PL193790B1 - Nowa sól peptydu BPC, kompozycja farmaceutyczna zawierająca nową sól peptydu BPC, kompozycja diagnostyczna zawierająca nową sól peptydu BPC, zastosowanie nowej soli peptydu BPC oraz sposób otrzymywania nowej soli peptydu BPC - Google Patents

Abstract

1. Nowa sól peptydu BPC, w której anion soli stanowi peptyd o ladunku ujemnym zawierajacy od 8 do 15 reszt aminokwasowych, przy czym peptyd zawiera element strukturalny sekwencji okre- slony ogólnym wzorem (I): [Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala] (-) lub (2-) , w którym Xaa oznacza obojetna alifatyczna reszte aminokwasowa, Yaa oznacza zasadowa reszte ami- nokwasowa oraz Zaa oznacza kwasowa reszte aminokwasowa, zas kation soli jest kationem nieorga- nicznej lub organicznej, nietoksycznej zasady. 10. Kompozycja farmaceutyczna, stabilna w trakcie przechowywania, zawierajaca dopuszczal- ny farmakologicznie nosnik, znamienna tym, ze zawiera skuteczna ilosc soli peptydu BPC okreslonej w zastrz. 1. 12. Kompozycja diagnostyczna, stabilna w trakcie przechowywania, znamienna tym, ze zawie- ra skuteczna diagnostycznie ilosc soli peptydu BPC okreslonej w zastrz. 1. 15. Sposób otrzymywania soli peptydu BPC okreslonej w zastrz. 1, znamienny tym, ze co naj- mniej jeden peptyd BPC miesza sie w roztworze wodnym badz wodno-alkoholowym z co najmniej jedna zasada, otrzymujac sól peptydu BPC, w której kation soli jest kationem nieorganicznej lub orga- nicznej, nietoksycznej zasady. PL PL PL

Description

Przedmiotowy wynalazek dotyczy nowych soli syntetycznych peptydów BPC (z ang. Body Protection Compound - związek chroniący organizm), kompozycji farmaceutycznych i diagnostycznych zawierających te sole, zastosowań medycznych oraz sposobu otrzymywania tych soli. Syntetyczne peptydy BPC, mające masę cząsteczkową około 900 do 1600 daltonów, wykazują działanie ochronne względem narządów ciała.

Znane są białka i peptydy, wykorzystywane w leczeniu wielu różnych chorób ludzi i zwierząt. Wiele ztych środków, wytwarzanych jest in vivo i wcelu otrzymania kompozycji farmaceutycznej, może być uzyskiwanych ze zwierząt lub ludzi. Przykładami białek lub peptydów wykorzystywanych jako farmaceutyki są na przykład: insulina, erytropoetyna, cząsteczki BMP, interferony itp. Innym przykładem może być białko soku żołądkowego wykazujące aktywność chronienia śluzówki, które zostało ostatnio wyizolowane i oznaczone jako BPC.

Opis WO 92/04368 dotyczy cząsteczek BPC, które wykazują działania ochronnego względem organizmu i mają masę cząsteczkową około 400 000 daltonów, a także sposobu otrzymywania związków BPC oraz ich zastosowania. W opisach WO 93/24/24521 oraz WO 94/11394 ujawniono peptydy

BPC, wykazujące ten sam typ działania ochronnego względem organizmu, co znane białka PBC, będące związkami wyjściowymi dla tych peptydów. Sikirię i współpracownicy w „Digestive Diseases and Science”, 41 (1996) 7, 1518-1526 opisali pentadekapeptyd BPC 157, który u szczurów, w stanach ostrego zapalenia trzustki oraz zmianach chorobowych towarzyszących zapaleniu żołądka i dwunastnicy, po rozpuszczeniu w wodzie i soli, wykazuje korzystny wpływ leczniczy, a także działanie profilaktyczne.

Zatem, zastosowanie peptydów BPC jako środków farmakologicznych jest znane jako korzystne wwielu różnych chorobach. Jednakże stabilność fizykochemiczna tych peptydów, na przykład w roztworze izotonicznym chlorku sodu, nie jest wystarczająco dobra. Ponadto, zastosowanie peptydów BPC, a w szczególności podawanie poprzez iniekcję roztworu wodnego lub roztworu tych związków, przygotowanego w izotonicznym roztworze chlorku sodu powoduje ból i/lub martwicę.

Sole białek ipeptydów są dobrze znane wstanie techniki. Na przykład, zpracy Bertranda M. i wsp. wJournal of Peptide Research, 49 (1997) 3, 269-272, wiadomo, że działanie poszczególnych soli jest bardzo specyficzne wodniesieniu do stabilności istruktury peptydów. Na przykład, dodatek do roztworu peptydu (poli(Glu-Leu), o stężeniu końcowym 0,1 M, kationów jednowartościowych takich jak np. NH4⁺ indukuje przejście tego peptydu w rozpuszczalną wwodzie strukturę beta. Przeciwnie, nie zaobserwowano żadnego przejścia konformacyjnego w przypadku użycia jonów Li⁺, Na⁺ lub Cs⁺.

Badano rolę par jonowych dostępnych na powierzchni wutrzymywaniu stabilności białka, poprzez określanie wpływu dodawanych soli (KCl, MgCl2 iLaCl3), przy pH obojętnym bądź kwaśnym, na stabilność wyznaczonych de novo dwuniciowych, zwiniętych zwojów, o konfiguracji alfa-helisy. Wyniki wskazują, że dodana sól może mieć złożony wpływ na stabilność białka, obejmujący zarówno wkład stabilizujący, jak i destabilizujący, gdzie efekt wypadkowy zależy od znaku reszt aminokwasowych obdarzonych ładunkiem oraz oddziaływań jonowych występujących wbiałku (Kohn iwsp., w Journal of Molecular Biology, 267 (1997) 4, 1039-1052).

Uprzednio prowadzone badania na peptydach modelowych również wykazały, że mostki elektrolityczne rozdzielone przy i,i +4 wzdłuż łańcucha peptydowego bardziej wpływają na stabilność niż te mostki, które są rozmieszczone i,i +3, przy czym korzystniejsze są ustawienia kwas - zasada niż zasada - kwas licząc od końca N do C. Jednakże, obecnie nie wiadomo jeszcze czy powierzchniowe mostki elektrolityczne mają silny stabilizujący wpływ na strukturę natywną białek (Berger iwsp., wJournal of Biomolecular Structure and Dynamics, 14 (1996) 3, 285 - 291).

Zatem, właściwości soli peptydówwodniesieniu do stabilności tych peptydów, strukturyifunkcji zależą wznacznym stopniu od zastosowanych jonów, zaangażowanych wtworzenie specyficznych soli oraz od innych czynników wewnętrznych i zewnętrznych. Obecnie nie możliwe jest przewidzenie, które ze szczególnych właściwości może posiadać dana sól danego peptydu.

Problem techniczny rozwiązywany przez przedmiotowy wynalazek dotyczy otrzymania peptydów BPCwbardziej stabilnej postaci oraz dostarczenia kompozycji farmaceutycznej i/lub diagnostycznej zawierającej peptydy BPC, wykazującej poprawioną stabilność tych peptydów, atakże przynajmniej taką samą aktywność farmakologiczną, przy czym kompozycja ta będzie pozbawiona cech niekorzystnych wymienionych powyżej, a w szczególności umożliwi wykonywanie bezbolesnych iniekcji peptydów BPC.

PL 193 790 B1

Przedmiotowy wynalazek rozwiązuje wskazane powyżej problemy poprzez zapewnienie soli peptydów BPC oraz kompozycji diagnostycznych lub farmakologicznych zawierających diagnostycznie lub farmakologicznie skuteczną ilość nowych soli peptydów BPC.

Przedmiotem wynalazku jest nowa sól peptydu BPC, w której anion soli stanowi peptyd o ładunku ujemnym zawierający od 8 do 15 reszt aminokwasowych, przy czym peptyd zawiera element strukturalny sekwencji określony ogólnym wzorem (I):

[Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala]^{(-) lub (2)}, w którym

Xaa oznacza obojętną alifatyczną resztę aminokwasową, Yaa oznacza zasadową resztę aminokwasową oraz Zaa oznacza kwasową resztę aminokwasową, zaś kation soli jest kationem nieorganicznej lub organicznej, nietoksycznej zasady.

W jednym z korzystnych wariantów realizacji soli według wynalazku kation jest wybrany spośród kationu metalu alkalicznego, metalu ziem alkalicznych, Zn²⁺, aminy pierwszorzędowej, drugorzędowej, i trzeciorzędowej, a zwłaszcza spośród Na⁺, K⁺, Lit⁺, Cs⁺, Ca²⁺, NH⁴⁺, kationu trietanolamoniowego, cykloheksyloamoniowego, 2-AMP⁺ (2-amino-1-propanol) lub TRIS⁺ (tris-(hydroksymetylo)aminometan).

W innym korzystnym wariancie realizacji wynalazku Xaa oznacza Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle lub Nva; Yaa oznacza Lys, Arg, Orn lub His; zaś Zaa oznacza Glu, Asp, Aad lub Apm. W szczególnie korzystnym wariancie realizacji sól według wynalazku ponadto farmakologicznie lub diagnostycznie dopuszczalny nośnik.

W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji sól według wynalazku zawiera ponadto trehalozę. W szczególnie korzystnym wariancie realizacji sól według wynalazku jest określona wzorem ogólnym:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa

10 15

W kolejnym korzystnym wariancie realizacji soli według wynalazku peptyd wybrany jest z następującej grupy związków:

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val;

10 15

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val;

10 15

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val;

10 15

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp. Ala Leu Gly Val;

10 14

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Val

10 14

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala;

8

Asp Pro Pro Pro Ile Arg Pro Ala Asp;

9

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp;

9

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val;

10 14

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp

10

PL 193 790 B1

Wymienione powyżej peptydy znane są z opisów patentowych WO 94/11394 i WO 93/24521, których treść jest zamieszczona w niniejszym ujawnieniu w odniesieniu do otrzymywania i sposobu zastosowania peptydów BPC.

W szczególnie korzystnym wariancie realizacji soli według wynalazku peptyd ma postać pierścieniową, a zwłaszcza z pierścieniem zamkniętym wiązaniem amidowym pomiędzy pierwszą a ostatnią resztą aminokwasową.

W następnym korzystnym wariancie realizacji sól według wynalazku jest rozpuszczona wroztworze wodnym lub wodno-alkoholowym, korzystnie o pH między 6,0 a 8,5.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, stabilna w trakcie przechowywania, zawierająca dopuszczalny farmakologicznie nośnik, charakteryzująca się tym, że zawiera skuteczną ilość soli peptydu BPC według wynalazku. W korzystnym wariancie realizacji przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do podawania doustnego, która dodatkowo zawiera trehalozę.

Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja diagnostyczna, stabilna w trakcie przechowywania, charakteryzująca się tym, że zawiera skuteczną diagnostycznie ilość soli peptydu BPC według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie soli peptydu według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, stabilnej w trakcie przechowywania, do leczenia zaburzeń związanych z tworzeniem się tlenku azotu (NO) lub z nieprawidłowym funkcjonowaniem układów związanych z NO, a w szczególności do leczenia nadciśnienia, dusznicy bolesnej, impotencji, wstrząsu krążeniowego i septycznego, porażeń, zapaleń, zespołu zaburzeń oddechowych, zlepiania się i agregacji płytek krwi i leukocytów, zaburzeń czynności śródbłonka, uszkodzeń żołądkowo-jelitowych, zaburzeń perystaltyki, cukrzycy, zapalenia trzustki, niedociśnienia i choroby Parkinsona; zaburzeń czynności lub nadczynności nerwów somatosensorycznych, w szczególności neuropatii czuciowej, nerwobólu poopryszczkowego, atopowego zapalenia skóry, nieprawidłowego zdrowienia uszkodzonej tkanki, nabytej pokrzywki wywołanej przez zimno lub ciepło, łuszczycy, pęcherzowego pemfigoidu, wyprysku, dermatoz wywołanych światłem, chronicznego zapalenia stawów, uszkodzeń żołądkowo-jelitowych oraz specyficznej lub niespecyficznej zbyt dużej aktywności górnych i dolnych dróg oddechowych (astmy, nieżytów górnych dróg oddechowych); zaburzeń śródbłonkowych, ran, owrzodzeń; stanów związanych z ostrymi i/lub chronicznymi zapaleniami, w szczególności chronicznych zapaleń stawów i chorób związanych z opóźnioną nadwrażliwością oraz uszkodzeń żołądkowo-jelitowych; chorób wątroby, uszkodzeń organów spowodowanych przez wolne rodniki, zwłaszcza spowodowanych przez napromieniowanie; chorób związanych z zaburzeniami układu katecholaminergicznego, w szczególności schizofrenii, wpływu prowokacji amfetaminą, nadużywania leków; stanów związanych ze stresem; ostrych zapaleń trzustki z dodatkowym w pozytywnym wpływem na towarzyszące zapaleniom żołądka i dwunastnicy patologie; zaburzeń sercowych; zaburzeń depresyjnych; choroby Parkinsona i w patologiach chorób podobnych do choroby Parkinsona; zaburzeń temperaturowych; upośledzeń kostnych; uszkodzeń różnych organów indukowanych nadciśnieniem; zakłóceń koagulacji; zakłóceń bólowych; zakłóceń drgawkowych; uszkodzeń rdzenia kręgowego, uszkodzeń spowodowanych alkoholem, wywołanych nadużywaniem alkoholu lub zwiększonym pobieraniem alkoholu; chorób niedokrwistości mózgu; uszkodzenia nerwu obwodowego; chorób kataleptycznych i zakłóceń neuroleptycznych; chorób związanych z nienormalnymi lub zmutowanymi limfocytami; zakłóceń płodowych; atrofii pochwowej i rozwoju osteoporozy spowodowanego przez stany związane z wycięciem jajników; nowotworów; chorób wirusowych, w szczególności AIDS lub ARC, uszkodzeń żołądkowo-jelitowych i chorób poznawczych; uszkodzeń związanych z wycofaniem leku, zakłóceń pracy nerek i zakłóceń w odpowiedzi immunologicznej komórki.

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie soli peptydu BPC według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej według wynalazku, jako substancję o właściwościach ochronnych w stosunku do komórek oraz narządów.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania soli peptydu BPC według wynalazku, charakteryzujący się tym, że co najmniej jeden peptyd BPC miesza się w roztworze wodnym bądź wodno-alkoholowym z co najmniej jedną zasadą, otrzymując sól peptydu BPC, w której kation soli jest kationem nieorganicznej lub organicznej, nietoksycznej zasady.

Zaskakujące jest, że nowe sole peptydów BPC według przedmiotowego wynalazku wykazują przynajmniej taką samą aktywność farmaceutyczną, jak peptydy BPC oraz dodatkowo, znacząco większą stabilność fizykochemiczną w porównaniu do wolnych peptydów BPC lub octanów peptydów

PL 193 790 B1

BPC. Kationy stosowane w solach według przedmiotowego wynalazku nie wpływa na aktywność peptydów BPC, ale zwiększa ich stabilność. Sole peptydów BPC według przedmiotowego wynalazku są na przykład w izotonicznym roztworze chlorku sodu lub wodzie bardziej stabilne niż peptydy BPC lub octany peptydów BPC. Ponadto, sole według przedmiotowego wynalazku są odpowiednie do stosowania doustnego i nie wykazują żadnych niepożądanych efektów ubocznych, takich jak ból lub martwica w czasie lub po podaniu, w szczególności przez iniekcję. Dlatego też sole peptydów BPC według przedmiotowego wynalazku umożliwiają usprawnienie podawania dojelitowego i pozajelitowego. Ponadto, sole według przedmiotowego wynalazku są bardzo korzystne ze względu na brak jakichkolwiek oznak toksyczności aż do poziomu dawki 50 mg/kg masy ciała pacjenta.

Sole według przedmiotowego wynalazku mogą być otrzymywane poprzez rozpuszczanie wolnego peptydu BPC w roztworze wodnym bądź wodno-alkoholowym lub w innym odpowiednim rozpuszczalniku zawierającym odpowiednią zasadę, a następnie otrzymywaniu pożądanej soli według przedmiotowego wynalazku w wyniku odparowania rozpuszczalnika, wymrażania, liofilizowania lub w wyniku dodania innego rozpuszczalnika, np. eteru dietylowego do roztworu wodnego i/lub roztworu alkoholowego soli peptydu BPC, co powoduje wydzielenie nierozpuszczalnej, nieoczyszczonej soli. W celu utworzenia soli stosowany jest zwykle jeden lub najwyżej dwa mole zasady, to jest kationu oraz jeden mol wolnego peptydu BPC. W celu otrzymania zasadowej soli peptydu BPC, korzystnie stosuje się węglan lub wodorowęglan metalu alkalicznego. Otrzymane sole peptydu są łatwo rozpuszczalne w wodzie.

W zakresie przedmiotowego wynalazku, za zasadę uważa się substancję zdolną do uwalniania kationów w roztworze, zwłaszcza w roztworach wodnych i wodno-alkoholowych.

W zakresie przedmiotowego wynalazku, aktywność farmaceutyczna obejmuje działanie profilaktyczne oraz terapeutyczne. Zgodnie z powyższym, kompozycja farmaceutyczna oznacza kompozycje wykazujące działanie profilaktyczne i/lub terapeutyczne.

Kompozycje według przedmiotowego wynalazku są odpowiednie do stosowania miejscowego bądź ogólnego, na przykład w postaci roztworów do iniekcji, tabletek, kremów, kapsułek, maści, płynów, płatków, itp. Korzystnie dawki zawierają się w zakresie 10^-5 do 10^-2 mg/kg masy ciała pacjenta, podawane ogólnie ustrojowo, lub w wyższych stężeniach pomiędzy 0,1% do 0,5% podawane miejscowo. Określenie najkorzystniejszych dawek dla poszczególnych kuracji jest znane w stanie techniki.

Korzystnie, rozpuszczalna w wodzie kompozycja według przedmiotowego wynalazku może oprócz soli peptydu BPC, zawierać również białko rozpuszczalne w wodzie, które poprzez iniekcję może być wprowadzone do płynów krążących w organizmie, przy czym białko to nie wykazuje żadnych znaczących typów aktywności farmakologicznej, w stężeniach stosowanych w przypadku jednorazowego podawania kompozycji według przedmiotowego wynalazku (poniżej białko to nazywane jest „białkiem rozpuszczalnym w wodzie”). Jako opisane powyżej białko rozpuszczalne w wodzie, korzystne stosuje się albuminę z surowicy, globulinę, kolagen i/lub żelatynę. Białko to może być dodawane w ilościach ogólnie stosowanych w kompozycjach farmaceutycznych do iniekcji. Zatem na przykład, stosunek wagowy pomiędzy białkiem rozpuszczalnym w wodzie asolą peptydu BPC wynosi około 0,0001:1 do 100:1, korzystnie około 0,001:1 do około 10:1 lub korzystniej około 0,01: 1do około 1:1.

Wynalazek dotyczy również wymienionych powyżej soli peptydu BPC, jaki kompozycji zawierających te sole, a w szczególności w postaci wysuszonej i/lub czystych postaci lub w postaci roztworu wodnego i/lub roztworu wodno-alkoholowego. Wartość pH roztworu przygotowanego z kompozycji rozpuszczalnej w wodzie lub soli peptydu według przedmiotowego wynalazku, powinna być taka, aby nie wywierała żadnego niekorzystnego wpływu na działanie peptydu aktywnego farmakologicznie, i powinna zawierać się w dopuszczalnym zakresie ogólnie stosowanym w iniekcjach. Ponadto, wartość pH powinna być taka, aby nie powodować znaczącej zmiany w lepkości roztworu, ani powodować wytrącania się osadów i tym podobnych. Zatem wartość pH roztworu powinna wynosić korzystnie od około 6 do 9, korzystniej 6,5 do 7,5.

W momencie, gdy rozpuszczalna w wodzie kompozycja według przedmiotowego wynalazku wcelu podania pacjentowi, jest przekształcana w roztwór wodny, stężenie soli peptydu aktywnego farmakologicznie w tym roztworze korzystnie zazwyczaj powinno wynosić od około 0,0000001 do 10% (masa/objętość), korzystniej około 0,000001 do 5% (masa/objętość) lub najkorzystniej około 0,00001 do 1% (masa/objętość).

Kompozycja według przedmiotowego wynalazku korzystnie powinna mieć postać jednorazowej dawki, zawierającej aktywną farmakologicznie sól peptydu BPC według przedmiotowego wynalazku, połączoną - jeśli jest to konieczne - z innymi dodatkami, takimi jak wymienione powyżej białko roz6

PL 193 790 B1 puszczalne w wodzie. Zatem, wcelu stworzenia roztworu soli peptydu BPC aktywnego farmakologicznie, do ampułki lub fiolki w wyniku rozpuszczenia ich lub zawieszenia w sterylnej wodzie lub sterylnym roztworze soli fizjologicznej wprowadzone zostały na przykład dwa lub trzy składniki wymienione powyżej. W tym przypadku sposób otrzymywania może obejmować dodanie do roztworu opisanego powyżej, roztworu farmakologicznie aktywnej soli peptydu BPC, a następnie - jeśli jest to konieczne, dodanie dodatków w postaci roztworów lub w formie proszku. Można zastosować wszelkie odmiany znanych procedur i sposobów postępowania. W innej postaci, jednorazowa dawka może być również przygotowana poprzez dodanie sterylnej wody lub sterylnego roztworu soli fizjologicznej do proszku uzyskanego w wyniku liofilizacji lub suszenia w próżni, w którym obecna jest aktywna farmakologicznie sól peptydu BPC oraz inne dodatki, jeśli jest to konieczne. Ta postać dawki jednorazowej może zawierać co najmniej jeden typowy dodatek, taki jak czynnik stabilizujący pH (np. glicynę, kwas solny, wodorotlenek sodu), miejscowe środki znieczulające (np. chlorowodorek ksylokainy, chlorobutanol), czynniki regulujące izotoniczność (np. chlorek sodu, mannitol, sorbitol), środki emulgujące, inhibitory adsorbentów (np. Tween^® 60 lub 80), talk, skrobię, laktozę i tragakant, stearynian magnezu, glicerol, glikol propylenowy, środki konserwujące, alkohol benzylowy, benzoesan metylohydroksylowy i/lub uwodorniony olej arachidowy. Ta postać jednorazowej dawki może również zawierać dopuszczalne farmakologicznie zaróbki, takie jak na przykład poli(glikol etylenowy) 400 lub dekstran.

Kompozycje rozpuszczalne w wodzie, będące przedmiotem wynalazku korzystnie przyjmują postać preparatów pozajelitowych. Jak stwierdzono powyżej, najkorzystniejsze są preparaty pozajelitowe, roztwory do iniekcji, roztwory do podawania przezśluzówkowego, roztwory do podawania donosowo, roztwory podawane dousznie.

Roztwory do iniekcji obejmują roztwory do podawania dożylnego, podawania podskórnego, do podawania donaczyniowego, domięśniowego oraz doocznego. Te preparaty o przedłużonym działaniu mogą być z łatwością wprowadzane do strzykawek z ampułek lub fiolek. Jeśli w trakcie napełniania strzykawki, powstają pęcherzyki powietrza to mogą one być z łatwością usuwane przez zwykłe krótkotrwałe odstanie.

Kompozycja według przedmiotowego wynalazku może być rozpuszczona w wodzie roztworu lub występować w postaci liofilizatu z substancją rozpuszczoną, na przykład mannitolem. Dodatek sterylnej wody lub sterylnego roztworu soli fizjologicznej do liofilizatu prowadzi do uzyskania roztworu wodnego.

Podczas podawania preparatu toniczność roztworu wodnego kompozycji rozpuszczalnej wwodzie według wynalazku, powinna zawierać się w dopuszczalnym zakresie i może być ustalana, na przykład w wyniku zastosowania środków izotonizujących takich, jak na przykład chlorek sodu imannitol. Korzystnie, toniczność roztworu jest równa połowie lub jest dwukrotnie wyższa niż toniczność roztworu soli fizjologicznej, korzystniej wynosi ona trzy czwarte do półtora toniczności roztworu soli fizjologicznej.

Lepkość roztworu wodnego kompozycji rozpuszczalnej w wodzie, według wynalazku powinna być wystarczająco niska, aby roztwór ten mógł być wstrzykiwany. Korzystnie lepkość jest niższa niż

500 mPa^s, korzystniej lepkość jest niższa niż 400 rnPa^s. Wartości lepkości odpowiadają wartościom zmierzonym przez lepokościomierz Cone LD typ E (TOKIMEC, Japonia)wtemperaturze 25°C.

Jeśli kompozycja ma postać liofilizatu, korzystne jest aby lepkość, toniczność roztworu oraz stężenia składników wroztworze wodnym otrzymanym ztej kompozycji mieściły się w odpowiednim zakresie, jak przedstawiono powyżej.

Kompozycję według przedmiotowego wynalazku przygotowuje się przez dodanie odpowiednich składników zgodnie ze znanymi, tradycyjnymi sposobami. Celem dodawania składnikówdo kompozycji powinno być utrzymywanie aktywności aktywnej farmakologicznie soli BPC oraz ograniczenie do minimum tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas tego procesu. Składniki są wprowadzane do naczynia (na przykład butelki lub bębna) równocześnie, bądź kolejno,wdowolnej kolejności. Ośrodek wnaczyniu może stanowić na przykład sterylnie czyste powietrze lub sterylnie czysty azot gazowy. Otrzymany roztwór może być przeniesiony do małych fiolek lub ampułek, a następnie może być poddany liofilizacji.

Postać płynna lub sproszkowana postać liofilizatowa kompozycji według przedmiotowego wynalazku może być rozpuszczona lub może tworzyć zawiesinę wroztworze biodegradowalnego polimeru takiego, jak na przykład kopolimer, kwasu poli(laktozoglikolowego), polimer kwasu hydroksymasłowego, kopolimer kwasu poli(hydroksymasłowoglikolowego) lub ich mieszaniny, anastępnie może być

PL 193 790 B1 utworzona na przykład w postaci błon, mikrokapsułek (mikrosfer) lub nanokapsułek (nanosfer), zwłaszcza w postaci miękkich lub twardych kapsułek.

Ponadto, kompozycja według przedmiotowego wynalazku zamknięta w liposomach zbudowanych z fosfolipidów, cholesterolu lub pochodnych tych związków może być użyta do wytworzenia zawiesiny w roztworze soli fizjologicznej lub roztworze kwasu hialuronowego rozpuszczonego w roztworze soli fizjologicznej.

Kapsułka miękka może być wypełniona płynną postacią kompozycji będącej przedmiotem wynalazku. Kapsułka twarda może być wypełniona kompozycją według wynalazku, w postaci proszku otrzymanego w wyniku liofilizacji, albo kompozycja według wynalazku w postaci proszku otrzymanego w wyniku liofilizacji może być sprasowana w tabletkę do podawania odpowiednio doodbytniczego lub doustnego.

Oczywiste jest, że kompozycja według przedmiotowego wynalazku może być dostarczana w napełnionej wcześniej strzykawce do samodzielnego pobierania.

Kompozycja według wynalazku może być przechowywana w normalnej temperaturze to znaczy w temperaturze od +10°C do +30°C lub w zakresach typowych dla chłodziarek, korzystnie od około +2°C do +8°C.

Wynalazek dotyczy również nowych zastosowań i sposobów leczenia przy użyciu opisanych powyżej soli i/lub kompozycji, w szczególności wynalazek dotyczy leczenia zaburzeń związanych z tworzeniem się tlenku azotu (NO), bądź nieprawidłowego funkcjonowania układów związanych z NO, a w szczególności leczenia nadciśnienia, dusznicy bolesnej, impotencji, wstrząsu krążeniowego i septycznego, porażeń, zapaleń, zespołu zaburzeń oddechowych, zlepiania się i agregacji płytek krwi i leukocytów, zaburzeń czynności śródbłonka, uszkodzeń żołądkowo-jelitowych, zaburzeń perystaltyki, cukrzycy, zapalenia trzustki, niedociśnienia i choroby Parkinsona; zaburzeń czynności lub nadczynności nerwów somatosensorycznych, w szczególności neuropatii czuciowej, nerwobólu poopryszczkowego, atopowego zapalenia skóry, nieprawidłowego zdrowienia uszkodzonej tkanki, nabytej pokrzywki wywołanej przez zimno lub ciepło, łuszczycy, pęcherzowego pemfigoidu, wyprysku, dermatoz wywołanych światłem, chronicznego zapalenia stawów, uszkodzeń żołądkowo-jelitowych oraz specyficznej lub niespecyficznej zbyt dużej aktywności górnych i dolnych dróg oddechowych (astmy, nieżytów górnych dróg oddechowych), zaburzenia śródbłonkowego, ran, owrzodzeń, stanów związanych z ostrymi i/lub chronicznymi zapaleniami, w szczególności chronicznych zapaleń stawów i chorób związanych z opóźnioną nadwrażliwością oraz uszkodzeń żołądkowo-jelitowych; chorób wątroby, uszkodzeń organów spowodowanych przez wolne rodniki, zwłaszcza spowodowanych przez napromieniowanie; chorób związanych z zaburzeniami układu katecholaminergicznego, w szczególności schizofrenii, wpływu pobudzenia wywołanego amfetaminą, nadużywania leków; stanów związanych z napięciem (stresem); ostrych zapaleń trzustki z dodatkowym pozytywnym wpływem na towarzyszące zapaleniom żołądka i dwunastnicy patologie, zaburzeń sercowych, w szczególności jako leki przeciwko arytmii, przeciwko dusznicy bolesnej i chroniące serce; zaburzeń depresyjnych; choroby Parkinsona i w patologiach chorób podobnych do choroby Parkinsona; zaburzeń temperaturowych; upośledzeń kostnych; uszkodzeń różnych organów indukowanych nadciśnieniem; zakłóceń koagulacji; zakłóceń bólowych; zakłóceń drgawkowych; uszkodzeń rdzenia kręgowego, uszkodzeń spowodowanych alkoholem, wywołanych nadużywaniem alkoholu lub zwiększonym pobieraniem alkoholu; chorób niedokrwistości mózgu; uszkodzenia nerwu obwodowego; chorób kataleptycznych i zakłóceń neuroleptycznych; chorób związanych z nienormalnymi lub zmutowanymi limfocytami; zakłóceń płodowych; atrofii pochwowej i rozwoju osteoporozy spowodowanego przez stany związane z wycięciem jajników; nowotworów; chorób wirusowych, w szczególności AIDS lub ARC, uszkodzeń żołądkowo-jelitowych i chorób poznawczych; uszkodzeń związanych z wycofaniem leku, zakłóceń pracy nerek i zakłóceń w odpowiedzi immunologicznej komórki.

Ponadto do peptydów mogą być przyłączone inne reszty funkcyjne lub strukturalne, takie jak węglowodory, tłuszcze, białka lub peptydy, przeciwciała, receptory, hormony, substancje cytotoksyczne, substancje markerowe, barwniki, związki znakowane radioaktywnie, czynniki immunomodulujące, leki, nośniki, substancje docelowe lub sygnałowe itp.

Wynalazek zostanie wyjaśniony poniżej bardziej szczegółowo na podstawie przykładów i załączonego rysunku. Poszczególne figury rysunku przedstawiają:

Figura 1 przedstawia widmo IR NaBPC157.

Figura 2 przedstawia widmo IR Na2BPC157.

Figura 3 przedstawia widmo IR soli dwucezowej BPC157 (Cs2BPC157).

PL 193 790 B1

Figura 4 przedstawia widmo IR soli BPC157 i TRISu (TRIS-BPC157).

Figura 5 przedstawia widmo IR soli BPC157 i (TRIS)2 ((TRIS)2-BPC157).

Figura 6 przedstawia widmo IR soli BPC157 i 2-aminopopanolu (2-AMP-BPC157).

Figura 7 przedstawia widmo IR soli BPC157 i trietanolaminy (TEAM-BPC157)

P r zyk ł a d 1

Otrzymywanie soli sodowej BPC157 (NaBPC157)

Rozpuszczono 0,5 g (0,35 mmoli) pentadekapeptydu o sekwencji Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys

Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val (BPC157) w10 ml wody zawierającej 29,6 mg wodorowęglanu sodowego (0,35 mmoli), przefiltrowano sterylnie przez filtr 0,2 m i wysuszono przez suszenie sublimacyjne otrzymując 0,48 g białawego ciała stałego.

Czystość otrzymanej soli 99,4% (HPLC).

Spektroskopia masowa (FAB): 1419, wyższe jony przy 1441 (M⁺Na⁺).

Analiza aminokwasowa otrzymanej soli peptydu po 72 godzinach hydrolizy z roztworem 6N HCl w szczelnie zamkniętej probówce w temp. 110°C wykazała wartości odpowiadające składowi 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp, Glu, Leu, Val, Lys.

Widmo IR (KBr): fig. 1.

Widmo UV (H2O): lmax = 190 nm, brak innych maksimów.

Temperatura topnienia: 288 - 290°C (rozkład).

P r zyk ł a d 2

Otrzymywanie soli dwusodowej BPC157 (Na2BPC157)

Rozpuszczono 0,5 g (0,35 mmoli) BPC157 w10 ml etanolu. Stale, umiarkowanie mieszając dodano, 1,4 ml 0,5 molowego roztworu wodorotlenku sodu w metanolu. Otrzymany roztwór przefiltrowano sterylnie przez filtr 0,2 m i dodawano powoli do mieszanego eteru dietylowego (50 ml). Oddzielone białe ciało stałe odsączono i przemyto eterem dietylowym, otrzymując 0,52 g soli dwusodowej.

Czystość otrzymanej soli 99,4% (HPLC).

Spektroskopia masowa (FAB): 1419, wyższe jony przy 1441 (M⁺Na⁺), 1464 (M⁺Na2⁺).

Analiza aminokwasowa otrzymanej soli peptydu odpowiada składowi 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp,

Glu, Leu, Val, Lys.

Widmo IR (KBr): fig. 2.

Widmo UV (H2O): lmax =190 nm, brak innych maksimów.

Temperatura topnienia: 275 - 277°C.

P r zyk ł a d 3

Otrzymywanie soli dwucezowej BPC157 (Cs2BPC157)

Rozpuszczono 0,5 g (0,35 mmoli) BPC157 w8 ml wody zawierającej 114 mg węglanu cezu (0,70 mmoli), przefiltrowano sterylnie przez filtr 0,2 m i liofilizowano otrzymując 0,55 g białawego ciała stałego.

Czystość otrzymanej soli 99,3% (HPLC).

Spektroskopia masowa (FAB): 1419, wyższe jony przy 1551 (M⁺Cs⁺), 1684 ((M⁺Cs2⁺)).

Analiza aminokwasowa otrzymanej soli peptydu odpowiada składowi 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp,

Glu, Leu, Val, Lys.

Widmo IR (KBr): fig. 3.

Widmo UV (H2O): lmax = 190 nm.

Temperatura topnienia: 268°C.

P r zyk ł a d 4

Otrzymywanie soli BPC157 i TRIS-u (TRIS-BPC157)

Rozpuszczono 0,5 g (0,35 mmoli) BPC157 w10 ml metanolu, zawierającego 42,6 mg (0,35 mmoli) tris-(hydroksymetylo)-aminometanu (TRIS) i przefiltrowano sterylnie przez filtr 0,2 m i wysuszono przez odparowanie metanolu w próżni w temp. 40°C, otrzymując 0,56 g białego ciała stałego.

Czystość otrzymanej soli 99,5% (HPLC).

Spektroskopia masowa (FAB): 1419 (MH⁺).

Analiza aminokwasowa otrzymanej soli peptydu odpowiada składowi 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp,

Glu, Leu, Val, Lys.

Widmo IR (KBr): fig. 4.

Widmo UV (H2O): lmax = 190 mn.

Temperatura topnienia: 250°C (rozkład).

PL 193 790 B1

P r zyk ł a d 5

Otrzymywanie soli BPC157 i di-TRIS-u ((TRIS)2-BPC157)

Związek otrzymano według procedury opisanej w przykładzie 1, z wyjątkiem, że zamiast wodorowęglanu zastosowano 85,2 mg (0,70 mmoli) TRIS-u.

Czystość otrzymanej soli 99,5% (HPLC).

Spektroskopia masowa (FAB): 1419 (MH⁺).

Analiza aminokwasowa otrzymanej soli peptydu odpowiada składowi 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp,

Glu, Leu, Val, Lys.

Widmo IR (KBr): fig. 5.

Widmo UV (H2O): lmax =190 nm.

Temperatura topnienia: 188 - 193°C.

P r zyk ł a d 6

Otrzymywanie soli BPC157 i 2-aminopropanolu (2-AMP-BPC157)

Związek otrzymano według procedury opisanej w przykładzie 1. Jako zasady użyto 2-aminopropanolu (2-AMP).

Czystość otrzymanej soli 96,6% (HPLC).

Spektroskopia masowa (FAB): 1419 (MH⁺).

Analiza aminokwasowa otrzymanej soli peptydu odpowiada składowi 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp,

Glu, Leu, Val, Lys.

Widmo IR (KBr): fig. 6.

Widmo UV (H2O): lmax = 190 nm.

Temperatura topnienia: 158°C (rozkład).

P r zyk ł a d 7

Otrzymywanie trietanoloaminowej soli BPC157 (TEAM-BPC157)

Związek otrzymano według procedury opisanej w przykładzie 1. Jako zasady użyto trietanoloaminy (TEAM).

Czystość otrzymanej soli 99,2% (HPLC).

Spektroskopia masowa (FAB): 1419 (MH⁺).

Analiza aminokwasowa otrzymanej soli peptydu odpowiada składowi 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp,

Glu, Leu, Val, Lys.

Widmo IR (KBr): fig. 7.

Widmo UV (H2O): lmax = 190 nm.

Temperatura topnienia: 202 - 205°C.

P r zyk ł a d 8

Otrzymywanie tabletek zawierających TRIS-BPC157

Składnik mg/tabletkę

TRIS-BPC157	0,5
trehaloza	20,0
laktoza	17,0
skrobia	6,5
talk	3,0
tragakant	2,5
stearynian magnezu	0,5

RAZEM 50,0 mg

TRIS-BPC157 (0,5 mg)i trehalozę (20 mg) rozpuszczono w 1 ml wody i wysuszono przez odparowanie. Po wysuszeniu, surowy osad dodano do innych składników w celu przygotowania tabletek.

PL 193 790 B1

Przykład 9

Otrzymywanie kapsułek zawierających NaBPC157

Składnik mg/tabletkę

NaBPC157 0,5 trehaloza 60,0 laktoza 39,0 stearynian magnezu 0,5

RAZEM 100,0 mg

NaBPC157 (0,5 mg)itrehalozę (60 mg) rozpuszczonow1 ml wody i wysuszono przez odparowanie rozpuszczalnika. Surowy osad dodano do innych składnikówwcelu przygotowania kapsułek.

Przykład 10

Otrzymywanie roztworu zawierającego NaBPC157

Składnik g/25 ml

NaBPC157	0,05
gliceryna	15,00
alkohol benzylowy	0,01

buforopH7,0 dodany do uzyskania objętości końcowej 25,0 mg

Przykład 11

Otrzymywanie maści zawierającej TRIS-BPC157

Składnik g/25 g

TRIS-BPC157	0,05
czynnik emulgujący	2,80
uwodorniony olej arachidowy	7,08
Tween® 60	12,08
glikol propylenowy	3,00
benzoesan metylohydroksylowy	0,07

RAZEM 25,0 mg

Przykład 12

Badanie stabilności

Stabilność soli peptydu BPC badano inkubując sole przez 76 i 120 dni wtemp. 40°C. Stężenie soli peptydu BPC wroztworach wodnych wynosiło 0,2% (masa/objętość). Stabilność mierzono stosując metodę HPLC: kolumna Kromasil 100,5 m, 150 x 4,6 mm, faza ruchoma 0,1% kwasu trifluorooctowego w wodzie/acetonitrylu (od 0 do 50% objętościowych), wymywanie gradientem wciągu 25 minut, szybkość przepływu 1ml/ min, detekcja: UV przy 214 nm.

Dla porównania zastosowano wolny peptyd BPCijego octan.

Tabel a 1

Stabilność soli peptydu BPC w temp. 40°C dnia 0, 76 i 120; próba w% powierzchni (HPLC)

Związek	Wartość pH; 0,2% w wodzie	Dzień 0	Dzień 76	Dzień 120
1	2	3	4	5
Wolny peptyd BPC157	4,46	99,3	98,1	97,4
Octan peptydu BPC157	4,53	99,2	97,8	95,3
Sól sodowa BPC157	6,51	99,4	99,5	99,4

PL 193 790 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5
Sól dwusodowa BPC157	7,64	99,4	99,7	99,4
Sól TRIS-u i BPC157	6,31	99,5	99,5	99,4
Sól di-TRIS-u i BPC157	8,24	99,5	99,5	99,5
Sól 2-AMP i BPC157	8,20	99,6	99,4	99,5
Sól TEAM i BPC157	7,61	99,2	99,3	99,1

Na podstawie danych prezentowane w powyższej tabeli wyraźnie wykazano wzrost stabilności soli peptydu BPC będących przedmiotem wynalazku, w porównaniu do wolnego peptydu BPC lub jego octanu. Ponadto, prawdopodobnie ze względu na wysoką wartość pH roztworu soli peptydu BPC, iniekcja tych roztworów nie powoduje bólu ani martwicy.

W innym, oddzielnym doświadczeniu, po dodaniu trehalozy obserwowano dodatkową poprawę stabilności soli peptydu BPC, będących przedmiotem wynalazku, w postaci surowej oraz w roztworze. Dlatego dodatek trehalozy jako farmakologicznie dopuszczalnego dodatku do przygotowywanego preparatu farmaceutycznego, w szczególności będącego w postaci tabletek lub kapsułek, jest kolejnym ważnym aspektem niniejszego wynalazku.

Następujące przykłady opisują doświadczenia wykazujące aktywność farmaceutyczną soli peptydów BPC będących przedmiotem wynalazku. Doświadczenia te wykonano stosując różne tradycyjne modele in vitro i in vivo. Do doświadczeń użyto soli sodowej peptydu BPC157 (skrót NaBPC157), jeśli nie stwierdzono inaczej. Samce szczurów Wistar o masie ciała 250 - 280 g stosowano we wszystkich doświadczeniach, jeśli nie stwierdzono inaczej.

P r zyk ł a d 13

Układ tlenku azotu (NO)

Cząsteczka tlenku azotu (NO) funkcjonuje w organizmie zarówno jako cząsteczka sygnałowa w komórkach śródbłonka i komórkach nerwowych, jak i jako cząsteczka zabójcy aktywowana przez komórki układu immunologicznego. Obecne badania wykazują, że cząsteczka ta może być wykorzystywana jako lekarstwo i podawana poprzez inhalację. Ogólnie, zarówno w wyniku nadmiaru, jak i upośledzenia, NO wydaje się powodować lub uczestniczyć w różnych zaburzeniach, a w szczególności w nadciśnieniu, dusznicy bolesnej, impotencji, wstrząsie krążeniowym, porażeniu, zapaleniach, zespole zaburzeń oddechowych, nadciśnieniu płucnym, zlepianiu się i agregacji płytek krwi i leukocytów, cukrzycy, niedociśnieniu oraz chorobie Parkinsona.

Materiały i metody:

Niektóre skutki działania NaBPC157 (10 mg lub 10 ng/kg), takie jak na przykład aktywność poprawiającą gojenie uszkodzeń gastrycznych oraz aktywność NaBPC157 powodującą utrzymywanie odpowiedniego ciśnienia krwi sprawdzano u szczurów. Uszkodzenia uzyskano w wyniku podawania etanolu przez 1 godzinę (96%, dożołądkowo). Równocześnie podawane było NaBPC157 (dootrzewnowo). W doświadczeniu dotyczącym utrzymywania ciśnienia krwi NaBPC157 podawano dożylnie (i.v.).

Badano również połączone podawanie estru metylo-N^G-nitro-L-arginina (L-NAME) (5 mg/kg dożylnie), który jest kompetytywnym inhibitorem wytwarzania tlenku azotu (NO) w śródbłonku oraz L-argininy (200 mg/kg dożylnie), prekursora NO (D-arginina była nieskuteczna). W próbach z uszkodzeniem żołądkowym czynniki wpływające na NO podawano 5 minut przed uszkodzeniem etanolem i leczeniem NaBPC157.

Wyniki:

W modelu uszkodzenia etanolem, podawane samego NaBPC157 powodowało wpływ przeciwowrzodzeniowy podobnie jak L-arginina. NaBPC157 zapobiegało poważnym uszkodzeniom żołądkowym obserwowanym w innych przypadkach to jest u szczurów kontrolnych, którym podawano etanol. L-NAME nie powodowało żadnego efektu. L-NAME całkowicie znosiło aktywność L-argininy, lecz jednie osłabiało działanie NaBPC157. Po podaniu połączonych związków L-NAME i L-argininy, aktywność NaBPC157 była dodatkowo zmniejszona.

W badaniach nad wpływem NaBPC157 na ciśnienie krwi, NaBPC157 (nie mający wpływu na podstawowe normalne wartości), w porównaniu z L-argininą, miało zarówno efekt naśladujący (osłabiało wzrost ciśnienia krwi spowodowany przez L-NAME, po zastosowaniu profilaktycznym i obniżało

PL 193 790 B1 ciśnienie już podniesione przez L-NAME, po podaniu wczasie wystąpienia najwyższej wartości ciśnienia krwi wywołanego przez L-NAME, to jest 10 minut po podaniu L-NAME) oraz działanie zapobiegawcze (podany wcześniej NaBPC157 zapobiegał umiarkowanemu spadkowi ciśnienia krwi indukowanemu przez L-argininę). Jeśli NaBPC157 podano 10 minut po podaniu połączonych związków L-NAME iL-argininy (nadal prowadzącemu do podniesienia ciśnienia krwi), wyraźny wpływ NaBPC157 znikał (stwierdzono u szczurów poddawanych działaniu L-NAME). In vitro, wprzypadku błony śluzowej żołądka otrzymanej zhomogenatu żołądka szczura, NaBPC157podany w identycznej dawce (100 mM) co arginina indukował porównywalne tworzenie się NO. Lecz działanie NaBPC157 nie mogło zostać zahamowane przez L-NAME, nawet jeśli podana została dziesięciokrotnie (100 względem 1000 mM) wyższa dawka, niż jest konieczna do zahamowania aktywności L-argininy. Z drugiej strony, synteza NO była znacznie zmniejszona, jeśli podano łącznie Na PBC157 i L-a rg i n i n ę . Podsumowując, NaBPC157 może w szczególny sposób, wpływać na efekty wywołane przez NO, zarównowodniesieniu do utrzymania ciągłości błony śluzowej żołądka oraz utrzymywania odpowiedniego ciśnienia krwi, zwłaszcza jeśli związek ten zostanie połączony zL-argininą, mającą znaczniejszy i/lub zasadniczo różny wpływ na NO.

NaBPC157 dzięki bardziej znaczącemu wpływowi na funkcjonowanie NO niż L-arginina, może zapobiegać nadmiernemu tworzeniu się NO związanemu ze skutkami ubocznymi (zakłócony wpływ L-argininy (np. niedociśnienie)). Wspomniane powyżej skutki uboczne zostały zniesione in vivo do wartości nominalnych iudało się zapobiec nadmiernemu tworzeniu się NO in vitro. Dodatkowo zniesiono negatywne skutki zahamowania aktywności układu NO (np. zapobieżenie wzrostowi ciśnienia krwi wywołanemu przez L-NAME oraz zniesiono spowodowane przez L-NAME niedociśnienie).

W oparciu o bliskie podobieństwo badań oddziaływania NO winnych tkankach (na przykład: płucach, wątrobie, naczyniach krwionośnych itp.) oraz różnorodność zastosowanych modeli (uszkodzenia żołądkowo-jelitowe oraz utrzymanie odpowiedniego ciśnienia krwi), wykazane pozytywne skutki zastosowania NaBPC157 wodniesieniu zarówno do nadmiernego tworzenia NO, jaki nieprawidłowego funkcjonowania układu NO są wyraźne. W szczególności sole peptydu BPC będące przedmiotem wynalazku, mogą być korzystnie stosowane do leczenia nadciśnienia, dusznicy bolesnej, impotencji, wstrząsu krążeniowego i septycznego, porażeń, zapaleń, zespołu zaburzeń oddechowych, nadciśnienia płucnego, zapalenia trzustki, zlepiania się iagregacji płytek krwi ileukocytów, zaburzeń czynności śródbłonkaichoroby Parkinsona.

Przykład 14

Neurony somatosensoryczne.

Ogólnie, neurony somatosensoryczne biorą udział wkontroli homeostazy, a w szczególności wreakcji do prowokowania homeostazy. Neurony te mogą wykrywać potencjalne zagrożenia. Neurony te per se są wstanie natychmiast rozpoczynać odpowiednie pomiary aby zmniejszać niebezpieczeństwo. Zatem naczyniowoczynne nerwy doprowadzające reprezentują układ pierwszej linii obrony przeciwko urazowi. Ogólnie, ich zdolności ochronne zostały udowodnione dzięki doświadczalnemu uszkodzeniu skóry i żołądkowo-jelitowej błony śluzowej. Zarówno nieprawidłowe funkcjonowanie, jak inadczynność pociągają za sobą różne choroby, zwłaszcza wrodzone choroby czuciowego układu nerwowego, choroby czuciowego układu nerwowego spowodowane cukrzycą, półpasiec, neuralgię poopryszczkową, atopowe zapalenie skóry, upośledzone słyszenie lub uszkodzenie tkanki (na przykład uporczywe zranienia skórne, pogorszenie uszkodzeń skóry wywołanych kwasem oraz tworzenie się uszkodzeń rogówki typu zapalenia rogówki), nabyte pokrzywki wywołane przez zimno lub ciepło, łuszczycę, pęcherzowy pemfigoid, wypryski, dermatozy wywołane światłem, choroby górnych idolnych dróg oddechowych, specyficznej lub niespecyficznej zbyt dużej aktywności, naczyniowo-ruchowy nieżyt nosa, astmę, chroniczne zapalenia stawów, uszkodzenia żołądkowo-jelitowe.

Materiały i metody:

NaBPC157 badano pod kątem właściwości ochraniania żołądkawprzypadku uszkodzeń żołądka (wywołanych u szczurów poddawaniem działaniu 96% etanolu, powstrzymywaniem napięcia i wwyniku podawania indometacyny). Badano również możliwy udział neuronów czuciowych wdziałaniu uzdrawiającym NaBPC157 (10 mg/kg,10 ng/kg dootrzewnowo), podając kapsaicynę, która wywiera całkiem inny wpływ na neurony czuciowe: podawanie wysokich dawek dorosłym zwierzętom (125 mg/kgs.c. (podskórnie), trzymiesięczne zwierzęta) lub podawanie jej (50 mg/kg s.c.) nowonarodzonym zwierzętom (siedem dni po urodzeniu) niszczy włókna czuciowe, podczas gdy niskie dawki (500 mg/kg dootrzewnowo) aktywują uwalnianie neurotrasmiterów i działanie ochronne na błonę śluzową.

PL 193 790 B1

Wyniki:

(i) W przypadku braku kapsaicyny, NaBPC157 ochraniał błonę śluzową żołądka przeciwko działaniu etanolu, powstrzymywanemu napięciu i podawaniu indometacyny.

(ii) W obecności neurotoksycznych dawek kapsaicyny, negatywne działanie kapsaicyny na uszkodzenia powstałe w przypadku powstrzymywania napięcia, etanolu lub indometacyny łącznie wpływały na uzdrawiające działanie NaBPC157. We wszystkich wymienionych powyżej badaniach ochrona wywołana NaBPC157 była nadal widoczna w przypadku doświadczeń na modelach zwierzęcych, w których stosowano kapsaicynę (zarówno u zwierząt dorosłych, jak i u nowonarodzonych). Po poddaniu nowonarodzonych zwierząt działaniu kapsaicyny, stwierdzono całkowite zniesienie działania ochronnego NaBPC157, jeśli NaBPC157 podano jako pojedynczą dawkę rzędu nanogramów.

(iii) W połączeniu z dawką pobudzającą kapsaicyny, korzystne właściwości NaBPC157 zostały dodatkowo wzmocnione.

Podsumowując, przedstawione powyżej dane wykazują złożone oddziaływanie synergistyczne pomiędzy korzystnym działaniem NaBPC157 a aktywnością peptydergiczną czuciowych nerwów doprowadzających. Biorąc pod uwagę bliskie podobieństwo działania kapsaicyny u zwierząt i ludzi oraz doświadczenie opisane powyżej, NaBPC157 może być stosowany w leczeniu zaburzeń wymienionych powyżej.

P r z y k ł a d 15

Ochrona śródbłonka

Wiadomo, że uszkodzenia śródbłonka naczyniowego poprzedzają rozwój i stanowią warunek wstępny wystąpienia uszkodzeń w większości organów. Ochrona śródbłonka mogłaby zatem ograniczyć niszczące skutki niedokrwienia dzięki zachowaniu ciągłości błony śluzowej. Jako odpowiedni, ogólnie akceptowany, model zastosowano szczury, którym podano Błękit Monastral przed podaniem czynnika powodującego martwicę (na przykład etanolu podawanego dojelitowo), co jak wiadomo powoduje znaczne uszkodzenia.

Materiały i metody:

Wszystkie szczury otrzymywały dożylnie Błękit Monastral (BM) (Sigma Company, USA) (1,0 ml/kg masy ciała zwierzęcia) trzy minuty przed poddaniem ich działaniu etanolu. Szczury następnie zabijano 1 minutę po poddaniu działaniu etanolu. Jedną godzinę przed podaniem etanolu, podawano NaBPC157 (10,0 mg/kg dootrzewnowo) lub izotonicznego roztworu chlorku sodu (5,0 ml/kg dootrzewnowo). Natychmiast po zabiciu szczurów, wypreparowywano żołądek i uszkodzenia określali bezstronni obserwatorzy. Reprezentatywne preparaty żołądka oraz dwunastnicy poddawano dalszym analizom histologicznym.

Uszkodzenia naczyniowe oznaczano we wczesnym okresie (1 minuta po poddaniu działaniu etanolu), przy zastosowaniu techniki z Błękitem Monastral (BM). Powierzchniową gęstość wybarwionej błony śluzowej badano TEM.

Wyniki

Znaczące obniżenie wybarwienia BM było łącznie stwierdzone w grupach, w których podano NaBPC157. Bliskie podobieństwo zastosowanego modelu ze stanami chorobowymi u ludzi wykazuje możliwość zastosowania NaBPC157 do leczenia stanów związanych z nieprawidłowościami śródbłonka u ludzi.

P r z y k ł a d 16

Rozwój naczyń

Rozwój naczyń ma zasadnicze znaczenie w tworzeniu się ziaren, gojeniu się ran i/lub owrzodzeń. Stosując ogólnie znane sposoby badano charakterystykę rozwoju naczyń.

Materiały i metody:

Każdemu szczurowi do okolicy lędźwiowej wszczepiono podskórnie dwie sterylne gąbki (1 cm x 1 cm x 0,25 cm /V = 0,25 ml/) z takimi samymi ilościami NaBPC157 (roztwór 50 mg, 10 mg, 10 ng/ml) lub odczynnikami odnośnymi: cymetydyną (10 mg, 100 mg, 500 mg/ml), ranitydyną (2,5 mg, 25 mg, 250 mg/ml), famotydyną (10 mg, 50 mg, 100 mg/ml) oraz sukralfatem (1 mg, 5 mg, 10 mg/ml). Gąbki usunięto po trzech i siedmiu dniach. Następnie zostały one utrwalone i poddane badaniom histologicznym i histochemicznym oraz analizie morfometrycznej. Do analizy morfometrycznej zastosowano mikroskop Leitz, DIAPLAN i użyto oprogramowanie „SFORM” wykonane przez VAMS, Zagrzeb, Chorwacja.

PL 193 790 B1

Wyniki:

Nowo utworzone ziarnistości dookoła wszczepionej gąbki są typowo wykorzystywane jako wartościowy ilościowy pomiar odpowiedzi gospodarza na obce ciało w organizmie. Doświadczenia ze szczurami, które zabito trzeciego dnia po wszczepieniu wykazały co następuje: u zwierząt z grupy poddanej działaniu NaBPC157 stwierdzono znacznie więcej ziarnistości w porównaniu ze zwierzętami z grupy kontrolnej. Podobne wyniki otrzymano w przypadku szczurów poddanych działaniu sukralfatu we wszystkich trzech zastosowanych dawkach. W przeciwieństwie do tych wyników, nie stwierdzono różnicy pomiędzy wartościami kontrolnymi a analizowanymi odczynnikami u zwierząt poddawanych działaniu wszystkimi trzema blokerami H2. U zwierząt, które zostały zabite siódmego dnia po wszczepieniu, te zwierzęta, którym podawano wszystkie trzy dawki sukralfatu i te, którym podawano najwyższą dawką NaBPC157 (50 mg) były znacząco inne w porównaniu do grupy kontrolnej. Wartości kontrolne nie różniły się znacząco pomiędzy sobą w zależności od dnia uśmiercenia zwierząt.

Wewnątrz nowoutworzonych ziarnistości zliczane były przestrzenie śródbłonkowe. Względem wartości kontrolnych (ilość nowo utworzonych przestrzeni śródbłonkowych w grupie kontrolnej zabitej trzy dni po wszczepieniu wynosiła 7,94 ± 1,23 i siedem dni po wszczepieniu 14,8 ± 3,12), wszystkie zastosowane substancje prowadziły do znacząco zwiększonych wartości wobu przedziałach czasowych (trzeciego i siódmego dnia).

Oprócz dowodów, że różne lekarstwa przeciwko owrzodzeniom mają również własności indukowania rozwoju naczyń, wykazano, że NaBPC157 stymuluje także powstawanie ziarnistości, podobnie jak sukralfat. Zgodnie ztym, NaBPC157 może być stosowany do inicjowania i podtrzymywania procesu zdrowienia, w szczególności procesu gojenia się ran i/lub owrzodzeń.

P r zyk ł a d 17

Zapalenia

Obecnie stosowane środki przeciwzapalne są zwykle badane przy użyciu wielu odpowiednich modeli blisko odpowiadających ostrym i/lub chronicznym zaburzeniom zapalnym u ludzi. Jednakże, poważne uszkodzenia żołądkowo-jelitowe wydają się głównym skutkiem ubocznym stosowania tych środków.

W przypadku NaBPC157 stwierdzono działanie przeciwzapalne w stanach ostrych oraz znoszenia bólu, jak i działanie przeciwgorączkowe (obniżenie gorączki wywołanej przez drożdże (4000 mg/kg podanie podskórne)) (na przykład terpentyna, karragenina, kwas octowy lub MgSO4 (zależne od prostaglandyny, niezależne od prostaglandyny) wicie się z bólu w badaniach szczypania ogona). W rezultacie, u szczurów zbadano równolegle znane uzdrawiające działanie NaBPC157 na uszkodzenia żołądkowo-jelitowe, wpływ na chroniczne uszkodzenia zapalne, takie jak zapalenie stawu lub stawów wywołane środkiem wspomagającym oraz działanie NaBPC157 jako niesteroidowego środka przeciwzapalnego w uszkodzeniach żołądkowo-jelitowych indukowanych związkami NSAIA.

Materiały i Metody:

W badaniach uszkodzeń żołądkowo-jelitowych (indometacyna - 30 mg/kg, podskórnie, aspiryna - 400 mg/kg, dożołądkowo i diklofenak - 125 mg/kg, dootrzewnowo) podawano regularnie NaBPC157 (10 mg lub 10 ng/kg, dootrzewnowo), zarówno wtym samym momencie jak i/lub w jedną godzinę przed podaniem leku (indometancyny). W przypadku 9 badań (14 dni, 30 dni, jeden rok) zapalenia stawów wywołanego środkiem wspomagającym (podawanie doogonowe 0,2 ml adjuwanta Freunda) podawano NaBPC157 (10 mg lub 10 ng/kg dootrzewnowo) jako jednorazową dawkę (w jedną godzinę przed lub po podaniu adjuwanta Freunda) lub w trybie leczenia jednorazowa dawka dziennie (od 0 do 14-tego dnia, od 14 do 30-tego dniai od 14 dnia do jednego roku).

Wyniki:

NaBPC157 podawane razem z badanymi związkami NSAIA znacząco obniżały rozległe uszkodzenia żołądka w przypadku szczurów kontrolnych, podobnie jak uszkodzenia w jelicie cienkim wgrupie zwierząt, którym podawano indometacynę. W badaniach zapalenia stawów wywołanego środkiem wspomagającym, rozwój uszkodzeń był znacząco zmniejszony po pojedynczej dawce NaBPC157, a nawet bardziej osłabiony (rozwój uszkodzeń) u szczurów, którym NaBPC157 podawano codziennie.

Jako leczenie utworzonego już zapalenia stawów wywołanego środkiem wspomagającym, uzdrawiające działanie NaBPC157 konsekwentnie pojawiało się dopiero po dwóch tygodniach podawania leku i było oczywiste po jednym roku dawkowania. Wyniki te wykazują przeciwzapalne i ochronne działanie NaBPC157 na utrzymanie całości błony śluzowej.

Wiadomo, że dwa różne mechanizmy: zapalenie i opóźniona nadwrażliwość, biorą udział wpowstawaniu zapalenia stawów wywołanego środkiem wspomagającym. NaBPC157 wpływa pozytywnie

PL 193 790 B1 na oba te mechanizmy. W odniesieniu do standardów odniesienia (to jest aspiryny, indometacyny), NaBPC157 było skuteczne w znacząco niższych dawkach (mg i ng/kg względem mg/kg). Ta początkowa wyższa skuteczność w leczeniu zapalenia stawów wywołanego środkiem wspomagającym jest nawet bardziej podniesiona w przypadku dawkowania codziennego. Wyższe dawki (10 mg/kg) były skuteczne zarówno po podaniu jednorazowym, jak i dawkowaniu codziennym, podczas gdy niższe dawki (10 ng/kg) były początkowo nieskuteczne, podawane jako pojedyncza dawka, lecz stawały się skuteczne, jeśli były podawane jako tryb leczenia codziennie. Odkrycie to, w połączeniu z leczniczym działaniem NaBPC157 na całkowicie wykształcone zapalenia stawów, przedstawia korzystny sposób podawania NaBPC157 podczas całego przebiegu zapalenia stawów wywołanego środkiem wspomagającym. Wykazana skuteczność NaBPC157 w leczeniu zapalenia stawów wywołanego środkiem wspomagającym (działanie profilaktyczne/lecznicze, nierozwinięte/rozwinięte zapalenie stawów wywołane środkiem wspomagającym) nie może być obserwowane w przypadku obecnie stosowanych środków leczniczych. Glukokortykoidy są skuteczne jako środki zapobiegające zapaleniu stawów wywołanego środkiem wspomagającym, jeśli stosowane są codziennie, ale nie wykazują działania przy zastosowaniu krótkotrwałym. Leki immunosupresyjne (w wysokich dawkach) oraz niesteroidowe środki przeciwgorączkowe, są skuteczne jedynie odpowiednio przed leczeniem lubpo leczeniu.

Zatem, w oparciu o bliskie podobieństwo pomiędzy zastosowanymi modelami zwierzęcymi a odpowiadającymi im zaburzeniami u ludzi, oczywiste jest, że NaBPC157 charakteryzujące się właściwościami ochraniania błony śluzowej i może być stosowany do leczenia stanów chorobowych związanych z ostrymi zapaleniami oraz chronicznymi zapaleniami stawu lub stawów. Dodatkowo NaBPC157 może być stosowany w leczeniu chorób związanych z zaburzeniami nadwrażliwości typu opóźnionego oraz uszkodzeniami żołądkowo-jelitowymi wywołanymi w różnych częściach dróg pokarmowych, zwłaszcza tych, które są wywołane przez środki takie jak NSAIA.

Przykład 18

Działanie usuwające wolne rodniki

Materiały i metody:

Określono działanie ochronne NaBPC157 na wątrobę w porównaniu do standardów odniesienia takich jak bromokryptyna, amantadyna i somatostatyna w różnych doświadczalnych modelach uszkodzenia wątroby u szczurów: podwiązanie przez 24 godziny dróg żółciowych i tętnicy wątrobowej, powstrzymywanie napięcia przez 48 godzin oraz podawanie CCl4 (środek wywołujący powstawanie wolnych rodników). NaBPC157 podawano dojelitowo bądź dootrzewnowo.

Wyniki:

NaBPC157 znacząco zapobiegał rozwojowi martwicy wątroby lub zmianom tłuszczowym u szczurów, którym podwiązano przez 24 godziny drogi żółciowe i tętnicę wątrobową, w wyniku powstrzymywania napięcia przez 48 godzin oraz, którym podawano CCl4 (1 ml/kg dootrzewnowo, zabite 48 godzin po podaniu). Inne leki odniesienia wykazywały bądź niewielkie bądź nie wykazywały żadnego działania ochronnego na wątrobę w opisanych powyżej modelach. Badania laboratoryjne bilirubiny wykazały, że wartości SGOT i SGPT całkowicie pokrywają się z wynikami badań makro i mikroskopowych. Zatem, NaBPC157 może być stosowany w leczeniu chorób wątroby. Ponadto zahamowanie czynności szpiku, spowodowane przez napromieniowanie jest powtarzalnym modelem odpowiednim do badania dynamiki odzyskiwania zdrowia przez składniki hematopoezy. NaBPC157 wykazuje korzystne działanie na uszkodzenia szpiku kostnego spowodowane przez napromieniowanie subletalne.

Zatem, NaBPC157 może być stosowany do leczenia uszkodzeń szpiku kostnego spowodowanych przez napromieniowanie. Biorąc pod uwagę ogólnie uznawane powiązanie CCl4 z tworzeniem się wolnych rodników oraz rozwojem uszkodzeń, korzystne działanie NaBPC157, uważa się, że związek ten może być stosowanych do innych uszkodzeń organów, wywołanych wolnymi rodnikami, a w szczególności napromieniowaniem.

Przykład 19

Układ katecholaminergiczny

Leki sympatykomimetyczne działające niebezpośrednio, typu amfetaminy, mają wspólne właściwości, takie jak powodowanie zarówno wzrostu uwalniania katecholamin jak i zahamowania ponownego wychwytu katecholaminy (pierwotnie dopaminy) na zakończeniach nerwowych w centralnym układzie nerwowym (CUN). Stereotypowe zachowanie pojawia się w wyniku aktywacji układu dopaminergicznego w ciele prążkowanym. Ogólnie uważa się, że wzmożone zachowanie się polegające na wspinaniu wywołane amfetaminą powstaje w wyniku regulacji pozytywnej receptora dopaminy następującej po podaniu antagonisty dopaminy - haloperidolu. W następstwie, powoduje to rozwój nadwraż16

PL 193 790 B1 liwości na amfetaminę. Zastosowanie NaBPC157 nie wpływa na całkowite zachowanie ani nie indukuje powstawania stereotypów.

Materiały i metody

Badano wpływ NaBPC157 na stereotypy amfetaminy, agonisty dopaminy (10 mg/kg dootrzewnowo) oraz na pobudliwość. NaBPC157 podawano jako dodatkowe leczenie profilaktyczne lub w trybie podawania terapeutycznego (10 mg lub 10 ng/kg dootrzewnowo). Stereotypowe zachowanie i pobudliwość indukowano u szczurów.

Wyniki

Regularnie obserwowano znaczące osłabienie i odwrócenie (leki w maksimum zakłóceń amfetaminowych) zarówno zachowania stereotypowego jak i wzmożonej pobudliwości (to znaczy silniejsze i gwałtowne drgania, paniczne skakanie i ucieczka).

Następnie skoncentrowano się na wpływie NaBPC157 na wzrost, zachowania u myszy polegającego na wspinaniu się. Myszy były wstępnie poddane działaniu agonisty dopaminy haloperidolu (5,0 mg/kg dootrzewnowo), a następnie poddane działaniu amfetaminy (20 mg/kg dootrzewnowo test prowokacji 1, 2, 4 i 10 dnia po wstępnym podaniu haloperidolu), który zwykle jest wykorzystywany do badań nadwrażliwości behawioralnej na działanie stymulowane amfetaminą. Zatem, jeśli antagonizacja stereotypów amfetaminy mogłaby powstać w wyniku aktywności agonisty dopaminy (bezpośrednio lub pośrednio), badanego NaBPC157, to można spodziewać się wzmacniania wzrastającego wpływu haloperidolu na zachowanie wspinania się, wywołane amfetaminą. Zupełnie przeciwnie, zaobserwowano prawie całkowite przeciwdziałanie po łącznym podaniu NaBPC157 wraz z haloperidolem. Podsumowując, przedstawione wyniki wykazują, że zachodzi oddziaływanie NaBPC157 z układem dopaminowym. Ponadto oddziaływanie NaBPC157 z centralnym układem dopaminowym było również wykazane na innych modelach doświadczalnych (na przykład, ochrona przeciwko owrzodzeniu trawiennemu wywołanemu ostrym stresem). Oddziaływanie z układem dopaminowym było obserwowane w przypadku wielu znanych peptydów (neurotensyny, CCK, itp.). Dodatkowo, zastosowanie NaBPC157 odwraca również zakłócenia zachowania indukowane przez LSD (np. 0,3 mg/kg dootrzewnowo). NaBPC157 wykazuje działanie modulacyjne na układ dopaminowy. W stanach podwyższonego uwalniania i syntezy dopaminy indukowanych przez amfetaminę, NaBPC157 może zarówno zapobiegać, jak i odwracać następujące po tym zakłócenia (np. zachowania stereotypowe). Podobnie, NaBPC może znacząco osłabiać konsekwencje zablokowanie receptorów dopaminowych przez haloperidol. Wynik ten sugeruje, że działanie modulacyjne NaBPC157 obejmuje także podstawienie w innych przypadkach silnego niedoboru układu dopaminowego. Dzięki temu można uniknąć, występującej w następstwie, nadwrażliwości receptorów dopaminowych i powstawania zaburzeń amfetaminowych.

Zatem NaBPC157 jest skutecznym środkiem do leczenia schizofrenii, skutków prowokacji amfetaminą (formy schizofrenii, psychozy) i nadużywania leków.

P r z y k ł a d 20

Stres

Stres definiuje się jako zdarzenie niespecyficzne, prowadzące do uszkodzenia różnych organów. Odpowiedź stresową definiuje się jako odpowiedź skierowaną przeciwko różnym szkodliwym zdarzeniom. Jednym z najczęściej wykorzystywanych modeli zwierzęcych stresu jest model powstrzymywania napięcia prowadzący do poważnych uszkodzeń żołądkowych u szczurów. Inne organy mogą również być uszkodzone.

Materiały, metody i wyniki:

Podawanie NaBPC157 w dawkach po 10 mg lub 10 ng/kg masy ciała, dootrzewnowo lub dożołądkowo, 1 godzinę przed wywołaniem stresu, w dużej mierze zapobiegało nieodwracalnemu w innych przypadkach, rozwojowi ciężkich uszkodzeń gastrycznych. Jeśli czas pomiędzy podaniem środka zmniejszającego stres a wywołaniem stresu (w dalszym tekście określany jako „okres”) jest wydłużony, standardowy środek przeciwko owrzodzeniem staje się praktycznie nieskuteczny, co jest w znacznym stopniu przeciwne do oczywistej wydajności badanego NaBPC157. NaBPC157 zachowuje swoje uzdrawiające właściwości nawet po wyjątkowo wydłużonym okresie 48 godzin. Ochrona spowodowana przez NaBPC157 obejmuje zmniejszenie uszkodzeń pojawiających się regularnie w innych organach (np. wątrobie, nadnerczach, nerkach, jądrach, sercu, trzustce, śledzionie). Zatem, ze względu to, że inne, ogólnie znane parametry stresu są wyraźnie mniej zakłócone (to jest zanik fizjologiczny grasicy i układu limfatycznego oraz przerost nadnerczy) jest to oczywiste, że NaBPC157 może być stosowany w różnych stanach stresowych. NaBPC157 ma pozytywny wpływ zdrowotny na różne

PL 193 790 B1 uszkodzenia pojawiające się regularnie wróżnych organach, związane zniespecyficzną patologią stresu. Biorąc pod uwagę ten sam łańcuch zdarzeń u ludzi, jak wzastosowanych modelach zwierzęcych, jest to nawet bardziej widoczne, gdyż NaBPC157 wykazuje działanie uzdrawiające nawet jeśli został podany gdy choroba wwyniku stresu jest już zawansowana (na przykład 24 godziny po wywołaniu stresu).

Przykład 21

Wykazanie działania chroniącego komórkę

Działanie chroniące komórkę było pierwotnie definiowane jako możliwość obrony komórki przeciwko różnym szkodliwym czynnikom, szczególnie działaniewprzypadku błony śluzowej żołądka jako działanie niezależne od kwasu żołądkowego. Później, definicja ta została rozszerzona, tak, że obejmowała zasadniczo podobne właściwości ochraniania części zewnętrznej dróg żołądkowo-jelitowych, obejmując uszkodzenia różnych organów (działanie chroniące komórkę - działanie chroniące organ). Badano możliwe działania chroniące komórkę w wyniku podawania NaBPC157 woparciuoich skutek na wstępny model Robertsa przeszukiwania czynnikiem chroniącym komórkę uszkodzeń żołądkowych wywołanych etanolem.

Materiały, metodyiwyniki:

Podawane NaBPC157 (10 mg lub 10 ng/kg dootrzewnowo) wykazuje działanie profilaktyczne (stosowany zarówno 1 godzinę przed, lub równocześnie z96% etanolem (1 ml/szczura, dożołądkowo)) oraz działanie uzdrawiające (podawany 1 godzinę po podaniu etanolu przy najwyższym rozwoju uszkodzeń).

W celu stworzenia środowiska wolnego od kwasu dla prowadzenia badań działania chroniącego komórkę, wykonano całkowite wycięcie żołądka 24 godziny przed procedurą powodującą powstawanie wrzodu. W przypadku braku żołądka i kwasu żołądkowego, uszkadzające działanie cystaminy (400 mg/kg s.c., uśmiercenie zwierzęcia 24 godziny później), uważanej do tej pory za związany zkwasem żołądkowym środek powodujący wrzody dwunastnicy oraz działanie chroniące komórkę NaBPC157 (10 mg lub 10 ng/kg dootrzewnowo) były wdalszym ciągu prowokowane wporównaniu do środków odniesienia (cymetydyna (50), ranitydyna (10), omeprazol (10), bromokryptyna (10)i atropina (10) (wartości podano wmg/kg dootrzewnowo, 1 godzinę przed podaniem cystaminy)), znanych również jako środki chroniące komórkę. U szczurów nie stykających się dotądztymi bodźcami, mających nienaruszony żołądek, wszystkie zastosowane substancje wykazywały silne korzystne działanie. U zwierząt pozbawionych żołądka zastosowanie badanych środków (to jest NaBPC157 lub środków odniesienia, przed podaniem cystaminy) znacząco zapobiegały poważnym uszkodzeniom dwunastnicy, powstającym wprzypadku obserwowanych dla porównania szczurów kontrolnych, pozbawionych żołądka, którym podano cystaminę. W grupie nie poddanej działaniu cystaminy, nie stwierdzono żadnych uszkodzeń (laparotomia i wycięcie żołądka jedynie 24 godziny lub 48 godzin okresu pooperacyjnego) ani żadnego zwiększenia uszkodzeń nie zaobserwowano u zwierząt poddanych działaniu cystaminy ilaparotomii. Wyniki te (równy wpływ uszkadzający cystaminy, równe działanie ochronne NaBPC157 i środków odniesienia u szczurów, którym wycięto żołądki z nienaruszonym żołądkiem i bez żołądka, wpływ uszkadzający bądź ochraniający nie jest związany zwydzielaniem kwasów żołądkowych) wykazują działanie ochraniające komórkę. Analogia (uszkodzenia niezwiązane zkwasem żołądkowym) pomiędzy uszkodzeniami żołądka (np. etanolem), auszkodzeniami dwunastnicy pod wpływem cystaminy jest oczywiście sugerowana. Wysoka „pojemność ochronna komórki”, wyraźnie niezależna od kwasu, wspólna dla wszystkich badanych środków, lecz widoczne jest, że ewidentnie najbardziej skuteczny jest NaBPC157.

Ze względu na to, że NaBPC157 był skuteczniejszy wznacznie niższych dawkach, niż inne środki (to jest dawkach mg lub ng/kg względem mg/kg), jego skuteczność (i zastosowanie lecznicze) może być rozszerzona na różne uszkodzenia organów ciała pacjenta. Dzieje się tak dlatego, że skuteczność innych środków winnych organach jest również sugerowane ze względu na ich działanie ochraniające komórkę (na przykład somatostatyna: uszkodzenia nadnerczy, trzustki, wątroby, płuc i dróg pokarmowych).

Przykład 22

Wykazanie działania chroniącego organ ciała pacjenta

W korzystnym rozszerzeniu działania chroniącego komórkę na działanie chroniące organ badanie działania chroniącego śródbłonek jest ogólnie akceptowane. W celu wyraźnego wskazania, ogólnie rozpoznawane są badania Błękitu Monastral śródbłonka żołądka szczura uszkodzonej etanolem, ze względu na zdolność Błękitu Monastral wiązania sięzuszkodzonym śródbłonkiem.

PL 193 790 B1

Wszystkie szczury otrzymały błękit Monastral (BM) (Sigma Company, USA) (1,0 ml/kg masy ciała, dożylnie) 3 minuty przed podaniem etanolu i zwierzęta uśmiercano 1 minutę po poddaniu działaniu etanolu. NaBPC157 (10,0 mg/kg, dootrzewnowo) lub roztwór chlorku sodu (5,0 ml/kg, dootrzewnowo) podano 1 godzinę przed podaniem etanolu. Natychmiast po uśmierceniu zwierząt żołądek usunięto i uszkodzenia określano z pomocą bezstronnego obserwatora jak opisano uprzednio. Reprezentatywne fragmenty żołądka i dwunastnicy poddano dalszej analizie histologicznej. Uszkodzenie naczyniowe we wczesnym okresie (1 minuta po podaniu etanolu) określano przy użyciu techniki Błękitu Monastral. Gęstość powierzchniową wybarwionego śródbłonka określano TEM.

Wyniki

Silne zmniejszenie barwienia BM było zgodnie obserwowane w grupie zwierząt poddanej działaniu NaBPC157. Ponadto, nie zaobserwowano żadnych skutków ubocznych po podaniu NaBPC157. Nie zaobserwowano żadnego wpływu na różne parametry podstawowe oraz stwierdzono brak toksyczności, pomimo podawania wysokich dawek (na przykład g/kg masy ciała, dootrzewnowo).

Biorąc pod uwagę obecność w wielu organach tkanki śródbłonkowej z układem naczyniowym w ciele oraz ważną rolę ochrony śródbłonka w działaniach chronienia organu, NaBPC157 może być stosowany jako środek chroniący organ w przypadku różnych uszkodzeń organów ciała pacjenta.

P r zyk ł a d 23

Materiały i metody

NaBPC157 badano u szczurów jako środek chroniący lub leczniczy w stanach ostrego zapalenia trzustki (wywołanej podwiązaniem przewodów żółciowych). W tym samym czasie badano wpływ NaBPC157 na wspólnie rozwijające się uszkodzenia żołądka i dwunastnicy.

NaBPC157 (10 mg lub 10 ng/kg masy ciała, dootrzewnowo, dożołądkowo) podawano profilaktycznie 1 godzinę przed podwiązaniem, podczas gdy leczenie prowadzono jako podawanie raz dziennie 1 dzień po podwiązaniu (ostatni raz lek podano 24 godziny przed m uśmierceniem). Wpływ badano w odstępach dziennych do piątego dnia po podwiązaniu.

Wyniki:

W podawaniu przed podwiązaniem, otrzymano silną ochronę trzustki. Jeśli zastosowano w stanach już rozwiniętego, poważnego, ostrego zapalenia trzustki, zgodnie obserwowano oczywiste działanie uzdrawiające. Oszacowując pojawianie się martwicy, obrzęku, białych krwinek obojętnochłonnychi komórek jednojądrzastych, u szczurów, którym podano NaBPC157, zgodnie stwierdzono mniejszą martwicę, obrzęk i mniej białych krwinek obojętnochłonnych, lecz więcej komórek jednojądrzastych. W badaniach wartości amylazy surowiczej względem danych kontrolnych, zaobserwowano znacząco mniejszy wzrost wartości (NaBPC157 podawane przed podwiązaniem), jak i obniżenie danych, już podniesionych (NaBPC157 podawane leczniczo). Wraz z korzystnym działaniem leczniczym NaBPC157 na zapalenie trzustki, zaobserwowano pozytywny wpływ tego związku na uszkodzenie żołądka i dwunastnicy u szczurów, którym podwiązano drogi żółciowe, zarówno w przypadku podawania przed podwiązaniem, jak i po podwiązaniu. Podsumowując, NaBPC157 może być stosowane do leczenia ostrych zapaleń trzustki, wywierając dodatkowy pozytywny skutek na towarzyszące choroby żołądka i dwunastnicy.

P r zyk ł a d 24

Wpływ na kardiotoksyczność

Materiały i metody:

Doświadczenia prowadzono na szczurach odm. Albino Wistar i świnkach morskich odm. Hartley. Kardiotoksyczność indukowano podając roztwór chlorku baru (10 mg/kg, b.w.), dezypraminę (10 mg/kg) digitalinę (całkowita dawka 6,5 mg/ kg) i izoprenalinę (15 mg/kg) przez szyjną rurkę dożylną. Dodatkowo, doksorubicynę podawano w wielokrotnych dawkach (3 mg/kg podawana podskórnie, raz w tygodniu przez 13 tygodni) i w pojedynczych dawkach (7 mg/kg podawana dożylnie) i wywoływano kardiomiopatię. Kardiotoksyczność również indukowano stosując stres unieruchamiający jako niefarmakologiczne uszkodzenie mięśnia sercowego. NaBPC157 podawano jak przedstawiono poniżej:

1. Chlorek baru

a) wstępne podawanie środka (jedną godzinę wcześniej): NaBPC157 50 mg/kg, 10 mg/kg i 10 ng/kg, dootrzewnowo;

b) podawanie środka po uszkodzeniu (po 60 sekundach): NaBPC157 10 mg/kg i 10 ng/kg, dożylnie;

PL 193 790 B1

2. Dezypramina: podawanie NaBPC157 50 mg/kg i50 ng/kg, dootrzewnowo, jedną godzinę wcześniej;

3. Digitalina: podawanie NaBPC157 50 mg/kgi50 ng/kg, dożylniew15 minutowych odstępach;

4. Izoprenalina: podawanie NaBPC157 50 mg/kgi50 ng/kg, dożylnie, 15 minut wcześniej;

5. Stres unieruchomienia: podawanie NaBPC157 10 mg/kgi10 ng/kg, dootrzewnowo jednągodzinę wcześniej i natychmiast po związaniui24 oraz 48 godzin po unieruchomieniu;

6. (a) Chroniczna toksyczność doksorubicyny: podawanie NaBPC157 10 mg/kg i10 ng/kg, dootrzewnoworównocześniezdoksorabicyną;

(b) Ostra toksyczność doksorubicyny: podawanie NaBPC157 10 mg/kgi10 ng/kg, dootrzewnowo, jedną godzinę wcześniej niż doksorubinę.

W modelach arytmii przez cały czas uśpionym zwierzętom wykonywano elektrokardiogram. Co 15 sekund, lub kiedy pojawiło się zakłócenie rytmu, wykonywano bardziej szczegółowe pomiary przy 50 mm/s lub 100 mm/s. W innych modelach, elektrokardiogram wykonywano jednokrotnie lub wielokrotnie u zwierząt uśpionych na krótko, przy szybkości papieru 50 mm/s wbardziej szczegółowych pomiarach. Toksyczność doksorubicyny wyznaczano na podstawie badań makroskopowych imikroskopowych sercaiinnych organów przy pomocyanalizy biochemicznej. Podobne procedury zastosowano w badaniach ze stresem unieruchomienia.

Wyniki:

Stwierdzono działanie NaBPC157 przeciwko arytmiiwmodelu,wktórym arytmia została wywołana chlorkiem baru. W badaniach, wktórych NaBPC157 podawano przed wywołaniem arytmii, NaBPC157 opóźniał i zapobiegał pojawianiu się arytmii i zmniejszał i/lub zapobiegał niedokrwieniu. W badaniach, wktórych NaBPC157 podawano po wywołaniu choroby, NaBPC157 powodował gwałtowny powrót do rytmu zatokowegoizapobiegał pojawianiu się arytmii.

NaBPC157 całkowicie zapobiegał nagłemu wzrostowi częstości akcji serca oraz zakłóceniom przewodzenia wywołanym przez dezypraminę (wydłużenie PQ i rozszerzenie QRS). NaBPC157 również zapobiegał częstoskurczowi komorowemu związanemu zefektem wywoływania arytmii przez dezypraminę i poważnym blokiem przedsionkowo-komorowym. Efekt ten jest zależny od dawki.

Ponadto, NaBPC157 wykazywał selektywne działanie na kardiotoksyczność wywołaną digitaliną. NaBPC157 miał pozytywny wpływ na nagły wzrost częstości akcji serca izakłóceniom rytmu (skurcz dodatkowy komorowy, częstoskurcz komorowy iblok przedsionkowo-komorowy) poprzez zapobieganie im lub osłabianie ich. Wpływ NaBPC157wdawkach nanogramowych na opóźnianie przewodzenia inkubowanego przez toksyczne dawki digitaliny nie był znaczący. Wpływ ten był bardziej wyraźny w przypadku miligramowych dawek NaBPC157.

NaBPC157 wyraźnie zapobiegał niedokrwieniu izałamaniu pracy mięśnia sercowego. Wpływ ten był znacznie wyraźniejszy w przypadku miligramowych dawek NaBPC157. Pojedyncze podanie dootrzewnowe NaBPC157 w postaci środka zapobiegającego, wczasie testu stresu unieruchomieniem, umożliwiło zapobieżenie niedokrwieniu ihistologicznemuuszkodzeniu mięśnia sercowego, wykazanego przy pomocy elektrokardiogramu. Podawanie NaBPC157 po uszkodzeniu wprzypadku występujących już jawnych zmian elektrokardiograficznych również znosiło niedokrwienie. Mikrogramowe dawki NaBPC157 powodowały wzrost napięcia kompleksu QRS, zwłaszcza, jeśli NaBPC157 podano przed wystąpieniem uszkodzenia.

Podanie NaBPC157 prowadzi do znacząco obniżonych patomorfologicznych zmian kardiomiopatii antracyklinowej (poważne uszkodzenia włókien mięśniowych iścian naczyń oraz wakuolizacja) po pojedynczym i w większym stopniu, wielokrotnym podawaniu doksorubicyny. Aktywność LDH znacząco zmalała, pomimo znacznego wzrostu wartości bezwzględnych.

Podsumowując, udowodniono, że NaBPC157 może być stosowany jako środek znoszący arytmię serca, przeciwdusznicowy i odziałaniu chroniącym serce.

Przykład 25

Aktywność antydepresyjna

Materiały i metody:

Różne środki antydepresyjne wykazują aktywność przeciw owrzodzeniem oraz modele obecnie stosowane wbadaniach wrzodów idepresji mają znaczący stopień podobieństwa. Dlatego badano możliwość, że na choroby depresyjne mogłyby skutecznie oddziaływać pierwszorzędowe środki przeciw owrzodzeniom o aktywności chroniącej komórkę/organ, takie jak NaBPC157, stosując dwa typy doświadczeń na modelach depresyjnych szczura: test wymuszonego pływania (procedura Porsolta) isposób wywołania chronicznego nieprzewidywalnego stresu (po pięciu dniach przeprowadzania pro20

PL 193 790 B1 tokołu nieprzewidywalnego stresu, podawania leku raz dziennie podczas procedury wywoływania stresu i oszacowania testu unieruchomienia na otwartej przestrzeni czwartego i szóstego dnia przyjmowania leków).

Wyniki:

W teście wymuszonego pływania zmniejszenie czasu bezruchu u szczurów, którym podawano NaBPC157, (10 mg, 10 ng, 10 mg/kg, dootrzewnowo) odpowiadało aktywności zwierząt, którym podawano 15 mg lub 40 mg (dootrzewnowo) tradycyjnych środków antydepresyjnych, odpowiednio imipraminy lub nialamidu. Dalsze pogorszenie się warunków doświadczenia w przypadku procedury chronicznego, nieprzewidywalnego stresu prowadziło do utraty działania imipraminy (30 mg), podczas gdy NaBPC157 (10 mg, 10 ng) w zależności od dawki, poprawiało ruchliwość chronicznie stresowanych szczurów.

P r z y k ł a d 26

Wpływ na kardiotoksyczność

Materiały i metody:

Podawano środki wywołujące chorobę Parkinsona: 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyna (MPTP) (znane jako środki niszczące układ dopaminowy warstwy czarnej poprzez tworzenie wolnych rodników) (30,0 mg/kg masy ciała, dootrzewnowo raz dziennie przez 6 dni i po 4 dniach pojedyncza dawka 50 mg/kg masy ciała, dootrzewnowo) lub rezerpina (środek powodujący opróżnianie pęcherzyków katecholaminowych) (5,0 mg/kg masy ciała dootrzewnowo). NaBPC157 (1,50 mg lub 15,0 ng/kg masy ciała, dootrzewnowo) podawano 15 minut przed lub w innym badaniu 15 minut po każdym podaniu MPTP. W badaniach z użyciem rezerpiny, NaBPC157 (10,0 mg lub 10,0 ng/kg masy ciała, dootrzewnowo) podawano bądź 15 minut przed podaniem rezerpiny lub w stanie całkowitej, ustalonej już katalepsji, 24 godziny później.

Wyniki:

NaBPC157 silnie poprawiło orientację somatosensoryczną zakłóconą przez MPTP i zmniejszyło nadaktywność wywołaną MPTP. Ponadto NaBPC157 zmniejszyło nienormalną motorykę (drżenie, niedowład nerwicowy, katalepsję, objawy bardzo silne u zwierząt kontrolnych, którym podawano jedynie roztwór soli), prowadzącą do prawie całkowitego zniesienia przebiegu choroby normalnie prowadzącego do śmierci u zwierząt kontrolnych. W doświadczeniach z użyciem rezerpiny, NaBPC157 w dużej mierze zapobiegało rozwojowi bardzo poważnej katalepsji. Jeśli NaBPC157 podano 25 później, związek ten znosił objawy rozwiniętej katalepsji. Pomocniczo, zgodnie obserwowano zmniejszenie hipotermii wywołanej przez rezerpinę (wcześniejsze podanie NaBPC157) oraz zniesienie dalszego znacznego spadku temperatury (późniejsze podanie NaBPC157).

Obydwa opisane powyżej modele zwierzęce są znane jako orzekające dla ludzkich zakłóceń i leczenia tych zakłóceń. Ze względu na fakt, że wykazano wysoką skuteczność, zarówno w badaniach, w których NaBPC157 podawano przed wywołaniem uszkodzenia, jak i po wywołaniu uszkodzenia, stosując dawki mikrogramowe i nanogramowe, wydaje się, że NaBPC157 jest odpowiednim lekiem do leczenia choroby Parkinsona i chorób podobnych do choroby Parkinsona.

Ponadto, obserwowane działanie w przypadku hipotermii wywołanej przez rezerpinę umożliwia stwierdzenie, że NaBPC157 jest odpowiedni do leczenia zaburzeń temperaturowych.

P r z y k ł a d 27

Wpływ na uzdrawianie ubytków kostnych

Materiały i metody:

Wpływ osteogeniczny szpiku kostnego i TRIS-BPC157 na uzdrawianie ubytków odcinków kostnych badano u 42 królików przez sześć tygodni pooperacyjnych. W następstwie spowodowania uszkodzenia (po środku obu kości promieniowych utworzono ubytek kostny o wielkości 0,8 centymetra), stosując szpik kostny oraz TRIS-BPC157 doświadczenia przeprowadzono w następujący sposób: zwierzętom z uszkodzeniami podawano roztwór chlorku sodu (2 ml domięśniowo i 2 ml miejscowo do każdego ubytku kostnego) jako kontrolę (grupa 1). W drugiej i trzeciej grupie do każdego z ubytków kostnych wprowadzono lokalnie 2 ml szpiku kostnego pochodzącego z danego zwierzęcia (siódmego dnia po operacji) lub TRIS-BPC157 (10 mg/kg masy ciała siódmego i czternastego dnia po operacji). W grupach czwartej, piątej i szóstej TRIS-BpC157 podawano domięśniowo (i.m.) w dniu siódmym, dziewiątym, czternastym lub szesnastym po operacji (10 mg/kg masy ciała) lub raz dziennie okresie między siódmym a dwudziestym pierwszym dniem pooperacyjnych (10 mg lub 10 ng/kg masy ciała). Jako leczenie typowe stosowano natychmiast po utworzeniu ubytków kostnych w grupie siódmej ubytki te wypełniono przeszczepem korowym pochodzącym z danego zwierzęcia.

PL 193 790 B1

Zwierzęta uśmiercano w szóstym tygodniu po operacji. Wyzdrowienie ubytków odcinków kostnych szacowano przy wykonując zdjęcia rentgenowskie i badania histologiczne dwa razy w tygodniu.

Wyniki:

Jednoczesne porównanie zdjęć rentgenowskich wykonanych czterech odstępach czasowych (powierzchnia modeli, mikrofotodensytometria ubytków kostnych) i ilościowa histomorfometria ujawniła, że szpik kostny wstrzyknięty lokalnie do uszkodzenia kostnego i TRIS-BPC157 podany domięśniowo (szczególnie w dawkach dziennych 10 mg/kg masy ciała w czasie 14 dni) znacząco poprawiał wyleczenie kości (p < 0,001). Działanie to jest porównywalne do działania przeszczepu korowego z danego zwierzęcia.

Biorąc pod uwagę odniesienie medyczne powyższych badań, szpik kostny i TRIS-BPC157 (szczególnie w dawkach dziennych 10 mg/kg masy ciała w czasie 14 dni) powodują wyzdrowienie ubytków kostnych. Ze względu na prosty sposób podawania oraz niskie ryzyko powikłań, leczenie szpikiem kostnym od danego zwierzęcia podany miejscowo i, w szczególności, domięśniowe podanie substancji osteogenicznych takich, jak TRIS-BPC157 jest bardziej korzystne od bardziej skomplikowanych sposobów chirurgicznych (na przykład: przeszczepów kostnych, unaczynionych przeszczepów kostnych, metody Ilzarowa) w leczeniu upośledzeń zdrowienia u ludzi.

P r zyk ł a d 28

Wpływ na gojenie się ran

Materiały i metody:

NaBPC157 stosowano wcelu ustalenia wpływu tego związku na różne składniki związane z procesem powrotu do zdrowia. Uważa się, że składnikami najważniejszymi w procesie gojenia się ran są: tworzenie ziarnistości, tworzenie naczyń i produkcja kolagenu. Wpływ NaBPC157na tworzenie się ziarnistości, kolagenu i tworzenie się naczyń, jaki wzrastanie siły rozciągania badano stosując trzy szczurze modele doświadczalne: 1) rany skórne cięte, 2) zespolenia okrężnico-okrężnicze i 3) zespolenia przełykowo-dwunastnicze. Zwierzęta były badane histologicznie pod kątem kolagenu, naczyń krwionośnych i retikuliny przy zastosowaniu metod punktowania i morfometrycznych.

Wyniki:

We wszystkich doświadczeniach stwierdzono znaczące różnice między szczurami leczonymi NaBPC157 a szczurami z grupy kontrolnej. Doświadczenia wykazały silny, wspierający udział NaBPC157 w procesie powrotu do zdrowia. Efekty te osiągnięto poprzez różne reżimy podawania leku, obejmujące podawanie dożołądkowe i miejscowe. Ponadto, oszacowanie siły rozciągania zgodnie ujawnił wzrost wartości u szczurów, którym podawano NaBPC157.

W oparciu o bliskie podobieństwo pomiędzy modelami zwierzęcymi a odpowiadającymi im zaburzeniami u ludzi oraz wysoki stopień podobieństwa pomiędzy procesem powrotu do zdrowia u szczurów i ludzi, NaBPC157 może być stosowany jako lek ułatwiający gojenia się ran.

P r zyk ł a d 29

Wpływ na zaburzenia oddechowe

Materiały i metody:

W niniejszych doświadczeniach wykorzystywano świnki morskie (Hartley, obu płci, masa ciała 500 - 700 g) z pletyzmografią całego ciała, znieczulone uretanem (1,5 g/kg, dootrzewnowo), sztucznie wentylowane pod stałym ciśnieniem (0,98 kPa)i zwiotczeniem mięśni szkieletowych w wyniku podania suksametonium (0,2 mg/kg, dożylnie). Objętość wdechowej (mm, średnia ± odchylenie standardowe (SD) oszacowano przez i po podaniu środka wywołującego skurcze (histaminy, serotoniny, acetylocholiny, bradykininy, dożylnie) lub NaBPC157 (dożylnie, 10 minut przed kolejnym podaniem środka wywołującego skurcze).

Wyniki:

Zmniejszenie objętości wdechowej spowodowane przez serotoninę, histaminę, acetylocholinę i bradykininę zostało zahamowane przez NaBPC157 (10 mg/kg masy ciała, dożylnie i/lub 10 ng/kg masy ciała, dożylnie).

W oparciu o zaobserwowany wpływ leczniczy NaBPC157 na zwężenie oskrzeli wywołane różnymi środkami wywołującymi skurcze raz znane podobieństwo pomiędzy zastosowanymi modelami a stanami chorobowymi u ludzi, sprzyjające wyzdrowieniu dawkowanie NaPBC157 jest oczywiste w stosowaniu do leczenia różnych chorób związanych ze zwężeniem naczyń i/lub zaburzeniami dróg oddechowych.

PL 193 790 B1

P r zyk ł a d 30

Wpływ na zespół nadciśnienia płucnego

Materiały i metody:

Opisane poniżej doświadczenia przedstawiają wypływ agonistów i antagonistów tlenku azotu (NO) oraz wpływ NaBPC157 na rozwój zespołu nadciśnienia płucnego (z ang. Pulmonary Hypertension Syndrome PHS)i uszkodzeń tkankowych u piskląt. Przeprowadzono doświadczenia umożliwiające badanie toksyczności skumulowanej. Doświadczenia te obejmowały podawanie pojedynczej dawki roztworu NaCl (1 ml, dootrzewnowo), NaBPC157 (10 mg/kg masy ciała zwierzęcia), L-NAME (antagonista NO, dawki 50, 100, 150 mg/kg masy ciała) i L-argininy (agonista NO, 100 mg/kg masy ciała, wraz z ich połączeniami (L-NAME + NaBPC157, L-NAME + L-arginina)). Przeprowadzono badania patohistologiczne śledziony, serca, wątroby i płuc oraz analizy hematologiczne. Ponadto przeprowadzono doświadczenia, mające na celu badanie toksyczności skumulowanej. Codziennie przez pięć tygodni zwierzętom podawano dootrzewnowo L-NAME (10 mg/kg masy ciała), L-argininy (100 mg/kg masy ciała), NaBPC157 (10 mg/kg masy ciała) i ich połączeń (L-NAME + NaBPC157, L-NAME + L-arginina). Siedem zwierząt z każdej grupy, włączając grupę kontrolną (roztwór NaCl 1 ml, dootrzewnowo) uśmiercano każdego tygodnia.

Wyniki:

Zastosowanie L-NAME powodowało powstanie PHS u piskląt poddawanych działaniu tego związku. Działaniu temu zapobiegało równoczesne podanie L-argininy i NaBPC157. Badania patohistologiczne zarówno chronicznej, jaki skumulowanej toksyczności ujawniły, że L-NAME spowodowało poważne uszkodzenia tkankowe (martwica komórek mięśnia sercowego i wątroby oraz martwicę komórek limfoidalnych w śledzionie), podczas gdy L-arginina wywoływała przede wszystkim przekrwienie, obrzęk i krwotoki we wszystkich organach. Analizy hematologiczne wykazały znaczące obniżenie ilości hemoglobiny i leukocytów u grupy piskląt poddanych działaniu L-NAME. Skutki działania L-NAME były z powodzeniem zahamowane przez podanie L-argininy i NaBPC157. NaBPC157 nie powodował żadnych uszkodzeń tkanek lub organów.

Biorąc pod uwagę podobieństwo zastosowanych w opisanych powyżej badaniach modeli zwierzęcych i odpowiadających im zaburzeń u ludzi, NaBPC157 może być stosowane w leczeniu Zespołu nadciśnienia płucnego. Ponadto, oczywiste jest korzystne zastosowanie tego związku w hodowli komercyjnej.

P r zyk ł a d 31

Nadciśnienie doświadczalne.

Materiały, metody i wyniki:

U zwierząt cierpiących na nadciśnienie (nadciśnienie Goldblatta), posiadających dwie (2K1C) lub jedną nerkę. (1K1C) NaBPC157 powodowało szybkie obniżenie ciśnienia krwi (na przykład 5 lub 10 minut po wstrzyknięciu). Skutek ten trwał przez 20 minut u szczurów 1K1C lub przynajmniej 12 godzin u zwierząt 2K1C. Działanie to otrzymywano powtarzalnie po drugim lub trzecim podaniu związku 24 do 48 godzin później. Podobnie, u szczurów karmionych bądź fruktozą o wysokim stężeniu (80%) bądź dietą o podwyższonej zawartości soli (15%) przez dłuższy czas, NaBPC157 znacząco obniżał w innych przypadkach stale podniesione ciśnienie krwi, do wartości zbliżonych do wartości normalnych. Działanie lecznicze jest długotrwałe i nie stwierdzono pojawienia się tolerancji nawet o sześciomiesięcznym podawaniu. Nie zaobserwowano wpływu NaBPC157 na wartości podstawowe ciśnienia krwi.

Oprócz obniżenia w innych przypadkach stale podniesionego ciśnienia krwi, NaBPC157 również powodowało znaczące obniżenie lub nawet zniesienie uszkodzeń i zaburzeń normalnie pojawiających się w różnych organach, którymi były (po trzech tygodniach diety o podwyższonej zawartości soli u zwierząt kontrolnych): bardzo poważna degeneracja hialinowa z wydatnym krwotokiem miąższowym, degeneracja ścian tętnic, wakuolizacja komórek w sercu, poważne przekrwienie (szczególnie rdzenia) w nadnerczach, poważne przekrwienie, krwotok miąższowy z krwiomoczem w nerkach i hemosyderoza i fagocytoza erytrocytów w śledzionie. Naczynia były znacznie mniej uszkodzone u szczurów, którym podawano NaBPC157, oprócz zmniejszenia wakuolizacji ścian i braku krwotoków. Ponadto, ewidentna ochrona przeciwko uszkodzeniom dna była również zgodnie obserwowana u szczurów, którym podawano NaBPC157.

Stosując różne modele zwierzęce nadciśnienia, dzięki podawaniu NaBPC157 w dawkach 10 mg lub 10 ng/kg masy ciała, dożylnie, dootrzewnowo lub dożołądkowo, uzyskano zgodne wyniki przy różnych trybach dawkowania. Biorąc pod uwagę oczywiste podobieństwo tych modeli z odpowiednimi

PL 193 790 B1 stanami chorobowymi u ludzi, NaBPC157 może być stosowane do leczenia nadciśnieniai uszkodzeń różnych organów spowodowanych przez nadciśnienie.

Przykład 32

Wpływ na czas krwawienia

Materiałyimetody:

Badano skutek działania 2-AMP-BPC157 na czas krwawienia u myszy iszczurów (po lub bez wstępnego podania heparyny) w połączeniu z działaniem in vitro na parametry krzepnięcia krwi ludzkiej.

Wyniki:

W warunkach podstawowych (2-AMP-BPC157, 10 mg, 10 ng, 10 pg, 1 pg, 10 fg/kg masy ciała, dootrzewnowo, jednocześnie z obcięciem ogona) zgodnie wykazano zarówno u myszy, jaki u szczurów, silne skrócenie czasu krwawienia zależne od dawki. W badaniach obejmujących wstępne podanie heparyny (2 godziny przed zapoczątkowaniem krwawienia), obserwowano regularnie znaczące obniżenie, obserwowanego winnym przypadku wydłużonego czasu krwawienia u zwierząt, którym podano 2-AMP-BPC157wilości 10 mg lub 10 ng/kg masy ciała, dootrzewnowonie wykazano żadnego wpływu (2-AMP-BPC157 ostężeniu 10 (mg/ ml, czas inkubacji 1 godzina) na parametry krzepnięcia wprzypadku krwi ludzkiej in vitro.Zatem, sugeruje się działanie tego związku na warstwę śródbłonka.

Biorąc pod uwagę bliskie podobieństwo między mechanizmami krwawienia u ludzi izwierząt oraz ogólnie uznawane znaczenie modeli stosowanych do badania środków leczniczych, 2-AMPBPC157 może być stosowany do leczenia zaburzonego krzepnięcia (na przykład heparynizacji).

Przykład 33

Wpływ na cukrzycę doświadczalną

Materiały, metodyiwyniki:

Wykazano, że NaBPC157 po podaniu dootrzewnowym (dawka 10 mg/kg masy ciała) zapobiegało rozwojowi cukrzycy aloksanowej jak icukrzycy wywołanej podaniem streptozotocyny u szczurów. W ciągu 14 dni stwierdzono obniżenie cukromoczuimniej uszkodzeń wysepek. W naszych wstępnych doświadczeniach, NaBPC157 było również skuteczne, jeśli został podany w obecności rozwiniętej już 14-to dniowych uszkodzeń aloksanowych. W dalszych doświadczeniach, przeciwcukrzycowe działanie NaBPC157 było wdalszym ciągu badane ze szczególnym uwzględnieniem jego możliwej aktywności po podaniu dożołądkowo NaBPC157 (dawki 10 mg i 10 ng/kg masy ciała) połączono zpodawaniem aloksanu wilości 300 mg/kg, podskórnie, lub 200 mg/kg masy ciała, podskórnie. NaBPC157 podawano przed (24 godzin lub 1 godzinę przed podaniem aloksanu), równocześniei po (48 po podaniu aloksanu). Ogólnie NaBPC157 obniżało podniesiony poziom glukozywsurowicy oraz znacząco zwiększało przeżywalność u zwierząt, którym podano aloksan (działanie było szczególnie widoczne wgrupie zwierząt, którym podawano wyższe dawki aloksanu). Interesujące jest, że oprócz podnoszenia poziomuglukozy wsurowicy u zwierząt, którym podawano aloksan, zaobserwowano zwielokrotnione pojawianie się uszkodzeń żołądkowych u szczurów chorych na cukrzycę zgrupy kontrolnej. Każdy tryb podawania NaBPC157 powodował znaczące obniżenie dolegliwości wrzodowych, bez względu na warunki leczenia. Zasadniczo te same wyniki otrzymano u myszy.

Biorąc pod uwagę bliskie podobieństwo między chorobami ludzi a stosowanymi modelami zwierzęcymi oraz ze względu na ich szerokie stosowanie do badania aktywności środków leczniczych, NaBPC157 może być stosowany do leczenia cukrzycy

Przykład 34

Wpływ antynocyceptywne

Materiałyimetody:

Skutki aktywności antynocyceptywnej NaBPC157 wyznaczono porównując zdziałaniem standardowych odnośników: aspiryny imorfiny, stosując różne modele doświadczalne bezpośrednią/niebezpośrednią nocyceptywność i neurotoksyczność: wicie się (kwas octowy/siarczan magnezu), szczypanie ogona, gorący talerzi podawanie kapsaicyny.

Wyniki:

NaBPC157 (podawany zarówno w zakresach nanogramowych lub mikrogramowych na kilogram, dootrzewnowo) znacząco zredukował reakcje wbadaniach wicia się (zapalne i niezapalne, zależne od prostaglandyny i niezależne) i szczypania ogona. W badaniach typu gorący talerz, NaBPC157, przeciwnie do morfiny nie wykazywał żadnego działania u zdrowych zwierząt. Ponadto, NaBPC157 było podawane przed wywołaniem uszkodzenia lub raz dziennie przez 14 dni po wstrzyknięciu kapsaicyny. W badaniach NaBPC157 silnie obniżało alodynię wywołaną kapsaicyną. To obniżenie skutków działania kapsaicyny nie mogłoby być uzyskane, jeśli NaBPC157 było podane

PL 193 790 B1 w obecności rozwiniętej degeneracji neuronów somatosensorycznych pod wpływem kapsaicyny (podanie dopiero 14-tego dnia po podaniu kapsaicyny). Zatem, ze względu na nieuniknioną w innym przypadku nadmierną utratę neuronów somatosensorycznych wywołaną przez podanie kapsaicyny mogłoby być całkowicie uniknięte dzięki codziennemu podawaniu NaBPC157, możliwe jest, że działanie NaBPC157 może być związany szczególnie z integralnością neuronów somatosensorycznych wrażliwych na kapsaicynę i zich ochroną (to jest pierwotne neurony doprowadzające, mające małą średnicę ciała i włókna bez osłonki mielinowej (C-) lubz cienką osłonką mielinową (A-8)).

Biorąc pod uwagę, że kapsaicyna może wywoływać zasadniczo takie same zaburzenia, zarówno u ludzi jak i u zwierząt, NaBPC157 może być stosowany do leczenia różnych zaburzeń bólowych jak i stanów chorobowych powstających w wyniku uszkodzenia funkcjonowania neuronów somatosensorycznych.

P r z y k ł a d 35

Wpływ na drgawki

Materiały i metody:

Badano działanie KBPC157 na drgawki wywołane przez bikukulinę, pikrotoksynę, strychninę i izoniazyd. KBPC157 (100 mg, 10 mg lub 10 ng/kg masy ciała) podawano (dootrzewnowo) równocześnie lub 15 minut przed podaniem środków wywołujących drgawki (mg/kg masy ciała, dootrzewnowo) pikrotoksyny (3), strychniny (6, 3 lub 1,5), bikukuliny (2,5) i izoniazydu (800 mg).

Wyniki:

KBPC157 powodowało zgodnie pozytywne działanie przeciwdrgawkowe (w zależności od dawki i czasu), przeciwko wszystkim zastosowanym środkom wywołującym drgawki. Biorąc pod uwagę podobieństwo między zastosowanymi modelami a stanami chorobowymi u ludzi, KBPC157 może być stosowany do leczenia zaburzeń drgawkowych.

P r z y k ł a d 36

Uszkodzenia rdzenia kręgowego

Materiały i metody:

Uszkodzenia rdzenia kręgowego wywoływano u szczurów odmiany Albino Wistar przy pomocy kontrolowanego ciśnienia (zacisk naczyniowy Aesulap 0,010 - 0,15 N) na odsłonięty rdzeń kręgowy (na poziomie Th12) przez 30 sekund. Natychmiast po uszkodzeniu i raz dziennie, do dziesiątego dnia po uszkodzeniu zwierzętom podawano NaBPC157 (10 mg, 10 ng/kg masy ciała, dootrzewnowo) lub roztwór NaCl. Zwierzęta uśmiercano 24 godziny po ostatnim podaniu leku.

Wyniki

Staranne badania prowadzono zarówno klinicznie (oszacowywanie codzienne, wynik 1-5), jak i mikroskopowo. Badania ujawniły silne osłabienie paraliżu występującego w przypadku zwierząt kontrolnych po zastosowaniu NaBPC157. Biorąc pod uwagę podobieństwo między zastosowanymi modelami a stanami chorobowymi u ludzi, NaBPC157 może być stosowany do leczenia uszkodzeń rdzenia kręgowego.

P r z y k ł a d 37

Chroniczne zatrucie alkoholowe

Materiały i metody:

Badano działanie NaBPC157 na chroniczne zatrucie alkoholowe. Do przeprowadzonych doświadczeń używano samców szczurów Albino Wistar. Szczury piły bądź dostępną w handlu whiskey lub etanol (10 - 20% roztwór wodny) przez trzy miesiące. Podawanie NaBPC157 (10 mg, 10 ng/kg masy ciała), propranololu (10 mg/kg masy ciała) i ranitydyny (10 mg/kg masy ciała) (szczury z grupy kontrolnej otrzymywały taką samą objętość roztworu NaCl 5,0 ml/kg), dootrzewnowo lub dootrzewnowo, prowadzono bądź jako profilaktykę (10 dni przed rozpoczęciem podawania alkoholu), bądź jako leczenie równoległe, równocześnie z alkoholem lub leczniczo (rozpoczynając podawanie pod koniec okresu dwóch miesięcy, to jest podczas ostatniego miesiąca doświadczenia).

Wyniki:

Bezpośrednie oszacowanie ciśnienia krwi w żyle wrotnej jasno wykazało, że NaBPC157, jak i propranolol (podawany wg dowolnej procedury), znacząco zapobiegały i/lub obniżały podniesione ciśnienie krwi wrotnej, obserwowane u szczurów z grupy kontrolnej. Przeciwnie, leczenie ranidyniną prowadziło nawet do podwyższenia wartości ciśnienia krwi wrotnej, niż obserwowanych u zwierząt w grupie kontrolnej. Ponadto, NaBPC157, w większym stopniu niż propranolol był w stanie u zwierząt poddawanych działaniu alkoholu, znacząco zmniejszać rozległe uszkodzenia żołądka obserwowane u

PL 193 790 B1 innych zwierząt doświadczalnych. Podobne pozytywne działanie obserwowano również wprzypadku innych uszkodzeń organów (na przykładwnerkachi sercu).

Biorąc pod uwagę, tezgodne, pozytywne działaniei ogólnie znane dowody, że podniesiony poziom przyjmowania alkoholu powoduje podobne zmiany u ludzi jak iu zwierząt, jasne jest, że NaBPC157 może być stosowany do leczenia uszkodzeń wywołanych alkoholem.

Przykład 38

Działanie na zaburzenia związanez niedokrwieniem mózgu

Materiałyimetody:

NaBPC157 (10 mg lub 10 ng/kg masy ciała, dootrzewnowo) lub roztwór NaCl (5,0 ml/kg masy ciała, dootrzewnowo) podawano bądź jedną godzinę przed lub 1 godzinę po tym, jakobie tętnice szyjne podwiązano przez 3 do 6 godzin u szczurów.

Wyniki:

Silne działanie lecznicze NaBPC157 było widoczne zarówno u zwierząt, którym podano ten związek przed uszkodzeniem (1 godzinę przed podwiązaniem), jak ipo uszkodzeniu (1 godzinę po podwiązaniu). Działanie to stwierdzono we wszystkich zakresach dawek: mikrogramowych i nanogramowych oraz po podwiązaniu na 3 i 6 godzin. Oprócz wartości ocenionych wpunktach, poważne obrzęki okołonaczyniowe i obrzęki tkanek mózgu z przekrwieniem mózgu, były najbardziej wyróżniającymi się i charakterystycznymi objawami. Zaobserwowano również powierzchnie demielinizacji, zwłaszcza wmóżdżku. Wszystkie te właściwości były znacznie mniej wyraźne u zwierząt, którym podawano NaBPC157, bez względu na sposób leczenia.

Biorąc pod uwagę poważne uszkodzenia wwyniku niedokrwienia u zwierząt zgrupy kontrolnej i wyraźne podobieństwo pomiędzy uszkodzeniami u szczurówi u ludzi, ewidentne jest, korzystne stosowanie NaBPC157 do leczenia u ludzi uszkodzeń związanychzniedokrwieniem.

Przykład 39

Wpływ na uszkodzenie nerwu

Materiałyimetody:

Badano wpływ NaBPC157 na regenerację nerwów obwodowych. U dorosłych samców szczurów Wistar (225 - 250 g), odsłonięte prawy nerw kulszowy, usunięto tkankę łączną i przecięto 5 cm, dystalnie do wcięcia kulszowego. Trzy szwy okołonerwowe (10,0 Ethilon, Ethicon) zastosowano, aby zapewnić anastomozęowłaściwym podwiązaniu pęczkowym. Zwierzętom podawano bądź miejscowo poprzez kąpiel miejsca anastomozy w1 ml NaBPC157 (2 mg/ml lub 2 ng/ml), dootrzewnowo lub dootrzewnowo (10 mg lub 10 ng/kg masy ciała) natychmiast po utworzeniu anastomozy. Zwierzętom zgrupy kontrolnej podawano taką samą ilość wodnego roztworu NaCl. W wyznaczonych dniach po operacji (dni 3, 6, 9, 12i 30), przeprowadzono próby funkcjonalne. Próby te obejmowały próby ciepłej wody (60°C), próby zimnej wody (2°C), analizę drogi chodzenia, EMG okresu utajnienia dystalnego oraz amplitudę CMAP. Pobierano również próbki do analizy histologicznej imorfometrycznej. W innych doświadczeniach, stosując te same procedury chirurgiczne ite same miejsca nerwu, wywołano uszkodzenie zmiażdżenia przy pomocy mikrochirurgicznych kleszczy przez 60 sekund i miejscowo podano NaBPC157. Oszacowanie prowadzono po 2, 7,10, 50i 100 dniach.

Wyniki:

Wyznaczono zarówno klinicznie, jak imikroskopowo, że podanie NaBPC157, zwłaszcza we wczesnym okresie, znacząco poprawia gojenie się szczurów, u których spowodowano uszkodzenie.

Biorąc pod uwagę bliskie podobieństwo pomiędzy uszkodzeniem u zwierząt astanami chorobowymi u ludzi, NaBPC157 może być stosowane do leczenia u ludzi uszkodzeń nerwu obwodowego.

Przykład 40

Wpływ na zaburzenia neuroleptyczne

Badano wpływ NaBPC157 na różne zaburzenia wywołane środkami neuroleptycznych.

Materiały, metodyiwyniki:

Podawanie NaBPC157 (10 mg lub 10 ng/kg masy ciała, dootrzewnowo) konsekwentnie obniżało katalepsję wywołaną haloperidolem i flufenazyną (haloperidol 0,625; 1,25; 2,5 i10,0 mg/kg masy ciała, dootrzewnowo, flufenazyna 0,3125; 0,625; 2,5 i 5,0 mg/kg masy ciała, dootrzewnowo (4,0 ml/kg)) przy niższych dawkach obu środków powodujących neurolepsję następujących po sobie przedziałach czasowych. Oprócz działania leczniczego na uszkodzenia wywołane przez niższe dawki środków neuroleptycznych, nawet silniejsze korzystne działanie przeciwkataleptyczne NaBPC157 obserwowano przy wyższych dawkach obu środków neuroleptycznych, zarówno wprzypadku mikrogramowych i nanogramowych dawek NaPBC157. Działanie to było również obserwowane wprzypadku somato26

PL 193 790 B1 sensorycznie orientowanych zwierząt, którym podawano sulpirydynę (20, 40, 80, 160 mg/kg masy ciała, dootrzewnowo), jednakże nie zaobserwowano żadnych objawów katalepsji u myszy z grupy kontrolnej, którym podawano sulpirydynę.

Widoczne są korzyści podawania NaBPC157 w leczeniu chorób związanych z układami dopaminowymi, zaburzeniami kataleptycznymi i zaburzeniami neuroleptycznymi.

P r zyk ł a d 41

Podawanie w leczeniu wstrząsu

Materiały i metody:

Doświadczalny wstrząs krwotoczny badano u uśpionych szczurów (rurki w tętnicy szyjnej wspólnej oraz wżyle szyjnej). Usuwanie krwi przy kontrolowanej objętości prowadzono do momentu śmierci zwierzęcia lub ustalenia się niskiego ciśnienia krwi (30 - 35 mm Hg). W tych doświadczeniach dootrzewnowo podawano BaBPC157 (10 mg lub 10 ng/kg masy ciała) lub roztwór wodny NaCl (5,0 ml/kg) 15 minut przed krwawieniem lub dożylnie (3,0 ml/kg) po czasie 5 minut od ustalenia się niskiego ciśnienia krwi.

Wyniki:

W zależności od wartości kontrolnych, zgodnie obserwowano, że utrata znacząco większej objętości krwi prowadziła do śmierci (efekt ten zależał od dawki związku) u zwierząt leczonych CaBPC157. U zwierząt o zmniejszonej objętości krwi krążącej i o obniżonym ciśnieniu krwi, którym podawano CaBPC157, wykazano natychmiastowe i długotrwałe znaczące podwyższenie ciśnienia krwi, nie prowadzące do śmierci. Wynik ten znacznie różni się od wyniku w grupie kontrolnej, gdzie otrzymano krótki i słaby wzrostu ciśnienia krwi i 75% współczynnik śmiertelności przed zakończeniem 45-cio minutowego doświadczenia. U szczurów, które poddano jedynie zabiegowi chirurgicznemu po uśpieniu, lecz nie pozbawione życia, podanie CaBPC157 (dootrzewnowo lub dożylnie) po 65 minutach okresu stabilizacji nie wpłynęło znacząco na wartości ciśnienia krwi tętniczej, wtym samym czasie po podaniu. Dane te sugerują, że CaBPC157 może być skuteczne w polepszaniu konsekwencji dużej utraty objętości krwi. Biorąc pod uwagę wyraźne podobieństwo pomiędzy zastosowanymi modelami zwierzęcymi a chorobami u ludzi, CaBPC157 może być stosowana w terapii wstrząsu.

P r zyk ł a d 42

Wpływ na nieprawidłowe limfocyty

Materiały, metody i wyniki:

Badano stwierdzone zmiany immunologiczne u dwóch pacjentek cierpiących na rzadkie kliniczne jednostki chorobowe - dziedziczną eozynofilię związaną z śródnaskórkowym pęcherzowym zapaleniem skóry i podostrym stwardnieniowym zapaleniem mózgu. Egzaminowano działanie NaBPC157 (in vitro) na limfocytowe aberracje chromosomowe i proliferację limfocytów T. NaBPC157 wywoływał znaczące zmniejszenie poważnych typów aberracji chromosomowej (to znaczy stwierdzone normalne limfocyty) i wykazywał działanie stymulujące na cykle mitotyczne.

P r zyk ł a d 43

Działanie na wady rozwojowe

Materiały i metody:

Badano wpływ NaBPC157 na wady rozwojowe spowodowane witaminą A u myszy. NaBPC157 (10 ng/kg masy ciała lub 10 mg/kg masy ciała, dootrzewnowo) lub roztwór wodny NaCl (5 ml/kg masy ciała, dootrzewnowo) podawano równocześnie z witaminą A (15 700 IU/kg masy ciała, i.m.) dziesiątego dnia ciąży. Myszy, którym nie podawano witaminy A, lecz otrzymywały roztwór wodny NaCl wtych samych dawkach, wtym samym czasie, były stosowane jako kontrola.

Wyniki:

Wiele wad rozwojowych było wywołanych podawaniem witaminy A. Znaczące zmniejszenie ilości wad rozwojowych było obserwowanych w grupach zwierząt, którym podawano NaBPC157. Korzyści uzyskane w wyniku podawania NaBPC157 w leczeniu zaburzeń płodowych są widoczne.

P r zyk ł a d 44

Wycięcie jajników

Materiały i metody:

Przeprowadzono tradycyjne wycięcie jajników. NaBPC157 podawano (10 mg lub 10 ng/kg masy ciała, dootrzewnowo), bądź raz dziennie przez 28 dni, bądź raz dziennie przez 14 dni, rozpoczynając od piętnastego dnia po wycięciu jajników. Regularnie w przedłużonym trybie podawania, ostatnie podanie NaBPC157 miało miejsce 24 godziny przed uśmierceniem zwierzęcia. Zwierzęta z innych grup otrzymywały pojedynczą dawkę miligramową piętnastego dnia po wycięciu jajników. Pięć grup

PL 193 790 B1 zastosowano jako kontrole: zwierzętom z2 grup wycięto jajniki, podawano roztwór NaCl, anastępnie uśmiercono 14-tegoi28-ego dnia po wycięciu jajników, zwierzętaz1grupy nie były poddane wycięciu jajników, jedynie podawano im roztwór NaCl, adwie grupy zwierząt niepoddanych wycięciu jajników, były leczone NaBPC157 (10 mg lub 10 ng/kg masy ciała, dootrzewnowo) raz dziennie przez 28 dni. Wymazy śluzówki pochwy pobrano od każdego zwierzęcia 5 minut przed operacją, 9, 14 i28 dnia doświadczenia iwybarwiano Pap wcelu zbadania cytologicznego. Stopień dojrzałości śródbłonka pochwy wyrażano jako średnie wartości dojrzałości. Po uśmierceniu zwierząt, kości kończyn pobrano od każdego zwierzęciawcelu biomechanicznego badania, jak pokrótce opisano poniżej.

Badanie biomechaniczne:

Wszystkie kości sprawdzono w zależności od momentu zgięcia (jeden punkt zgięcia) (moment zgięcia = Nm) wróżnych kierunkach, przednim, tylnim ibocznym. Kości udowa i piszczelowa były wykorzystywane wtym doświadczeniu. Odległe końce kości były utrwalone zużyciem cementu kostnego (Palacos) w metalowych rurkach o długości 1 cm. Metalowe rurki umieszczono wukładzie obciążeniowym. Kości stale utrzymywano wilgotne. Mierzono długość wolnej części kości, jak idługość od części umocowanej do części obciążonej. Doświadczenie wykonywano według zasady zginającego się kija, umocowanego z jednego końca, wgranicach elastyczności. Obciążenie wynosiło 0,1; 0,2; 0,5; 0,7; 1,0 N. Zdeformowanie lub kąt zgięcia zmierzono jako kąt odchylenia wiązki laserowej, która została załamana przez małe lusterko umieszczone na końcu kości. Masa lusterka została dodana do zastosowanej siły zgięcia. Papier milimetrowy, na który wiązka laserowa była kierowana był odległy około 1,5 - 1,8 m od kości zzamocowanym małym lusterkiem. Kąt deformacji mierzono stosując metody trygonometryczne. Podczas każdego pojedynczego obciążenia, mierzono długość trwania deformacji (i następującego po niej powrotu do normalnego wyglądu). Po zdjęciu obciążenia, kość powróciła do pozycji wyjściowej, wykazując, żewkości nie zaszły żadne zmiany strukturalne i, że obciążanie byłowzakresie granic elastyczności według diagramu Hooka. Te obserwacje wykazały, że możliwe było obciążenie tej samej kości dwukrotnie wróżnych kierunkach, bez powodowania zmian jej struktury. Jeśli nie stwierdzono dodatkowych deformacji wczasie dwóch następnych minut, lub jeśli uzyskano dodatkowy powrót do normalnego wyglądu, punkty te były uważane za końcowe (ogólnie, czas pomiaru wynosił w przybliżeniu 30 sekund (zwierzęta kontrolne, pozbawiona jajników) lub 16 minut (zwierzęta zdrowe)). Deformacja kątowa kości (obciążeniowa lub poobciążeniowe dochodzenie do pozycji wyjściowej) podawanowmm/sek.

Wyniki:

Podawanie codzienne obu dawek NaBPC157 prowadziło do zauważalnego zwiększenia wartości dojrzałości wporównaniu z zanikowymi zmniejszonymi wartościami dojrzałości stwierdzonymi u szczurów nieleczonych. Zatem, sugeruje się, że NaBPC157 może zapobiegać zanikowi pochwy u szczurów spowodowanemu kastracją.

W grupach kontrolnych, pozbawionych jajników, stwierdzono najniższe wartości amplitudy zginania przy najkrótszym czasie, jakinajniższe amplitudy powrotów do zdrowia. Takie same niskie wartości otrzymano wobu grupach kontrolnych, wktórych zwierzęta uśmiercano 15-tego lub 28-ego dnia). Pozytywne tendencje obserwowano wgrupie, która otrzymała pojedynczą mikrogramową dawkę NaBPC157, 15-tego dnia po wycięciu jajników. Znacząco lepsze wyniki otrzymywano we wszystkich innych grupach leczonych NaBPC157, zarówno wilościach nano- jak i mikrogramowych. Najlepsze wyniki otrzymano wgrupie, która otrzymywała NaBPC157 wdawkach mikrogramowych codziennie przez 28 dni. Wszystkie parametry u zwierząt pozbawionych jajników były widocznie lepsze oraz poziom poprawy zbliżał się do wartości otrzymanych wgrupach zwierząt zdrowych. Nie stwierdzono różnic pomiędzy zdrowymi szczurami, bez względu na to czy podawano im roztwór wodny NaCl czy NaBPC157 (dawki nano-lub mikrogramowe).

Biorąc pod uwagę ogólnie uznawane znaczenie zastosowanych modeli zwierzęcych dla stanów po wycięciu jajników u ludzi zarówno na zanik pochwowy jak i rozwój osteoporozy, widoczne jest, że NaBPC157może być stosowanywterapii wycięcia jajników.

Przykład 45

Nowotwory

Materiały, metodyiwyniki:

Jednym ze zwykle stosowanych modeli doświadczalnych nowotworu obejmuje oszacowywanie liczby przerzutów raka i czerniaka B-16 u myszy. Podobnie jak różne modele doświadczalnych nowotworów, wymienione powyżej doświadczalne nowotwory wykazują znaczące podobieństwo do zaburzeń obserwowanych u ludzi. Wykazano, że zastosowane według różnych protokołów, NaBPC157,

PL 193 790 B1 zmniejsza ilość przerzutów u myszy leczonych względem odpowiadających im zwierząt kontrolnych. Nowotwór wodobrzuszny Ehrlicha (EAT) jest nowotworem, który może rosnąć we wszystkich rasach myszy. Może on rosnąć w wodobrzuszu lub w postaci stałej, w zależności od sposobu, wjaki komórki nowotworowe zostały wprowadzone. Mimo, że ogólnie nowotworowe modele zwierzęce jedynie częściowo mają podobne właściwości jak choroby u ludzi, to zastosowanie tego modelu zostało ogólnie zaakceptowane, ze względu na jego możliwą użyteczność jeśli stosuje się je do badań środków przeciwnowotworowych.

Przeżycie (dni) myszy zaszczepionych komórkami nowotworu wodobrzusznego Ehricha było najczęściej ograniczone do mniej niż 25 dni. Wcześniejsza inkubacja komórek nowotworowych z NaBPC157 prowadziła do wydłużenia życia zwierząt, którym wszczepiono komórki nowotworowe. Ponad 99% zwierząt przeżyło do końca 45-cio dniowego okresu obserwacyjnego. Ponadto różne leki cytostatyczne indukujące neutrofenię u pacjentów, jak i u zwierząt doświadczalnych. Cyklofosfamid jest tradycyjnie stosowanym środkiem do wywoływania neutrofenii. Podawanie cyklofosfamidu (180 mg/kg, dootrzewnowo) indukuje znaczące zaburzenia. NaBPC157 zapobiegało neutrofenii, zmniejszało ilość retikulocytów i poprawiało wartości hemoglobiny.

W rezultacie, przeciwnowotworowa skuteczność NaBPC157 jest widoczna. Biorąc pod uwagę wyraźne podobieństwo modeli zwierzęcych i stanów chorobowych u ludzi oraz korzystne działanie otrzymane zarówno w doświadczeniach in vitro, jak i in vivo, NaBPC157 może być stosowany w terapii przeciwnowotworowej. NaBPC157 jest odpowiednie do osłabiania działań cytostatycznych.

P r zyk ł a d 46

Aktywność przeciwwirusowa

Materiały i metody:

Wirusy ARBO (kleszczowe zapalenie mózgu, Bhania, Dengue 1, 2, 3, 4, Sinbis, Zachodni Nil, Ealovo), zapalenia wątroby A, limfatycznego zapalenia opon i splotów naczyniowych, opryszczki typu 1 podano i.c. (lub wirusy zapalenia wątroby - po operacyjnie) jako zawiesiny wirusów w rozcieńczeniu 10-2 (0,02 ml/mysz). NaBPC157 (20 mg/kg masy ciała) lub 0,9% NaCl (0,02 ml/mysz) podawano i.c.

lub dootrzewnowo a) w trybie podawania przed zaszczepieniem wirusów, b) równocześnie z podaniem zawiesiny wirusów lub c) 4 dni po infekcji w obecności rozwiniętych objawów choroby.

Wyniki:

Obserwowano znaczne opóźnienie pojawienia się objawów choroby i następującej śmierci (występującej u zwierząt kontrolnych regularnie 4-tego i 5-tego dnia po infekcji) po równoczesnym podaniu NaBPC157 z wirusami. Jeśli związek ten podano w obecności poważnego obrazu choroby, znaczące przedłużenie czasu przeżycia było konsekwentnie obserwowane. Wyraźny był całkowity brak zarówno objawów, jaki następującej śmierci po wcześniejszemu podaniu NaBPC157.

W celu sprawdzenia otrzymanych wyników, badano również wirulencję zastosowanych zawiesin wirusów (zainfekowano wirusem ARBO) poprzez zaszczepienie zawiesinami otrzymanymi z mózgu myszy, które uprzednio były leczone NaBPC157 lub roztworem NaCl i odpowiednio przeżyły (NaBPC157) (pomimo wprowadzenia wirusa) lub spontanicznie zmarły (roztwór NaCl). Inaczej niż u myszy zaszczepionych zawiesiną mózgową z myszy, którym podawano roztwór NaCl (które nie różniły się od myszy zaszczepionych zawiesiną wirusową, którym podawano roztwór NaCl) nie stwierdzono objawów choroby lub śmierci u myszy zaszczepionych zawiesiną mózgową myszy leczonych NaBPC157. Myszy obserwowano przez 50 dni od momentu zaszczepienia zawiesiną mózgową.

Na korzystne działanie NaBPC157 nie miała wpływu inkubacja w podniesionej temperaturze (56°C przez 30 minut).

Biorąc pod uwagę, że wymienione wirusy powodują podobne zaburzenia u ludzi, NaBPC157 może być stosowany w leczeniu chorób wirusowych, zwłaszcza w leczeniu, w którym ogólne stany są znacznie upośledzone (na przykład AIDSi stany chorobowe związane z AIDS).

P r zyk ł a d 47

Uszkodzenia jelitowe

Materiały i metody:

Badano działanie NaBPC157 (10 mg lub 10 ng/kg dootrzewnowo, dożołądkowo) u szczurów w porównaniu z kilkoma standardowymi odnośnikami w kilku różnych doświadczalnych modelach owrzodzeń (48 godzinny utrzymujący się stres, podanie podskórne cystaminy, próba dożołądkowego podawania 96% etanolu, uszkodzenia NSAIA, DNFB (dinitrofluorobenzen), zapalenie przełyku z zarzucania treści żołądkowej następująca po nim zespolenie przełykowo-czcze końcowo-boczne) (podawanie przed uszkodzeniem lub po).

PL 193 790 B1

Wyniki

Jedynie reżimy podawania NaBPC157 były konsekwentnie skuteczne we wszystkich badanych modelach. Bromokryptyna, amatadyna, famotydyna, cymetydyna i somatostatyna były nieskuteczne (przy stałym stresie) lub jedynie częściowo skuteczne (bromokryptyna, uszkodzenia jelitowe wywołane przez DNFB, sukralfat, ranitydynę, cholestyraminę i zapalenie przełyku z zarzucania treści żołądkowej). Biorąc pod uwagę peptydy odnośnikowe, ochronę w zależności od dawki (cystamina) i/lub częściowo pozytywne działanie (związane z leczeniem stanów chorobowych) (etanol) otrzymywano stosując glukagon, NPY i sekretynę, podczas gdy CCK/26-30/ były nieskuteczne.

Biorąc pod uwagę, że wszystkie wymienione modele zwierzęce były stosowane do badania środków obecnie stosowanych w terapii uszkodzeń żołądkowo-jelitowych i zgodny korzystny wpływ NaBPC157, zatem widoczne jest korzystne zastosowanie tego związku w leczeniu uszkodzeń dróg pokarmowych w całości.

Przykład 48

Wpływ na zaburzenia poznawcze.

Materiały i Metody:

Zastosowanie środków antycholinergicznych (skopolaminy, atropiny, 10 mg/kg masy ciała, dootrzewnowo) prowadziło do znacznych braków poznawczych u szczurów, które to stwierdzenie zpowodzeniem powtarzające oszacowanie zachowania zwierząt w wodnym labiryncie T przez wydłużony okres.

Wyniki:

W odniesieniu do kontroli, zwiększona ilość pomyłek może być z łatwością wykazana u szczurów, którym podano skopolaminę lub atropinę. Te braki poznawcze zostały zniesione (otrzymane wartości były równe wartościom kontrolnym) dzięki następującemu jednoczesnemu podaniu NaBPC157 (10 mg lub 10 ng/kg masy ciała, dootrzewnowo).

Biorąc pod uwagę szeroko implikowane znaczenie wymienionych modeli dla ludzkich zaburzeń funkcji poznawczych, widoczne jest, że NaBPC157 może być korzystnie stosowane w leczeniu chorób poznawczych.

Przykład 49

Wpływ na zaburzenia wycofania

Materiały, metody i wyniki:

NaPBC157 wykazywało działanie przeciwdrgawkowe oddziałujący z układem GABAergicznym i zwiększoną skuteczność diazepamu, jeśli związki te podawane są razem (10 mg/kg, 10 ng/kg, dootrzewnowo) z diazepamem (5,0 mg/kg, dootrzewnowo, dwa razy dziennie przez 10 dni). NaBPC157 osłabiał tolerancję na diazepam i opóźniał działanie wycofania oraz zależność fizyczną. W testach tolerancji czterdzieści dwie godziny po trybie uwarunkowywania, obserwowano krótsze przeddrgawkowe okresy utajenia, niż te u zdrowych myszy następujące po podaniu izoniazydu (800 mg/ml), jeśli diazepam (5,0 mg/kg, dootrzewnowo) podano ponownie myszy, którą wcześniej uwarunkowywano jedynie diazepamem. Całkowicie tego uniknięto u zwierząt, które uwarunkowano NaBPC157 (obie dawki) i diazepam. W doświadczeniach uzależnienia fizycznego (oszacowanego 6, 14, 42i72 godzin po podawaniu uwarunkowującym) obserwowano krótsze przeddrgawkowe okresy utajenia u myszy uwarunkowywanych diazepamem, niż u zdrowych myszy nie uwarunkowanych, w następstwie podawania izonidu czterdzieści dwie i siedemdziesiąt dwie godziny po podawaniu uwarunkowującym. NaBPC157 (dawka 10 mg/kg) połączona z diazepamem opóźniała to działanie do momentu ostatniej obserwowanej przerwy. W grupie tej, przy sześciogodzinnych przerwach, inaczej niż u myszy uwarunkowywanych diazepamem, przeddrgawkowe okresy utajenia były nadal dłuższe niż odpowiadające im wartości kontrolne. NaBPC157 nie powoduje powstawania tolerancji.

Biorąc pod uwagę znaczenie wymienionych modeli dla chorób ludzi, widoczne jest, że NaBPC157 może być korzystnie stosowany w leczeniu zaburzeń wycofania.

Przykład 50

Wpływ na zaburzenia nerek

Materiały i metody:

Podawanie zwierzętom doświadczalnym chlorku rtęci (1 mg/kg, dożylnie) lub cysplatyny (10 mg/kg, podane podskórnie) wytwarza ostry stan niewydolności nerek. Jeśli stan niewydolności nerek został wywołany wten sposób, to ma on silne korelacje z odpowiadającymi mu zaburzeniami u ludzi. W rezultacie, uszkodzenia wywołane u szczurów mają znacząco wysoki stopień podobieństwa z odpowiadającym im uszkodzeniom u ludzi.

PL 193 790 B1

Wyniki:

NaBPC157 znacząco obniżało uszkodzenia u szczurów, wobu stanach: podawania przed poddaniem zwierzęcia działaniu środków uszkadzających i po podaniu tych środków. Jednostronne wycięcie nerki powodowało znaczące przeciążanie funkcjonalne oraz przerost czynnościowy pozostałej nerki. Zatem, w zakresie teorii funkcjonalnej przerostu wyrównawczego nerki, wyniki te silnie podkreślają poprawę funkcjonowania pozostałej nerki. Dodatkowe badania biochemiczne również popierają ten wniosek. Dodatkowo, wyniki te są całkowicie zgodne z działaniem uzyskanym u szczurów nadciśnieniowych, mających zwężone tętnice nerkowe i/lub wyciętą jedną nerkę. Korzystne działanie NaBPC157 w leczeniu zaburzeń nerek jest oczywiste.

Przykład 51

Komórkowa odpowiedź immunologiczna limfocytów krwi obwodowej

Badano komórkowe odpowiedzi immunologiczne limfocytów krwi obwodowej na BPC u pacjentów z grupy kontrolnej i u pacjentów cierpiących na różne choroby wymienione w tabeli 2. Odpowiedzi immunologiczne limfocytów T krwi obwodowej na BPC badano stosując metodę opisaną przez deSmeta i wsp., (deSmet MDi wsp, w „Cellular immune responses of patients with uveitis to retinal antigens and their fragments” Am.J.Ophtal., 110:135-142, 1990) na 7-mio dniowych hodowlach komórkowych. Komórki inkubowano bez antygenu oraz w obecności 20 mg/l antygenu (BPC157 petadekapeptydu). Dla każdego pacjenta obliczano współczynnik pobudzania, dzieląc średnie wartości zliczeń kultur stymulowanych antygenem przez średnie zliczenia kontrolnych kultur komórkowych, do których nie dodawano antygenu to jest BPC157 pentadekapeptydu. Wyniki przedstawiono w tabeli 2.

Wartości kontrolne mniejsze lub równe 2, mierzone w grupie kontrolnej (tabela 2), odpowiadały wartościom uzyskanym przez innych badaczy dla peptydów o podobnej masie cząsteczkowej, to jest nie zaobserwowano żadnego pobudzania limfocytów krwi obwodowej przez BPC157 pentadekapeptyd w grupie kontrolnej. U pacjentów cierpiących na inne choroby, zaznaczone odpowiedzi komórkowe na BPC zaprezentowano w tabeli 2, w której wykazano ogólnoustrojowe pobudzenie limfocytów na peptyd soku żołądkowego. Wyniki te jasno wskazują na obecność zaburzeń związanych zBPC u pacjentów cierpiących na zdecydowanie inne choroby. Sugeruje to podawanie środków związanych zBPC (na przykład soli pentadekapeptydu BPC 157) w leczeniu immunomodulacyjnym odpowiednich zaburzeń.

Tabel a 2

Współczynniki podwyższonego pobudzania limfocytów Tzkrwi obwodowej u11 pacjentów, cierpiących na różne choroby.

Choroba	Płeć	Współczynnik pobudzania Wartości kontrolne < 2
Wrzód trawienny	K	26,28
Stwardnienie rozsiane	K	13,80
Podostre stwardnieniowe ogólne zapalenie mózgu	K	2,54
Zapalenie nerwu wzrokowego	M	3,54
Zapalenie nerwu wzrokowego	K	9,53
Zapalenie błony naczyniowej oka	K	16,87
Zapalenie błony naczyniowej oka	M	15,21
Zapalenie błony naczyniowej oka	K	22,30
Surowiczo-ujemna choroba stawów kręgosłupowych	K	4,99
Dziedziczna eozynofilia i pęcherzowe zapalenie skóry	K	2,70
Zapalenie błony naczyniowej oka	K	4,75

Wyniki opisanych powyżej badań farmakologicznych wykazują korzystne działanie soli peptydów BPC, polegające na ochronie organizmu przeciwko stresowi i chorobom oraz ogólnie na przywraPL 193 790 B1 caniu do normalności funkcjonowania organizmu. Sole peptydów będące przedmiotem wynalazku są również skuteczne w zapobieganiu i leczeniu wielu chorób i zaburzeń u ludzi i/lub zwierząt.

Claims (15)

1. Nowa sól peptydu BPC, w której anion soli stanowi peptyd o ładunku ujemnym zawierający od 8 do 15 reszt aminokwasowych, przy czym peptyd zawiera element strukturalny sekwencji określony ogólnym wzorem (I):

[Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala]^{(-) lub (2-)}, w którym

Xaa oznacza obojętną alifatyczną resztę aminokwasową, Yaa oznacza zasadową resztę aminokwasową oraz Zaa oznacza kwasową resztę aminokwasową, zaś kation soli jest kationem nieorganicznej lub organicznej, nietoksycznej zasady.

2. Sól według zastrz. 1, znamienna tym, że kation jest wybrany spośród kationu metalu alkalicznego, metalu ziem alkalicznych, Zn²⁺, aminy pierwszorzędowej, drugorzędowej, i trzeciorzędowej, a zwłaszcza spośród Na⁺, K⁺, Li⁺, Cs⁺, Ca²⁺, NH⁴⁺, kationu trietanolamoniowego, cykloheksyloamoniowego, 2-AMP⁺ (2-amino-1-propanol) lub TRIS⁺ (tris-(hydroksymetylo)-aminometan).

3. Sól według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że Xaa oznacza Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle lub Nva; Yaa oznacza Lys, Arg, Orn lub His; zaś Zaa oznacza Glu, Asp, Aad lub Apm.

4. Sól według zastrz. 3, zamienna tym, że zawiera ponadto farmakologicznie lub diagnostycznie dopuszczalny nośnik.

5. Sól według zastrz. 1 albo 2, albo 4, zamienna tym, że zawiera ponadto trehalozę.

6. Sól według zastrz. 5, o wzorze ogólnym:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 5 10 15

7. Sól według zastrz. 1 albo 2, albo 4, albo 6, znamienna tym, że peptyd wybrany jest z następującej grupy związków:

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp.Ala Leu Gly Val;

5 10 15

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val;

5 10 15

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val;

5 10 15

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val;

5 10 14

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Val

5 10 14

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala;

5 8

Asp Pro Pro Pro Ile Arg Pro Ala Asp;

5 9

PL 193 790 B1

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp;

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val;

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp oraz Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asn.

8. Sól według zastrz. 7, znamienna tym, że peptyd ma postać pierścieniową, a zwłaszcza z pierścieniem zamkniętym wiązaniem amidowym pomiędzy pierwszą a ostatnią resztą aminokwasową.

9. Sól według zastrz. 1 albo 2, albo 4, albo 6, albo 8, znamienna tym, że sól jest rozpuszczona w roztworze wodnym lub wodno-alkoholowym, korzystnie o pH między 6,0 a 8,5.

10. Kompozycja farmaceutyczna, stabilna w trakcie przechowywania, zawierająca dopuszczalny farmakologicznie nośnik, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość soli peptydu BPC określonej w zastrz. 1.

11. Kompozycja farmaceutyczna do podawania doustnego według zastrz. 10, znamienna tym, że dodatkowo zawiera trehalozę.

12. Kompozycja diagnostyczna, stabilna w trakcie przechowywania, znamienna tym, że zawiera skuteczną diagnostycznie ilość soli peptydu BPC określonej w zastrz. 1.

13. Zastosowanie soli peptydu określonego w zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, stabilnej w trakcie przechowywania, do leczenia zaburzeń związanych z tworzeniem się tlenku azotu (NO) lub z nieprawidłowym funkcjonowaniem układów związanych zNO, a w szczególności do leczenia nadciśnienia, dusznicy bolesnej, impotencji, wstrząsu krążeniowego i septycznego, porażeń, zapaleń, zespołu zaburzeń oddechowych, zlepiania się i agregacji płytek krwi i leukocytów, zaburzeń czynności śródbłonka, uszkodzeń żołądkowo-jelitowych, zaburzeń perystaltyki, cukrzycy, zapalenia trzustki, niedociśnienia i choroby Parkinsona; zaburzeń czynności lub nadczynności nerwów somatosensorycznych, w szczególności neuropatii czuciowej, nerwobólu poopryszczkowego, atopowego zapalenia skóry, nieprawidłowego zdrowienia uszkodzonej tkanki, nabytej pokrzywki wywołanej przez zimno lub ciepło, łuszczycy, pęcherzowego pemfigoidu, wyprysku, dermatoz wywołanych światłem, chronicznego zapalenia stawów, uszkodzeń żołądkowo-jelitowych oraz specyficznej lub niespecyficznej zbyt dużej aktywności górnych i dolnych dróg oddechowych (astmy, nieżytów górnych dróg oddechowych); zaburzeń śródbłonkowych, ran, owrzodzeń; stanów związanych z ostrymi i/lub chronicznymi zapaleniami, w szczególności chronicznych zapaleń stawów i chorób związanych z opóźnioną nadwrażliwością oraz uszkodzeń żołądkowo-jelitowych; chorób wątroby, uszkodzeń organów spowodowanych przez wolne rodniki, zwłaszcza spowodowanych przez napromieniowanie; chorób związanych z zaburzeniami układu katecholaminergicznego, w szczególności schizofrenii, wpływu prowokacji amfetaminą, nadużywania leków; stanów związanych ze stresem; ostrych zapaleń trzustki z dodatkowym pozytywnym wpływem na towarzyszące zapaleniom żołądka i dwunastnicy patologie; zaburzeń sercowych; zaburzeń depresyjnych; choroby Parkinsona i w patologiach chorób podobnych do choroby Parkinsona; zaburzeń temperaturowych; upośledzeń kostnych; uszkodzeń różnych organów indukowanych nadciśnieniem; zakłóceń koagulacji; zakłóceń bólowych; zakłóceń drgawkowych; uszkodzeń rdzenia kręgowego, uszkodzeń spowodowanych alkoholem, wywołanych nadużywaniem alkoholu lub zwiększonym pobieraniem alkoholu; chorób niedokrwistości mózgu; uszkodzenia nerwu obwodowego; chorób kataleptycznych i zakłóceń neuroleptycznych; chorób związanych z nienormalnymi lub zmutowanymi limfocytami; zakłóceń płodowych; atrofii pochwowej i rozwoju osteoporozy spowodowanego przez stany związane z wycięciem jajników; nowotworów; chorób wirusowych, w szczególności AIDS lub ARC, uszkodzeń żołądkowo-jelitowych i chorób poznawczych; uszkodzeń związanych z wycofaniem leku, zakłóceń pracy nerek i zakłóceń w odpowiedzi immunologicznej komórki.

PL 193 790 B1

14. Zastosowanie soli peptydu BPC określonej w zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej określonej w zastrz. 10, o właściwościach ochronnych w stosunku do komórek oraz narządów.

15. Sposób otrzymywania soli peptydu BPC określonej w zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jeden peptyd BPC miesza się w roztworze wodnym bądź wodno-alkoholowym zco najmniej jedną zasadą, otrzymując sól peptydu BPC, w której kation soli jest kationem nieorganicznej lub organicznej, nietoksycznej zasady.