EA010156B1 - Пептид, стимулирующий регенерацию ткани печени, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к лекарственным средствам для лечения заболеваний печени и может быть использовано как средство, стимулирующее регенерацию ткани печени. Предлагается фармацевтическая композиция, стимулирующая регенерацию ткани печени, содержащая в качестве активного начала эффективное количество пептида глутамил-аспартил-лейцин общей формулы H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO: 1] и фармацевтически приемлемый носитель. При этом фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для парентерального введения. Предлагается пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы H-Glu-Asp-Leu-ОН последовательности 1 [SEQ ID NO: 1], обладающий биологической активностью, проявляющейся в стимулировании регенерации ткани печени, а также применение этого пептида для приготовления лекарственного средства, стимулирующего регенерацию ткани печени. Предлагается способ стимуляции регенерации ткани печени, заключающийся во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO: 1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела, по крайней мере 1 раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. При этом введение осуществляют парентерально.

Description

Изобретение относится к лекарственным средствам для лечения заболеваний печени и может быть использовано как средство, стимулирующее регенерацию клеток печени.

В настоящее время известны препараты, улучшающие метаболические процессы в печени, к которым относятся природные антиоксиданты, в частности витамины группы В (В_ь В₆, В₁₂), аскорбиновая кислота, витамин Е, витамин А; препараты из лекарственных растений - Лив-52 (Большая Российская Энциклопедия лекарственных средств, М.: Издательство Ремедиум, т.2, 2002, с.435). Известны средства, улучшающие обмен веществ в клетках печени, среди которых следует отметить силибинин (Большая Российская Энциклопедия лекарственных средств, М.: Издательство Ремедиум, т.2, 2002, с.719); сирепар (Большая Российская Энциклопедия лекарственных средств, М.: Издательство Ремедиум, т.2, 2002, с.722); эссенциале (патент Франции № 2556050); а также синтетические пептидные препараты (патент РФ № 2166957, 2000г.).

Известные средства обладают только однонаправленным действием, а именно улучшают метаболические процессы в печени и повышают ее устойчивость к патогенным воздействиям.

Необходимо отметить, что препараты, направленные на регенерацию гепатоцитов, в уровне техники не обнаружены.

В связи с этим актуальна разработка новых групп препаратов, в том числе биологически активных пептидных соединений, обладающих свойством регенерировать ткань печени.

Структурных аналогов, представленных в уровне техники, предлагаемый пептид не имеет.

Настоящим изобретением поставлена и решена задача получения пептида, стимулирующего регенерацию клеток печени и фармацевтической композиции, содержащей этот пептид в качестве активного начала, а также способа ее применения.

Технический результат изобретения заключается в создании пептида, обладающего биологической активностью, проявляющейся в стимулировании регенерации клеток печени, а также фармацевтической композиции, содержащей этот пептид в качестве активного начала, использование которой стимулирует регенерацию клеток печени за счет восстановления синтеза тканеспецифических белков и нормализации функций клеток печени.

Для решения поставленной задачи и достижения указанного технического результата предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Одним из объектов предложенной группы изобретений является фармацевтическая композиция, стимулирующая регенерацию клеток печени, содержащая в качестве активного начала эффективное количество пептида глутамил-аспартил-лейцин общей формулы Н-С1и-А5р-Бси-ОН последовательности 1 |8ЕО Ш N0: 1] и фармацевтически приемлемый носитель.

При этом фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для парентерального введения.

Другой аспект настоящего изобретения касается пептида глутамил-аспартил-лейцин общей формулы Н-С1и-А5р-Бси-ОН последовательности 1 |8ЕО 1Э N0: 1], обладающего способностью стимулировать регенерацию клеток печени. Предлагается применение пептида глутамил-аспартил-лейцин общей формулы Н-С1и-А5р-Бси-ОН последовательности 1 |8ЕО Ш N0: 1] для приготовления лекарственного средства, стимулирующего регенерацию клеток печени.

Следующий аспект настоящего изобретения касается способа стимуляции регенерации клеток печени, заключающегося во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы Н-С1и-А5р-Бси-0Н последовательности 1 |8Е0 Ш N0: 1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела, по крайней мере 1 раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. При этом введение осуществляют парентерально.

Пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы Н-С1и-А5р-Бси-0Н получают классическим методом пептидного синтеза в растворе.

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, которые содержат сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.

Стимулирующее действие пептида Н-С1и-А5р-Бси-0Н на регенерацию клеток печени выявлено при его экспериментальном изучении.

Изучение биологической активности проводили на эксплантатах печени, в экспериментальных моделях частичной гепатэктомии и цирроза печени.

Понятие фармацевтическая композиция подразумевает различные лекарственные формы, содержащие пептид Н-С1и-А5р-Беи-0Н. которые могут найти лечебное применение в медицине в качестве средства, стимулирующего регенерацию ткани печени.

Для получения фармацевтических композиций, отвечающих изобретению, эффективное количество пептида Н-С1и-А5р-Беи-0Н. как активное начало, смешивают с фармацевтически приемлемым носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.

Понятие эффективное количество подразумевает использование такого количества активного на

- 1 010156 чала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм.

Для парентерального введения носитель обычно включает физиологический раствор или стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты, способствующие стабильности, или для сохранения стерильности.

Сущность изобретения поясняется фигурой и таблицами.

На фигуре показано влияние пептида Н-С1и-А8р-Ьеи-ОН на развитие эксплантатов печени.

В табл. 1 представлено влияние пептида Н-С1и-Л8р-Ьеи-ОН на число делящихся клеток в регенерирующей печени крыс через 32 и 96 ч после частичной гепатэктомии (% от общего числа клеток печени).

В табл. 2 представлено влияние пептида Н-С1и-Л8р-Ьеи-ОН на биохимические показатели крови у крыс с экспериментальным циррозом печени.

В табл. 3 представлено влияние пептида Н-С1и-Л8р-Ьеи-ОН на содержание суммарного гликогена (усл.ед.) в печени крыс с экспериментальным циррозом печени.

В табл. 4 представлено влияние пептида Н-С1и-Л8р-Ьеи-ОН на морфологические и биохимические показатели периферической крови морских свинок при изучении токсичности.

В табл. 5 представлено влияние пептида Н-С1и-Л8р-Ьеи-ОН на биохимические показатели периферической крови больных хроническим гепатитом.

Изобретение иллюстрируется примером синтеза пептида глутамил-аспартил-лейцин общей формулы Н-С1и-Л8р-Ьеи-ОН (пример 1), примерами испытания биологической активности пептида (примеры 2, 3, 4), примером изучения токсичности (пример 5), а также примером результатов клинического применения пептида, демонстрирующим его фармакологические свойства и подтверждающим возможность достижения лечебного эффекта (пример 6).

Пример 1. Синтез пептида Н-С1и-Л8р-Ьеи-ОН.

1. Название соединения: глутамил-аспартил-лейцин.

2. Структурная формула: Н-С1и-Л8р-Ьеи-ОН.

3. Брутто-формула без противоиона: С|₅Н₂^₃О-.

4. Молекулярный вес без противоиона: 375,37.

5. Противоион: ацетат.

6. Внешний вид: белый аморфный порошок без запаха.

7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме

В0С-61и(0Вг1)-0Н

НО5и

ОСС

ВОС-С1и(ОВг1)-О8и

ΒΟ€-61υ(ΟΒζ1)-Α3ρ(ΟΒζ1)-ΟΗ

I Н-Ьеи-ΟΒζΙ ψ ОСС

ВОС-01и(ОВг1)-А5р(ОВД)-Ьеи-ОВ21

1) Н₂/Р1

2) ТРА

Н-СИи-Азр-Ьеи-ОН

ВОС - трет.бутилоксикарбонильная группа, ОЗи - Ν-оксисукцинимидный эфир,

ОСС - Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид,

ОВ/1 - бензиловый эфир,

ТРА - трифторуксусная кислота.

- 2 010156

8. Характеристики готового препарата.

Содержание основного вещества

ТСХ

Содержание влаги рН 0,001% раствора

Удельное оптическое вращение

98,15% (по ВЭЖХ, 220 нм)

Индивидуален, Я(=0,65 (ацетонитрил-вода 1:3) 6%

4,57 [а]_с ²²: -30° (с=1, Н₂О), Ро1ата1 А, Саг1 Ζοίκκ 1епа

Пример синтеза.

1) ВОС-С1и(ОВ/1)-О5>и. Ν-оксисукцинимидный эфир И-трет.бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутаминовой кислоты (I).

№трет.Бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутаминовую кислоту ВОС-С1п(ОВх1)-ОН (33,7 г, 0,1 моль) растворяли в 50 мл Ν,Ν'-диметилформамида, охлаждали до температуры -10°С, добавляли при перемешивании охлажденные (4-6°С) растворы Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимида (23,0 г, 0,11 моль) в 30 мл Ν,Ν'-диметилформамида и Ν-гидроксисукцинимида (13,0 г, 0,11 моль) в 20 мл Ν,Ν'-диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали в течение 12 ч при охлаждении льдом и далее в течение 1 суток при комнатной температуре. Выпавшую Ν,Ν'-дициклогексилмочевину отфильтровывали и полученный раствор активированного эфира использовали без выделения на следующей стадии.

2) ВОС-СЩОВ/О-Акр/ОВ/О-ОН, №трет.бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутамил-(в-бензил)аспартат (II).

((в-Бензил)аспарагиновую кислоту Н-Акр(ОВх1)-ОН (28,0 г, 0,12 моль) и 36 мл (0,12 моль) триэтиламина суспендировали в 50 мл Ν,Ν'-диметилформамида и перемешивали в течение 1 ч. Затем добавляли порциями раствор активированного эфира ВОС’-С1и(ОВ/1)-О8и (I), полученный на предыдущей стадии. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 суток. Затем подкисляли 0,5н. серной кислотой до рН 2-3 и экстрагировали этилацетатом 4x50 мл. Вытяжки объединяли и последовательно промывали 0,5н. Н₂8О₄ 3x50 мл, водой 2x50 мл, 5% раствором №1НС’О₃ 2x50 мл, водой 2x50 мл, насыщенным раствором №1С1 2x50 мл. Органический слой сушили над №₂8О₄, упаривали растворитель в вакууме, остаток кристаллизовали под гексаном. Получено 50 г продукта (92%). Я(=0,34 (бензол-ацетон 2:1).

3) ВОС-СбКОВ/О-Акр/ОВ/О-Веи-ОВхк бензиловый эфир №трет.бутилоксикарбонил-(у-бензил) глутамил-(в-бензил)аспартиллейцина (III).

Дипептид ВОС-С1и(ОВ/1)-А8р(ОВх1)-ОН (II) (1,20 г, 2,2 ммоль) и Ν-оксибензотриазол (0,4 г, 3 ммоль) растворяли в 5 мл тетрагидрофурана и охлаждали до температуры -10°С. К суспензии То8Н-Беи-ОВ/1 (1,38 г, 3,5 ммоль) в 5 мл тетрагидрофурана добавляли 0,5 мл (3,5 ммоль) триэтиламина и тоже охлаждали. Ν,Ν'-Дициклогексилкарбодиимид (0,62 г, 3,0 ммоль) растворяли в 5 мл тетрагидрофурана и охлаждали. Охлажденные растворы объединяли и в течение 1 суток перемешивали при охлаждении льдом. Выпавшую Ν,Ν-дициклогексилмочевину отфильтровывали, растворитель упаривали в вакууме. Остаток растворяли в 50 мл этилацетата и последовательно промывали 0,5н. Н₂8О₄ 2x520 мл, водой 2x20 мл, 5% раствором NаНСОз 2x20 мл, водой 2x20 мл, насыщенным раствором №1С1 2x20 мл. Органический слой сушили над №₂8О₄, упаривали растворитель в вакууме, остаток кристаллизовали под гексаном. Перекристаллизация из изопропилового спирта. Получено 0,97 г продукта (68%). Я(=0,88 (бензол-ацетон 1:1).

4) Н-СЫ-Акр-Ьеи-ОН, глутамил-аспартил-лейцин.

Защищенный трипептид ВОС-С1и(ОВ/1)-А8р(ОВ/1)-Веи-ОВх1 (III) (0,90 г) растворяли в смеси метиловый спирт-вода (4:1) и гидрировали над катализатором Рб/С (5%) в течение 4 ч. Катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали в вакууме, остаток сушили в вакууме над КОН и Р₂О₅. Далее продукт растворяли в 2 мл смеси хлористый метилен-трифторуксусная кислота (5:1) и выдерживали при комнатной температуре в течение 2 ч. Полноту прохождения реакции деблокирования контролировали по ТСХ в системе ацетонитрил-вода (1:3). Растворитель упаривали в вакууме, остаток сушили в вакууме над КОН.

Для очистки 300 мг препарата растворяли в 4 мл 0,01% трифторуксусной кислоты и подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50x250 мм И1а5ОтЬ-130С16Т, 7ткт. Хроматограф Весктап 8ук1ет 6о1б, 126 8о1уеп1 Моби1е, 168 Июбе Аггау Ие1ес1ог Моби1е. Условия хроматографирования: А: 0,1% ТРА; В: МеС№0,1% ТРА; градиент В 0^50% за 100 мин. Объем пробы: 5 мл, детекция: при 215 нм, сканирование: 190-600 нм, скорость потока: 10 мл/мин. Отбирали фракцию 47,0-54,0 мин. Растворитель упаривали в вакууме при температуре не выше 40°С, упаривание многократно (5 раз) повторяли с 10 мл 10% раствора уксусной кислоты. Окончательно остаток растворяли в 20 мл деионизованной воды и лиофилизовывали.

Получено 196 мг очищенного препарата в виде аморфного белого порошка без запаха.

5) Анализ готового препарата.

Содержание основного вещества определяли методом ВЭЖХ на колонке Рйепотепех С 18 ΒυΝΛ 4,6x150 мм. А: 0,1% ТРА; В: МеСИ; градиент В 0^ 100% за 10 мин. Скорость потока: 1 мл/мин. Детекция при 220 нм, сканирование: 190-600 нм, проба: 20цл. Содержание основного вещества: 98,15%.

- 3 010156

ТСХ: индивидуален, ^,=0.65 (ацетонитрил-вода 1:3, пластинки ПТСХ-П-В-УФ 8огЬй1, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин).

Содержание влаги: 6% (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при 100°С). рН 0,001% раствора: 4,57 (потенциометрически).

Удельное оптическое вращение: |α|_υ ²²: -30° (с=1, Н₂О), Ро1ата1 А, Саг1 Ζοίδδ 1еиа.

Пример 2. Влияние пептида Н-С1и-А8р-Ьеи-ОН на развитие эксплантатов печени.

Эксперименты проведены на 27 фрагментах печени крыс линии \УМаг с массой тела 150-200 г. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты печени помещали в эту среду и культивировали в чашках Петри в термостате при температуре 36,7°С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли пептид Н-С1и-А8р-Ьеи-ОН в концентрациях 1,10 и 100 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента печени. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.

На фигуре показано влияние пептида Н-С1и-А8р-Ьеи-ОН на развитие эксплантатов печени.

Установлено, что через 1 сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке и начиналось выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток по периферии эксплантата. На 3 сутки культивирования при концентрации пептида Н-СШ-Акр-Ьеи-ОН 10 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 28% по сравнению с контрольными значениями ИП. При исследовании эксплантатов печени на более длительных сроках культивирования (7 дней) были выявлено аналогичное стимулирующее действие пептида Н-СШ-Акр-Ьеи-ОН в той же концентрации.

Таким образом, в отношении ткани печени пептид Н-СЫ-Акр-Ьеи-ОН оказывает тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов.

Пример 3. Влияние пептида Н-СШ-Акр-Ьеи-ОН на компенсаторную регенерацию печени после частичной гепатэктомии у крыс.

Исследование проведено на 18 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150-200 г.

Животные были разделены на 3 группы: 1 группа - здоровые животные, 2 группа - контроль (крысы, которым была произведена частичная гепатэктомия с удалением 2/3 печени), 3 группа - прооперированные животные, которым затем вводили подкожно через 2 и 24 ч после операции по 0,1 мкг пептида НС1и-А8р-Ьеи-ОН на крысу в 0,5 мл стерильного 0,9% физиологического раствора ИаС1. В эти же сроки животным 1-й и 2-й групп вводили стерильный физиологический раствор в том же объеме.

Прооперированные крысы были умерщвлены эфиром через 32 и 96 ч после операции. В это же время забивали и крыс контрольной группы. Печень крыс фиксировали в формалине. После окраски препаратов гематоксилин-эозином определяли митотический индекс в клетках печени, а также количество полиплоидных клеток, находящихся в 8-фазе клеточного цикла (количество делящихся клеток).

Изучение митотической активности клеток регенерирующей печени через 32 ч после частичной гепатэктомии показало, что число митозов и клеток в 8-фазе клеточного цикла становится в 2 раза больше, чем в печени здоровых животных. Эти отличия недостоверны в случае введения физиологического раствора, тогда как после инъекций пептида Н-СЫ-Акр-Ьеи-ОН увеличение количества митозов, клеток, синтезирующих ДНК, и общей суммы делящихся клеток становится достоверным (табл. 1).

При изучении препаратов печени через 96 ч после гепатэктомии оказалось, что и у крыс, получавших физиологический раствор, и у крыс, получавших пептид Н-СШ-Акр-Ьеи-ОН, наблюдается значительное усиление митотической активности гепатоцитов. При сравнении данных подопытной (третьей) и контрольной (второй) групп выяснилось, что у крыс, которым вводили пептид Н-С1ц-А8р-Ьеи-ОН, наблюдается количество митозов, в 2 раза большее, чем у крыс, получавших физиологический раствор. Количество клеток, находящихся в 8-фазе митотического цикла, у крыс подопытной группы не отличалось достоверно от количества гепатоцитов в 8-фазе в контрольной группе, хотя, в целом, количество делящихся клеток через 96 ч после гепатэктомии в регенерирующей печени крыс с введением пептида НС1и-А8р-Ьеи-ОН было на 75% больше, чем у крыс после введения физиологического раствора (табл. 1).

Таким образом, установлено, что при введении крысам пептида Н-СШ-Акр-Ьеи-ОН через 96 ч после частичной гепатэктомии наблюдается усиление митотической активности гепатоцитов, свидетельствующее об ускорении репаративных процессов в печени.

Пример 4. Эффективность применения пептида Н-СЫ-Акр-Ьеи-ОН у крыс с экспериментальным циррозом печени.

В работе использовали 45 белых беспородных крыс-самцов, масса которых в начале опыта составляла 120-180 г. Животных подвергали ингаляционному воздействию четыреххлористого углерода (СС14) в течение 6 месяцев. Половине животных вводили внутримышечно пептид Н-СШ-Акр-Ьеи-ОН по 0,5 мкг на крысу в 0,5 мл стерильного физиологического 0,9% раствора №С1 ежемесячно курсами по 5 последовательных дней. Животные контрольной группы получали инъекции стерильного физиологического раствора по аналогичной схеме.

Состояние печени у животных оценивали по данным биохимического анализа, определяя концентра

- 4 010156 цию белка, билирубина, холестерина, аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ).

Содержание суммарного гликогена в гепатоцитах определяли цитофлуориметрически в препаратахмазках после проведения флуоресцентной РА8-реакции.

Содержание гликогена является одним из важнейших индикаторов функциональной активности гепатоцитов. Известно, что цирроз печени характеризуется существенными нарушениями гликогенообразовательной функции гепатоцитов.

В результате проведенных исследований было установлено, что у животных после воздействия СС1₄ развивались выраженные нарушения в печени. Наблюдалось уменьшение содержания общего белка, уровня билирубина и холестерина. Резко возрастала активность аминотрансфераз (табл. 2).

При одновременном введении СС1₄ и пептида Н-ОШ-Акр-Ьеи-ОН биохимические показатели восстанавливались до нормальных значений и свидетельствовали о менее выраженной деструкции печени, чем у животных контрольной группы (табл. 2).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что пептид Н-С1и-А8р-Ьеи-ОН ограничивает развитие патологического процесса в печени. Он уменьшает ферментемию, ограничивает признаки гепатоцеллюлярной недостаточности и тромбогеморрагического синдрома, увеличивая очаги регенерации в печени.

На фоне воздействия гепатотропным ядом содержание суммарного гликогена в гепатоцитах увеличивается, в среднем, в 2,5 раза (табл. 3).

Установлено, что после применения пептида Н-О1и-А8р-Ьеи-ОН повышенное содержание гликогена снижается практически до нормы.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о положительном действии пептида Н-О1иАкр-Ьеи-ОН на гликогенообразовательную функцию гепатоцитов цирротически измененной печени, а также о восстановлении метаболической состоятельности ткани печени.

Пример 5. Изучение токсичности пептида Н-О1и-А8р-Ьеи-ОН.

Общетоксическое действие пептида Н-О1и-А8р-Ьеи-ОН исследовали в соответствии с требованиями Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении пептида.

Исследование по изучению острой токсичности проведено на 66 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-22 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 1, 2, 3, 4, 5 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9% раствора ИаС1. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор №1С1.

Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 55 белых беспородных крысахсамцах с массой тела 140-180 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мкг/кг, 0,1, 1 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора ИаС1. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор ИаС1. До введения препарата на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.

Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев, исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата, на 88 морских свинках-самцах с массой тела 260-300 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно пептид в течение 6 месяцев в дозах 1 мкг/кг, 0,1, 1 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора ИаС1. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор №С1 в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинно-мозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.

При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого пептида животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.

Изучение подострой и хронической токсичности пептида свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 100-1000 раз. При исследовании влияния пептида на морфологический состав крови морских свинок не установлено достоверного изменения морфологических и биохимических показателей периферической крови морских свинок (табл. 4).

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и

- 5 010156 дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены. Отсутствие общетоксического действия позволяет рекомендовать фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного начала пептид Н-СШ-Акр-Ьеи-ОН, для проведения клинических испытаний. Пример 6. Эффективность применения пептида Н-О1и-Л8р-Ьеи-ОН у больных хроническим гепатитом. Исследование проведено на 34 больных хроническим гепатитом в возрасте от 30 до 56 лет, которых разделили на 2 группы методом рандомизации.

больным основной группы вводили фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного начала пептид Н-О1и-Л8р-Ьеи-ОН, в дозе 10 мкг в 1,0 мл стерильного 0,9% физиологического раствора внутримышечно однократно ежедневно в течение 10 дней. Контрольная группа состояла из 15 аналогичных больных, которым назначалось общепринятое лечение.

В динамике оценивали жалобы больных и биохимические показатели крови.

На фоне проводимого лечения 89% больных основной группы отмечали исчезновение слабости, повышение аппетита и работоспособности, у 53% больных значительно снизилась интенсивность болевого синдрома.

При проведении обследования больных наиболее значительное внимание уделялось оценке результатов биохимических исследований, характеризующих аминотрансферазную активность, пигментную и белковообразовательную функции печени.

У 81% обследованных больных отмечались гипербилирубинемия и повышение уровня аланинаминотрансферазы (АЛТ), что свидетельствует об определенной активности хронического воспалительного процесса.

Применение фармацевтической композиции, содержащей пептид Н-СШ-Акр-Ьеи-ОН, способствовало нормализации уровня билирубина и активности АЛТ (табл. 5), что свидетельствует о нормализации метаболических процессов в печени, снижении активности воспалительного процесса и восстановлении синтеза тканеспецифических белков клетками печени.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о свойстве фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид Н-ОШ-Акр-Ьеи-ОН, стимулировать регенерацию ткани печени. Кроме того, результаты исследований подтверждают целесообразность применения фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид Н-ОШ-Акр-Ьеи-ОН, в комплексном лечении хронического гепатита в фазе обострения и ремиссии.

Таблица 1

Группа животных	Срок исследования	Митотический индекс	% клеток, находящихся в фазе синтеза ДНК	Общее количество делящихся клеток
Здоровые животные + физ. раствор	-	0,682±0,013	1,752+0,463	3,403±0,498
Контроль (частичная гепатэктомия + физ. раствор)	32 ч	До	0,431+0,019	1,043±0,127	1,474±0,143
После	1,364±0,595	2,063±0,474	3,427±1,066
96 ч	До	0,417±0,053	0,924+0,091	1,342±0,060
После	2,012+0,146*	3,417±0,295*	5,429±0,388*
Частичная гепатэктомия + пептид П-СИи-Азр-Ьеи- ОН	32 ч	До	0,449±0,065	0,872±0,101	1,321±0,156
После	2,316±0,451**	3,885+0,838**	6,197±1,274**
96 ч	До	0,296±0,085	0,984±0,139	1,278±0,125
После	4,850+0,336*&	4,667±1,312**	9,513±1,608*#

* Р<0,001 по сравнению с показателями до операции;

** Р<0,05 по сравнению с показателями до операции;

& Р<0,001 по сравнению с показателями у животных контрольной группы;

# Р<0,05 по сравнению с показателями у животных контрольной группы.

- 6 010156

Таблица 2

Показатель	Здоровые животные	Контроль	Пептид Н-СИи-Азр-Ьеи-ОН
Белок, г/л	85,5±4,2	74,2+2,1*	84,4+3,4**
Общий билирубин, мкмоль/л	13,4+1,3	9,2+1,1*	14,7+3,2**
Холестерин, мм/л	4,5+0,3	3,1+0,3*	4,3+0,32**
АЛТ, мЕ/мл	6,1+1,1	9,2+1,2*	5,7+0,78**
АСТ, мЕ/мл	12,7+2,1	18,2+1,3*	12,3+1,9**

* Р<0,05 по сравнению с показателем у здоровых животных;

** Р<0,05 по сравнению с показателем в соответствующей контрольной группе.

Таблица 3

Здоровые животные	Контроль (воздействие ССЦ)	Воздействие ССК+ пептид Н-О1и-Акр-1.еи-ОН
3,85+0,1	8,21+0,3*	3,65+0,1**

* Р<0,05 по сравнению с показателем у здоровых животных;

** Р<0,05 по сравнению с показателем у животных контрольной группы.

Таблица 4

Показатель	Введение пептида Н-О1и-Авр-Ьеи-ОН (1 мкг/кг)
3 месяца	6 месяцев
Контроль (п=24)	Пептид (п=24)	Контроль (п=24)	Пептид (п=24)
Эритроциты, х10|2/л	5,3+0,6	5,4+0,1	5,4+0,3	5,3+0,3
Гемоглобин, г/л	14,2+1,4	14,5+0,9	14,5+1,3	14,1+1,5
Ретикулоциты, %	1,3+0,07	1,1+0,05	1,1+0,05	1,2+0,04
Тромбоциты, хЮ’/л	143,7+7,9	144,9+4,8	144,5+8,6	143,5+6,4
Лейкоциты, х109/л	9,4+0,5	9,9+0,6	9,6+0,5	10,8+0,3
Нейтрофилы палочкоядерные, %	0,31+0,04	0,29+0,06	0,33+0,04	0,31+0,02
Нейтрофилы сегментоядерные, %	45,8+2,1	45,7+3,1	46,2+3,5	45,4+2,6
Эозинофилы, %	0,69+0,05	0,72+0,08	0,72+0,04	0,67+0,06
Базофилы, %	0,61+0,04	0,64+0,03	0,72+0,03	0,67+0,04
Моноциты, %	2,5+0,02	2,6+0,04	2,6+0,06	2.4+0,07
Лимфоциты, %	48,9+2,5	50,2+1,9	51,3+2,7	49,9+1,8
СОЭ, мм/ч	1,69+0,05	1,64+0,03	2,01+0,05	1,87+0,07
Резистентность эритроцитов, % ИаС1 -максимальная -минимальная	0,41+0,02 0,32+0,05	0,40+0,01 0,29+0,05	0,40+0,07 0,33+0,03	0,43+0,05 0,31+0,07
Общий белок в сыворотке крови, г/л	72,9+3,1	72,6+3,3	73,1+3,4	71,6+2,8
Натрий в сыворотке крови, ммоль/л	153,9+5,7	154,8+6,8	155,5+6,2	152,8+4,9
Калий в сыворотке крови, ммоль/л	5,1+2,3	5,3±1,8	5,2+2,1	5,2+1,9

- 7 010156

Таблица 5

Показатель (ммоль/л)	До лечения	После лечения общепринятыми средствами	После лечения с применением пептида Н-61и-Азр-Ьеи-ОН
Холестерин	5,1±0,5	5,2±0,2	5,2±0,2
Билирубин	27,4±1,7	22,3±1,1*	18,6±1,4*#
АСТ	40,3±3,2	39,8±2,7	39,5±2,3
АЛТ	54,5±4,9	46,2±3,8	41,7±2,9*
Триглицериды	2,3±0,4	2,4±0,2	2,4±0,3

* Р<0,05 по сравнению с показателем до лечения;

# Р<0,05 по сравнению с показателями после лечения общепринятыми средствами.

Перечень последовательностей <110> Общество с ограниченной ответственностью СИД пептайдс” <120> пептид, стимулирующий регенерацию ткани печени, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения <13 0> 5ΙΑ/04/2006 <160> 1 <170> РатепПп уегззоп 3.3 <210> 1 <211> 3 <212> РКТ <213> Аг11Яс1а1 <22О>

<223> Пептидное соединение н-с!и-А5р-кеи-он, стимулирующее регенерацию ткани печени за счет восстановления синтеза тканеспецифических белков и нормализации функций клеток печени.

<400> 1 и Азр ьей

Claims (6)

1. Фармацевтическая композиция, стимулирующая регенерацию клеток печени, характеризующаяся тем, что содержит в качестве активного начала эффективное количество пептида глутамил-аспартиллейцин общей формулы Н-СйнАзр-Беи-ОН последовательности 1 |8ЕО ΙΌ N0: 1] и фармацевтически приемлемый носитель.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что она находится в форме, подходящей для парентерального введения.

3. Пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы Н-01и-Азр-Бси-0Н последовательности 1 |8Е0 ΙΌ N0: 1], обладающий способностью стимулировать регенерацию клеток печени.

4. Применение пептида по п.3 для приготовления лекарственного средства, стимулирующего регенерацию клеток печени.

5. Способ стимуляции регенерации клеток печени, заключающийся во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы Н-С1и-А8р-Беи-ОН последовательности 1 |8Е0 ΙΌ N0: 1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела, по крайней мере 1 раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что введение осуществляют парентерально.