JPS6341500A - ヒトインタ−フエロン−α誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒトインターフェロン−α誘導体に関するもの
である。　　　・ 従来技術 ヒトインターフェロン−αＡはヒト白血球インターフェ
ロンとも称され、各種腫瘍に対する効果も明らかとなり
つつあり、また遺伝子組換え技術による大量生産も可能
となってきている〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　）　、２５６，９７５０（１９
８１））。

ヒトインターフェロン−αＡは、遺伝子組換え法を適用
した場合、大腸菌中で回収し得る程度の量で発現されて
おり、通常、モノクローナル抗体カラムクロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー等を用いて、培養
液から分離される［ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　）　
、２５６．９７５０（１９８１）］。

発明が解決すべき問題点 このようにして分離されたインターフェロン−αＡには
天然型の蛋白質（Ｍｆ−１）以外に逆相高速液体クロマ
トグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）によって分離される成分
が混在している。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、この天然型の蛋白質（Ｍｆ−１）以外に
混在する成分の本体を鋭意研究した結果、本成分の一部
はヒトインターフェロン−αＡのＮ−末端アミノ基がア
セチル基、またはグリコロイル基でアシル化された新規
インターフェロン−αＡ誘導体（Ｍｆ−２）であること
を解明し、さらに驚くべきことに本誘導体が、ヒトイン
ターフェロン−αＡと同等の活性を有するのみならず、
酵・粛清化に対して、抵抗性を有する優れた性質を持つ
ことを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はＮ−末端アミノ基がアセチル基、ま
たはグリコロイル基でアシル化されているヒトインター
フェロン−αＡに関する。

本発明の原料は１例えば、インターフェロン産生遺伝子
を組入れた発現ベクターを持つ微生物を培養し、培養物
よりモノクロナール抗体カラム。

イオン交換クロマトグラフィー等の通常の分離法を用い
て採取した粗なインターフェロン−αＡであり、このも
のから、本発明の新規Ｎ末端アシル化インターフェロン
−αＡ（Ｍｆ−２）をＭｆ−１と分離するに当っては逆
相ＨＰＬＣを用いて行うのが有利であるが、クロマトフ
オーカシング法。

イオン交換クロマトグラフィー法等によっても可能であ
る。逆相カラム担体としてはｐｏｒｅ　５ｉｚｅ　５μ
、０１８のものが好ましい。溶出溶媒としては、トリフ
ルオロ酢酸を含む含水アセトニトリルが優れているが、
トリフルオロ酢酸含有含水メタノール。

エタノール、プロパツールであってもよい。これら溶媒
系のグラジェント溶出によって、Ｍｆ−２画分を分取し
得るが、その代表例を実施例１に記載した。このように
して取得したＭｆ−’２をブロムシアン消化後、トリプ
シン、又はトリプシン。

ついでｖ８プロテアーゼ処理し、ファーストアトムボン
バードメント質量分析法に供した。得られたスペクトル
を、同様に処理したＭｆ−１のスペクトルと比較したと
ころ、Ｎ末端ペプチドに由来するピークにのみ差が認め
られた。

すなわち、Ｍｆ−１ではｍ／ｚ＝１３１３　（Ｃｙｓｌ
−Ａｒｇ１２）。

２３８６（Ａｌａ”−Ｃｙｓ”−Ｇｌｕ”７）Ｃｙｓ”
−Ａｒｇ”）、 ２７９９（Ａｌａｇ７−’Ｃｙｓ”−Ｈ５ｅ１１１）の
スペクトルがｖＡ奈Ｃｙｓｌ−Ａｒｇ１２） されるが、Ｍｆ−２では、これらのスペクトルが観察さ
れず、新たに、　ｍ／ｚ＝１３５５．１３７１，２４２
８．２８４１のスペクトルが観察された。この結果はＮ
末端領域（Ｃｙｓｌ−Ａｒｇ１２）に分子量４２．又は
５８の官能基が付加していることを示しており、分子量
４２がアセチル基であることは、Ｍ’ｆ−１由来のＮ末
端ペプチドを含む両分を逆相ＨＰＬＣを用いて分取し、
アセチル化することにより同定した。分子量５８はグリ
コロイル基であると考えられる。

上記で取得したＮ末端アミノ基がアセチル、又はグリコ
ロイルでアシル化されたヒトインターフェロン−αＡ誘
導体の抗ウィルス活性はＭｆ−１と同等であった（約６
Ｘ１０’単位／■）。また、Ｍｆ−２をロイシンアミノ
ペプチダーゼＭで消化したとき、アミノ酸の遊離は全く
認められず、この酵素に対して強い抵抗性を有すること
が判明した。

したがって、本発明の誘導体は、生体内で安定であると
推測される。

該誘導体は、Ｍｆ−２が抗腫瘍、抗ウィルス剤として使
用できるのみならず、酵素に対する抵抗性を有する点で
、持続性製剤としての可能性を示唆しており、有用であ
る。

このように、本発明の誘導体は、従来公知のヒトインタ
ーフェロン−αＡと同様の目的に同様の用法により使用
することができるが、酵素に対して耐性があるので更に
有効なものとして使用される。

該誘導体は、抗ウィルス作用、抗腫瘍作用、細胞増殖阻
害作用、免疫抑制作用などを有するの・で、該誘導体は
、哺乳動物（例、ヒト、ウシ、ウマ。

ブタ、マウス、ラットなど）のウィルス感染症。

腫瘍などの治療に用いることができる。たとえば、該誘
導体を抗ウィルス剤、抗腫瘍剤、細胞増殖阻害剤、免疫
抑制剤として用いるには、たとえば該誘導体を自体公知
の薬理的に許容しうる担体、賦形剤、希釈剤などと混合
して、注射剤として非経口的に静脈注射又は筋肉注射な
どにより投与する。

その投与量は正常人１日当り約１０万ないし１億単位好
ましくは約１００万ないし５０００万単位である。また
、上記ヒト以外の哺乳動物に対しての投与量は、２００
０ないし２００万単位／ｋｇ１日、　さらに好ましくは
約２万ないし１００万単位／ｋｇ７日である。

」 本発明のＮ−末端アミノ基がアセチル基、またはグリコ
ロイル基でアシル化されたヒトインターフェロン−αＡ
は新規な物質であり、抗ウィルス作用、抗腫瘍作用、廁
胞増殖阻害作用、免疫抑制作用を有し、また酵素に対し
て強い抵抗性を有する。

以下に、実施例を挙げて、本発明の説明を行うが、これ
らが本発明の範囲を限定するものではない。

なお、実施例に開示する原料としてのヒトインターフェ
ロン−αＡ水溶液は、ＥＰＣ特許出願公開第１４４０６
４号（日本特開昭６０−１１８゜１９６号）公報に記載
の方法で製造したものである。

実施例ＩＭｆ−２の分取 ヒト白血球インターフェロン−αＡ遺伝子を組み入れた
発現プラスミドを持つ大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４
６）／ｐＬｅ　ＩＦ　Ａ　ｔｒｐ　２５株（ＲＰＣ特許
出願公開第４３９８０号（日本特開昭５７−７９８９７
号公報）〕を、Ｍ−９培地にグルコース２５ｇ／Ｑ＋Ｌ
−グルタミン酸ナトリウム４　ｇ　／　Ｑ　ｐＦｅＣＱ
　３　・６Ｈｚ　０２７　ｍｇ　／　Ｑ　、ＣｕＳＯ４
＄　ｓ）（、０８＋ｎｇ　／　Ｑ　。

ＺｎＳＯ４・７１１□０８　ｍｇ／　Ｑ　、ビタミンＢ
１塩酸塩７０■／Ｑ、塩酸テトラサンタリン５■ＩＱ、
Ｌ−プロリン５０ｍｇ／ＱおよびＬ−ロイシン５０ｍｇ
／Ｑを添加した培地（合成培地）２．５Ｑを仕込んだ５
Ｑ容ジャーファーメンタ−へ接種し、通気２．５９／分
撹拌１０００ｒ、ｐ、ｍ、、　３７℃で培養を開始し、
途中ＯＤ　３０００ＫＵテ３３℃、５０００ＫＵで２９
℃、７０００ＫＵで２５℃に温度を下げて４８時間培養
を続けた。培養中溶存酸素濃度は５％以上に保たれた。

途中培養液中のグルコース濃度が１％以下に低下した時
、２５ｇ／Ｑの割合でクルコースを添加した。

上記のようにして得られたヒトインターフェロン−ａＡ
水溶液から５ｔａｅｈｅｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　ｒジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、１
３ｉｏ１．ｃｈｅｍ、）　Ｊ、２５６．９７５０−９７
５４（１９８１）に述べられた方法に従い、インターフ
ェロン−αＡを精製した。

得られたインターフェロン−ａＡｉ品から、　Ｍｆ−２
を分取するためＮｕｃｌｅｏｓｙｌ、Ｃ１ｓカラム（０
，４Ｘ　３０ａ＋＋）（Ｍａｃｋｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ
　Ｃａｍｐａｎｙ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用
いる逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）
を行なった。カラムを０．１％トリフルオロ酢酸−１５
％アセトニトリルで平衡化したのちインターフェロン−
αＡ標品を負荷し、アセトニトリルの直線的濃度勾配（
３５−５５％／４０　ｍ１ｎ）により溶出した。溶出速
度は０．９ｍｇ／ｍｉｎ、検出は、Ａ、、ｏｎｍで行っ
た。

Ｍｆ−１およびＭｆ−２のピーク画分を集め、凍結乾燥
した。

このようにして得られたＭｆ−１およびＭｆ−２が十分
に分離されていることを知るため、Ｕｌｔｒａｐｏｒｅ
　ＲＰＳＣカラム（４，６Ｘ７５ｍｍ）を用いる逆相高
速液体クロマトグラフィーを行った。溶出は、０．１％
ＴＦＡ存在下にアセトニトリル濃度が４０〜５５％の直
線的濃度勾配溶出により行った。流速は１分間当り０．
９ｍ１２であった。第１図に示したように、Ｍｆ−１お
よびＭｆ−２はそれぞれ２２分および２４分の溶出時間
、におけるピークを示し、それぞれ単一ピークであるこ
とが分った６さらに、このようにして得られたＭｆ−１
およびＭｆ−２の等重点はそれぞれ６．２および５．９
であった。

実施例２ 実施例１の方法に従って調製したＭｆ−２，Ｍｆ−１を
それぞれ０．５％（ｗ／ｖ）の重炭酸アンモニウム緩衝
液（ｐＨ８，０）に溶解し、Ｌ−１−トシルアミド−２
−フェニルエチルクロロメチルケトン処理トリプシン（
ワシントン社製）を基質の５０分の１（ｗ／ｗ）量加え
た後３７℃で１５時間処理した。

上記の酵素処理により生じたペプチドフラグメントを逆
相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用
いて分離した。０．０５％トリフルオロ酢酸で平衡化し
たＭＭＣ−ＯＤＳ　（Ｓ−５）カラム（４Ｘ　２５０　
ｍｍ　、株式会社山村化学研究所製）に試料を負荷後ア
セトニトリル濃度を１０％から６０％まで毎分１％の割
合で増加させた。流速は毎分１ｎ＋Ｑで行なった。溶出
されたペプチドを凍結乾燥後、ファーストアトムボンバ
ードメント質量分析及びアミノ酸組成分析を行った。

分析の結果から、Ｍｆ−１からはＮ末端ペプチド（Ｃｙ
ｓｌｌ−Ａｒｇ”、　ｍ／ｚ＝１３１３）がＰｈｅ８４
−Ｌｙｓ１１２及びＡｓＦ３１−　Ｌ　ｙｓ１１２のペ
プチドとジスルフィド結合を介して結合した形で２個所
にわかれて溶出されることが示された（第２図Ａピーク
１及び２）。−力筒２図Ｂで示されるようにＭｆ−２か
らはこれらのピークは観察されず、やや遅れてピーク３
及び４が観察された。これらのピークは酸加水分解後の
アミノ酸分析ではそれぞれピーク１及び２と同じアミノ
酸組成を示したが、質量分析法ではｍ／ｚＪ３１３のピ
ークは観察されず、それよりも４２゜５８原子質量単位
大きなピークが観察された（第３図）。これらの結果は
Ｍｆ−２のＮ末端ペプチドは分子量４３又は５９の官能
基が付加したものであることを示している。

分子量４３の官能基がアセチル基であることを確認する
ため、ピーク１及び２を、酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルを用いてアセチル化した後還元カルボキ
シメチル化を行いＲＰ−ＨＰＬＣでＮ−アセチル−８−
カルボキシメチル化されたＮ末端ペプチドを得た。この
ペプチドはピーク３．４を還元カルボキシメチル化して
得られたペプチドとＲＰ−ＨＰＬＣで同じ保持時間に溶
出された（第４図）。図中、Ａは、ピーク１，２をアセ
チル化後、還元カルボキシメチル化したもの、Ｂは、ピ
ーク３．４を還元カルボキシメチル化したもの、Ｃは、
ＡおよびＢの混合物である。

以上の結果はＭｆ−２のＮ末端がアセチル化されている
ことを示すものである。

参考例１．７ミノペプチダーゼに対する抵抗性実施例１
の方法に従って調製したＭｆ−２及びアミノペプチダー
ゼＭ（豚腎撚製、ピアス社製）をそれぞれ３ｍｇ／ｍＱ
、０．３■／ｍＱになるように０゜０５Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ＰＨ７，４）に溶解し、３７℃で４０時間
反応を行った。

又、それとは別に、Ｍｆ−２及びロイシンアミノペプチ
ダーゼ（豚腎撚製、シグマ社製）を上記の濃度にＯ，Ｉ
Ｍ）−リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，４）（１ｍＭ塩化マグ
ネシウムを含む）に溶解し、上記と同様に反応を行った
。

それぞれの反応液１００μＱに０．００２規定濃度の塩
酸を４００μａ加えた後ｐＨを２．０に調製し、アミノ
酸分析計に負荷したが、Ｎ末端近傍のアミノ酸の遊離は
見られなかった。

発」Ｉひ丸泉 本発明のＮ−末端アミノ基がアセチル基、またはグリコ
ロイル基でアシル化されたヒトインターフェロン−αＡ
は新規な物質であり、抗ウィルス作用、抗腫瘍作用、細
胞増殖阻害作用、免疫抑制作用を有し、酵素に対して強
い抵抗性を有すので、補乳勅物のウィルス感染症、腫瘍
などの治療に有効であることが期待できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＭｆ−１およびＭｆ−２の逆相高速液体クロマ
トグラフィーの結果を示す図である。 第２図はＭｆ−１およびＭｆ−２のトリプシン消化物の
ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。 第３図はＭｆ−２の質量分析の結果を示す図である。 第４図はＭｆ−２の内の１つが、Ｍｆ−１のＮ末Ｒｊ５
がアセチル化されているものであることを確認した逆相
高速液体クロマトグラフィーの溶出図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. Ｎ−末端アミノ基がアセチル基、またはグリコロイル基
   でアシル化されているヒトインターフェロン−αＡ。