como un método para suministrar a un individuo que necesite del mismo, una preparación farmacéutica de R'-Glu-Trp-R'' con el ánimo de inducir una disminución en la velocidad o en el grado de neovascularización o de angiogénesis.

En una modalidad actualmente preferida, una preparación farmacéutica de R'-Glu-Trp-R'' se administra a un paciente con cáncer en una cantidad y durante un tiempo suficiente para disminuir uno o más de los indicios clínicos o de laboratorio de neovascularización o de angiogénesis, efectuando por lo tanto una mejora en la condición clínica del paciente tratado así. Esta disminución en la neovascularización en el tumor, inhibiendo el suministro de sangre al tumor y, por lo tanto, inhibiendo el crecimiento del tumor.

En una modalidad preferida, se administra a un individuo una dosis aproximadamente de 0,5 \mug por kg de peso corporal hasta aproximadamente 1 mg por kg de peso corporal, diariamente durante un período de 1 día hasta aproximadamente 30 días. En modalidades preferidas, se le administra una dosis al individuo ya sea como una dosis intramuscular diaria única de la preparación farmacéutica R'-Glu-Trp-R'' (en forma intramuscular), o como una dosis intranasal diaria única de la preparación farmacéutica R'-Glu-Trp-R'' (en forma intranasal). La dosis para el individuo se formula preferiblemente como una solución estéril, inyectable, inhalable, como gotas para la nariz, o como una solución nebulizadora para la mucosa que contiene aproximadamente desde 0,001% hasta aproximadamente 0,01% de la preparación farmacéutica R'-Glu-Trp-R''. Alternativamente, la formulación de la preparación farmacéutica
R'-Glu-Trp-R'' puede incorporarse preferiblemente en una forma de suministro de dosis unitaria, por ejemplo, una tableta, un supositorio, una cápsula, una película ocular, o dentro de una pasta o ungüento, por ejemplo, un dentífrico, un ungüento dermatológico, o una crema soluble en base acuosa. Una forma de dosificación unitaria más preferida es para el suministro aproximadamente de 0,01 mg de la preparación farmacéutica R'-Glu-Trp-R''.

La invención encuentra una variedad de usos profilácticos y terapéuticos en el tratamiento de condiciones patofisiológicas en humanos y en animales domésticos. En ciertas modalidades, la invención encuentra uso durante el mantenimiento in vitro de cultivos de células endoteliales y de tejidos vasculares tales como puede ocurrir antes de una autoplastia o un injerto alogénico. Los usos involucran mantener los cultivos de células endoteliales o los cultivos de tejido vascular in vitro por medio del cultivo de los tejidos en un medio de cultivo que contiene un compuesto
R'-Glu-Trp-R''. Los usos de acuerdo con la invención tienen la ventaja de mantener los tejidos vasculares y reducir las alteraciones inflamatorias desencadenadas por el trauma del tejido que ocurre durante una remoción quirúrgica y el almacenamiento en un cultivo de tejido.

En un régimen de tratamiento profiláctico representativo, las composiciones objetivo utilizadas en la invención son para ser administradas a un paciente susceptible a, o bien con riesgos de desarrollar neovascularización, por ejemplo, con posterioridad a una cirugía se utilizan para prevenir la neovascularización de un tumor primario recurrente o de sus células metastáticas. La "dosis profilácticamente efectiva" quiere decir aquí una cantidad suficiente para producir un efecto angiostático en un sitio del tejido, en donde la cantidad dependerá del estado de salud del paciente y de peso, pero que generalmente caerá dentro de los rangos descritos aquí para uso terapéutico. La administración profiláctica puede ser particularmente deseable para individuos que tienen riesgo de las secuelas de una enfermedad que involucra neovascularización o angiogénesis como una complicación, por ejemplo, de la retinopatía
diabética.

Las modalidades de la invención fluyen regímenes de tratamiento terapéutico en donde una preparación farmacéutica con R'-Glu-Trp-R'' se administra sola, o en combinación con un segundo agente farmacéutico, esto es, una "terapia combinada". Las terapias representativas combinadas incluyen aquellas en las cuales se administra una composición de R'-Glu-Trp-R'' con uno o más antibióticos, agentes antiinflamatorios, o compuestos quimioterapéuticos. Las composiciones objetivo se puede administrar ya sea en conjunto con las segundas modalidades de tratamiento, o separadamente, por ejemplo, en diferentes momentos o en diferentes jeringas o tabletas. A menudo, se administra R'-Glu-Trp-R'' en una terapia combinada con agentes antiinflamatorios, antihistamínicos, agentes quimioterapéuticos y similares. Los tratamientos ilustrativos combinados con R'-Glu-Trp-R'' pueden incluir, por ejemplo, agentes antiinflamatorios bien conocidos en el estado del arte.

Los tratamientos ilustrativos combinados con R'-Glu-Trp-R'' pueden incluir también la administración de una droga vasoactiva como el segundo agente. Las drogas vasoactivas representativas incluyen drogas en la clase de los inhibidores de enzima convertidora de angiotensina (ECA), abridores de canal de potasio (ACP) y similares.

Los tratamientos ilustrativos combinados para cáncer con R'-Glu-Trp-R'' incluyen la administración de un agente quimioterapéutico como segundo agente. Los tratamientos con R'-Glu-Trp-R'' puede ser efectivos para disminuir los efectos secundarios indeseables asociados con una terapia de corticosteroides, por ejemplo, neovascularización. Los agentes quimioterapéuticos representativos son bien conocidos en el estado del arte.

Las personas entrenadas ajustarán el ritmo y dosificación para acomodarse a los síntomas clínicos de los pacientes. Tal conocimiento se ha acumulado durante décadas, y se reporta en la literatura médica así como en los textos médicos. El momento de cuándo iniciar los métodos-objetivo en terapias con agentes combinados o sencillos reposa en el juicio clínico del médico.

La terapia empírica es una terapia diseñada para tratar a los agentes causantes más comunes o probables con base en información histórica, demográfica, y epidemiológica. La terapia empírica puede incluir a menudo el uso de múltiples agentes terapéuticos diseñados para cubrir un amplio rango de posibilidades terapéuticas. Cuando se dispone de los datos de los análisis de laboratorio, se puede ajustar la escogencia de la terapia para tratar en forma más particular a la enfermedad. Ya que el tratamiento de síndromes clínicos se inicia muy a menudo empíricamente, por el contrario, un nuevo método terapéutico debe ser probado para un síndrome clínico particular.

En el arte del desarrollo de drogas farmacéuticas, los estudios preclínicos de una terapia evalúan los efectos de la terapia no sólo sobre una condición, sino sobre agentes y condiciones múltiples de interés. Los resultados de los diferentes estudios (alguna veces equivocados) se prueban como los beneficios y los riesgos de la terapia particular dado del conocimiento médico de los riesgos asociados con una enfermedad particular.

Es común que no todos los pacientes con un síndrome se curen por medio de una terapia única, sino que más bien puede existir un subgrupo de pacientes con los cuales la terapia tenga un resultado positivo y favorable. Los ejemplos de síndromes clínicos en los cuales subgrupos de pacientes pueden encontrar resultados favorables a partir las terapias objeto de la invención, se divulgan en los diferentes párrafos siguientes.

Las composiciones siguientes utilizadas en la invención están encaminadas a administración parenteral, tópica, subcutánea, intramuscular, intratecal, oral, intranasal, intraperitoneal o local (por ejemplo, en crema sobre la piel), o a tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Preferiblemente, las composiciones de la presente invención son para ser administradas en forma parenteral, intramuscular o intranasal. Las composiciones objetivo con R'-Glu-Trp-R'' tienen aquí la ventaja de proveer los efectos deseados con niveles de dosis muy bajos y sin toxicidad. Por lo tanto, un propósito de la terapia en un estado agudo puede ser la de incrementar rápidamente la concentración de R'-Glu-Trp-R'' en un tejido, por ejemplo, por medio de una inyección o infusión intravenosa el bolo. Alternativamente, en otros casos puede ser deseable suministrar R'-Glu-Trp-R'' durante un período de tiempo más largo.

Las composiciones objetivo que contienen R'-Glu-Trp-R'' se puede formular en formas que permitan la absorción dentro del torrente sanguíneo. Las composiciones presentes son moduladores vasculares que inducen cambios a nivel celular que posteriormente efectúan cambios en procesos celulares que no dependen más de la presencia de la composición. Se ha observado que los efectos del péptido pueden ser de larga duración, esto es, de semanas a meses, a pesar de la degradación bastante rápida del péptido, por ejemplo dentro de 5 minutos. Aunque los compuestos objetivo
R'-Glu-Trp-R'' son en sí mismos solubles en agua en las bajas concentraciones las cuales usualmente se emplean, se los utiliza preferiblemente en la forma de sus sales ácidas o alcalinas formadas con agentes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, ácido acético, cítrico, maléico, succínico, sodio, potasio, amonio, o zinc. Las sales libremente solubles de las composiciones objetivo R'-Glu-Trp-R'' se puede convertir también en sales de baja solubilidad en fluidos corporales, por ejemplo, por medio de modificación con una sal farmacéuticamente aceptable ligeramente soluble en agua como el ácido tánico o el ácido palmóico, o por medio de la inclusión en una formulación de liberación en el tiempo con acoplamiento covalente a un portador más largo, o inclusión en una cápsula de liberación en el tiempo y similares.

Las preparaciones farmacéuticas objetivo R'-Glu-Trp-R'' se puede utilizar como péptidos libres o en la forma de sales farmacéuticamente aceptables solubles en agua sus, tales como una sal de sodio, de potasio, de amonio o de cinc. Se entenderá que los dipéptidos objetivo se pueden administrar con otros ingredientes activos que impartan independientemente una actividad a la composición. Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden preparar convenientemente a partir de un dipéptido R'-Glu-Trp-R'' (o su agonista) por medio de métodos convencionales. Por lo tanto, tales sales pueden ser, por ejemplo, preparadas por medio de tratamiento del dipéptido R'-Glu-Trp-R'' con una solución acuosa del hidróxido metálico farmacéuticamente aceptable deseado o de otra base metálica y evaporar la solución resultante hasta sequedad, preferiblemente bajo presión reducida en atmósfera de nitrógeno. Alternativamente, una solución del dipéptido R'-Glu-Trp-R'' se pueden mezclar con un alcóxido del metal deseado, y evaporar posteriormente la solución hasta sequedad. Los hidróxidos, bases y alcóxidos farmacéuticamente aceptables incluyen aquellos con cationes para este propósito, incluyendo (pero sin limitarse a), potasio, sodio, amonio, calcio y magnesio. Otras sales representativas farmacéuticamente aceptables incluyen clorhidrato, bromhidrato, sulfato, bisulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato y similares.

Para administración parenteral, la presente invención provee preparaciones farmacéuticas que contienen una solución del dipéptido R'-Glu-Trp-R'', o formas poliméricas, multiméricas, o cíclicas o derivados de los mismos, disueltos en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Se pueden utilizar una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua amortiguada, suero fisiológico al 0,4%, glicina al 0,3%, y similares, incluidas proteínas y/o glicoproteínas para una mejor estabilidad, tales como albúmina, lipoproteína, globulina, y similares. Estas composiciones se pueden esterilizar por medio de técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las soluciones acuosas resultantes se pueden empacar para ser utilizadas o filtradas bajo condiciones asépticas y liofilizadas, siendo combinada la preparación liofilizada con una solución acuosa estéril antes de su administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas, tales como los agentes para el ajuste del pH y la amortiguación, los agentes para el ajuste de la tonicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc. Puede ser deseable estabilizar a los dipéptidos R'-Glu-Trp-R'', análogos, derivados, agonistas, y similares para incrementar su duración en almacenamiento y la vida media farmacocinética. La estabilidad en almacenamiento se mejora por medio de la adición de excipientes tales como: a) agentes hidrófobos (por ejemplo, glicerol); b) azúcares (por ejemplo, sacarosa, manosa, sorbitol, ramnosa, xílosa); c) carbohidratos complejos (por ejemplo, lactosa); y/o d) agentes bacteriostáticos. La vida media farmacocinética de los péptidos se modifica por medio del acoplamiento a péptidos portadores, polipéptidos, y carbohidratos por medio de derivatización química (por ejemplo, acoplando la cadena lateral o los residuos N o C-terminales), o alterando químicamente al aminoácido por otro aminoácido (como más arriba). La vida media farmacocinética y los farmacodinámicos también se pueden modificar por medio: a) encapsulación (por ejemplo, en liposomas); b) controlando el grado de hidratación (por ejemplo, por medio del control del grado y el tipo de glicosilación del péptido); y, c) controlando la carga electrostática y la hidrofobicidad del
péptido.

El dipéptido R'-Glu-Trp-R'' que contienen las composiciones utilizadas en la presente invención se pueden administrar en forma compatible farmacéuticamente adecuada para administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular). Las preparaciones se pueden someter a operaciones farmacéuticas convencionales, tales como esterilización, y pueden contener adyuvantes, tales como preservantes, estabilizadores, agentes humectantes y similares.

Las composiciones con el dipéptido R'-Glu-Trp-R'' son típicamente biológicamente activas en dosis aproximadamente de 0,5 \mug/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg, preferiblemente aproximadamente 1 \mug/kg hasta aproximadamente 50 \mug/kg. La concentración de los dipéptidos R'-Glu-Trp-R'' en composiciones farmacéuticas puede variar, esto es, aproximadamente desde 0,001% hasta 15 ó 20% en peso y se seleccionará principalmente por medio de volúmenes fluidos, viscosidades, etc., de acuerdo con las necesidades particulares del tratamiento y de la forma de administración a un paciente. Cuando se las utiliza en forma intramuscular como una solución inyectable con el ingrediente activo en una cantidad efectiva para inhibir la neovascularización, por ejemplo, aproximadamente 0,001% hasta 0,01% en peso de R'-Glu-Trp-R''. Si se la prepara en forma de una tableta, cápsula o supositorio, se prefiere que el ingrediente activo esté presente en una cantidad aproximadamente de 0,1 mg de R'-Glu-Trp-R'' por tableta, supositorio o cápsula. El vehículo farmacéuticamente aceptable para esta forma de inyección puede ser cualquier solvente farmacéuticamente aceptable tal como el cloruro de sodio acuoso al 0,9%, agua destinada, solución de Novocaína, solución de Ringer, solución de glucosa, y similares. En tal forma, la cápsula, el supositorio o la tableta también pueden contener otros excipientes convencionales y vehículos tales como rellenos, almidón, glucosa, etc. En preparaciones tópicas, los dipéptidos R'-Glu-Trp-R'' están generalmente contenidos en emolientes basados en urea, ungüentos basados en petróleo, y similares a concentraciones aproximadamente de 0,1 a 10.000 partes por millón, preferiblemente aproximadamente de 1 a 1000 partes por millón, y más preferiblemente aproximadamente 10 a 100 partes por millón. Los métodos actuales para preparar compuestos que puedan ser administrados en forma parenteral, oral, y tópica serán conocidos o claros para aquellos capacitados en el arte y se describen con detalle, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science, 17ava edición, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985).

Se prefieren las vías intramuscular e intranasal para la administración de las composiciones objetivo R'-Glu-Trp-R''. Una dosificación preferida de las composiciones objetivo para administración intramuscular es aproximadamente de 50 \mug hasta 100 \mug de R'-Glu-Trp-R'' por dosis para adultos (para una terapia de tratamiento total de 300 \mug hasta 1000 \mug); para niños hasta de 1 año de edad aproximadamente 10 \mug por dosis, para niños de 1 a 3 años de edad aproximadamente 10 \mug a 20 \mug por dosis; para niños de 4 a 6 años de edad aproximadamente 20 \mug a 30 \mug por dosis, para niños de 7 a 14 años de edad aproximadamente 50 \mug por dosis. Todas las dosis anteriores son útiles para un tratamiento de 3 a 10 días, dependiendo de las necesidades del paciente. El tratamiento se puede repetir según se necesite, usualmente dentro de 1 a 6 meses. En otra modalidad preferida, una dosis para tratamiento aproximadamente de 10 \mug/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg de una preparación farmacéutica de R-Glu-Trp-R'' para ser administrada a un individuo diariamente durante un período aproximadamente 6 días hasta aproximadamente 10 días pero opcionalmente bajo discreción del médico tratante hasta por 30 días aproximadamente. El transcurso de una terapia preferida, se administra diariamente R'-Glu-Trp-R'' en una dosis de 1-100 \mug/kg durante 5-7 días, seguido de una intermitencia de 1-6 meses antes de repetir el mismo régimen de inyecciones.

La composición R'-Glu-Trp-R'' se pueden administrar sola o formularse con vehículos farmacéuticamente aceptables, ya sea en dosis únicas o múltiples. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes o rellenos sólidos inertes, soluciones acuosas estériles, y diferentes solventes orgánicos no tóxicos. Las composiciones farmacéuticas formadas por medio de la combinación del dipéptido R'-Glu-Trp-R'' con un vehículo farmacéuticamente aceptable y un antibiótico opcional. La combinación objetivo de agentes terapéuticos se administra entonces fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como tabletas, pastillas, jarabes, soluciones inyectables, y similares. La combinación de agentes terapéuticos puede incluir también al dipéptido R'-Glu-Trp-R'', por ejemplo, L-Glu-L-Trp, en la misma forma de dosificación unitaria. Los vehículos farmacéuticos pueden, si se desea, contener ingredientes adicionales tales como saborizantes, aglutinantes, excipientes, y similares.

Así, para los propósitos de administración oral, se pueden emplear tabletas que contengan diferentes excipientes tales como citrato de sodio, carbonato de calcio, y fosfato de calcio junto con diferentes desintegrantes tales como almidón, y preferiblemente, almidón de papa o de tapioca, ácido algínico, y ciertos silicatos complejos, junto con agentes aglutinantes tales como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y acacia. Adicionalmente, agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, laurel sulfato de sodio, y talco, son a menudo útiles para los propósitos de tableteado. Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como rellenos en cápsulas de gelatina con sal y relleno duro. Los materiales preferidos para este propósito incluyen la lactosa o azúcar de leche y polietilén glicoles de alto peso molecular. Cuando se desean suspensiones acuosas de elixires para administración oral, los ingredientes esenciales del dipéptido R'-Glu-Trp-R'' activo se pueden combinar allí dentro con diferentes agentes edulcorantes o saborizantes, material colorante o tinta, y si se desea, agentes emulsificantes o de suspensión, junto con diluyentes tales como agua, etanol, propilén glicol, glicerina, y combinaciones de los mismos.

Para administración parenteral, se pueden emplear soluciones de R'-Glu-Trp-R'' en sésamo o en aceite de maní o en polipropilén glicol acuoso, así como soluciones acusas de suelo fisiológico estéril de las correspondientes sales metálicas farmacéuticamente estables solubles en agua previamente descritas. Tale solución acusa se debe amortiguar convenientemente si es necesario y tornar primero isotónico al diluyente líquido con suficiente suero fisiológico o glucosa. Estas soluciones acusas particulares son especialmente adecuadas para inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea, e intraperitoneal. El medio acuoso estéril empleado se obtiene fácilmente por medio de técnicas estándar bien conocidas por aquellos capacitados en el arte. Adicionalmente, es posible administrar tópicamente los compuestos mencionados (por ejemplo, a través de un catéter ubicado) utilizando una solución apropiada adecuada para el propósito a la mano.

Una cantidad adecuada para efectuar un resultado terapéutico en más de 50% de individuos así tratados, se define como una "dosis terapéuticamente efectiva". El tratamiento de condiciones agudas generalmente ocurrirá aproximadamente durante 3-10 días. El tratamiento de condiciones crónicas o los tratamientos profilácticos tienen el mismo curso, pero se pueden repetir aproximadamente después de 1-6 meses o más. En algunos casos, puede ser deseable administrar las composiciones intermitentemente sobre una base diaria por períodos aproximadamente desde 2 hasta aproximadamente 20 días, preferiblemente aproximadamente desde 3 hasta aproximadamente 14 días, más preferiblemente aproximadamente desde 4 hasta aproximadamente 10 días que se repiten aproximadamente al menos 15 días, preferiblemente aproximadamente 20 días o aproximadamente tanto como 1 a 6 meses o más.

La ruta de suministro de una composición R'-Glu-Trp-R'' se determina por la enfermedad y el sitio en donde requiere el tratamiento. Para aplicaciones tópicas puede ser deseable aplicar la composición R'-Glu-Trp-R'' en el sitio local (por ejemplo, colocando una aguja dentro del tejido en el sitio) o colocando una banda impregnada por ejemplo en el sitio del tumor después de una remoción quirúrgica; mientras que para otras enfermedades puede ser deseable administrar en forma sistémica las composiciones R'-Glu-Trp-R''. Para otras indicaciones, las composiciones R'-Glu-Trp-R'' y similares se pueden suministrar por medio de inyección intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal, e intradérmica, así como, por medio de instilación intrabronquial (por ejemplo, con un nebulizador), suministro transdérmico (por ejemplo, con un portador soluble en lípido en un parche para la piel), o suministro gastrointestinal (por ejemplo, con una cápsula o tableta).

En general, las sales de adición ácida de la composición objetivo R'-Glu-Trp-R'', por ejemplo, L-Glu-L-Lys, las composiciones con ácidos farmacéuticamente aceptables serán biológicamente equivalentes a las composiciones objetivo R'-Glu-Trp-R'' en sí mismas.

Las composiciones terapéuticas preferidas, inóculos, rutas y dosis desde luego variarán con la indicación clínica. Para inyección intramuscular, el inóculo se prepara típicamente a partir de un péptido seco (o péptido conjugado) suspendiendo al péptido en un diluyente fisiológicamente aceptable tal como agua, suero fisiológico, o suero fisiológico amortiguado con fosfato. Necesariamente ocurrirá alguna variación en la dosis dependiendo de la condición del paciente que está siendo tratado, y el médico, en cualquier caso, determinará la dosis apropiada para el paciente individual. La cantidad efectiva de péptido por dosis unitaria depende, entre otras cosas, del peso corporal, la fisiología, y del régimen de inoculación escogido. Una dosis unitaria de péptido se refiere al peso de péptido sin el peso del portador (cuando se utiliza portador). Se logrará un tratamiento efectivo cuando la concentración del dipéptido
R'-Glu-Trp-R'', por ejemplo, L-Glu-L-Trp, en un sitio del tejido en el micro ambiente de las células se aproxima a una concentración de 10^{-5} M a 10^{-9} M. Las personas entrenadas pueden hacer uso de indicios clínicos y de laboratorio (más arriba) para hacer seguimiento a la respuesta del paciente a la terapia objetivo y ajustar en forma adecuada la dosis. Ya que las farmacocinéticas y farmacodinámicas de los dipéptidos R'-Glu-Trp-R'', agonistas, antagonistas, y similares variarán en indiferentes pacientes, un método más preferido para lograr una concentración terapéutica en un tejido, es escalar gradualmente la dosis y hacer seguimiento a los indicios clínicos y de laboratorio (más arriba). La dosis inicial, para un régimen tal de terapia de dosis por escalamiento, dependerá de la ruta de administración. Para administración intravenosa del dipéptido R'-Glu-Trp-R'' con un peso molecular aproximado de 200 a 400 daltons, se administran una dosis inicial aproximadamente de 0,5 \mug/kg de peso corporal y se escala la dosis hasta un incremento de 10 veces en concentración para cada intervalo del régimen de dosis por escalamiento.

Si se presenta en la forma de una tableta, cápsula o supositorio, se prefiere que el ingrediente activo esté presente en una cantidad aproximadamente de 0,1 mg por tableta, supositorio o cápsula. Si se presenta en tal forma, la cápsula, el supositorio una tableta pueden contener también otros excipientes convencionales y vehículos tales como rellenos, almidón, glucosa, etc.

Convenientemente, se sintetiza al dipéptido objetivo R'-Glu-Trp-R'' por medio de cualquiera entre un cierto número de técnicas automatizadas que están disponibles comúnmente ahora. Generalmente hablando, estas técnicas involucran la síntesis escalonada por medio de adiciones sucesivas de aminoácidos para producir moléculas progresivamente mayores. Los aminoácidos se enlazan entre sí por medio de condensación entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de otro aminoácido para formar un enlace peptídico. Para controlar estas relaciones es necesario bloquear al grupo amino de un aminoácido y al grupo carboxilo del otro aminoácido. Los grupos de bloqueo se deben seleccionar para remoción fácil sin afectar adversamente los péptidos, esto es, por medio de racemización o de hidrólisis de los enlaces peptídicos formados. Los aminoácidos con grupos carboxilo (por ejemplo, Asp, Glu) o grupos hidroxilo (por ejemplo, Ser, homoserina, y tirosina) también requieren de bloqueo previo a la
condensación.

Existe una amplia variedad de procedimientos para la síntesis de péptidos, siendo preferida usualmente la síntesis en fase sólida. En este procedimiento un aminoácido se une a una partícula de resina, y el péptido generado paso a paso por medio de adiciones sucesivas de aminoácidos protegidos a la cadena en crecimiento. Se utilizan comúnmente las modificaciones de la técnica descrita por Merrifield. En un ejemplo de método automatizado en fase sólida, los péptidos se sintetizan cargando el aminoácido carboxi terminal sobre un enlazador orgánico (por ejemplo, PAM, 4-oximetil fenilacetilamidometilo) unido en forma covalente a una resina insoluble de poliestireno que se entrecruza con divinil benceno. Se utiliza el bloqueo con t-Boc para proteger a la amina terminal, y los grupos hidroxilo y carboxilo comúnmente se bloquean con grupos O-bencilo. La síntesis se logra con un sintetizador automatizado de péptidos (Applied Biosystems, Foster City, CA, por ejemplo, el Modelo 430- A). Después de la síntesis, se puede remover el producto de la resina y remover los grupos de bloqueo utilizando ácido fluorhídrico o ácido trifluorometil sulfónico de acuerdo a métodos establecidos (Bergot, B.J. y S.N. McCurdy, Applied Biosystems Bulletin, 1987). Una síntesis de rutina puede producir 0,5 mmoles de péptido-resina. El rendimiento después de la escisión y purificación es aproximadamente 60 a 70%. Por ejemplo, un derivado amino y de una cadena lateral protegida de un éster activado de Glx reacciona con Trp protegido con un grupo lateral, unido a la fase sólida en su C-terminal. Después de la eliminación del grupo de protección alfa-amino, se puede escindir el péptido de la fase sólida o de otro aminoácido añadido en forma similar. Los aminoácidos adicionales se añaden en forma serial. Los péptidos se escinden por medio de escisión en medio muy ácido que también remueve típicamente a los grupos de protección.

Los péptidos se pueden aislar y liofilizado entonces, y almacenar para uso futuro. Las técnicas adecuadas de síntesis de péptidos se describen en detalle en Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, segunda edición, Pierce Chemical Company, 1984; y Tam y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 105:6442 (1983).

La purificación de los productos peptídicos se logra por ejemplo por medio de cristalización de péptido a partir de un solvente orgánico tal como el éter metil-butílico, seguido por disolución en agua destinada, y diálisis (si el peso molecular es aproximadamente mayor a 500), cromatografía en capa delegada, cromatografía sobre gel, liofilización, o HPLC en fase reversa (por ejemplo, utilizando una columna C18 con ácido trifluoroacético al 0,1% y acetonitrilo como solventes) si el peso molecular es menor a 500. El péptido purificado se liofiliza y almacenar en estado seco hasta su uso. Una preparación farmacéutica R'-Glu-Trp-R'' representativa es el dipéptido purificado L-Glu-L-Trp, que contiene un polvo blanco (si está liofilizado; de lo contrario es cristalino), soluble en agua, DMF; insoluble en cloroformo y en éter. [alfa 22_{D} = + 12.6; C = 0.5 H_{2}O. R_{f} = 0.65 (butanol:ácido acético: agua = 3:1:1). UV (275 \pm 5 nm, máx). RMN (500 MHz): 0.001mol/l de la solución del péptido, Trp (3.17; 3.37; 4.57; 7.16; 7.24; 7.71; 7.49); Glu (1.90; 1.96; 2.21; 3.72).

Típicamente un derivado protegido de cadena lateral y de amino de un éster activado de ácido glutámico reacciona con L-triptófano protegido. Después de la eliminación de los grupos de protección y de purificación convencional, tal como por medio de cromatografía GL o en capa delegada, se puede purificar el péptido por ejemplo por liofilización, purificación por gel, y similares.

Mientras no se desee estar atado a ningún mecanismo particular de acción, se cree posible que los péptidos objetivo que contienen triptófano pueden asociarse en forma reversible con receptores celulares EW específicos sobre células endoteliales, estando uno de tales receptores definido como la superficie celular determinante omnipresente "CD2" presente también sobre linfocitos, células endoteliales y ciertas células epiteliales. Se piensa que es posible que el enlazamiento del dipéptido EW a CD2 (y a otros receptores EW) desencadene un cambio en la conformación del receptor que puede iniciar el aumento de expresión de la adenilato ciclasa y una AMPc intracelular aumentada. Actualmente se cree posible que L-Glu-L-Trp ejerza su efecto por medio de la reducción en la expresión de los mecanismos celulares por medio de los cuales los mediadores inflamatorios tales como TNF-\alpha e IL-1 desencadenan a la célula endotelial y la activación de pericitos y proliferación. La activación resulta en cambios en la expresión en la superficie celular de adhesinas involucradas en el enlazamiento de células inflamatorias en la vasculitis, mientras que la proliferación estar involucrada en neovascularización. La reducción en la expresión de L-Glu-L-Trp de los efectos endoteliales inducidos por el mediador inflamatorio, puede involucrar desfosforilación en una o más de las tirosina quinasas celulares. Se considera probable que tal reducción en la expresión puede resultar en cambios en la síntesis o en la expresión en la superficie celular de adhesinas endoteliales, selectinas, y/o integrinas, por ejemplo ELAM, VCAM, y similares. Los cambios celulares más recientes inducidos por dipéptidos que contienen triptófano pueden resultar en una disminución en la capacidad de las células inflamatorias (por ejemplo, linfocitos, neutrófilos, y/o monocitos) para localizarse en sitios de vasculitis.

Como se utiliza aquí, los símbolos para los aminoácidos están de acuerdo con las recomendaciones de la IUPAC-IUB publicadas en Arch. Biochem. Biophys. 115: 1-12, 1966 con los símbolos siguientes de una sola letra para los aminoácidos: L, Leu, Leucina; V, Val, Valina; Y, Tyr, Tirosina; D, Asp, Ácido Aspártico; W, Trp, Triptófano; P, Pro, Prolina; I, Ileu, Isoleucina; G, Gly, Glicina; M, Met, Metionina; E, Glu, Ácido Glutámico; T, Thr, Treonina; K, Lys, Lisina; N, Asn, Asparagina; R, Arg, Arginina; Q, Gln, Glutamina; A, Ala, Alanina; C, Cys, Cisteína; S, Ser, Serina; F, Phe, Fenilalanina; H, His, Histidina; C, Cys, Cisteína; S, Ser, Serina.

Ejemplo 1 Carencia de Mutagenicidad y de Toxicidad de L-Glu-L-Trp: Farmacocinética y Biodistribución

Protocolo A

Estudios de Toxicidad Aguda

Resumen: cuando se inyecta L-Glu-L-Trp en forma intramuscular en dosis calculadas para ser aproximadamente 10.000 veces una dosis terapéutica, no fue tóxica en ratones, conejillos de indias, pollos, y perros como se determinó haciendo un seguimiento a la condición general, el comportamiento, los movimientos, la fisiología cardiaca y respiratoria, y la patología en conjunto.

\newpage

Protocolo B

Estudios de Toxicidad Crónica

Resumen: cuando se inyecta diariamente L-Glu-L-Trp como una inyección intramuscular única o intravenosa durante un período de 28 días fue sin efectos adversos, como se determinó haciendo seguimiento el comportamiento, alimentación, peso corporal, condición del pelaje, membranas mucosas, recuento de glóbulos blancos y glóbulos rojos, fisiología cardiaca y respiratoria, funcionamiento del hígado y el riñón, y patología en conjunto. El funcionamiento del riñón se determinó por medio de la evaluación de la diuresis después de la ingesta de agua; para ciertos otros experimentos, los perros y las ratas fueron sacrificados y examinados después de 10, 20, 30, y 60 días.

Protocolo C

Farmacocinéticas y Biodistribución: Estudio GLP

Se administró en forma intranasal L-Glu-L-Trp radiomarcado con ^{14}C (110 \mug/kg) a ratas Sprague-Dawley. Se recolectaron muestras de sangre y de tejido a horas diferentes: 0,5, 2, 8, ó 24 y se determinó la cantidad intacta de L-Glu-L-Trp por medio de HPLC. Las muestras de tejido incluyeron glóbulos rojos empacados, glóbulos blancos, hígado, riñón, corazón, pulmón, bazo, timo, cerebro, músculo, piel, grasa, ojos, ovarios, testículos, nodos linfáticos submandibulares, y el tracto gastrointestinal con su contenido. El ^{14}C- L-Glu-L-Trp administrado en forma intranasal se absorbió rápidamente con un C_{máx} en plasma de 0,349 \mug*eq.*hora/g del ^{14}C. No se detectaron compuestos intactos en la sangre a los 30 minutos con una sensibilidad en el rango de 5-101 ng/mL, sugiriendo una vida media en sangre de menos de 30 minutos. La vida media para eliminación del tejido se terminó que era de 18,7 horas.

Ejemplo 2 Efectos Inhibidores de L-Glu-L-Trp sobre la Angiogénesis en los Ensayos en Membrana Corioalantóica (MCA)

En resumen, se removieron embriones de pollo de ocho días de los huevos y se los colocó en cajas de Petri estériles. Los discos individuales de papel filtro se saturaron con 7,5 \mul de diferentes soluciones patrón de L-Glu-L-Trp disueltos en NaCl estéril 0,14M para lograr concentraciones finales de ensayo de 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 10, 100, 500 y 1000 \mug por disco. Los discos se secaron al aire y luego se invirtieron sobre la superficie de los respectivos embriones. La vascularización de los embriones se midió después de 48 horas de incubación utilizando la escala de clasificación resumida en la Tabla 1, a continuación.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Recuento de Vascularización de Embriones de Pollo: Ensayo MCA

Grado de Inhibición	Descripción	Porcentaje de Inhibición
0	No hay diferencia visible con el control negativo	0
1	Ligera inhibición de la formación de vasos	25
2	Inhibición moderada de la formación de vasos	50
3	Inhibición casi completa de la formación de vasos	75
4	Inhibición completa de la formación de vasos	100

En este experimento el suero fisiológico sirvió como control negativo y 10 \mug/disco de heparina sirvieron como control positivo. El pentapéptido Tyr-Ala-Glu-Glu-Lys (TAEEK) sirvió como un control específico (esto es, para posibles efectos no específicos de péptidos sobre la neovascularización en la concentración analizada). Nueve discos de 12 ensayos y un número correspondiente de embriones diferentes se emplearon para cada concentración de prueba junto con 82 (cada uno) y embriones de control positivos y negativos. Los resultados resumen en la siguiente
Tabla.

TABLA 2 Resultados de los Ensayos MCA sobre Embriones de Pollo

1

Los resultados muestran una disminución de 30-88% en vascularidad en embriones tratados con 10 ng-1000 \mug de L-Glu-L-Trp en suero fisiológico. El nivel de inhibición logrado con las dosis de 10-1000 \mug se aproximó a aquella con heparina (10 \mug). Aunque se observaron algunos efectos no específicos que se presumían de control del pentapéptido TAEEK sobre la vascularidad del embrión con las dosis más altas (esto es, 100-1000 \mug), el efecto no fue tan pronunciado como el logrado con L-Glu-L-Trp y el efecto presuntivo no específico no se observó con dosis menores. Tomado juntos estos resultados se sugiere un efecto de L-Glu-L-Trp sobre el proceso de formación de vasos en tejidos embrionarios de pollo.

Ejemplo 3 Inhibición de Neovascularización del Carcinoma de Lewis

Cuando se inyectan (0,1 ml) células de carcinoma de pulmón de Lewis (5x10^{7}) en forma intradérmica en ambos costados de los ratones C57BL/6 (día 0) se producen nódulos de tumor vascularizado altamente visibles dentro de 7 días. Extirpando el tumor se puede determinar microscópicamente el grado de vascularización del tumor contando el número de vasos grandes que se radian desde la masa del tumor. Se llevó a cabo un estudio independiente (como sigue) con una organización de investigación con convenio aprobado de BPM.

El suero fisiológico se utilizó como control negativo y Citoxan como control positivo. El control positivo, Citoxan (200 mg/kg), se administró únicamente el día 2. Los tratamientos de prueba con L-Glu-L-Trp se administraron en forma intramuscular diariamente empezando el día 1 después de la inyección en el tumor y continuando durante 5 días (esto es, hasta el día 6). Se administró L-Glu-L-Trp en dosis de 125, 250, 500, 1000 y 2000 \mug/kg/dosis. El control negativo, suero fisiológico, se administró en forma intraperitoneal diariamente con el mismo cronograma de 5 días. Se evaluaron diez ratones (20 tumores) con cada dosis de prueba o agente de control. Los resultados se resumen en la siguiente Tabla.

TABLA 3 Inhibición de Neovascularización del Tumor de Pulmón de Lewis

3

Los resultados muestran una clara inhibición estadísticamente significativa de neovascularización como resultado de los tratamientos ya sea con Citoxan o con L-Glu-L-Trp. Las bajas dosis de L-Glu-L-Trp fueron más efectivas en la inhibición de la angiogénesis (grupos 4-7) que las dosis más altas (grupo 3). El perfil inverso dosis-respuesta, esto es, con menor actividad a dosis más altas, es consistente con el desempeño observado previamente de otros modificadores de respuesta biológica en este ensayo (por ejemplo, IFN-\alpha o IL-12).

Todos los tratamientos fueron bien tolerados y no se registraron muertes o pérdida de peso.

Ejemplo 4 Actividad Antitumoral de L-Glu-L-Trp: Sarcoma 180

Se requiere de neovascularización para el desarrollo del tumor. La actividad antitumoral de L-Glu-L-Trp se evaluó con una organización de investigación con un convenio independiente. Los tumores de Sarcoma 180 (ATCC CCL-8 CCRF S-180 II) se indujeron por medio de una inyección de 2 x 10^{6} células/0,1 ml en forma intramuscular en cada costado posterior de los ratones Swiss-Webster. Los grupos consistían de 10 animales (20 tumores). Se administró L-Glu-L-Trp en una dosis única de 0,1 ml ya sea de 10 \mug/kg, 75 \mug/kg, 250 \mug/kg ó 100 \mug/kg. El tamaño de los tumores se evaluó por medio de remoción quirúrgica y pesaje de los miembros afectados, y comparando el peso con el peso de los miembros de control normal (sin tumor). El primer régimen de droga profiláctica (RDP-1) consistió de 5 inyecciones intraperitoneales consecutivas en forma diaria, comenzando el día 5 y terminando el día 1. El segundo régimen de droga profiláctica (RDP-2) consistió de 5 inyecciones intramusculares diarias consecutivas en el costado posterior izquierdo (sitio del tumor) comenzando el día 5 y terminando el día 1. Las células de Sarcoma 180 se inyectaron en forma intramuscular el día 0. 0,1 ml de suero fisiológico sirvieron como control negativo.

TABLA 4 Efecto de los Tratamientos con L-Glu-L-Trp sobre el Tamaño del Tumor de Sarcoma 180

4

Los resultados presentados en la Tabla 5 muestran que los tratamientos profilácticos con L-Glu-L-Trp intraperitoneal o intramuscular en dosis de 250 \mug/kg y 1000 \mug/kg, inhibieron el crecimiento posterior intramuscular del tumor. En forma muy interesante, parece posible invocar los efectos sistémicos del inhibidor a partir de tratamientos suministrados en un sitio intramuscular local, debido a que los tratamientos intramusculares suministrados en el costado izquierdo inhibieron el crecimiento posterior del tumor en el costado derecho (esto es, los grupos 8 y 9). Los resultados son consistentes con la inhibición de la neovascularización observada en los Ejemplos 2 y 3, más arriba.

La presente invención provee un medio sustancialmente nuevo para inhibir la neovascularización. Aún cuando se han suministrado ejemplos específicos, la anterior descripción es ilustrativa y no restrictiva.

Claims (15)

1. El uso de un agente activo que contiene un dipéptido Glu-trp antiangiogénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una condición patológica que involucra neovascularización, la condición patológica seleccionada de la neovascularización de tumores, hemangiomas, neovascularización en la recuperación posterior a un accidente cerebrovascular, neovascularización debida a trauma de cabeza, restenosis después de una angioplastia, neovascularización asociada con enfermedades del hígado, neovascularización del hígado inducida por una sustancia, disfunción angiogénica relacionada con un exceso de hormona, secuelas neovasculares de la diabetes, secuelas neovasculares por hipertensión o neovascularización debida a trauma por calor o por frío.

2. El uso como el reivindicado en la reivindicación 1, en donde el agente activo contiene análogos de aminoácido del dipéptido Glu-Trp antiangiogénico.

3. El uso como el reivindicado en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, en donde el agente activo contiene R'-Glu-Trp-R'' incluidos los análogos de aminoácido del mismo, R' y/o R'' seleccionados independientemente de las sales farmacéuticamente aceptables del dipéptido, amidas, imidas, ésteres, anhídridos, éteres, metil o etil-alquil ésteres, derivados de alquilo, arilo o de mezclas de alquilo/arilo, en donde el peso fórmula es aproximadamente menor a 5000 Daltons.

4. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente activo contiene una forma cíclica del dipéptido, polímeros lineales o cíclicos del dipéptido que tienen no más de 20 aminoácidos o péptidos de no más de 20 aminoácidos que incluyen al menos un dipéptido dentro de sus secuencias de aminoácidos.

5. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los aminoácidos Glu y Trp del agente activo son independientemente L-Glu y/o L-Trp.

6. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente activo contiene no más de 10 aminoácidos.

7. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde el análogo de Trp es un análogo de pirrol en el cual el nitrógeno en el anillo de pirrol se reemplaza con carbono, 5-hidroxi-triptamina o ácido 5-hidroxi-indol-acético.

8. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente activo se selecciona entre HEW, EWEW, GEW, EWKHG, EWKKHG, EW-NH-NH-GHK-NH_{2}, Ac-L-Glu-L-Trp-OH, Suc-EW, Cpr-EW, But-EW, RKEWY, RKEW, KEWY KEW o pEW.

9. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medicamento es para administrarle al individuo una dosis aproximadamente de 0,5 \mug por 1 kilogramo de peso corporal hasta aproximadamente 1 mg por 1 kg de peso corporal, preferiblemente aproximadamente 1 \mug/kg hasta aproximadamente 50 \mug/kg de peso corporal.

10. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medicamento es para administración de la dosis diaria durante un período de 1 día hasta aproximadamente 30 días.

11. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medicamento es para administración intramuscular o intranasal.

12. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el medicamento es para administración en la forma de una solución inyectable que contiene de 0,001% a 0,01% del agente activo, preferiblemente L-Glu-L-Trp.

13. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el medicamento es en una forma de dosificación unitaria que comprende una tableta, un supositorio, una cápsula, una película ocular, un inhalador, un nebulizador para mucosa, gotas para la nariz, gotas para los ojos, un dentífrico, un ungüento, una crema soluble en base acuosa; opcionalmente dicha forma de dosis unitaria consiste esencialmente de 0,01 mg de dicho agente activo.

14. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medicamento contiene además una droga vasoactiva, por ejemplo un inhibidor de la enzima de conversión de la angiotensina (ECA) o en un abridor del canal de potasio (ACP).

15. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde o bien el individuo sufre de un tumor y el medicamento contiene además un agente quimioterapéutico, o el individuo no está comprometido inmunológicamente.