BG64023B1 - Врс пептидни соли с органозащитна активност, метод за получаването им и използването им в медицината - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до нови фармацевтични състави, приложими при лечението на различни заболявания при хора и животни. Те съдържат един или повече пептиди.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до нови форми за приложение на синтетични ВРС пептиди (телесно защитни съединения), включващи 8 до 15 аминокиселинни остатъци с молекулно тегло от 900 до 1600 Da, които имат органозащитна активност, до методи за получаването им и до използването им в диагностиката и терапията.

Предшестващо състояние на техниката

Известни са протеини и пептиди, приложими при лечението на различни заболявания при хора и животни. Много от тези средства се получават in vivo и могат да се екстрахират от животни или хора, за да се получат фармацевтични състави. Примери за фармацевтично приложими протеини или пептиди са инсулин, еритропоетин, ВМР, интерферони и т.н. Друг пример е протеин от стомашен сок с мукозна защитна активност, който е изолиран и наречен ВРС.

В WO 92/04368 е описан ВРС, проявяващ телесно-защитна активност, с молекулно тегло около 40 000 Da, неговото получаване и употреба. WO 93/24521 и WO 94/11394 описват ВРС пептиди с органозащитна активност от същия тип на изходния протеин ВРС. Sikiric et al., Digestive Diseases and Sciences, 41 (1996)7, 1518-1526 описва пентадекапептид ВРС 157, който проявява, когато се разтвори във вода и физиологичен разтвор, лечебен и профилактичен ефект при акутен панкреатит и едновременно гастродуоденални увреждания при плъхове.

ВРС пептидите са известни с широкото си фармацевтично приложение. Физикохимичната стабилност на тези пептиди обаче, например в нормален физиологичен разтвор, не е задоволителна. Нещо повече, приложението на ВРС пептиди, по-специално чрез инжектиране на воден разтвор или в нормален физиологичен разтвор предизвиква болка и/или некрози.

Добре известни са солите на протеините и пептидите. Известно е, например от Bertrand, М. et al., Journal of Peptide Research, 49 (1997), 269 - 272, че ефектите на различните соли са много селективни с оглед на стабилността и структурата на пептидите. Прибавянето на моновалентни катиони като NH₄* в краен 0.1 М пептид (poly(Glu-Leu)) разтвор, предизвиква преминаване към водноразтворима β структура. За разлика от това не се наблюдава преминаване, когато се използват Li*, Na* или Cs* йони.

Ролята на повърхностнодостъпните йонни двойки в протеиновата стабилност е била изследвана чрез определяне на ефектите от прибавени соли (KCI, MgCl₂ и LaCl₃) при неутрален и кисел pH върху стабилността на новоочертаните двуверижни α-навити спирали. Резултатите показват, че прибавената сол може да има комплексни ефекти върху стабилността на протеина, включващи допринасяне за стабилизирането или дестабилизирането, при което мрежестият ефект зависи от характера на заредените остатъци и йонните взаимодействия, присъстващи в протеина (Kohn et al., Journal of Molecular Biology, 267 (1997)4, 1039-1052).

Предишни изследвания на моделни пептиди също са показали, че слоеви мостове, разположени при i,i +4 в продължение на пептидната верига са по-стабилизиращи от тези, които са разположени при i,i+ 3, като се предпочита подреждането да е киселина-база, а не база-киселина от N- към С-терминалите. Понастоящем не е известно, дали повърхностните солеви мостове имат силен стабилизиращ ефект върху природната структура на протеините (Berger et al., Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, 14 (1996)3, 285-291).

Така свойствата на пептидните соли по отношение на тяхната стабилност, структура и функция зависят много от конкретните йони, включени при образуване на дадената сол и от други външни и вътрешни фактори. Понастоящем не може да се предвиди какви свойства може да има дадена специфична сол на конкретен пептид.

Техническият проблем, изтъкнат в настоящото изобретение, е да се осигури ВРС пептиди в по-стабилна форма и диагностициращ и/ или фармацевтичен състав, включващ ВРС пептиди с подобрена стабилност и най-малко същата фармацевтична активност, проявявана от самите ВРС пептиди. Задача на настоящо то изобретение е да се осигури фармацевтичен състав, който преодолява горните недостатъци, по-специално позволяващ безболезненото инжектиране на ВРС пептидите.

Техническа същност на изобретението

Изобретението разрешава тези проблеми чрез осигуряването на ВРС пептидни соли и фармацевтичен или диагностичен състав, включващ фармацевтично или диагностично ефективно количество от соли на ВРС пептиди, в които анионът на солта е отрицателно натоварен пептид, включващ 8 до 15 аминокиселини, с молекулно тегло 900 до 1600 Da и с обща формула I.

[Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala]^{< )K}™ ^<2’’ в която Xaa е неутрален алифатен аминокиселинен остатък, по-специално Ala, ЬА1а, Leu, lie, Gly, Vai. Nle или Nva,

Yaa е базичен аминокиселинен остатък, по-конкретно Lys, Arg, Om или His и

Zaa е киселинен аминокиселинен остатък, по-специално Glu, Asp. Aad или Apm и в която катионът на солта е катион на неорганична или органична нетоксична и фармацевтично приемлива база. По-конкретно катионът на солта е алкален или алкалоземен метал, например Na⁺, К⁺, Li⁺, Cs²⁺, Са²⁴ или друг метал като Zn²⁺, или първичен, вторичен или третичен амин или органично съединение, като NH/, триетаноламин*, циклохексиламин*,

2-АМР* (2-амино-1-пропанол) или TRIS* (трис(хидроксиметил)-аминометан), доколкото тези катиони са физиологично приемливи.

Изненадващо ВРС пептидните соли от настоящото изобретение показват най-малко същата фармацевтична активност както ВРС пептидите и в допълнение имат значително повишена физикохимична стабилност в сравнение със свободните ВРС пептиди или ацетатите на ВРС пептидите. Използваният съгласно изобретението катион не повлиява на активността на ВРС пептидите, но повишава тяхната стабилност. ВРС пептидните соли от изобретението са например по-стабилни от ВРС пептидите или ВРС пептидните ацетати в нормален физиолдгичен разтвор или във вода. Нещо повече, солите от изобретението са много подходящи за перорално приложение и не проявяват нежелани странични ефекти като болка или некроза през време или след приложение, по-специално чрез инжектиране. ВРС пептидните соли от изобретението поради това позволяват подобрено вътрешно и парентерално приложение. Освен това солите от настоящото изобретение са много подходящи поради отсъствието на каквато и да е токсичност до дози 50 mg/kg телесно тегло.

Солите от изобретението могат да се получат чрез разтваряне на свободен ВРС пептид във воден или водно-алкохолен разтворител или в други подходящи разтворители с подходяща база и след това изолиране на получената сол от изобретението чрез изпаряване на разтвора чрез замразяване и лиофилизиране или чрез прибавяне на друг разтворител, например диетилов етер, към водния и/или алкохолен разтвор на ВРС пептидната сол, с което се предизвиква отделянето на неразтворимата сурова сол. За образуване на сол, обикновено се използва 1 или максимално 2 mol от базата, т.е.катиона, и 1 mol от свободния ВРС пептид. За получаването на алкални ВРС пептидни соли за предпочитане се използват алкални карбонати или хидрогенкарбонати. Получените пептидни соли са свободно разтворими във вода. Изобретението се отнася също така и до метод за получаване на ВРС пептидни соли.

В описанието на настоящото изобретение база означава вещество, способно да образува катион в разтвор, по-специално във воден и водно-алкохолен разтвор.

В контекста на настоящото изобретение, фармацевтична активност включва профилактична и лечебна активност. Съответно фармацевтичен състав се отнася до състав, проявяващ профилактична и/или лечебна активност.

Освен това изобретението се отнася до фармацевтичен или диагностичен състав, включващ ВРС пептидните соли от изобретението, евентуално заедно с един или повече фармацевтично приемливи носители, както и методи за получаването на тези състави. Тези състави са подходящи за външно и системно приложение, например под формата на инжекционни разтвори, таблетки, кремове, капсули, мазила, лосиони, форми за смучене и т.н. Дозировката, приложена системно, е с предпочитане в граници 10’⁵ до IO’² mg/kg телесно тегло, или външно в по-високи концентрации между 0.1 и 0.5%. Определянето на оптималната доза за конкретно лечение е в компетентността на специалистите от областта.

Изобретението се отнася също така до фармацевтичен или диагностичен състав, който в допълнение на едната или повече ВРС пептидни соли от изобретението съдържа трехалоза, по-специално при приложение през устата и/или фармацевтични или диагностични приемливи носители, разредители и/или други добавки.

Съставът, по-специално водноразтворимият състав от изобретението, може в допълнение към ВРС пептидната сол да съдържа още водноразтворим протеин, който може да се инжектира в телесните течности, без да показва каквато и да е съществена фармакологична активност в използваната в една единична дозираща форма концентрация от настоящото изобретение (по-надолу означен като “водноразтворим протеин”). Като такъв водноразтворим протеин се предпочитат водноразтворим протеин, серумен албумин, глобулин, колаген и/или желатин. Този протеин може да се добави в количество, обичайно използвано в инжекционни фармацевтични състави. Така например тегловното съотношение между водноразтворимия протеин и ВРС пептида е около 0.0001:1 до 100:1, за предпочитане 0.001:1 до около 10:1 или най-добре около 0.01 :1 д около 1:1.

Изобретението се отнася също така до самите гореописани ВРС пептидни соли и до съдържащи ги състави, по-специално в изсушена и/или чиста форма или във воден или водно-алкохолен разтвор. pH на разтвор, получен от водноразтворимия състав или от пептидна сол от настоящото изобретение трябва да бъде такъв, че да не повлиява неблагоприятно върху фармакологичната активност на пептида, но да е в приемливи граници за инжектиране и освен това този pH да не предизвиква голяма промяна във вискозитета на разтвора, нито да предизвиква образуването на преципитат. Така разтворът трябва да има pH на стойност около 6 до 9, по-добре 6.5 до 7.5.

Когато водноразтворимият състав от изобретението се превърне във воден разтвор за прилагане, концентрацията на фармакологично активната пептидна сол в този разтвор трябва да бъде около 0.0000001 до 10% (т/о), по-добре около 0.000001 до 5% (т/о).

Съставът от изобретението за предпочитане може да бъде в дозиращи единични форми, съдържащи фармакологично активна ВРС пептидна сол от изобретението и при необходимост и други добавки като гореспоменатия водноразтворим протнеин. Така например, две или трите споменати по-горе състави се поставят в ампула или флакон чрез разтварянето или суспендирането им в стерилна вода или стерилен физиологичен разтвор. В този случай методът на получаване може да се състои в разбъркване на разтвор на фармакологично активна ВРС пептидна сол и след това, ако е необходимо, с разтвор на добавката или прибавяне на добавката в прахообразна форма към разтвора на фармакологично активната ВРС пептидна сол или да се използва друга комбинация на подходящи начини на работа. Дозиращата форма може също да се приготви чрез прибавяне на стерилна вода или стерилен физиологичен разтвор към лиофилизиран или вакуумно изсушен продукт, в който фармацевтично активната ВРС пептидна сол или, ако е необходимо, добавките са събрани заедно. Тези единична дозираща форма може да съдържа една или повече обичайни добавки като средства, коригиращи pH (например глицин, хлороводородна киселина, натриев хидроксид), локални анестетици (например ксилокаин хидрохлорид, хлоробутанол), изотонисиращи средства (например натриев хлорид, манитол, сорбитол), емулгатори, инхибитори на адсорбцията (например Tween® 60 или 80), талк, нишесте лактоза и трагакант, магнезиев стеарат, глицерол, пропиленгликол, консерванти, бензил алкохол, метилхидрокси бензоат и/или хидрирано фъстъчено масло. Единичната дозираща форма може освен това да съдържа фармацевтично приемливи пълнители като полиетиленгликол 400 или декстран.

Водноразтворимият състав от изобретението, за предпочитане е под формата на препарат за парентерално приложение. Като парентерални формулировки се предпочитат инжекционни разтвори, разтвори за мускулно приложение, разтвори за прилагане през носа и в очите.

Тези инжекционни разтвори включват разтвори за венозно, подкожно, артериално, мускулно приложение и за приложение в очите. Тези продължително действащи препарати могат лесно да се изтеглят от ампули или флакони в спринцовки. Ако се образуват мехурчета при изтеглянето, те лесно се елиминират при престояване за кратко време.

Съставите от настоящото изобретение могат да са във форма на разтвор във вода или в лиофилизирана форма с кристално разтворимо вещество като манитол. При прибавяне то на стерилна вода или на стерилен физиологичен разтвор към лиофилизатите се получава воден разтвор.

Тоничността на воден разтвор на водноразтворимия състав съгласно изобретението трябва да бъде при прилагане в границите на поносимостта и се наглася например с изотонизиращи средства, като натриев хлорид и манитол. Тоничността е за предпочитане от половината до два пъти по-висока от тази на физиологичен солев разтвор, по-добре от 3/4 до 1 1/2 пъти по-висока от тази на физиологичния разтвор.

Вискозитетът на воден разтвор на водноразтворимия състав съгласно изобретението трябва да бъде достатъчно нисък, за да може да бъде инжектиран. Предпочита се вискозитетът да е по-нисък от 500 cP, по-добре понисък от 400 cP. Стойностите за вискозитет отговарят на тези, измерени при използване на Cone LD в тип Е вискозиметър (TOKIMEC, Japan) при 25°С.

Когато съставът е под формата на лиофилизат, предпочита се вискозитетът, тоничността и концентрациите на съставките в получения от състава воден разтвор да са в границите на по-горе посочените стойности.

Съставът от настоящото изобретение се получава чрез смесване на съставките по обичайния метод. Целта на смесване на съставките на състава трябва да бъде запазването на активността на фармакологично активната ВРС сол и да се сведе до минимум образуването на мехурчета по време на получаването. Съставките се поставят в съд (например бутилка или барабан) или едновременно или последователно. Атмосферата в съда може да бъде примерно стерилночист въздух или стерилночист азотен газ. Полученият разтвор може да се прехвърли в малки ампули или флакони и след това те могат да се подложат на лиофилизация.

Течната форма или лиофилизираната прахообразна форма на състава от настоящето изобретение могат да се разтворят или диспергират в разтвор на биоразграждащ се полимер като поли(млечнокисел-гликолов) киселинен съполимер, поли(хидроксимаслено киселинен), поли (хидроксимаслен-гликолов) киселинен съполимер или смес от тях и те могат да се формулират примерно като филм, микрокапсули (микросфери) или нанокапсули (наносфери), по-специално под формата на меки или твърди капсули.

В допълнение съставът от изобретение то, капсулиран в липозоми, включващи фосфолипиди, холестерол или производните им може след това да се диспергира във физиологичен солев разтвор или в разтвор на хиалуронова киселина, разтворена във физиологичен солен разтвор.

Меките капсули могат да се напълнят с течната форма на състава от изобретението, а твърдите капсули - с лиофилизирания прах или лиофилизираният прах от изобретението може да бъде компирмиран в таблетки за ректално приложение, съответно - орално приложение.

Съставът от изобретението може предварително да бъде напълнен в спринцовка, която пациентът сам да прилага.

Съставът от изобретението може да се съхранява при нормална температура +10 до +30°С или при обикновени хладилни условия при температура около +2 до +8°С.

Изобретението се отнася също така и до нови приложения и методи на лечение при използването на посочените соли и/или състави, по-специално с оглед лечението на смущения, свързани или с образуването на азотен оксид (N0) или нарушена функция на NO-системата, по-специално високо кръвно налягане, ангина, импотентност, шок, предизвикан от нарушение на кръвообращението или септичен шок, удар, възпаление, дихателен дистресов синдром, адхезия или агрегиране на тромбоцитите и левкоцитите, ендотелиална дисфункция, гастроинтестинални увреждания, смущения в перисталтиката, диабет, панкреатит, ниско кръвно налягане, дисфункция или хиперфункция на соматосензорни нерви, по-специално сензорна невропатия, постхерпетна невралгия, атопичен дерматит, затруднено заздравяване на наранени тъкани, придобита студова и топлинна уртикария, псориаза, bullous pemphigoid, екзема, фотодерматоза, хроничен артрит, стомашночревни поражения и специфична и неспецифична хиперчувствителност на горните и долни дихателни пътища (астма, ринит), смущения на ендотелиума, рани, язви, състояния, свързани с акутни и/или хронични възпаления, по-специално хроничен артрит, и смущения, свързани със забавен тип хиперчувствителност и стомашночревни поражения; чернодробни смущения, органни поражения, предизвикани от свободни радикали, получени вследствие радиация; смущения, свързани с нарушения на катехоламинергичната система, по-специално шизофрения, предизвикани от амфетамин ефекти, въздържане от лекарства; свързани със стрес състояния; акутен панкреатит със съпътстваща гастродуоденална патология; сърдечни смущения, по-специално при аритмии, антиангинално и кардиозащитно лечение; депресивни смущения; Паркинсонова болест и патология, подобна на Паркинсонова болест; температурни смущения, костни увреждания, предизвикани от високо кръвно налягане различни органни увреждания; смущения в коагулацията, болка; конвулсивни смущения, нараняване на гръбначния мозък, алкохолни увреждания, предизвикани при алкохолно въздържание или при увеличено поемане на алкохол; мозъчни исхемични смущения; периферни нервни увреждания; каталептични смущения и невролептични смущения; смущения, свързани с ненормални или мутантни лимфоцити; нарушения на фетуса, вагинална атрофия и остеопороза, предизвикана от овареоктомия; тумори, вирусни заболявания, по-специално СПИН или ARC; стомашночревни поражения; когнитивни смущения, смущения при въздържание; бъбречни нарушения и смущения в клетъчната имунна реакция. Изобретението се отнася освен това до ВРС пептидна сол или фармацевтичен или диагностичен състав с обща формула

Хаа Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa

Ala Xaa Xaa Xaa

Изобретението се отнася по-конкретно до ВРС пептидна сол или фармацевтичен или диагностичен състав, включващ сол на ВРС пептид, съгласно формула (II), в която пептидът е подбран от групата, състояща се от:

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala

Leu Gly Vai;

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala

Gly Leu Vai;

(наречен също ВРС 157);

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu

Gly Vai;

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu

Gly Vai;

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Vai;

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala; Asp Pro Pro Pro lie Arg Pro Ala Asp; Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp; Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Vai;

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp и

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asn.

Тези пептиди са известни от WO 94/ 11394 и 93/24521, чието съдържание е включено в настоящото описание с оглед на получаването и използването на ВРС пептидите.

Нещо повече, пептидите могат да са свързани към други функционални и/или структурни радикали, като въглехидрати, мазнини, протеини или пептиди, антитела, рецептори, хормони, цитотоксични вещества, маркерни вещества, багрила, радиоактивно белязани групи, имуномодулаторни средства, лекарства, носители, насочващи или сигнализиращи вещества и т.н.

Изобретението се отнася също така до гореспоменатите ВРС пептидни соли и състави, в които пептидът е в линейна или циклизирана форма, по-специално чрез амидна връзка между първия и последен аминокиселинен остатък.

Описание на приложените фигури

Изобретението се пояснява по-цялостно чрез примерите и приложените фигури, където: фигура 1 показва ИЧ спектър на NaBPC 157;

фигура 2 - ИЧ спектър на Na₂BPC 157;

фигура 3 - ИЧ спектър на дицезиевата сол на ВРС 157 (Cs₂BPC 157) ;

фигура 4 - ИЧ спектър на ТРИС солта наВРС157 (ТРИС-ВРС157);

фигура 5 - ИЧ спектър на ди-ТРИС солта на ВРС157 ((ТРИС) ₂ВРС157);

фигура 6 - ИЧ спектър на 2-аминопропаноловата солна ВРС 157 (2-АМР-ВРС157);

фигура 7 - ИЧ спектър на триетаноламинната сол на ВРС 157 (ТЕАМ-ВРС157).

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1. Получаване на мононатриева сол на ВРС157 (NaBPC157).

0.5 g (0.35 mmol) пентадекапептид с последователност Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Vai (BPCI57) ce разтваря в 10 ml вода, съдържаща 29.6 mg натриев хидрогенкарбонат (0.35 mmol), стерилизира се чрез филтруване през 0.2 μ филтър и се суши чрез замразяване до получаване на 0.48 g белезникаво бяло вещество.

Чистота на получената сол: 99,4% (ВЕТХ).

Масспектър (FAB): 1419, по-висши йо ни при 1441 (M⁺Na⁺).

Аминокиселинният анализ на получената пептидна сол след 72 h хидролизиране с 6N-HC1 в затворена епруветка при 110°С дава стойности, отговарящи на състава: 3Gly, 4Pro, 2А1а, 2Asp, Glu, Leu, Vai, Lys.

ИЧ спектър (КВг): фигура 1.

УВ спектър (Н₂О): λ max = 190 nm, няма други максимуми.

Т.т. 288-290°С (с разлагане).

Пример 2. Получаване на двунатриевата сол на ВРС157 (Na₂BPC157).

0.5 g (0.35 mmol) ВРС157 се разтварят в 10 ml етанол. При умерено бъркане се прибавя 1.4 ml 0.5 mol/1 метанолов разтвор на натриев хидроксид. Разтворът се стерилизира чрез филтруване през 0.2 μ филтър и бавно се прибавя при бъркане към диетилов етер (50 ml). Отделената бяла утайка се отфилтурва и се промива с диетилов етер до получаване на 0.52 g динатриева сол.

Чистота на получената сол: 99.4% (ВЕТХ).

Масспектър (FAB): 1419, по-висши йони при 1441 (М⁺ Na), 1464 (М⁺ Na₂ ⁺).

Аминокиселинният анализ на получената пептидна сол отговаря на състава: 3Gly, 4Pro, 2А1а, 2Asp, Glu, Leu, Vai, Lys.

ИЧ спектър (КВг): фигура 2.

УВ спектър (Н₂О): max 190 nm, няма други максимуми.

Т.т. 275 - 277°С.

Пример 3. Получаване на дицезиевата сол на ВРС157.

(Cs₂BPC 157).

0,5 g (0.35 mmol) ВРС157 се разтварят в 8 ml вода, в която се съдържат 114 mg цезиев карбонат (0.70 mmol), стерилно се филтрува през 0.2 μ филтър и се лиофилизира до 0.50 g белезникаво твърдо вещество.

Чистота на получената сол: 99.3% (ВЕТХ).

Масспектър (FAB): 1419, по-висши йони при 1551 (M⁺Cs⁺), 1684 (M⁺Cs₂ ⁺).

Аминокиселинният анализ на получената пептидна сол отговаря на състава: 3Gly, 4Pro, 2А1а, 2Asp, Glu, Leu, Vai, Lys.

ИЧ спектър (КВг); фигура 3.

УВ спектър (Н₂О): λ max “190 nm.

Т.т. 268°С.

Пример 4. Получаване на ТРИС сол на ВРС 157 (ТРИС-ВРС157)

0.5 g (0.35 mmol) ВРС157 се разтварят в 10 ml метанол, съдържащ 42.6 mg (0.35 mmol) трие-(хидроксиметил)-аминометан (ТРИС), стерилизира се чрез филтруване през 0.2 филтър и се суши чрез изпаряване на метанола под вакуум при 40°С до получаване на 0.56 g бяло твърдо вещество.

Чистота на получената сол: 99.5% (ВЕТХ).

Масспектър (FAB): 1419, (МН⁺).

Аминокиселинният анализ на получената пептидна сол отговаря на състава: 3Gly, 4Pro, 2А1а, 2Asp, Glu, Leu, Vai, Lys.

ИЧ спектър (КВг): фигура 4.

У В спектър (Н₂О): λ max “190 nm. Т.т. 250°С (с разлагане).

Пример 5. Получаване на ТРИС сол на ВРС157 ((ТРИС)₂ВРС157)

Съединението се получава съгласно метода, описан в пример 1, с изключение на това, че се използват 85.2 mg (0.70 mmol) ТРИС.

Чистота на получената сол: 99.5% (ВЕТХ).

Массспектър (FAB): 1419, (МН⁺).

Аминокиселинният анализ на получената пептидна сол отговаря на състава: 3Gly, 4Рго, 2А1а, 2ASp, Glu, Leu, Vai, Lys.

ИЧ спектър (КВг): фигура 5. УВ спектър (Н₂О): λ шах = 190 nm. Т.т. 188-193°С.

Пример 6. Получаване на 2-аминопропаноловата сол на ВРС157 (2-АМР-ВРС157)

Съединението се получава съгласно метода, описан в пример 1, с изключение на това, че за база се използва 2-аминопропанол (2-АМР).

Чистота на получената сол: 99.6% (ВЕТХ).

Масспектър (FAB): 1419, (МН⁺).

Аминокиселинният анализ на получената пептидна сол отговаря на състава: 3Gly, 4Рго, 2А1а, 2Asp, Glu, Leu, Vai, Lys.

ИЧ спектър (КВг): фигура 6. УВ спектър (Н₂О): λ max 190 nm. Т.т.158°С (с разлагане).

Пример 7. Получаване на триетаноламинната сол на ВРС 157 (ТЕАМ-ВРС157)

Съединението се получава съгласно метода, описан в пример 1, с изключение на това, че за база се използва триетаноламин (TEAM).

Чистота на получената сол: 99.2% (ВЕТХ).

Масспектър (FAB): 1419, (МН⁺).

Аминокиселинният анализ на получената пептидна сол отговаря на състава: 3Gly, 4Pro, 2А1а, 2Asp, Glu, Leu, Vai, Lys.

ИЧ спектър (КВг): фигура 7.

У В спектър (Н₂О): λ max = 190 nm Т.т. 202 - 205°С.

Пример 8. Получаване на таблетки, съдържащи ТРИС-ВРС157

Състав	mg/таблетка
ТРИС-ВРС157	0.5
трехалоза	10.0
лактоза	17.0
нишесте	6.5
талк	3.0
трагакант	2.5
магнезиев стеарат	0.5
общо	50.0 mg
ТРИС-ВРС157 (0.5 mg)	и трехалозата

(20 mg) се разтварят в 1 ml вода и се сушат при изпаряване. След сушене суровият остатък се смесва с другите съставки, за да се приготвят таблетките.

Пример 9. Получаване на капсули, съдържащи NaBPC157 Състав NaBPC157 трехалоза лактоза магнезиев стеарат общо mg/капсула

0.5

60.0

39.0

0.5 100.0 mg

NaBPC157 (0.5 mg) и трехалозата (60 mg) се разтварят в 1 ml вода и се сушат чрез изпаря ване на разтворителя. Суровият остатък се смесва с другите съставки, за да се получат капсулите. Пример 10. Получаване на разтвор, съ-

държащ NaBPC157
Състав	g/25 ml
NaBPC 157	0.05
глицерол	15.00
бензил алкохол	0.01
буфер pH 7.0 до	25 ml
Пример 11, Получаване на крем, съдър-
жащ ТРИС-ВРС157
Състав	g/25 g
ТРИС-ВРС157	0.05
емулгатор	2.80
хидрирано фъстъчено
масло	7.08
Tween® 60	12.08
пропиленгликол	3.00
метилхидрокси бензоат	0.07
общо	25.00 g

Пример 12. Изпитания за стабилност

Стабилността на ВРС пептидните соли 2Q се изпитва чрез инкубиране на солите в продължение на 76 и 120 дни при 40°С. Концентрацията на ВРС пептидните соли във воден разтвор е 0.2% (т/о).

Стабилността се измерва, като се използ2^ ва ВЕТХ метод: колона Kromasil 100, 5μ, 150 х 4.6 mm, мобилна фаза 0.1 % трифлуорооцетна киселина във вода/ацетонитрил (от 0 до 50 об.%), градиент на елуиране за 25 min, поток 1 ml/min, детектиране: УВ при 214 пт.

3θ За сравнение се използват свободният

ВРС пептид и маноацетатът.

Таблица 1.

Стабилност на ВРС пептидна сол при 40°С в дните 0, 76 и 120; анализ на площта в % (ВЕТХ)

съединение	pH 0.2% в Н20	0 дни	76 дни	120 ДНИ
свободен пептид BPC157	4.46	99.3	98.1	97.4
пептид BPG157 моноацетат	4.53	99.2	97.8	95.3
натриева сол на ВРС157	6.51	99.4	99.5	99.4
динатриева сол на ВРС157	7.64	99.4	99.7	99.4
ТРИС сол на ВРС157	6.31	99.5	99.5	99.4
диТРИС сол на ВРС157	8.24	99.5	99.5	99.5
2-АМР сол на ВРС157	8.20	99.6	99.4	99.5
TEAM сол на ВРС157	7.61	99.2	99.3	99.1

Данните от таблицата ясно показват повишената стабилност на ВРС пептидните соли съгласно изобретението за разлика от свободния ВРС пептид или неговия моноацетат. Нещо повече, вероятно поради високата стойност на pH на разтворите на ВРС пептидните соли, инжектирането на тези разтвори не причинява каквато и да е болка или некроза.

В друг отделен опит, допълнително подобряване на стабилността на ВРС пептидните соли съгласно изобретението в сурова форма или в разтвор се наблюдава след прибавяне на трехалоза. Поради това, прибавянето на трехалоза като фармацевтично приемлива добавка за получаването на фармацевтичен състав, по-специално под формата на таблетки или капсули, е друг важен аспект на изобретението.

Следващите примери описват експерименти, демонстриращи фармацевтичната активност на ВРС пептидните соли от настоящото изобретение. Тези експерименти се провеждат, използвайки обичайни модели in vivo и in vitro. За опитите се използва мононатиревата сол на ВРС пептида 157 (съкратено название Na ВРС157), освен ако не е посочено друго. Мъжки Wistar плъхове с тегло 250-280 g се използват при всички опити, освен ако не е посочено друго.

Пример 13: NO-система

Въведение:

Азотен оксид (N0) функционира както като сигнализираща молекула в ендотелийните и нервни клетки, така и като активирана от имунните клетки убиваща молекула. Проучванията напоследък показват, че той може да се използва като лекарство чрез инхалиране. При излишък или при недостиг N0 причинява или допринася до най-различни смущения, по-специално повишено кръвно налягане, импотентност, предизвикан от смущения на кръвоносната система, шок, септичен шок, удар, възпаления, дихателни дистресови синдроми, белодробно повишено налягане и съсирване на тромбоцитите и левкоцитите, диабет, високо кръвно налягане и болестта на Паркинсон.

Материали и методики:

Някои от ефектите на NaBPC157 (10 gg или 10 ng/kg се проверяват при плъхове, като лечебният ефект при стомашни поражения и активността на NaBPC157 за поддържане на кръвното налягане. Уврежданията се получават, като се прилага в продължение на lh ета нол 96% директно в стомаха. NaBPC157 се прилага едновременно интраперитонеално. При опита за поддържане на кръвното налягане NaBPC157 се поставя венозно.

Изследвано е също така комбинираното прилагане на метилов естер на №-нитро-Ь-аргинин (L-NaME) (5 mg/kg венозно), конкуриращ инхибитор на ендотелно азотнооксидно (N0)-генериране и NO-източника L-аргинин (200 mg/kg венозно) (D-аргинин и неефективен). При опита със стомашно увреждане N0средствата се дават 5 min преди увреждането с етанол и лечението с NaBPC157.

Резултати

В етаноловия модел, даден самостоятелно, NaBPC157 има противоязвен ефект както и L-аргинина. NaBPC157 предпазва от сериозното увреждане, наблюдавано при контролните плъхове, на които е приложен само етанол. L-NAME няма ефект. L-NAME напълно унищожава активността на L-аргинин, но само отслабва активността на NaBPC157. След прилагане на комбинация от L-NAME + L-аргинин активността на NaBPC157 допълнително се понижава.

В изследванията за кръвно налягане NaBPC157 (без ефект върху основните нормални стойности), сравнена с L-аргинин има както поддържащ ефект (намалява увеличеното от L-NAME кръвно налягане, приложена профилактично, понижава вече повишените от L-NAME стойности, дадена по време на максималното увеличение на кръвното налягане от L-NAME (т.е. 10 min след L-NAME)), така и предпазно действие (при предварително прилагане на NaBPC157 се предпазва от умерено намаляване на кръвното налягане, предизвикано от L-аргинин). Когато NaBPC157 се приложи 10 min след прилагането на комбинацията от L-NAME + L-аргинин (все пак води до повишаване на кръвното налягане), неговият ясно изразен ефект (забелязан при плъхове, на които е въздействано с L-NAME) изчезва. In vitro в стомашна мукоза от тъканни хомогенати на стомах на плъх, NaBPC157 даден в същата доза (100 μΜ) както L-аргинин, индуцира сравнимо образуване на N0. Но ефектът на NaBPC157 солите не може да се инхибира чрез L-NAME дори с десетократно по-висока доза (100 към 1000 μΜ) от необходимата за инхибиране на ефекта на L-аргинин. От друга страна, синтезата на N0 се намалява, когато

NaBPC157 и L-аргинин се комбинират. Накратко, NaBPC157 може да взаимодейства с N0 ефектите както по отношение на стомашната мукозна цялост, така и за поддържане на кръвно налягане по специфичен начин, особено когато е комбинирана с L-аргинин, като проявява значителен и/или по-различен ефект върху N0.

Като има по-значителен ефект върху N0 от L-аргинин, NaBPC157 може да предпази от страничните ефекти, свързани с образуването на излишък от N0 (нарушен ефект на L-аргинин (например високо кръвно налягане)). Тези странични ефекти се връщат към нормалните стойности in vivo и се предпазва от образуването на излишък от NO in vitro. В допълнение отрицателните последици от инхибирането на N0 системата се преодоляват (например предпазване от предизвикано от L-NAME повишено кръвно налягане и връщане към нормалното на вече установено повишение от L-NAME).

Въз основа на близкото сходство на N0 изпитанията в други тъкани (например бял дроб, черен дроб, кръвоносни съдове и т.н.) и разнообразието на прилаганите модели (стомашни поражения и поддържане на кръвното налягане) отбелязаните благоприятни ефекти на NaBPC157 по отношение и на двете, образуване на излишък от N0 и увреждане на N0системните функции, са очевидни. По-специално ВРС пептидните соли от изобретението са полезни при лечението на високо кръвно налягане, ангина, импотентност, предизвикан от смущения на кръвоносната система шок, септичен шок, удар, възпаления, дихателни дистресови синдроми, белодробна хипертония, панкреатит, съсирване на тромбоцитите и левкоцитите, ендотелна дисфункция и болестта на Паркинсон.

Пример 14. Соматосензорни неврони Въведение:

Соматосензорни неврони обикновено участват при контролиране на хомеостазиса, по-специално при реакцията при предизвикателствата на хомеостазиса. Тези неврони могат да проследяват потенциална заплаха. Неврониет са, per se, способни веднага да инициират подходящи мерки за облекчаване на опасността. Вазоактивни сетивни нерви по този начин представляват първа отбранителна линия срещу травма. Най-общо тяхната защитна способност се доказва чрез експериментално уврежда не на кожата и стомашночревната мукоза. В резултат на различни смущения се получават или дисфункции или хиперфункции, по-специално вродена сензорна невропатия, причинена от диабет сензорна невропатия, херпес зостер, посттерапевтична невралгия, атопичен дерматит, влошено заздравяване на наранени тъкани (например упорити кожни рани, влошаване на предизвикани от киселина кожни увреждания и образуване на кератитоподобни увреждания на корнеата), придобита студова и топлинна уртикария, псориазис, bullous pemphigoid, екзема, фотодерматози, смущения в горните и долни дихателни пътища, специфична и неспецифична свръхреактивност, вазомоторен ринит, астма, хроничен артрит и стомашночревни увреждания.

Материали и методики

Изследват се стомашнозащитните ефекти на NaBPC157 при стомашни увреждания (предизвикани в плъхове при въздействие с 96%-ен етанол, въздържан стрес и индометациново лечение). Проучва се възможното участие на сензорни неврони в оздравителните ефекти на NaBPC157 (10 pg/kg, 10 ng/kg интраперитонеално) с капсаицин, който има твърде различни ефекти върху сензорните неврони: прилагане на висока доза на възрастни животни (125 mg/kg подкожно, на възраст три месеца) или прилагане на новородени животни (на възраст седем дни по 50 mg/kg подкожно) разрушава сензорните тъкани, докато ниска доза (500 pg/kg интраперитонеално) активирана невротрансмисионното освобождаване и има защитно действие върху лигавицата.

Резултати (I) В отсъствие на капсаицин, NaBPC157 защитава стомашната лигавица срещу етанол, въздържан стрес и индометациново приложение.

(II) В присъствието на невротоксични дози капсаицин, отрицателното влияние на капсаицин върху увреждания, предизвикани от въздържан стрес, етанол или индометацин значително повлиява на оздравителната активност на NaBPC157. Защитното действие на NaBPC157 е видно дори при животните, на които е въздействано с капсаицин, независимо дали са възрастни или новородени. След прилагане на капсаицин при новородени, се отбелязва цялостно унищожаване на стомашната защита на NaBPC157, ако NaBPC157 се прилага в еднократна ng-доза. Защитата на лигавицата се възвръща, когато същата доза се прилага ежедневно.

(III) заедно с възбуждащата доза на капсацин, благоприятната активност на NaBPC157 допълнително се повишава.

Взети заедно, тези данни показват комплексно синергично взаимодействие между благоприятната активност на NaBPC157 и пептидергичната сензорно провеждаща невронна активност. Поради близката прилика на капсаициновите ефекти в животни и хора и гореописания експеримент, NaBPC157 може да се използва за лечение на смущенията, споменати по-горе.

Пример 15. Защита на ендотелиума

Известно е, че васкуларни ендотелни увреждания предхождат развитието на и са съществен признак за големи увреждания на органите. Защитата на ендотелиума може да намали вредните последици от исхемия за цялостта на лигавицата. Възприето е прилагането на Monastral Blue при плъхове непосредствено преди прилагането на некротизиращо средство (например вътрешностомашно приложен етанол) , известен с това, че предизвиква големи поражения.

Материали и методики:

На всички плъхове се поставя венозно Monastral Blue (Sigma Company, USA) (1.0 ml/kg телесно тегло) 3 min преди въздействието c етанол. Плъховете се убиват 1 min след въздействието с етанол. Един час преди третирането с етанол на плъховете се дава NaBPC157 (10.0 pg/kg интраперитонеално) или физиологичен разтвор (5.0 ml/kg интраперитонеално). Непосредствено след убиването стомахът на животните се отстранява и се преценяват пораженията. Части от стомаха и дванадесетопръстника се обработват за по-нататъшен хистологичен анализ.

Васкуларното увреждане се оценява в един ранен период (1 min след въздействието с етанол), като се използва Monastral Blue (MB) техника. Плътността на оцветената лигавица върху площта се изследва чрез ТЕМ.

Резултати

Наблюдава се значително намаляване на MB-оцветяванията при групите, на които е приложена NaBPC157. Близкото сходство на използваните модели със състоянията при хората показва, че NaBPC157 може да се използва за лечение на състояния, свързани с ендотелни смущения при хора.

Пример 16. Ангиогеназа

Въведение

Ангиогенезата е от съществено значение при възстановяване на гранулиращи тъкани и рани и/или заздравяването на язви. Ангиогенните свойства се изследват при използване на общоизвестен метод.

Материали и методики

На всеки плъх се поставят по две стерилни гъбички (1 cm х 1 cm х 0.25 cm (V-0.25 ml)) c едно и също количество NaBPC157 (разтвори от 50 pg, 10 pg, 10 ng/ml) или от използваните за сравнение средства симетидин (10 mg, 100 mg, 500 mg/ml), ранитидин (2.5 mg, 25 mg, 250 mg/ml), фамотидин (10 mg, 50 mg, 100 mg/ml) и сукралфат (1 mg, 5 mg, 10 ng/ml), имплантирани подкожно в лумбалната област. Гъбичките се отстраняват след три или седем дни. След това те се фиксират във формалин и се обработват за хистологично и хистохимично оценяване и морфометрия. Използваният микроскоп е Leitz, DIAPLAN: За морфометричен анализ се използва програмата “SFORM” (VAMX, Zagreb, Croatia).

Резултати

Новообразувана гранулационна тъкан около имплантираната гъбичка се използва като ценна количествена мярка за реакция на приемника по отношение на чуждото тяло. Експериментите с плъхове, убити три дни след имплантирането, показват следното. При групата животни, на които е поставено NaBPC157, има значително повече гранулираща тъкан в сравнение с тази на контролните животни. Подобни резултати се наблюдават при плъховете, на които е поставен сукралфат във всички използвани дози. За разлика от това, няма разлика между стойностите на контролните групи и тези, на които са поставени трите Н₂ блокера. При животните, убити на седмия ден след имплантирането, тези, на които са поставени и трите дози сукралфат и тези с найвисоката доза NaBPC157 (50 pg) са много различни в сравнение с контролната група. В контролните групи няма съществени разлики между убитите на третия и седмия ден след инплантирането.

В новообразуваната гранулационна тъкан се отчитат еднотелийните пространства. По отношение на контролната група (броя на новообразуваните ендотелийни пространства в контролната група три дни след инплантирането е 7.94 ± 1.23 и седем дни след инплантирането е 14.8 ± 3.12) и всички вещества водят до значително увеличени стойности в двата интервала (на трети и седми ден).

В допълнение към доказателството, че различни противоязвени лекарства притежават ангиогенни свойства, NaBPC157 също стимулира гранулирането както и сукралфат. Следователно, NaBPC157 може да се използва за иницииране и подпомагане на оздравителния процес, по-специално при рани и/или язви.

Пример 17. Възпаление

Въведение

Понасотящем използваните противовъзпалителни средства обикновено се оценяват в много подходящи модели, сходни с акутните и/или хронични възпалителни смущения при хора. Обаче сериозни стомашночревни поражения се явяват като главен страничен ефект на тези средства.

За NaBPC157 се отчита акутна противовъзпалителна и аналгетична активност (например тестове с турпентин, карагенин, оцетна киселина или магнезиево сулфатно гърчене (простагландин-зависещ, простагландин-независещ), тест с прищипване на опашката) както и антипиретичен ефект (намаляване предизвикана с дрожди температура (4000 mg/kg подкожно)). Едновременно при плъхове NaBPC157 е изследван за оздравителен ефект при стомашночревни поражения, при хронични възпалителни поражения като вторичен артрит и като нестероидно противовъзпалително средство при предизвикани с NSAlAs стомашночревни увреждания.

Материали и методики

В изследвания при стомашночревни поражения (индометацин (30 mg/kg подкожно), аспирин (400 mg/kg в стомаха) и доклофенак (125 mg/kg в перитонеума), NaBPC157 (10 pg или 10 ng/kg в перитонеума) се дава редовно или едновременно и/или lh преди прилагането на лекарството (индометацин). При изследванията при вторичен артрит (прилагане в опашката на 0.2 ml от добавката на Freund) (14 дни, 30 дни, една година), NaBPC157 (10 pg или 10 ng/kg интраперитонеално) се прилага еднократно (lh преди или след прилагането на добавката на Freund) или веднъж дневно (ΟΙ 4-ия ден, 14- 30-ия ден, 14-ия ден, е една година).

Резултати

Даван заедно с изследвания NSAIAs, NaBPC157 значително намалява известните поражения в стомаха на контролните плъхове, както и уврежданията в тънките черва в иднометациновата група. При изследванията за вторичен артрит развитието на уврежданията значително се намалява след едно приложение на NaBPC157 и още повече те затихват при плъхове, на които дневно се прилага NaBPC157. Като лечение за вече установен вторичен артрит, оздравителният ефект на NaBPC157 се появява само след две седмици след даване на лекарството и става ясно видим след една година лечение. Тези данни показват противовъзпалителния и защитен ефект на NaBPC157 върху лигавичната цялост.

Два различни механизма възпаление и свръхчувствителност са известни като участващи при лечението на вторичен артрит. NaBPC157 повлиява благоприятно и на двата. По отношение на използваните за сравнение средства (т.е. аспирин, индометацин) NaBPC157 е ефективна в значително по-ниска доза pg и ng/kg към mg/kg). Тази начална ефективност за предпазване от вторичен артрит е още подобра при ежедневно приложение. По-високи дозировки (10 pg/kg) са ефективни или като еднократна доза, или като ежедневно приложение, докато по-ниски дозировки стават ефективни при ежедневен режим на приложение. Това откритие, заедно с лечебния ефект на NaBPC157 при напълно установен артрит, доказва полезността при прилагането й през цялостния курс на лечение на вторичен артрит. Отбелязаната ефективност на NaBPC157 при вторичен артрит (профилактичен/лечебен ефект, неустановен/установен вторичен артрит) може да се наблюдава с понастоящем използваните лечебни средства. Глюкокортикоиди са ефективни при предпазване от вторичен артрит когато се прилагат ежедневно, но не за кратко лечение. Имуносупресанти (във високи дози) и нестероидни аналгетици са ефективни само при предварително или респективно последващо лечение.

Така въз основа на близкото сходство между използвания модел и съответното човешко страдание, очевидно е, че NaBPC157 с нейните мукотични защитни свойства, може да се използва при лечението на състояния, свързани с остро възпаление и хроничен артрит. В допълнение NaBPC157 може да се използва за лечение на смущения, сродни на забавен тип свръхчувствителни смущения и стомашночревни поражения, причинени на различни места на стомашночревния път, особено такива, предизвикани от средства като NSAlAs.

Пример 18. Ефект при свободни радикали

Материали и методики

Хепатозащитните ефекти на NaBPC157 се оценяват в сравнение с известни стандартни средства като бромокриптин, амантадин и соматостетин при различни експериментални модели при увреждане на черен дроб при плъх: 24 h - жлъчен канал и хепатична артериална лигатура, 48 h - задържан стрес и прилагане на СС1₄ (средство индуциращо свободни радикали).

Резултати

NaBPC157 значително предпазва от развитието на чернодробна некроза или мастни промени при плъхове, подложени на 24 h жлъчноканална хепатичноартериална лигатура, 48 h сдържан стрес и СС1₄ въздействие (1 ml/kg перитонеално, животните се убиват 48 h след това). Другите използвани за сравнение лекарства или имат много слаб ефект, или са неефективни при тези модели. Лабораторни изпитания за билирубин показват, че SGOT и SGPT напълно съвпадат с макро/микроскопските изследвания. Така NaBPC157 може да се използва за лечение на чернодробни заболявания. В допълнение, миелосупресия, предизвикана от облъчване, е възпроизводим модел за изследване динамиката на възстановяване на хематопоетичните елементи. NaBPC157 показва благоприятен ефект върху увреждания на костния мозък, предизвикано от сублетално облъчване.

Така NaBPC157 може да се използва за лечение на увреждания на костния мозък, предизвикани от облъчване. Обсъждайки всеобщо признатата връзка на CCL₄c образуването на свободни радикали и получаване на поражения, благоприятните ефекти на NaBPC157 могат да се прилагат към други органни поражения, предизвикани от свободни радикали, поспециално при облъчване.

Пример 19. Катехоламинергична система Въведение

Недиректно действащи симпатомиметични лекарства като амфетамини имат общи свой ства като от една страна предизвикват увеличено катехоламиново освобождаване и от друга инхибират обратното катехоламиновото поемане (предимно допамин) при нервните окончания на централната нервна система (CNS). Стереотипичното отношение е в резултат на активирането на допаминергичната система в corpus striatum. Смята се, че в резултат на амфетамина увеличено катерене на животните се дължи на стриатно допаминово рецепторно регулиране след допаминовото антагонистично халоперидолово приложение. Това предизвиква последващо амфетаминово свръхсензитивно развитие. Приложението на NaBPC157 не засяга грубото поведението или индуцира стереотипове.

Материали и методики.

Изследват се ефектите на NaBPC157 върху допамин агонистични амфеггаминови (10 mg/kg интраперитонеално) стереотипове и върху възбудимостта. NaBPC157 се прилага профилактично съвместно или като лечебен оздравителен режим (10 pg или 10 ng/kg интраперитонеално). Стереотипично поведение и възбудимост се индуцират върху плъхове.

Резултати

Наблюдава се забележимо намаляване и обратимо (лечение при максимума на амфетаминовото смущение) стереотипно поведение и повишена възбудимост (т.е. по-силно и бурно отдръпване, паническо скачане и изчезване).

След това се изследва ефектът на NaBPC157 върху повишеното поведение на катерене на мишките. Предварително на мишките се дава допаминов антагонист халоперидол (5.0 mg/kg интраперитонеално) и след това се въздейства с амфетамин (20 mg/kg в дните 1, 2, 4 и 10 след предварително въздействие с халоперидол), който обикновено се използва за изследване на поведението на свръхчувствителност към амфетаминовия стимулиращ ефект. Така, ако се появи антагонизиране на амфетаминовите стереотипове в резултат на допаминова антагонистична активност (директно или индиректно) от изпитвания NaBPC157, тогава ще се очаква усилване на халоперидоловия повишен ефект на амфетаминово катерещо поведение. За разлика от това, когато NaBPC157 се прилага съвместно с халоперидол, се забелязва почти напълно противоположно действие. Заедно тези данни доказват, че NaBPC157 взаимодейства с допаминовата система. Нещо повече, доказано бе взаимодействие на NaBPC157 с централната допаминова система и в други експериментални модели (т.е. защита срещу язва при стрес). Взаимодействие с допаминовата система вече е забелязано при много известни пептиди (невротензин, ССК и т.н). В допълнение, прилагането на NaBPC157 също така премахва смущения в поведението, предизвикани от LSD (например 0.3 mg/kg интраперитонеално). NaBPC157 има модулиращ ефект върху допаминовата система. В състояние на увеличено допаминово освобождаване и синтез, предизвикано от амфетамин, NaBPC157 може да предотвратява и премахва последващите смущения (т.е. стереотипично поведение). По подобен начин NaBPC157 може значително да намали последиците от блокирането на допаминовите рецептори от халоперидол. Предполага се, че модулиращият ефект на NaBPC157 включва също заместване на недостатъчната допаминова система. Това избягва последващата свръхчувствителност на допаминовите рецептори и повишените амфетаминови смущения.

Така NaBPC157 е полезно средство при лечението на шизофрения, амфетаминови предизвикателни ефекти (шизофрения от психоза) и лошите прояви при въздържание от лекарства.

Пример 20. Стрес.

Въведение

Стресът се определя като неспецифично събитие, водещо до увреждане на различни органи. Реакцията спрямо стрес се определя като реакция, насочена срещу различни рискови ситуации. Един от най-често използваните животински модели за стрес е сдържаният стресов модел, водещ до сериозни стомашни поражения в плъхове. Други органи могат също така да се засегнат.

Материали, методики и резултати

Приложен в доза 10 gg или 10 ng/kg телесно тегло, интраперитонеално или в стомаха 1 h преди предизвикването на стрес, NaBPC157 сигурно предпазва от неизбежното развиване на сериозно стомашно поражение. Ако времето между прилагането на намаляващото стреса, средство и въвеждането на стрес (в следващия текст означено като “период”) се удължи, стандартните противоязвени средства стават особено неефективни, за разлика от добрата ефективност на изпитваната

NaBPC157. NaBPC157 запазва оздравителната си активност дори след много продължителен период от 48 h. Осигурената от NaBPC157 защита включва облекчаване на пораженията, появяващи се в други органи (например черен дроб, надбъбречна жлеза, бъбреци, тестиси, сърце, панкреас, далак). Тъй като други общоизвестни стресови параметри се засягат по-малко (т.е. тимолимфатично разстройство и кортикална хипертофия на надбъбречните жлези), явно е, че NaBPC157 може да се приложи при различни стресови състояния. NaBPC157 има положително оздравително въздействие върху различни поражения, появяващи се в различни органи, свързани с неспецифичната стресова патология. Обсъждайки същите прояви при хора, както и при използваните модели, се счита, че NaBPC157 има оздравителен ефект, дори когато се приложи при вече напреднала стресова патология (например 24 h след предизвикването на стрес).

Пример 21. Демонстриране на цитозащитен ефект

Въведение

Цитозащитен ефект първоначално се дефинира като свойство за защита на клетките срещу различни вредни средства, ефект проявен при стомашната лигавица, независещ от стомашната киселина. По-късно тази дефиниция е разширена да обхваща по същество подобни защитни ефекти вън от стомашночревния път, включваща пораженията на различни органи (цитозащита - органозащита). Възможните цитозащитни ефекти при прилагането на NaBPC157 се изследват на базата на техния ефект върху първоначален модел на Robert за цитозащитно средство, като се проследяват предизвикани от етанол стомашни поражения.

Материали, методики и резултати.

NaBPC157 (10 gg или 10 ng/kg интраперитонеално) има профилактичен ефект (приложен или 1 h предварително, или едновременно с 96%-ен етанол (1 ml/плъх в стомаха) и оздравителен ефект (приложен 1 h след етанола в максимума на развитието на поражението).

За да се създаде свободна от киселина среда за изследване на цитозащитното действие, 24 h преди улцерогенната процедура се извършва гастектомия. В отсъствие на стомах и стомашна киселина, увреждащите ефекти на цистеамин (400 mg/kg подкожно, животните се убиват 24 h по-късно), досега считан за киселинно свързан дуоденален улцероген, и цитозащитните ефекти на NaBPC157 (10 pg или 10 ng/kg интраперитонеално) се изследват в сравнение с известни средства (симетидин (50), ранитидин (10), омепразол (10), бромокрипин (10) и атропин (10) (стойностите са дадени в mg/kg интраперитонеално, lh преди цистеамин)), за когото е известно, че е също цитозащитно средство. При плъхове с неувредени стомаси всички приложени вещества имат много благоприятен ефект.При гастректомизирани животни приложението на изследваните средства (т.ел NaBPC157 или сравнителните средства преди цистеамин) значително предпазват от развиващите се сериозни увреждания на дванадесетопръстника, които се забелязват в контролните гастректомизирани цистеаминни плъхове. При групите, на които не е прилаган цистеамин, не се забелязват поражения (лапартомия и гастректомия само 24 или 48 h след хирургическия период), нито се наблюдава засилване на увреждането в третираните с цистеамин лапаратомизирани животни. Тези открития (еднакво увреждащ ефект при цистеамин, еднакъв защитен ефект на NaBPC157 и сравнителните средства при гастректомизираните плъхове с цял стомах и без стомах, уврежданията или защитният ефект не са свързани със секретирането на стомашната киселина) дават указание за цитозащитен ефект. Прави се аналогия (поражения, които не са свързани със стомашна киселина) между стомашното (например етанол) и цистеаминовото увреждане на дванадесетопръстника. Всички изпитани средства имат голям цитозащитен капацитет, явно независещ от киселина, но по-ясно изразен при NaBPC157.

Тъй като NaBPC157 е ефективен в много по-ниски дози от другите средства (т.е. pg или ng/kg срещу mg/kg) неговата ефективност (и лечебно приложение) може да се разпростре при поражения на различни органи. Това се дължи на факта, че ефективността на други средства при други органи е също подсказана, благодарение на техните цитозащитни ефекти (например соматостатин: поражения на надбъбречната жлеза, панкреаса, черния дроб, белия дроб и стомашночревния път).

Пример 22. Демонстриране на органозащитен ефект

Въведение:

За разширяване на цитозащитния ефект в органозащитен ефект обикновено се приема изследвания за защита на ендотелиума. Като указание са широко признати изследванията с Monastral Blue при етанолно увреждане на стомашната лигавица при плъх, благодарение на способността на Monastrai Blue да свързва увредения ендотелий.

Материали и методи:

На всички плъхове се поставя венозно Monastral Blue (MB) (1,0 ml/kg телесно тегло) 3 min преди етанола и животните се убиват 1 min след въздействието с етанол. NaBPC157 (10,0 pg/kg интраперитонеално) или физиологичен разтвор (5,0 ml/kg интраперитонеално) се дава 1 h преди етанола. Веднага след убиването, стомахът се отстранява и пораженията се оценяват както е описано по-горе. Проби от стомаха и дванадесетопръстника се обработват за следващ хистологичен анализ. Васкуларните увреждания в ранния период (1 min след поставянето на етанол) се определят, като се използва техниката на Monastral Blue. Плътността на оцветена лигавица върху площта се изследва чрез ТЕМ.

Резултати:

Наблюдава се силно намаляване на МВоцветяванията при групите, на които е приложена NaBPC157. Нещо повече, не се забелязват отрицателни прояви при прилагането на NaBPC157. Не се наблюдава повлияване на различните основни параметри и няма токсичност, въпреки прилаганите високи дози (например g/kg телесно тегло, интраперитонеално).

Имайки предвид голямото присъствие на ендотелни васкулатурни клетки в телото и решаващата роля на ендотелната защита за органозащитните ефекти, NaBPC157 може да се използва като органозащитно средство при различни органни поражения.

Пример 23. Остър панкреатит

Материали и методики:

NaBPC157 се изпитва при плъхове като защитно и лечебно средство при акутен панкреатит (предизвикан от поражение на жлъчния път). В същото време се изследва влиянието на NaBPC157 на едновременно развити поражения на стомаха и дванадесетопръстника.

NaBPC157 (10 pg или 10 ng/kg телесно тегло, интраперитонеално или в стомаха) се дава профилактично 1 h преди поражението, докато лечението се провежда чрез ежедневно прилагане 1 ден след увреждането (последно прилагане 24 h преди убиването на животните). Ефектът се проследява на интервали от един ден до края на петия ден след поражението.

Резултати:

При прилагане преди третирането се получава силен защитен ефект на панкреаса. Когато се прилага при състояние на вече установен сериозен акутен панкреатит се забелязва явен оздравителен ефект. При преценяване явяването на некроза, едема, неутрофили и мононуклеари, се установява, че се явяват значително по-малко некрози, едема и неурофили, но има повече мононуклеари при плъховете, на които е прилагана NaBPC157. При проучване на стойностите на серумната амилаза по отношение на контролните данни, се отбелязва значително по-малко завишаване (NaBPC157 приложена преди въздействието), както и ограничаване на вече повишените стойности (NaBPC157 приложена лечебно). Заедно с благоприятния ефект върху панкреатита, се наблюдава и положително повлияване на NaBPC157 върху пораженията на стомаха и дванадесетопръстника при плъхове с увредени жлъчни пътища, когато се прилага както преди, така и след третирането. NaBPC157 може да се използва за лечение на акутен панкреатит с допълнително положително въздействие върху съпътстваща гастродуоденална патология.

Пример 24. Ефекти върху кардиотоксичност

Материали и методики:

Експериментите се провеждат върху бели плъхове Wistar и морски свинчета Hartley. Кардиотоксичност се причинява чрез прилагане на разтвор от бариев хлорид (10 mg/kg телесно тегло), дезипрамин (10 mg/kg) дигиталис (обща доза 6,5 mg/kg) и изопреналин (15 mg/kg) през канула във вратната вена (югуларната вена). В допълнение се прилага доксорубицин в неколкократни дози (3 mg/kg подкожно, веднъж седмично в продължение на 13 седмици) и в единични дози (7 mg/kg венозно) и се провокира кардиомиопатия. Кардиотоксичност се предизвиква също чрез стрес на обездвижване като нефармакологично миокардно увреждане. NaBPC157 се прилага, както е показано по-долу:

1. Бариев хлорид

а) предварително (1 h преди въздействието): NaBPC157 50 pg/kg, 10 pg/kg и 10 ng/kg интраперитонеално;

б) след въздействието (след 60 s): NaBPC157 10 pg/kg и 10 ng/kg, венозно.

2. Дезипрамин: NaBPC157 50 pg/kg и 50 ng/kg интраперитонеално 1 h предварително.

3. Дигиталис: NaBPC157 50 pg/kg и 50 ng/kg венозно, в интервали от 15 min

4. Изопреналин: NaBPC157 50 pg/kg и 50 ng/kg венозно, 15 min предварително.

5. Стрес от обездвижване: NaBPC157 10 pg/kg и 10 ng/kg интраперитонеално, 1 h предварително и веднага след връзването и 24 и 48 h след обездвижването.

6. (а) Хронична доксорубицинова токсичност: NaBPC157 10 pg/kg и 10 ng/kg интраперитонеално едновременно с доксорубицин;

(б) остра доксорубицинова токсичност: NaBPC157 10 pg/kg и 10 ng/kg интраперитонеално, 1 h преди доксорубицин.

При моделите за аритмия електрокардиограма непрекъснато регистрира състоянието на анестезираните животни. Всеки 15 s или при появяването на ритьмни смущения се провеждат разширени записвания при 50 mm/s или 100 mm/s. При други модели се прави електрокардиограма еднократно или многократно с леко упоени животни със скорост на хартията 50 mm/s при разширено записване. Доксорубициновата токсичност се оценява чрез микроскопично и микроскопично изследване на сърцето и чрез биохимичен анализ на другите органи. Подобна методика се прилага и в теста със стрес вследствие обездвижване.

Резултати:

Отбелязва се антиаритмичен ефект на NaBPC157 в модела с предизвикана с бариев хлорид аритмия. При изследванията с предварително прилагане, NaBPC157 забавя и предпазва от появяване на аритмия и намалява и/ или предпазва от исхемия. При проучванията след въздействието с дразнителя, NaBPC157 предизвиква бързо преминаване в синусов ритъм и предпазва от възвръщане на аритмията.

NaBPC157 напълно предпазва от внезапно намаляване на скоростта на сърцето и появата на смущения, предизвикани от дезипрамин (PQ удължаване и QRS разширяване). NaBPC157 предпазва също така от вентрикуларна тахикардия, свързана с проаритмичен ефект на дезипрамин и сериозен атриовентрикуларен блок. Ефектът е в зависимост от дозата.

Нещо повече, NaBPC157 има селективни ефекти върху дигиталисиндуцирана кардиотоксичност. NaBPC157 проявява положителни ефекти при внезапно намаляване на сърдечната скорост и при ритъмни смущения (вентрикуларни екстрасистоли, вентрикуларна тахикардия и атриовентрикуларен блок), като не ги допуска или ги облекчава. Ефектът на NaBPC157 в нанограмови дозировки върху забавянето на състояния, предизвикани от токсични дози дигиталис, е незначителен. Ефектът е по-добре изразен при микрограмови дози от NaBPC157.

NaBPC157 ясно предпазва от исхемия и миокарден инфаркт. Ефектът е по-ясно изразен при микрограмовите дози. Еднократно предварително интраперитонеално приложение на NaBPC157 дава предпазване от електрокардиографично демонстрирана исхемия и хистологично миокардно увреждане при теста със стрес вследствие обездвижване. Приложение на NaBPC157 след въздействието при вече установени електрокардиографски промени също облекчава исхемията. Микрограмови дозировки на NaBPC157 дават увеличаване на волтажа на QRS комплекса, особено при предварителното му приложение.

Приложението на NaBPC157 води до значително намаляване на патоморфологичните констатации за антрациклинова кардиомиопатия (сериозни увреждания на миоцитите и стените на съдовете и вакуолизация) след единична, и в по-голяма степен след многократно прилагане на доксорубицин. LDH активността значително намалява, въпреки забележимото повишаване на абсолютните стойности.

В заключение, NaBPC157 се оказва приложима като антиаритмично, антиангиално и кардиозащитно средство.

Пример 25. Антидепресивна активност

Материали и методики:

Различни антидепресанти имат противоязвена активност и използваните понастоящем модели за изследване на язва и депресия имат много общи черти. Поради това, възможността депресивни смущения да могат ефективно да се повлияват от по същество противоязвено средство с цито-/органозащитна активност като NaBPC157, бе изследвана в два теста за депресия с плъхове: насилствен тест за плуване (метод на Porsolt) и хроничен непредсказуем стресов метод (след пет дни непредсказуем стрес), веднъж дневно прилагане на лекарство през време на стресовата процедура и оценяване чрез тест за неподвижност на четвъртия и шести ден от лечението.

Резултати:

При теста с насилствено плуване намаляването на времето на неподвижност при плъховете, на които е давано NaBPC157 (10 pg, 10 ng, 10 pg/kg интраперитонеално) отговаря на активността на животните, на които е давано 15 mg или 40 mg (интраперитонеално) от обичайните антидепресанти имипрамин или съответно ниаламид. Допълнително утежняване на експерименталните условия при хронична непредсказуема стресова обстановка води до липса на активност на имипрамин (30 mg), докато NaBPC157 (10 pg, 10 ng) подобрява в зависимост от дозата подвижността на хронически стресираните плъхове.

Пример 26. Модел на Паркинсонова болест

Материали и методики:

Прилагат се паркинсонгенични средства 1 -метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрахидропиридин (МРТР) (известен с това, че разрушава допаминовата нигростриатална система чрез образуване на свободни радикали) (30,0 mg/kg телесно тегло, интраперитонеално, веднъж дневно в продължение на 6 дни и след 4 дни еднократно 50,0 mg/kg телесно тегло, интраперитонеално) или резерпин (изчерпващ катехоламиновитедепа) (5,0 mg/kg телесно тегло, интраперитонеално) . NaBPC157 (1,50 pg или 15,0 ng/kg телесно тегло интраперитонеално) се прилага 15 min преди или алтернативно 15 min след всяко МРТР приложение. В резерпиновите изследвания NaBPC157 (10,0 pg или 10,0 ng/kg телесно тегло, интраперитонеално) се дава или 15 min преди резерпина, или при вече напълно установената каталепсия 14 h след това.

Резултати:

NaBPC157 много подобрява причинената от МРТР соматосензорна ориентация и намалява предизвиканата от МРТР хиперактивност. NaBPC157 намалява МРТР-моторните анормалности (треперене, акинеза, каталепсия, много изявени в животните, на които е приложен физиологичен разтвор и служещи за контрола), водещ до почти пълно избягване на нормалния смъртен изход при контролите, на които е въздействано с МРТР. При експериментите с резерпин NaBPC157 силно предпаз ва от развиването на каталепсия, която в противен случай е силно изявена. Когато се приложи след 24 h, NaBPC157 повлиява обратимо на настъпилата каталепсия. Освен това се наблюдава намалявана на резерпиновата хипотермия (NaBPC157 предварително приложен) и обратимо повлияване на по-нататъшен изявен температурен спад (NaBPC157 след въздействието) .

И двата по-горе използвани обичайни животински модела се считат за индикативни за човешки смущения и тяхното лечение. Благодарение на факта, че висока ефективност се отчита при изследванията при предварително и последващо приложение при дози от pg и ng, NaBPC157 се смята за много подходяща за приложение при лечението на Паркинсонова болест и подобни на Паркинсоновата болест патологии.

Нещо повече, наблюдаваният ефект при резерпинова хипотермия позволява заключението, че NaBPC157 е много подходяща при лечението на температурни смущения.

Пример 27. Ефекти при оздравяване на костни дефекти

Материали и методики:

Остеогенният ефект на костния мозък и TRIS-BPC157 при заздравяването на сегментални костни дефекти се изследва в 42 заека в продължение на шест следоперативни седмици. След направата на увреждането (0,8 сантиметров остеопериостален дефект, по средата на двете лъчеви кости) опитите, използващи костен мозък и TRIS-BPC157 (6 заека в група), се провеждат, както следва: поставя се физиологичен разтвор (2 ml мускулно и 2 ml местно във всеки костен дефект) в наранените животни и те се използват за контрола (група 1). Във втората и трета група всеки от костните дефекти се третира местно или с 2 ml автологичен костен мозък (на 7-ия ден след операцията), или с TRIS-BPC157 (10 pg/kg телесно тегло, на 7-ия и 14 ден след операцията). При групи четири, пет и шест TRIS-BPC157 се прилага мускулно или на 7, 9, 14 и 16 ден след операцията (10 pg/kg телесно тегло) или веднъж дневно в периода от 7 до 21 ден след операцията (10 pg или 10 ng/kg телесно тегло) . Като стандартно лечение веднага след образуването им, костните дефекти се запълват с автологична кортикална присадка.

Всички животни се убиват в шестата сле доперативна седмица. Сегментално дефектно заздравяване се установява с двуседмични радиографи и хистологични изследвания.

Резултати:

Паралелното сравняване на радиографите, взети в интервали на четири пъти (калусна повърхност, микрофотодензитометрия на костния дефект), и количествена хистоморфометрия откриват, че костен мозък, инжектиран местно в костния дефект, и TRIS-BPC157, приложен мускулно (особено при дневна доза от 10 pg/kg телесно тегло, в продължение на 14-дневен период) значително подобряват заздравяването на костите (р<0,001). Ефектът отговаря на този с автологична кортикална присадка.

Обсъждайки клиничните резултати от това изследване костен мозък и TRIS-BPC157 (особено при дневна доза от 10 pg/kg телесно тегло в продължение на 14 дни) облекчава заздравяването на костните дефекти. Благодарение на простото си приложение и малкия риск от усложнения, приложен местно автологичен костен мозък и по-специално мускулно приложени остеогенни вещества като TRIS-BPC157, имат предимство пред по-сложните хирургически методи (т.е. костни присадки, васкуларизирани костни присадки, методът на Ilizarov) при лечението и оздравяване на увреждания при хора.

Пример 28. Ефект при заздравяването на рани

Материали и методики:

Използва се NaBPC157 за установяване влиянието й върху различни елементи, свързани с оздравителния процес. Елементи, считани за съществени в процеса на оздравяване, са образуването на гранулираща тъкан, ангиогенезис и производството на колаген. Влиянието на NaBPC157 при образуването на гранулираща тъкан, образуване на колаген и ангиогенезис, както и якостта на разкъсване се изпитват, като се използват три експериментални модела с плъхове: 1) кожни рани от срязване; 2) дебело черво - анастомози на дебелото черво и 3) Esophago-дванадесетопръстникови анастомози. Веществата се оценяват хистологично за колаген, ретиколин и кръвоносни съдове, като се използват точкови и морфометрични методи.

Резултати:

При всички опити се констатират значителни различия между лекуваните с NaBPC157 плъхове и контролните. Експериментите показ ват много добър оздравителен процес, предизвикан от участието на NaBPC157. Тези ефекти се постигат по различни пътища на приложение, включително в стомаха и местно приложение. Нещо повече, оценката за якостта на скъсване има много по-високи стойности при лекуваните с NaBPC157 плъхове.

Въз основа на близкото сходство между животинския модел и съответните човешки смущения и високата степен на подобие между оздравителните процеси при плъхове и хора, NaBPC157 може да се използва в лечението за заздравяване на рани при хора.

Пример 29. Ефект при дихателни смущения

Материали и методики:

При опитите се използват морски свинчета (Hartley, от двата пола, 500-700 g телесно тегло) с плетизмография на цялото тегло, уретанова анестезия (1,5 g/kg интраперитонеално), изкуствено вентилиране при постоянно налягане (0,98 kPa) и отпускане на скелетната мускулатура чрез суксаметониум (0,2 mg/kg венозно). Надувният обем (шт, средни SD) се оценява преди и след прилагането на спазмогени (хистамин, серотонин, ацетилхолин, брадикинин, венозно) или NaBPC157 (10 min преди повторното прилагане на спазмоген, венозно).

Резултати:

Намаляване на надувния обем, предизвикан от серотонин, хистамин, ацетилхолин и брадикардин се инхибира от NaBPC157 (10 pg/kg телесно тегло, венозно и/или 10 ng/kg телесно тегло, венозно).

Въз основа на наблюдавания оздравителен ефект на NaBPC157 върху стесняването на бронхите, предизвикано от различните спазмогени, и известното близко сходство между използвания модел и човека, явно е успешното използване на NaBPC157 при лечението на различни смущения, свързани със стесняване на бронхите и/или смущения на дихателния път.

Пример 30. Ефект при белодробен хипертоничен синдром

Материали и методики:

Настоящите експерименти описват ефектите на азотен оксид (N0) агонисти и антагонисти и влиянието на NaBPC157 върху развитието на белодробен хипертоничен синдром (PHS) и пораженията на тъканите при пилета.

Проведени са опити за изследване на акутната токсичност. Те включват прилагането на единична доза от физиологичен разтвор (1 ml интраперитонеално), NaBPC157 (10 pg/kg телесно тегло), L-NAME (N0 агонист /в дози 50, 100, 150 mg/kg телесно тегло) и L-аргинин (N0 агонист /100 mg/kg телесно тегло/ с комбинацията (L-NAME + NaBPC157, L-NAME + L-аргинин)). Провеждат се патохистологични проверки на далака, сърцето, черния дроб и белите дробове и хематологични анализи. Провеждат се също експерименти за хронична токсичност. На животните се дава дневно в продължение на пет седмици L-NAME (10 mg/kg телесно тегло), L-аргинин (100 mg/kg телесно тегло), NaBPC157 (10 pg/kg телесно тегло) и техните комбинации (L-NAME + NaBPC157, LNAME + L-аргинин) интраперитонеално. По седем животни от всяка група, включително и от контролната (1 ml физиологичен разтвор интраперитонеално) се умъртвяват всяка седмица.

Резултати

Прилагането на L-NAME предизвиква PHS в пилетата. Този ефект се предотвратява чрез едновременно прилагане на L-аргинин и NaBPC157. Патохистологичните изследвания за акутната и хронична токсичност показват, че L-NAME предизвиква сериозни увреждания на тъканите (миокардна и хепатична клетъчна некроза и некроза на лимфоидните клетки в далака), докато L-аргинин предизвиква предимно конгестия, едема и хемораги във всички органи. Хематологичните анализи показват значително намаляване на хемоглобина и броя на левкоцитите в групите пилета, на които е поставяно L-NAME. Ефектите на L-NAME успешно се инхибират чрез прилагане на L-аргинин и NaBPC157. NaBPC157 не предизвиква никакво тъканно или органно увреждане.

Разглеждайки сходството на гореизползвания животински модел и съответните смущения при хората, NaBPC157 може да се използва за лечение на белодробен хипертоничен синдром. Нещо повече, успешното му прилагане при промишлено отглеждане на животни е очевидно.

Пример 31. Експериментална хепитония Материали, методики и резултати: При животни с високо кръвно налягане (Goldblatt hypertension) с два бъбрека (2К1С) или с един бъбрек (1К1С) NaBPC157 бързо смъква кръвното налягане (например 5 до 10 min след инжектиране). Този ефект продължава 20 min при 1К1С плъхове или най-малко 12 h при 2К1С животни. Ефектът се повтаря след второ или трето приложение след 24-48 h. По подобен начин при плъхове, хранени или със силно фруктозна (80%) или с много сол (15%) диета за продължителен период от време, NaBPC157 значително намалява постоянно увеличаващото се кръвно налягане до нормалните му стойности. Лечебният ефект е продължителен и толерантност не се развива до период от шест месеца. Не се забелязва влияние на NaBPC157 върху артериалното налягане.

В допълнение към намаляване на стойностите на повишеното кръвно налягане, NaBPC157 също предизвиква значително облекчаване или дори отстраняване на пораженията и смущенията, нормално появяващи се в различните органи, които са (след три седмици диета с увеличено количество сол в контролите): много сериозно хиалиново дегенериране с изявени паренхиматозни хемораги, дегенериране на артериалните съдове, вакуолизация на клетките в сърцето, сериозна конгестия (по-конкретно средната част) в надбъбречните жлези, сериозна конгестия, паренхиматозна хеморагия с хематура в бъбрека и хемосидероза и еритроцитопатия в далака. Съдовете са много по-малко увредени при лекувани с NaBPC157 плъхове, като същевременно има по-малко васкуолизиране на стената и отсъствие на хеморагии. Нещо повече, при плъховете, получавали NaBPC157, се доказва ясна защита срещу основни увреждания.

При използване на различни модели за хипертензия при животни NaBPC157, прилаган 10 pg или 10 ng/kg телесно тегло венозно, интраперитонеално или в стомаха, дава положителни резултати при различните дозировки. Разглеждайки явното сходство на тези модели със съответните състояния при хората, NaBPC157 може да се използва за лечение на високо кръвно налягане и на хора както и на уврежданията на различни органи, причинени от високото кръвно налягане.

Пример 32. Ефект върху времето на кървене

Материали и методики:

Ефектът на 2-АМР-ВРС157 върху времето на кървене при мишки и плъхове (със и без предварително третиране с хепарин) се из следва във връзка с активността in vitro върху параметрите на съсирване на човешка кръв.

Резултати:

При прилагане на 2-АМР-ВРС157,10 pg, 10 ng, 10 pg, 1 pg, 10 fg/kg телесно тегло интраперитонеално, едновременно с отрязване на опашката се забелязва зависещо от дозата намаляване на времето на кървене както при мишки, така и при плъхове. При предварително прилагане на хепарин (1000 IU/kg интраперитонеално) 2 h преди започване на кървенето при животните, на които е поставена 2-АМРВРС157 в доза 10 pg или 10 ng/kg телесно тегло, интраперитонеално, се наблюдава съществено намаляване на иначе силно увеличеното време на кървене. In vitro се показва, че при 2-АМР-ВРС157 в концентрация 10 pg/ml и инкубиране 1 h, параметрите на съсирване на човешката кръв не се повлияват. Така се предполага, че има ефект върху ендотелния слой.

Обсъждайки близкото сходство на механизма на кървене при хора и животни и широко признатата значимост на моделите за скриниране на средствата, 2-АМР-ВРС157 може да се използва за лечение на нарушено коагулиране (например хепаринизация).

Пример 33. Ефект върху експериментален диабет

Материали, методи и резултати:

Приложена интраперитонеално (10 pg/kg телесно тегло), NaBPC157 предпазва от развиването на алокеан, както и индуциран от стрептозотоцин диабет в плъхове. Намалена глюкозурия и по-малко единични температурни покачвания се наблюдават в продължение на 14 дни. В предварителните опити NaBPC157 е ефективна, когато се приложи в присъствието на вече установени 14 дневни алоксанови поражения. При следващи експерименти противодиабетичният ефект на NaBPC157 се проучва, като се фокусира върху възможната й активност при прилагането в стомаха. NaBPC157 (доза от 10 pg и 10 ng/kg телесно тегло) се комбинира с приложението на алоксан в количество 300 mg/kg подкожно или 200 mg/kg телесно тегло, приложена подкожно, предварително (24 h или 1 h преди прилагането на алоксан), съвместно или последващо (48 h след прилагането на алоксан). Най-общо NaBPC157 намалява повишените нива на глюкоза в серума и значително повишава преживяемостта на третираните с алоксан животни (ефектът е особено ясно видим в групите, третирани с поголеми дози алоксан). В допълнение на повишените нива на глюкоза в серума при третираните с алоксан животни, се наблюдават и повишени стомашни поражения в контролните диабетични плъхове. Всяка от NaBPC157 дозировки значително намалява сериозността на язвите, без оглед на условията на въздействие. Същите резултати се получават и при мишки.

Разглеждайки сходството между човешката патология и използваните модели и с оглед на широкото им приложение за скриниране на активността на средствата, NaBPC157 може да се използва за лечение на диабет.

Пример 34. Антиноцицептивни ефекти

Материали и методики:

Антиноцицептивните ефекти на NaBPC157 се оценяват в сравнение с аспирин и морфин, използвани за еталони при различни експериментални модели за директна/индиректна ноцицепция и невротоксичност; гьрчене (оцетна киселина/магнезиев сулфат), пршципване на опашка, гореща плоча и прилагане на капсаицин.

Резултати:

NaBPC157 (приложена в доза от ng или pg/kg интраперитонеално) значително намалява реакциите на гьрчене (възпалителни и невъзпалителни, зависещи и независещи от простагландин) и в теста с прищипана опашка. При теста с гореща плоча NaBPC157, за разлика от морфин, няма ефект при нормални животни. NaBPC157 се прилага предварително или веднъж дневно в продължение на 14 дни след инжектиране на капсаицин. При опита NaBPC157 силно намалява капсаициновата алодиния. Това намаление на ефекта на капсаицин не се получава, когато NaBPC157 се прилага в присъствието на установен капсаицинсоматосензорна невронна дегенерация (приложена само на 14-ия ден след капсаицина). След като неизбежното соматоневронно изчерпване след прилагане на капсаицин може напълно да се избегне с ежедневно приложение на NaBPC157, то е възможно ефектите на NaBPC157 да се свържат конкретно с целостта на капсаицин сензитивните соматозензорни неврони и тяхната защита (т.е. основно афарентни неврони, притежаващи с малък диаметър сомата и немиелинирани (С1) или тънко миелинирани (А-8) фибри).

Разглеждайки, че капсаицин ще предиз вика по същество същите смущения при хора и животни, NaBPC157 може да се използва за лечение на различни причиняващи болка смущения, както и състояния след соматосензорно невронно функционално увреждане.

Пример 35. Ефект върху конвулсии

Материали и методики:

Изследва се ефектът на КВРС157 върху конвулсии, предизвикани от бикукулин, пикротоксин, стрихнин и изониазид. КВРС157 (100 pg, 10 pg или 10 ng/kg телесно тегло) се прилага интраперитонеално едновременно или 15 min преди прилагането на конвулсивните средства (mg/kg телесно тегло, интраперитонеално) пикротоксин (3), стрихнини (6, 3 или 1.5), бикукулин (2.5) и изониазид (800 mg).

Резултати:

КВРС157 проявява положителен (зависещ от дозата и времето) антиконвулсивен ефект срещу всички приложени конвулсанти. Разглеждайки сходството на използваните модели със състоянията при хората, КВРС157 може да се използва за лечение на конвулсивни смущения.

Пример 36. Увреждания на гръбначния мозък

Материали и методики:

Увреждане на гръбначния мозък се предизвиква в мъжки бели плъхове порода Wistar чрез контролирано притискане (васкуларна щипка Aesculap 0,10-0,15 N) върху оголен гръбначен мозък (на ниво Th 12) в продължение на 30 s. На животните веднага след увреждането и веднъж дневно до 10-ия ден след увреждането се прилага NaBPC157 (10 pg, 10 ng/kg телесно тегло, интраперитонеално) или физиологичен разтвор. Животните се умъртвяват 24 h след последното прилагане на лекарство.

Резултати:

Провежда се внимателно проучване както клинично (оценява се дневно по точкова система 1-5), така и микроскопски. Резултатите показват силно облекчаване на продължителната парализа (при контролните плъхове) в плъховете, на които е прилагана NaBPC157. Имайки предвид сходството на използваните модели и състоянията при хората, NaBPC157 може да се използва при лечението на увреждания на гръбначния мозък.

Пример 37. Хронична алкохолна интоксикация

Материали и методики:

Изследва се ефектът на NaBPC157 при хронична алкохолна интоксикация. За тези експерименти се използват мъжки бели плъхове Wistar. На плъховете се дава да пият търговско уиски или етанол (10-20%-ен воден разтвор) в продължение на три месеца. Прилага се NaBPC157 (10 gg, 10 ng/kg телесно тегло), пропранолол (10 mg/kg телесно тегло) или ранитидин (10 mg/kg телесно тегло) (контролните плъхове получават еднакъв обем физиологичен разтвор 5,0 ml/kg) в стомаха или интраперитонеално, било профилактилно (10 дни преди започването на алкохола) или заедно с алкохола или лечебно (започва се в края на двумесечния период, т.е. през време на последния месец от експеримента).

Резултати:

Директно оценяване на кръвното налягане в порталната вена ясно показва, че NaBPC157, както и пропранолол (дадени при всичките дози) значително предпазват и/или намаляват увеличеното налягане в порталната вена на контролните плъхове. За разлика от тях ранитидин води до дори по-увеличено портално налягане от това в контролните животни. Освен това NaBPC157, повече от пропранолол, облекчава напредналите увреждания на стомаха при плъховете, на които е даван алкохол. Подобен облекчаващ ефект се забелязва и при други поразени органи (бъбреци, сърце).

Обсъждайки тези постоянни положителни ефекти и всеизвестното правило, че увеличено поемане на алкохол води до сходни промени при хора, очевидно е, че NaBPC157 може да се прилага при лечението на алкохолни увреждания.

Пример 38. Ефекти върху мозъчни исхемични смущения

Материали и методики:

NaBPC157 (10 gg или 10 ng/kg телесно тегло, интраперитонеално) или физиологичен разтвор (5,0 mg/kg телесно тегло, интраперитонеално) се прилага 1 h предварително или 1 h след като двете каротидни артерии на плъховете са лигирани за 3 или 6 h.

Резултати:

Много положителен ефект на NaBPC157 се наблюдава при предварително (1 h преди лигиране) както и при последващо (1 h след лигиране) приложение. Това е и при двете дози в границите на gg и ng и в двата случая на три- и шестчасовите изследвания. Освен точковото оценяване се наблюдават и сериозни периваскуларни и едеми на мозъчната тъкан с мозъчна конгестия. Отбелязват се и пространствата на демиелинизиране, по-конкретно в церебелума. Всички тези прояви са много помалко изразени при групите животни, на които е прилагана NaBPC157, независимо от условията на въздействие.

Обсъждайки сериозните исхемични поражения, забелязани при контролите, и явно сходството между исхемични смущения при плъхове и хора, NaBPC157 би могла успешно да се прилага при лечението на мозъчни исхемични смущения.

Пример 39. Ефект при нервно увреждане Материали и методики:

Изпитва се ефектът на NaBPC157 върху регенерирането на периферните нерви. На анестезирани възрастни мъжки плъхове порода Wistar (225-250 g) десният седалищен нерв се открива, изчиства се от свързващи тъкани и се отделя на 5 cm от седалищната вдтьбнатана. Използват се три перинуерални атрафи (10,0 Ethilon, Ethicon) за анастомозата, осигуряващи правилно подреждане на снопчетата. Животните се третират или локално на мястото на анастомозата чрез баня от 1 ml NaBPC157 (2 gg/ml или 2 ng/ml), в стомаха или интраперитонеално (10 gg или 10 ng/kg телесно тегло) веднага след анастомозното образуване. Контролните животни получават равен обем физиологичен разтвор. В означените дни след операцията (дните 3, 6, 9, 12 и 30) се провеждат функционални тестове. Тези тестове включват тест с гореща вода (60°С), тест със студена вода (2°С), анализ на следите при ходене, EMGкрайна латентност и амплитудата на СМАР. Също така се провеждат хистологични и морфометрични анализи. При другите експерименти, използвайки същата хирургическа методика и същото място на нерва, се предизвиква увреждане чрез смачкване с микрохирургичен форцепс за 60 s и на мястото се прилага NaBPC157. Оценяването се извършва след 2, 7, 10, 50 и 100 дни.

Резултати:

Клиничните, както и микроскопичните оценки, особено в първоначалния период показват, че NaBPC157 значително подобрява оздравяването на увредените плъхове.

Обсъждайки близкото сходство между увреждането при животни и хора, NaBPC157 може да се използва при лечението на увреждания на периферните нерви.

Пример 40. Ефект при невролептични смущения

Ефектът на NaBPC157 се изследва при различни предизвикани невролептични смущения.

Материали, методики и резултати:

Прилагане на NaBPC157 (10 pg или 10 ng/kg телесно тегло, интраперитонеално) значително облекчава халоперидолова и флуфеназинова (халоперидол 0,625, 1,25, 2,5, 5,0 и 10,0 mg/kg телесно тегло, интраперитонеално, флуфеназин 0,3125,0,625, 1,25, 2,5 и 5,0 mg/kg телесно тегло, интраперитонеално (4,0 ml/kg)) каталепсия при по-ниските дози и на двата невролептика в последващи интервали от време. В допълнение към оздравителния ефект на ниските дози на невролептици, дори по-добър антикаталептичен ефект на NaBPC157 се появява при по-високите дози на двата невролептика при дози от pg и ng NaBPC157. Този ефект се забелязва също така при соматозензорна ориентация на сулпирид (20, 40, 80 и 160 mg/kg телесно тегло, интраперитонеално) третирани животни, въпреки че не се наблюдава каталепсия при контролните сулфпиридни мишки.

Очевидно е благоприятното приложение на NaBPC157 при лечение на смущения, свързани с допаминови системи, каталептични смущения и невролептични нарушения.

Пример 41. Приложение при лечението на шок

Материали и методики:

Проучва се експериментален хеморагичен шок при анестезирани плъхове (канюли в обикновена каротидна артерия и във вратна вена). Отстранява се контролиран обем кръв до настъпването на смърт или стабилизирано ниско налягане (30-35 mm Hg). При тези експерименти се прилага СаВРС157 (10 pg или 10 ng/kg телесно тегло) или физиологичен разтвор интраперитонеално (3,0 ml/kg) след период от 5 min на стабилно ниско кръвно налягане.

Резултати:

По отношение на контролните стойности се поддържа загуба на значително по-голям обем кръв преди смъртта (която е зависеща от дозата) при плъховете, на които е приложена СаВРС157. При животните, на които е въздействано с СаВРС157, може да се отдели по голям обем кръв и имат по-високо кръвно налягане, получава се бързо и значително повишаване на кръвното налягане без смърт. Това контрастира с кратко и слабо повишаване на кръвното налягане и 75% смъртност преди изтичането на 45-минутен експериментален период при контролната група. Плъхове, подложени само на хирургическа намеса след анестезиране, но не аксангуирани, СаВРС157 (интраперитонеално или венозно), приложена след 65-минутен стабилизационен период, не повлиява значително на артериалното кръвно налягане в същия период.

Пример 42. Ефект върху ненормални лимфоцити

Материали, методики и резултати:

Изследват се имунологични прояви в две пациентки, страдащи от рядка клинична наследствена еозинофилия, свързана с интраепидермален болусен дерматит и субакутен склерозиращ паненцефалит. Проучва се ефектът на NaBPC157 (in vitro) върху лимфоцитните хромозомни отклонения (аберации) и Т клетъчни пролиферации. NaBPC157 предизвиква значително намаляване на тежките типове хромозомни аберации (т.е. нормализира лимфоцитните прояви) и показва стимулиращ ефект на митозисните цикли.

Пример 43. Ефект при деформации (уродливост)

Материали и методики:

Изследва се ефектът на NaBPC157 върху предизвикани с витамин А деформации при мишки. Едновременно с витамин А (15,700 IU/kg телесно тегло, мускулно) се прилага NaBPC157 (10 ng/kg телесно тегло или 10 pg/kg телесно тегло, интраперитонеално) или физиологичен разтвор (5 ml/kg телесно тегло, интраперитонеално) на десетия ден от бременността. За контроли се използват мишки, на които не се прилага витамин А, но получават физиологичен разтвор в същата доза и по същото време.

Резултати:

Многобройни деформации се получават вследствие прилагането на витамин А. Значително намаляване на техния брой се наблюдава при групите, на които се прилага NaBPC157. Явно е благоприятното въздействие на NaBPC157 при лечението на смущения в зародиша.

Пример 44. Овариектомия

Материали и методики:

Провежда се обикновена овариектомия.

NaBPC157 се прилага (10 pg или 10 ng/kg телесно тегло, интраперитонеално) или веднъж дневно в продължение на 28 дни, или веднъж дневно 14 дни, като се започне от 15-ия ден след овариектомията. Последното приложение е 24 h преди умъртвяването на животните. Други групи получават едно единствено pg приложение на 15-ия ден след овариектомията. За контрола се използват пет групи: 2 групи са овариектомизирани, дава им се физиологичен разтвор и се убиват на 15-ия и 28 ден след овариектомията, 1 група не е овариектомизирана, но й се дава физиологичен разтвор и на 2 неовариектомизирани групи се дава NaBPC157 (10 pg или 10 ng/kg телесно тегло, интраперитонеално) веднъж дневно в продължение на 28 дни. От всяко животно се взимат вагинални натривки 5 min преди хирургическата намеса и в дните 9, 14 и 28 от експеримента и се оцветяват по Рар за цитологично изследване. Степента на съзряване на вагиналния епителни се изразява посредством стойности на съзряване. След убиването се взимат кости от крайниците на всяко животно за биомеханично изследване, както накратко е описано по-долу.

Биомеханично изследване

Всички кости се проверяват в зависимост от различните моменти на огъване (едноточково огъване) (момент на огъване Nm) в различни посоки, напред-назад и наляво-надясно. При този опит се използват фемолани и тибиални кости. Крайните части на костите се фиксират с костен цимент (Palacos) в 1 cm дълги метални тръбички. Последните се фиксират в натоварваща система. Костите се поддържат непрекъснато влажни. Измерва се дължината на свободната част, както и дължината от фиксираната част до мястото за натоварване. Експериментът се провежда съгласно принципа на огъване на пръчка, фиксирана в една точка, в границите на еластичност. Тежестите са 0,1, 0,2, 0,5, 0,7, 1,0 N. Деформацията или ъгълът на огъване се измерва като ъгъл на отклонение на лазерен лъч, който се пречупва от малко огледало, фиксирано в края на костта. Теглото на огледалото се прибавя към приложената сила на огъване. Милиметровата хартия, към която е насочен лазерният лъч, е на разстояние около 1,5-1,8 m от костта, върху която е качено малкото огледало. Ъгълът на деформация се измерва, като се използва тригонометричен метод. При всяко от делно натоварване се измерват остатъчната деформация (и последващото възстановяване). След разтоварване, костта се връща в изходната си позиция, с което се доказва, че няма структурни промени в костта и че натоварването е в границите на еластичност по диаграмата на Hook. Това наблюдение показва, че е възможно същата кост да се натовари два пъти в различни посоки, без да се промени структурата й. Ако не се наблюдава остатъчна деформация в продължение на две следващи минути или се постигне пълно възстановяване, тези точки се определят като крайни (общо взето времето на измерване е приблизително 30 s (овариектомизирана контрола) или 16 min (здрави)). Костната ъглова деформация (натоварване и възстановяване след натоварването) се изразява в mm/s.

Резултати:

Дневното прилагане и на двете дози от NaBPC157 води до забележително подобряване стойността на съзряване в сравнение с атрофичното намалено съзряване при нелекуваните контролни плъхове. Така се предполага, че NaBPC157 е способна да предпази от предизвикана чрез кастрация вагинална атрофия при плъхове.

При овариектомизираните контролни групи се наблюдава най-малката амплитуда на огъване с най-кратко време, както и най-ниската амплитуда на възстановяване. Същите ниски стойности се получават и при двете контролни групи, убити на 15-ия или 28 ден. Това се забелязва и в двете овариектомизирани групи, на които е прилаган физиологичен разтвор (умъртвени или на 15-ия, или на 28-ия ден). Положителна тенденция се наблюдава в групата, която получава еднократно pg-приложение на NaBPC157 на 15-ия ден след овариектомията. Значително по-добри резултати се получават при всички други групи, на които е прилагана NaBPC157, било в ng или pg. Найдобри резултати се получават в групата, получаваща ежедневно NaBPC157- pg-ово лечение в продължение на 28 дни. Всички параметри на овариектомизираните животни се подобряват значително и степента на подобрение показва тенденция за достигане стойностите при здравите групи. Не се забелязват различия при здравите групи, независимо дали са получавали физиологичен разтвор или NaBPC157 (pg или ng-ови дозировки).

Обсъждайки общоприетата значимост на тези животински модели за състояния при овариектомия при хора както по отношение на вагинална атрофия, така и за развиване на остеопороза, очевидно е, че NaBPC157 може да се прилага при лечение след овариектомия.

Пример 45. Тумори

Материали, методики и резултати:

Един от често използваните модели при експериментални тумори включва оценяването на броя на метастазите на карцинома и меланома В-16 при мишки. Тези различни модели на експериментални тумори имат значително сходство със смущения, наблюдавани при хора. Приложена в различни експерименти, NaBPC157 показва намаляване на броя на метастазите по отношение на съответните контроли. Асцитният тумор на Ehrlich (EAT) е тумор, който може да расте във всички видове мишки. Той може да расте в асцитна или твърда форма в зависимост от начина, по който туморните клетки са приложени. Въпреки че найобщо животински туморни модели имат само частично сходство с човешкото заболяване, използването на този модел е признато, поради полезността му при изследване на противотуморни средства.

Най-често преживяемостта на мишки, инжектирани с Ерлихови асцитни туморни клетки, е ограничена до по-малко от 25 дни. Предварителното инкубиране на туморните клетки с NaBPC157 (2 gg/ml) води до удължен живот на животните, инжектирани с тези туморни клетки. Повече от 90% от животните преживяват до края на 45-дневния наблюдателен период. В допълнение различни цитостатични лекарства предизвикват невропения в пациенти, както и при експерименталните животни. Циклофосфамид е обичайно използвано средство за предизвиканата невропения. Прилагането на циклофосфамид (180 mg/kg, интраперитонеално) предизвиква значителни смущения. NaBPC157 предпазва от невропения, намалява ретикулоцитите и подобрява хемоглобиновите стойности.

Следователно, антитуморният потенциал на NaBPC157 е явен. Обсъждайки явното сходство на животинските модели и човешките състояния и получения благоприятен ефект в експериментите in vivo и in vitro, NaBPC157 може да се прилага за противотуморно лечение. NaBPC157 е подходяща за облекчаване на вредните цитостатични ефекти.

Пример 46. Противовирусна активност

Материали и методи:

ARBO-вируси (Tick Bom Encephalitis (ТВЕ), Bhania, Dengue 1,2,3,4, Sinbis, West Nile, Ealovo), Hepatitis A, Lymphatic Choriomeningitis (LCM) и Herpes тип 1 се прилагат подкожно (илиперорално (следоперативно)-Hepatitis А) като вирусни суспензии в разреждане 10^-2 (0,02 ml/мишка). NaBPC157 (20 gg/kg телесно тегло) или 0,9% NaCl (0,02 ml/мишка) се прилагат подкожно или ентраперитонеално а) предварително, б) едновременно с приложението на вируса или в) 4 дни след заразяването в присъствие на установени болестни симптоми.

Резултати:

Значително забавяне на настъпването на болестните симптоми и последващата смърт (в противен случай настъпваща на 4-ия или 5-и ден след заразяването в контролните животни) се отбелязва при едновременно прилагане на NaBPC157 с вирусите. Когато се прилага в присъствието на сериозна болестна картина, се отбелязва значително удължаване на времето на преживяване. Очевидно е обаче, че при предварителното даване на NaBPC157 отсъстват всякакви симптоми на болест или последваща смърт.

За потвърждаване на получените резултати, вирулентността на прилаганите вирусни суспензии (ARBO-вирус заразени) се изпитва чрез инокулиране на мозъчна суспензия, приготвена от мишки, които предварително са третирани с NaBPC157 или физиологичен разтвор и са преживяли при NaBPC157 (въпреки вирусната зараза) или спонтанно са умрели съответно при физиологичния разтвор. За разлика от инокулираните с физиологичен разтвор мозъчни суспензии мишки (които не се различават от мишките, инокулирани с вирусна суспензия и лекувани с физиологичен разтвор) не се наблюдават болестни симптоми или смърт при мишките, на които е поставено NaBPC157мозъчна суспензия. Мишките се наблюдават в продължение на 50 дни след инокулиране с мозъчната суспензия.

Благоприятните ефекти на NaBPC157 са устойчиви при инкубиране при повишена температура (56°С в продължение на 30 min).

Считайки, че тези вируси предизвикват подобни смущения при хора, NaBPC157 може да се използва при лечението на вирусни за25 болявания, особено при терапия, при която общото състояние е забележимо влошено (например СПИН и сродни на СПИН състояния).

Пример 47. Поражения на червата

Материали и методики:

Ефектите на NaBPC157 (10 pg или 10 ng/kg интраперитонеално, в стомаха) се изследват при плъхове в сравнение с няколко стандартно използвани средства, при няколко опитни язвени модели (48 h задържан стрес, подкожно цистеамин, в стомаха 96% етанол, NSAIAsпоражения, DNFB (динитрофлурхензен), рефлуксен езофагит след езофагоиеиунална термина-латерална анастомоза) при предварително, съвместно или последващо лечение.

Резултати:

Само NaBPC157 дозировките са ефективни при всички изпитани модели. Бромокриптин, аматадин, фамотидин, симетидин и соматостатин са неефективни (при задържан стрес) или само частично ефективни (бромокриптин, DNFB-чревни поражения; сукралфат, ранитидин, холестирамин, рефлуксен езофагит. Обсъждайки използването на стандартните пептиди, се отчита зависеща от дозата защита (цистеамин) и/или частично положителен ефект (в зависимост от лекуваното състояние) (етанол) при използване на глукагон, NPY и секретни, докато ССК (26-30) не е ефективен.

Всички тези модели се използват за скриниране на прилаганите понастоящем средства при лечението на стомашно-чревни поражения и от тях се вижда благоприятното въздействие на NaBPC157 върху целия стомашно-чревен път.

Пример 48. Ефект при смущения на познавателната способност

Материали и методики:

Приложението на антихолинергични средства (скополомин, атропин, 10 mg/kg телесно тегло, интраперитонеално) значително намалява познавателната способност при плъхове, едно откритие успешно възпроизводимо за оценяване на държанието на животните във воден Т-лабиринт за продължителен период.

Резултати:

При плъховете, получили скополомин и атропин, се получава увеличаване на броя на грешките в сравнение с контролните животни. Този познавателен недостиг преминава (получените стойности са равни на контролните стойности) при следващо съвместно прилагане на

NaBPC157 (10 pg или 10 ng/kg, интраперитонеално) .

Имайки предвид широковъзприетата значимост на тези модели при увреждане на познавателните способности на човек, явно е, че NaBPC157 може да се прилага при лечението на познавателни смущения.

Пример 49. Ефект при смущения от въздържание

NaBPC157 проявява антиконвулсивен ефект, взаимодейства с САВАергичната система и подобрява диазепамовата ефективност, когато се прилага съвместно (10 pg/kg, 10 ng/kg интраперитонеално) с диазепам (5,0 mg/kg интраперитонеално, два пъти дневно в продължение на 10 дни). NaBPC157 намалява диазепамовата толерантност и отлага ефектите от въздържанието и физическата зависимост. При опити за толерантност 42 h след режима на кондициониране, се наблюдават по-кратки преконвулсивни латентности от тези в здрави мишки, следващи лечение с изониазид (800 mg/kg интраперитонеално) ако отново се даде диазепам (5,0 mg/kg интраперитонеално) на мишки, предварително кондиционирани само с диазепам. Това напълно се избягва при животни, кондиционирани с NaBPC157 (двете дози) и диазепам. При опит за физическа зависимост (оценявано на 6, 14, 42 и 72 h след кондициониращото лечение) се забелязват по-кратки преконвулсилни латенции при кондиционираните с диазепам мишки отколкото в некондиционираните здрави мишки след изониазидно лечение 42 и 72 h след кондициониращото лечение. NaBPC157 (10 pg/kg доза), комбинирана с диазепам, отлага този ефект до последния наблюдаван интервал. В тази група на 6 h интервал, за разлика от кондиционираните с диазепам мишки, изониазидните преконвулсивни латентности са още по-продължителни от съответните контроли. NaBPC157 не дава ефекти на толерантност.

Разглеждайки значението на тези модели за състоянията при хората, очевидно е, че NaBPC157 е приложим в лечението на смущения вследствие въздържание.

Пример 50. Ефект при бъбречни смущения

Материали и методики:

Живачен хлорид (1 mg/kg венозно) или цисплатинум (10 mg/kg подкожно) предизвикват остри бъбречни увреждания при експери менталните животни. Когато се приложат по този начин, бъбречните смущения много съвпадат със съответните заболявания при хората. Следователно, предизвиканите в плъхове пораженията са в голяма степен сходни със съответните при хората.

Резултати:

NaBPC157 значително намалява пораженията при плъхове при прилагане както предварително, така и след това. Унилатерална нефректомия дава забележимо функционално свръхнатоварване и функционална хипертрофия на останалия бъбрек. Лечението с NaBPC157 увеличава диурезата при унилатерално нефректомизирани животни и намалява хипертрофията на останалия бъбрек. Съгласно условията на функционалната теория на компенсаторната бъбречна хипертрофия, тези открития подчертават подобрена функция на оставащия бъбрек. Това се потвърждава и от допълнителни биохимични резултати. Тези данни напълно съвпадат с ефектите, получени при плъхове с високо кръвно налягане с бъбречна артериална стеноза и/или енилитерална нефректомия. Очевидно е полезното приложение на NaBPC157 в лечението на бъбречни смущения.

Пример 51. Клетъчна имунна реакция на периферни кръвни лимфоцити

Изследват се клетъчни имунни реакции на периферни кръвни лимфоцити към ВРС в контроли и пациенти с различни заболявания, представени на таблица 2. Периферни кръвни Т клетъчни реакции към ВРС се изпитват чрез описания от deSmet at al. метод (deSmet MD., et al., “Cellular immune responses of patients with uveitis to retinal antigens and their fragments”, Am. J. Ophthal., 110; 135-142, 1990) със 7дневни клетъчни култури. Клетките се инкубират без антиген и с 20 pg/l антиген (ВРС157 пентадекапептид). За всеки пациент стимулиращият индекс се изчислява чрез разделяне на средния брой от стимулирани с антиген култури със средния брой от контролните клетъчни култури, в които не е прибавен антиген, т.е. ВРС157 петадекапептид. Резултатите са дадени на таблица 2.

Контролните стойности на < 2, измерени в контролните вещества (таблица 2), отговарят на стойностите на други изследователи на пептиди с подобни молекулни тегла, т.е. няма чувствителност на периферните кръвни лимфоцити спрямо ВРС157 пентадекапептид в контролните обекти. При пациентите с различни заболявания, забележимата клетъчна реакция към ВРС, представена на таблица 2, показва системна лимфоцитна сенсибилизация към този пептид на стомашен сок. Тези данни ясно показват присъствието на ВРС-свързани смущения в пациенти, страдащи явно от различни заболявания. Това подсказва за използването на ВРС-сродни средства (например солите на пентадекапептида ВРС157) в имуномодулаторно лечение на съответните смущения.

Таблица 2.

Повишени стимулиращи индекси на периферни кръвни Т клетки в 11 пациенти с различни заболявания

заболяване	пол	стимулиращ индекс контролни стойности < 2
пептична язва	ж	26.82
множествена склероза	ж
subscute sclerosans pancencephalitis	ж	2.54
оптичен неврит	м	3.54
оптичен неврит	ж	9.53
uveitis	ж	16.87
uveitis	м	15.21
uveitis	ж	22.30
серонегативна спондилоартропапатия	ж	4.99
наследствена еозинофилия и boilous dermatitis	ж	2.70
uveitis	ж	4.75

Резултатите от гореописаните фармакологични изследвания показват по-добрата активност на солите на ВРС пептидите при защита на организмите срещу стрес и заболявания и най-общо за нормализиране на органичните функции. Пептидните соли от изобретението са също ефективни за предпазване и лечение на различни заболявания и смущения при хора и/или животни.

Claims (15)

1. Патентни претенции

   1. Сол на ВРС (телесно защитно съединение) пептида, включващ 8 аминокиселинни остатъка, в която анионът на солта е отрицателно натоварен пептид с обща формула [Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala]'·’^<2·’ (I) в която Xaa е неутрален алифатен аминокиселинен остатък, Yaa е базичен аминокиселинен остатък, Zaa е киселинен аминокиселинен остатък, и в която катионът на солта е катион на неорганична или органична нетоксична база.
2. 2. Сол съгласно претенция 1, в която катионът е подбран от групата, състояща се от алкален метал, алкалоземен метал, Zn²⁴, първичен, вторичен или третичен амин, по-специално Na⁺, К⁺, Li⁺, Cs²⁺, Са²*, NH/, триетаноламин⁺, циклохексиламин*, 2-АМР* (2-амино-1пропанол) или TRIS+ (трис-(хидроксиметил)аминометан).
3. 3. Сол съгласно претенции 1 или 2, в която Хаа означава Ala, bAla, Leu, lie, Gly, Vai, Nle или Nva; Yaa означава Lys, Arg, Om или His и Zaa означава Glu, Asp, Aad или Apm.
4. 4. Сол съгласно всяка от предходните претенции, която съдържа още фармацевтично или диагностично приемлив носител.
5. 5. Сол съгласно всяка от предходните претенции, която съдържа още трехалоза.
6. 6. Сол съгласно всяка от предходните претенции, която има обща формула

   Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp 5 10

   Zaa Ala Xaa Xaa Xaa
7. 7. Сол съгласно всяка от предходните претенции, в която пептидът е подбран от групата, състояща се от:

   Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp

   510

   Ala Leu Gly Vai;

   Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp

   510

   Ala Gly Leu Vai;

   Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp

   510

   Ala Leu Gly Vai;

   Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Lys Pro Ala Asp Ala 510

   Leu Gly Vai;

   Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala

   510

   Gly Leu Vai;

   Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala;

   Asp Pro Pro Pro He Arg Pro Ala Asp;

   Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp;

   Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala

   510

   Leu Gly Vai;

   Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp и

   510

   Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asn.
8. 8. Сол съгласно всяка от предходните претенции, в която пептидът е циклизиран, поспециално чрез амидна връзка между първия и последен аминокиселинен остатък.
9. 9. Сол съгласно всяка от предходните претенции, където солта е разтворена във воден или водно/алкохолен разтвор, за предпочитане при pH 6,0 до 8,5.
10. 10. Поносим, стабилен при съхранение фармацевтичен състав, включващ фармацевтично ефективно количество от ВРС пептидна сол, съгласно всяка от предходните претенции, и в даден случай физиологично приемлив носител.
11. 11. Фармацевтичен състав съгласно претенция 10 за перорално приложение в смес с трехалоза.
12. 12. Диагностичен, стабилен при съхранение състав, включващ диагностично ефективно количество от ВРС пептидна сол, съ гласно всяка от предходните претенции.
13. 13. Използване на ВРС пептидна сол, съгласно всяка от претенциите от 1 до 9 за получаване на поносим, стабилен при съхранение фармацевтичен състав, съгласно претенция 10 за лечение на:

    - смущения, свързани или с образуване на азотен оксид (N0), или нарушена функция на NO-системата, по-специално високо кръвно налягане, ангина, импотентност, септичен или в резултат на нарушено кръвообращение шок, удар, възпаление, дихателен дистресов синдром, адхезия и съсирване на тромбоцити и левкоцити, ендотелиални дисфункции, стомашно-чревни увреждания, смущения в перисталтиката, Diabetes pancreatitis, ниско кръвно налягане и Паркинсонова болест; дисфункция или хиперфункция на соматосензорните нерви, поспециално сензорна невропатия, постерапевтична невралгия, атопичен дерматит, нарушено заздравяване на наранени тъкани, придобита студова и топлинна уртикария, псориаза, bullous pemphigoid, фотодерматоза, хроничен артрит, стомашно-чревни поражения и специфична или неспецифична свръхреактивност на горните и долни дихателни пътища (астма, ринит);

    - ендотелиумни смущения;

    - рани, язви;

    - състояния, свързани с остри и/или хронични възпаления, по-специално вторичен артрит и смущения, свързани със забавен тип свръхчувствителност и стомашно-чревни поражения; смущения в черния дроб, поражения в органите, предизвикани от свободни радикали, по-специално предизвикани от облъчване; смущения, свързани със смущения в катехоламинергачна система, по-специално шизофрения;

    - предизвикани от амфетамин ефекти, отказване от лекарства;

    - свързани със стрес състояния;

    - акутен панкреатит, особено със съпътстваща гастродуоденална патология;

    - сърдечни смущения;

    - депресивни смущения;

    - Паркинсонова болест и патология, подобна на Паркинсоновата болест;

    - температурни смущения;

    5 - наранявания на костите;

    - предизвикани от високо кръвно налягане органни увреждания;

    - смущения в коагулацията;

    - конвулсивни смущения;

    10 - наранявания на гръбначния мозък;

    - алкохолни увреждания, предизвикани от отказване от алкохол или от увеличено приемане на алкохол;

    - мозъчни исхемични смущения;

    15 - повреди на периферните нерви;

    - каталептични смущения и невролептични смущения;

    - смущения, свързани с ненормални или мутантни лимфоцити;

    20 - смущения във фетуса;

    - вагинална атрофия и остеопороза, предизвикана от овариектомия;

    - тумори;

    - вирусни заболявания, по-специално 25 СПИН или ARC;

    - стомашно-чревни поражения;

    - познавателни смущения;

    - смущения, в резултат на въздържание;

    - бъбречни смущения и

    30 - смущения в клетъчната имунна реакция.
14. 14. Използване на ВРС пептидна сол съгласно всяка от претенциите от 1 до 9 за получаване на поносим, стабилен при съхранение фармацевтичен състав, съгласно претенция 10

    35 като цитозащитно и органозащитно средство.
15. 15. Метод за получаване на ВРС пептидна сол съгласно всяка от претенциите от 1 до 9, чрез смесване на най-малко един ВРС пептид във воден или водно-алкохолен разтворител с една или

    40 повече бази и получаване на ВРС пептидната сол, при което катионът на солта е катион на неорганична или органична нетоксична база.