MXPA04011679A - Sistema de expresion eucariotico inducible. - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones y metodos para la expresion inducible de genes en celulas eucarioticas. La expresion de una secuencia nucleotida de interes se controla por la proteina de fusion reguladora que consiste de un dominio de bloqueo de transcripcion y un dominio de enlace al ligando. Cuando el ligando cognado para el dominio enlazado al ligando se presenta, la transcripcion de la secuencia de nucleotido de interes se bloquea. Una vez removido el ligando cognado, la secuencia de nucleotido de interes se transcribe. El metodo es util para una produccion a gran escala de un producto deseado en celulas eucarioticas.

Description

SISTEMA DE EXPRESION EUCARIOTICO INDUCIBLE Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos para la expresión inducible de genes en células eucarióticas . La invención incluye además células que pueden hacer la expresión de genes inducibles, animales transgénicos que comprenden tales células y secuencias de nucleótidos y proteínas que comprenden las proteínas de fusión reguladoras.

Antecedentes de la Invención Se conocen en el arte diversos métodos para la expresión controlada de una secuencia recombinante de nucleótidos de interés en una célula. Por ejemplo, No. et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. ÜSft 93:3346-3351, describe un sistema de expresión de genes inducibles utilizando un transactivador quimérico que consiste de un receptor nuclear de ecdisona fusionado a un dominio de transactivación VP16. En presencia de un inductor, este transactivador quimérico se enlaza a las secuencias de reconocimiento en dirección ascendente desde un promotor y estimula la transcripción de una secuencia de nucleótido de interés. En ausencia del inductor, se reduce la expresión de la secuencia del nucleótido de interés y depende del nivel basal de transcripción de la secuencia de nucleótido del promotor de interés. Gossen et al. (1992) REF- 159967 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, describe un sistema para regular la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés con base en una proteína quimérica tTA que consiste de una proteína represora TetR fusionada con el dominio de transactivación VP16. Similar al sistema de la ecdisona, las secuencias de ADN que especifican el sitio de enlace del ADN TetR se insertan en dirección ascendente del promotor de genes de manera tal que el enlace de la proteína de fusión TetR-VP16 estimula la transcripción desde el promotor y la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés. También se han desarrollado otros sistemas dirigidos a los sitios de enlace específicos del ADN próximos al promotor mínimo para la regulación dirigida de la transcripción que utilizan el dominio de transactivación GAL4-VP16 (Sadowski et al. (1988) Nature 335:563-564), LexA-VP16 (Brent et al. (1985)Cell 40:729-736), y LacI-VP16 (Labow et al. (1990) Mol. Cell . Biol . 10:3342-3356). Otros sistemas basados en TetR se describen en Deuschle et al. (1995) Mol. Cell. Biol 15:1907-1914 y Yao et al. (1998) Hum. Gene Ther 13:1939-1950. Los problemas que resultan de una expresión con fugas que se relacionan al uso del promotor mínimo han conducido a sistemas que usan fusiones de los dominios de enlace de estereoides de los receptores nucleares de estrógenos o glucocorticoides (ver por ejemplo, Mattioni et al. (1994) Methods Cell Biol. 43:335-352; Louvion et al. (1993) Gene 131:129-134; Iida et al. (1996) J. Virol . 70:6054-6059.

Breve Descripción De La Invención La presente invención se dirige a un sistema de expresión de genes inducidle firmemente regulado, adecuado para producción a gran escala de una molécula recombinante de interés en una célula eucariótica. Los componentes del sistema de la invención actual, incluyen una protelna de fusión que tiene un dominio de bloqueo de transcripción y un dominio de enlace de ligando, un operador que se enlaza al dominio de bloqueo de la transcripción de la proteína de fusión para inhibir la transcripción de una secuencia de nucleótidos, y un promotor que está bajo el control del operador. Cuando se desea inhibir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés, el sistema incluye un ligando que puede enlazar el dominio de enlace al ligando de la proteína de fusión de manera tal que se estabilice la proteína de fusión. Cuando se desea que se exprese la secuencia de nucleótidos de interés, se retira el ligando lo cual resulta en una desestabilización y degradación de la proteína de fusión. De esta manera en ausencia de un ligando similar, se retira la proteína de fusión del operador, y la inhibición del operador de la expresión que controla el promotor de la secuencia de nucleótidos de interés se retira, con lo cual se permite que la secuencia de nucleótidos de interés se exprese . En un primer aspecto, la invención es un método para inducir la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés en una célula eucariótica que comprende (a) suministrar una célula eucariótica que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión reguladora ( PR) , en donde la proteina de fusión consiste de (1) un dominio de bloqueo de la transcripción que puede inhibir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés y (2) un dominio de enlace al ligando; (ii) un promotor ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés y controlado por un operador que se enlaza a la proteína de fusión y (iii) un operador que puede enlazarse al dominio de bloqueo de la transcripción y bloquear la transcripción desde el promotor adyacente; (b) hacer crecer la célula de la etapa (a) hasta una densidad deseada en presencia de un ligando que se enlaza al dominio de enlace al ligando de la proteína de fusión, en donde la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés se inhibe y (c) retirar el ligando de la presencia de célula en donde la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés se induce. El dominio de bloqueo de la transcripción es una proteína que puede enlazar al ADN y bloquear la transcripción de un promotor adyacente. En una modalidad más específica, el dominio de bloqueo de la transcripción se puede derivar de una proteína bacteriana, bacteriófago, eucariótica, o represora de levadura. En modalidades más específicas, el dominio de bloqueo de la transcripción se deriva de una proteína represora de bacteriófagos o bacterianas . Aun en modalidades más específicas, el dominio de bloqueo de la transcripción se deriva de una proteína represora seleccionada del grupo que consiste de TerR, LexA, LacI, TrpR, Are, y LambdaCl . En otra modalidad, el dominio de bloqueo de la transcripción se deriva de una proteína represora eucariótica. En una modalidad aun más específica el dominio represor se deriva de GAL4. En otra modalidad específica del método de la invención, el dominio de bloqueo de la transcripción es una enzima de restricción mutada que puede enlazar pero no desdoblar al ADN, y el operador es un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción. En una modalidad más específica el dominio de bloqueo de la transcripción en un Notl mutado.

En modalidades específicas el dominio de enlace al ligando se deriva de un receptor esteroide, tiroide, o retinoide. En modalidades más específicas, el dominio de enlace al ligando se deriva de un receptor de estrógenos y el ligando similar es un estrógeno. En una modalidad aun más específica el receptor de estrógenos contiene una o más mutaciones por ejemplo, las mutaciones T2 y el ligando similar es tamoxifen.

Se puede usar una diversidad de células eucarióticas en el método de la invención, incluyendo sin limitación una célula de levadura tal como Pichia pastoris o una célula de mamífero tal como una célula COS, CHO, 293, BHK o ??0. La invención actual se puede usar ampliamente en la transcripción de una secuencia de nucleótidos de interés, y el producto de interés puede ser el producto de la transcripción, por ejemplo, un ARNm o ARN catalíticamente activo, o un producto en dirección descendente que resulta de la secuencia del nucleótido transcrito de interés, por ejemplo, una proteína o fragmento de proteínas que incluyen sin limitación, una hormona, un receptor o un fragmento del receptor, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un péptido o proteína biológicamente activo, una enzima, una proteína represora o una proteína del enlace al ADN. En un segundo aspecto, la invención caracteriza una secuencia aislada de nucleótidos que codifica una proteína de fusión reguladora (RPR) , en donde la proteína de fusión consiste de (1) un dominio de bloqueo de la transcripción que puede inhibir la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés y (2) un dominio de enlace al ligando, en donde en presencia de un ligando similar que puede enlazarse al dominio de enlace al ligando se estabiliza la proteína de fusión. En modalidades separadas, el dominio de bloqueo de la transcripción se puede derivar de una proteína represora de levadura, bacteriana, bacteriófago, eucariótico. En modalidades más específicas, el dominio de bloqueo de la transcripción se deriva de una proteína represora de bacteriófago o bacteriana tal como por ejemplo, TetR, LexA, LacI, TrpR, Are, y LambdaCl . En otra modalidad el dominio de bloqueo de la transcripción se deriva de una protelna represora eucariótica tal como por ejemplo, GAL4. En otra modalidad específica, el dominio de bloqueo de la transcripción es una enzima de restricción mutada capaz de enlazar pero no desdoblar al ADN, y el operador es un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción. En esta modalidad específica por ejemplo, el dominio de bloqueo de la transcripción es un Notl mutado. En modalidades específicas el dominio de enlace al ligando se deriva de un receptor esteroide, tiroide, o retinoide. En modalidades más específicas el dominio de enlace al ligando se deriva de un receptor de estrógenos y el ligando similar es un estrógeno. En una modalidad aun más específica el receptor de estrógenos contiene una o más mutaciones por ejemplo, las mutaciones T2 y el ligando similar es tamoxifen. En un tercer aspecto relacionado, la invención caracteriza una proteína de fusión reguladora (RPR) que consiste de (1) un dominio de bloqueo de la transcripción capaz de inhibir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés y (2) un dominio de enlace al ligando en donde en la presencia de un ligando similar capaz de enlazarse al dominio de enlace al ligando, se estabiliza la proteína de fusión. En una modalidad específica, la proteína de fusión reguladora (RPR) consiste esencialmente de (1) un dominio de bloqueo de la transcripción capaz de inhibir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés (2) un dominio de enlace al ligando en donde en la presencia de un ligando similar capaz de enlazarse al dominio de enlace al ligando se estabiliza la proteína de fusión. En un cuarto aspecto, la invención caracteriza una célula eucariótica capaz de expresión inducible de una secuencia de nucleótido de interés, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión reguladora (RPR) , en donde la proteína de fusión consiste de (1) un dominio de bloqueo de la transcripción que puede inhibir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés (2) un dominio de enlace al ligando, (ii) un promotor ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés y controlado por un operador que se enlaza a la proteína de fusión y (iii) un operador que puede enlazarse al dominio de bloqueo de la transcripción y bloquear la transcripción desde el promotor adyacente. En una modalidad específica, la célula eucariótica y la proteína de fusión consiste esencialmente de (1) un dominio de bloqueo de la transcripción que puede inhibir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés y (2) un dominio de enlace al ligando; (ii) un promotor ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés y controlado por un operador se enlaza a la proteína de fusión y (iii) un operador que puede enlazarse al dominio de bloqueo de la transcripción y bloquear la transcripción desde el promotor adyacente . En un quinto aspecto, la invención caracteriza un animal transgénico que comprende una célula eucariótica capaz de una expresión inducible de una secuencia de nucleótidos de interés, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión reguladora (RPR) en donde la proteína de fusión consiste de (1) un dominio de bloqueo de la transcripción que puede inhibir la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés y (2) un dominio de enlace al ligando; (íi) un promotor ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés y controlado por un operador que se enlaza a la proteína de fusión (iii) un operador que puede enlazarse al dominio de bloqueo de la transcripción y bloquear la transcripción del promotor adyacente. Serán evidentes otros objetivos y ventajas a partir de una revisión de la descripción detallada anexa.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 representa la estructura de pTE313, diseñada para la expresión de TetR-ERi,BDT2 a partir del promotor CMV.

La figura 2 representa la estructura de pTE158 diseñada para la expresión del FcyRI humano a partir de un promotor CMV que está regulado por el represor de tetraciclin . La figura 3 muestra un detalle de las dos estrategias usadas para aislar los clones CHO Kl que expresan el gen hFcyRI regulado por el TetR-ERLBDT2 RFP. La figura 4 muestra histogramas de citometría de flujo de CHO Kl-FcR/pTE313 clon de D124 que se hace crecer en presencia o ausencia de OHT, o en presencia de OHT y Dox teñido con FITC-Fc. La figura 5 es diagrama esquemático de la proteína de fusión Arc2-ERLBDT2. La figura 6 es un diagrama esquemático de un promotor híbrido de CMV-MIE/AO (SEQ ID NO: 7) que tiene operadores de arco en tándem inmediatamente en la dirección descendente de promotor/mej orador CMV-MIE (recuadro TATA) . La figura 7 muestra histogramas de citometría de flujo del clon CHO Kl-FcR/pTE534 C17 que crece en presencia o ausencia de OHT teñido con FITC-Fc.

Descripción Detallada De La Invención Antes de que se describan los métodos actuales, se entenderá que esta invención no se limita a los métodos particulares y condiciones experimentales descritas ya que tales métodos y condiciones pueden variar. También se entiende que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares solamente y no se pretende que sea limitativa ya que el alcance de la presente invención se limitará solamente por las reivindicaciones anexas. Como se usa en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un" "uno" y "los" incluyen referencias en plural a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Así por ejemplo las referencias a un método incluyen uno o más métodos y/o etapas del tipo aquí descrito o que serán evidentes para aquellas personas expertas en la técnica con la lectura de esta descripción y así sucesivamente. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo significado como se entienden comúnmente por alguien de experiencia ordinaria en la técnica a quien pertenece esta invención. Aunque algunos métodos y materiales similares o equivalente aquellos aquí descritos se puede usar en la práctica o prueba de la presente invención, se describen ahora los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones aquí mencionadas se incorporan aquí como referencia para describir los métodos y/o materiales en conjunto con las cuales se citan las publicaciones.

Descripción General La presente invención se basa en parte en el concepto de la expresión de genes en células eucarióticas se puede regular firmemente usando un promotor fuerte que se controla por un operador que a su vez se regula por una proteína de fusión reguladora (RFP) . La RFP consiste esencialmente de un dominio de bloqueo de la transcripción y dominio de enlace a ligando que regula su actividad. En presencia del ligando similar para el dominio de enlace al ligando, el RFP se enlaza al operador con lo cual se evita la transcripción del GOI. Cuando el ligando similar se retira, la RFP se desestabiliza y avanza la transcripción de la secuencia de nucleótidos de interés. El sistema regulador aquí descrito proporciona ventajas específicas las cuales combinan un control firmemente regulado de la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés con el aislamiento con líneas celulares capaces de un alto nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos de interés adecuada para producción a gran escala. El término "firmemente regulado" significa que en presencia de un ligando que se enlaza al domino de enlace al ligando de la proteína de fusión de la invención, se reduce substancialmente la transcripción de la secuencia de nucleótidos de interés, por ejemplo, al menos una disminución de 20 veces en al transcripción se alcanza en presencia de ligando con relación a nivel de transcripción que se observa en ausencia de ligando. En modalidades más específicas, el método de la invención alcanza al menos una disminución de 50 veces en la transcripción en presencia del ligando. En modalidades aun más específicas, el método de la invención alcanza una disminución de 100 veces o mayor en la transcripción en presencia de ligando. Ejemplos del grado del control de transcripción alcanzado por los métodos de la invención se observa en las figuras 4 y 7. El grado de regulación de la transcripción alcanzado por el método de la invención, también se puede establecer como una diferencia en la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés en ausencia de ligando que es al menos 20 veces mayor, preferiblemente al menos 50 veces mayor, más preferiblemente al menos 100 mayor, que la expresión de secuencia de nucleótidos de interés en presencia del ligando. El aislamiento de línea celulares que pueden expresar una secuencia de nucleótidos de interés a altos niveles requiere una regulación firme, pero la inducción de la secuencia de nucleótidos de interés en su expresión se logra preferiblemente por la inducción de un inductor más que por la adición de uno, es de importancia comercial substancial como un medio de reducción del costo de producción con relación a un sistema que requiere la adición de un ligando durante una producción a gran escala. La presente invención describe un sistema regulador que satisface estos requerimientos .

Secuencias de Nucleótidos de Interés. Los métodos de la invención se pueden usar ampliamente para controlar la transcripción de cualquier secuencia de nucleótidos de interés. El método de la invención se puede usar para producir una proteína deseada o fragmento de proteína, incluyendo por ejemplo, proteínas o péptidos quiméricos y de fusión. Además, el producto de interés puede ser un producto de transcripción, por ejemplo, un ARNm o ARN catalíticamente activo o un producto en dirección descendente que resulta de la acción del producto inicial de la transcripción . Las proteínas de interés pueden incluir sin limitación, una hormona, un receptor o un fragmento del receptor, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, un péptido o proteína biológicamente activo, una enzima, una proteína represora, o una proteína de enlace de ADN.

Promotores El "promotor" como se usa en la presente, indica una secuencia de ADN suficiente para dirigir la transcripción de una secuencia de ADN a la cual se liga operativamente, esto es, se liga en una forma tal que permite la transcripción de la secuencia del nucleótido de interés cuando están presentes las señales adecuadas. La expresión de la secuencia de nucleótidos de interés se puede colocar bajo el control de cualquier promotor o elemento mej orador como se conoce en el arte . Los promotores útiles que se pueden usar en la invención, incluyen pero no se limitan a la región del promotor temprano SV40, el promotor contenido en la repetición de la terminal larga 3 ' de virus de sarcoma de Rous, las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína, el promotor IE del citomegalovirus de ratón humano (Gossen et al., (1995) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 89:5547-5551); los vectores de expresión de plantas que comprenden la región de promotor de nopal ina sintetasa, el virus mosaico de la coliflor con el promotor ARN 35S; y el promotor de la enzima fotosintética de ribulosa bifosfato carboxilasa, elementos promotores de levadura u otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor ADC (alcohol deshidrogenasa) , el promotor PGK (fosforoglicerol cinasa) , el promotor de alcalina fosfatasa, y las siguientes regiones de control transcripcional animal que muestran especificidad de tejidos y se han utilizado en animales transgénicos : elastasa I, insulina, inmunoglobulina, virus del tumor mamario de ratón, albúmina, a-fetoproteína, al -antitripsina; ß-globina; y cadena ligera de miosina 2.

Operadores Como se usa en la presente, un "operador" indica una secuencia de ADN que se introduce en, o cerca de un gen en una forma tal que se puede regular el gen al enlazar el RFP al operador y como resultado evitar o permitir la transcripción de GOI . Han sido bien caracterizados diversos operadores en células procarióticas y bacteriófagos (Neidhardt, ed. Escherichia coli and Salmonella; Celular and Molecular Biology 2d. Vol 2 ASM Press, Washington D.C. 1996). Estos incluyen pero no se limitan a la región del operador del gen LexA de E. coli que se enlaza al péptido LexA y los operadores de lactosa y triptofano que se enlazan a las proteínas del represor codificadas por los genes LacI y trpR de E.coli. Estos también incluyen los operadores del bacteriófago de los genes lambda PR y el fago P22ant/mnt que se enlazan a las proteínas del receptor codificadas por lambda el y P22 are. En una modalidad alternativa cuando el dominio del bloqueo de la transcripción RFP es una enzima de restricción, el operador es la secuencia de reconocimiento para esa enzima. Alguien experto en la técnica reconocerá que el operador se debe localizar adyacente a, o 3' al promotor de manera tal que pueda controlar la transcripción por el promotor. Por ejemplo la patente de E.U.A No. 5,972650, que se incorpora aquí como referencia, específica que las secuencias teto están dentro de una distancia específica del recuadro TATA. En modalidades específicas, el operador se coloca preferiblemente de inmediato en la dirección descendente del promotor. En otras modalidades el operador se coloca dentro de 10 pares base del promotor.

Dominio de Bloqueo de la Transcripción Como se usa en la presente, un dominio de bloqueo de la transcripción es cualquier dominio que puede bloquear la transcripción como resultado de su interacción con un operador. Tal dominio se puede derivar de bacterias, bateriófagos o levaduras e incluye pero no se limita a aquellos represores o derivados de los mismos cuya función depende del enlace al ligando tal como TetR, LexA, LacI y Are. Alternativamente se puede derivar el dominio de bloqueo de la transcripción a partir de células de mamífero como se describe por ejemplo, en Yin et al. 1995 J. Virol . 69:6209-6216 o células de plantas como se describe por ejemplo en ilde et al. 1994 Plant Mol. Biol . 24:38. El dominio de bloqueo de la transcripción también se puede hacer sintéticamente. Por ejemplo, el dominio de bloqueo de la transcripción puede ser una enzima de restricción que esté mutada de manera que ya no pueda desdoblar al ADN. En tal caso la secuencia de reconocimiento para esa enzima se usaría como el operador.

Dominio de Enlace al Ligando Aunque la capacidad de la proteína de fusión para interactuar con el operador está controlada por el dominio de bloqueo de la transcripción, la actividad de la proteína de fusión se regula por el dominio de enlace al ligando. El dominio de enlace al ligando se puede derivar de cualquier polipéptido de cuando se enlaza a su ligando similar al polipéptido funcional incluyendo por ejemplo la estabilización del polipéptido. El dominio de enlace al ligando, significa que incluye dominios de enlace de ligando que se presenta naturalmente así como derivados funcionales de los mismos. Como se usa en presente el "ligando similar", incluyendo los ligandos que se presentan naturalmente que se enlazan a los dominios de enlace al ligando así como derivados funcionales de los mismos. Ejemplos de tales dominios de enlace al ligando incluyen pero no se limitan a los dominios de enlace al ligando de los receptores glucocorticoides y receptores esteroides, receptores retinoides y receptores tiroides (Eilers et al. (1989) Nature 340:66-68; Picard et al. (1988) Cell 54:1073-1080). Los ejemplos 1 a 3 ilustran una modalidad de la invención en la cual el dominio de bloqueo de la transcripción de la proteína de fusión es TetR y el dominio de enlace al ligando es el dominio de enlace al ligando al receptor de estrógenos con mutaciones T2 (ERLBDT2; Feil et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun 237:752-757) . Cuando la secuencia Teto se coloca en dirección descendente y próxima al promotor fuerte CMV-MIE, la transcripción de la secuencia de interés del nucleótido (en este caso hFcyRI) a partir del promotor C V-MIE/TetO se bloquea en presencia de tamoxifen y se desbloquea por al eliminación de tamoxifen.

Metodologías de Selección Celular Los métodos de la invención producen células que tiene una relación de producción elevada para una secuencia de nucleótidos de interés. Además de los métodos descritos en la sección experimental a continuación, se puede usar una diversidad de procesos de elección conocidos en el arte. En una modalidad preferida, el proceso de selección es la metodología "FASTR" descrita en USSN 20020168702 publicada el 14 de Noviembre de 2002 que se incorpora específicamente en la presente como referencia. La metodología FASTR es un método de separación por exclusión de alta producción para un aislamiento rápido de células que secretan una proteína fusión específica de citocinas de la invención, por una separación por exclusión directa de la proteína de fusión.

Animales Transgénicos La presente invención también contempla la creación de mamíferos transgénicos que expresan las proteínas de fusión de la invención. Por ejemplo puede ser deseable regular la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés en un mamífero. Un gen que codifica las proteínas de fusión de la invención se puede integrar en el genoma de un mamífero, de manera de regular la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés cuyo promotor se preparó por ingeniería para ser responsable de la proteína de fusión. Además, los animales transgénicos también pueden ser útiles como una fuente de la secuencia de nucleótidos de interés. Se puede producir un animal transgénico al introducir un constructo de ácido nucleico en los pronúcleos masculinos de un oocito fertilizado, por ejemplo, por microinyección, infección retroviral, y permitiendo que se desarrolle el oocito en un animal de crianza hembra pseudopreñada . Cualquiera de las secuencias reguladora u otras secuencias útiles en vectores de expresión pueden formar parte de la secuencia transgénica. Las secuencias reguladoras específicas de tejidos se pueden ligar operativamente al transgen para dirigir la expresión del transgen a células en particular. its La invención también proporciona un kit que comprende uno o más recipientes llenos con al menos una proteína de fusión de la invención. Opcionalmente asociados con tales recipientes puede ser un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental, que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, el aviso refleja la aprobación por la agencia de manufactura, uso o venta para la administración humana, (b) direcciones para uso o ambas.

Modalidades Específicas El ejemplo 1 describe la construcción de los plásmidos pTE313, pTE084, Y pTE158. pTE313 diseñado para una expresión de alto nivel de una proteína de fusión reguladora TetR-ERI,BDT2. Contiene un primer cásete de expresión independiente que es un gen de fusión TetR-ERLBDT2 impulsado por el promotor CMV-MIE, y el segundo cásete independiente que es un gen de resistencia a la blasticidina impulsado por un promotor SV40 (Fig. 1) . pTE084 se diseña para la expresión de alto nivel de hFcyRI , el receptor de superficie celular de alta afinidad para el dominio Fe de la IgG humana. pTE158 se genera al colocar dos operadores TetR en tándem inmediatamente la dirección descendente del promotor/mej orador CMV/MIE en pTE084 (Fig. 2). Las células CHO Kl que expresan el gen hFcyRI regulado por el TetR-ERLBDT2 RFP después de la transfección con pTE313 que se genera e identifica como se describe en el ejemplo 2. Se emplearon dos estrategias para aislar clones que expresan el gen hFcyRI regulado por el TetR-ERLBDT2 RFP después de la transfección con pTE313 (Fig.3) . Ambas estrategias parten del mismo acumulado de células obtenido después de la introducción de TetR-ERLBDT2 RFP dentro de las células CHO Kl-FcR y el aislamiento (ejemplo 3) . Estos resultados muestran claramente que la expresión de un gen recombinante puede regularse firmemente por TetR-ERLBDT2 , y la inducción de la expresión se puede lograr por la adición de doxiciclina en presencia de tamoxifen o al eliminar el tamoxifen (Fig. 4) . La inducción de la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés, por eliminación de una molécula pequeña a partir del medio del cultivo conseguido fácilmente por dilución o intercambio de medios, proporciona un medio efectivo en costo para la inducir la expresión a gran escala. Además, estos datos muestran que una regulación firme de la expresión se puede lograr por la proteína de fusión reguladora TetR-ERLBDT2. Las células CHO Kl que expresan hFcyRI impulsado por el promotor CMV-MIE/Arc02 se generaron como se describe en los ejemplos 4 y 5. Las líneas celulares inducibles reguladas por Are-ERLBDT2 se seleccionaron similares a las estrategias que se muestran en la figura 3 y muestran una regulación firme en respuesta a la presencia de OHT en el medio de crecimiento (Ejemplo 6 y figura 7) .

EJEMPLOS El siguiente ejemplo se establece como para suministrar a aquellos expertos ordinarios en la técnica con una descripción y divulgación completa de la forma de elaborar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no se pretende que limite el alcance de que los inventores se refiere como su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la expresión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se deben tomar en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones . A menos que se indique de otra manera, partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura esta en grados centígrados y la presión está en, o cercana a la atmosférica.

Ejemplo 1. Construcción de pTE313, pTE084 y pTE158 pTE313 se construyó al ligar un fragmento de 975 bp EcoRI (completo en sus pares base) a partir de pTA-ER-LBD-T2 que codifica el dominio de enlace de ligando receptor de estrógeno humano con las mutaciones T2 (ERLBDT2) (Feil, et al. 1997 Biochem Biophys Res Commun 237:752-757) dentro del sitio EcoRI (completo en sus pares base en la región ligadora que sigue inmediatamente a la terminación TerR C) de pcDNA6/TR (Invitrogen Cat . No. V-1025-20). Las mutaciones T2 de G400V, M543A, y L544A le otorgan especificidad al enlace del análogo de estradiol doxiciclina. La orientación adecuada del fragmento que codifica ERLBDT2 en los plásmidos deseables resulta a partir de ligamiento que se confirma por la determinación de la secuencia de ADN. Esta construcción resultó en un gen que codifica una proteína de fusión que consiste de los aminoácidos MI a ?207 de TerR (acceso al Genbank AAF75608) fusionado a los aminoácidos N304 a V595 del receptor de estrógeno (acceso Genbank P03372) . La proteína quimérica codificada por este gen también tiene las mutaciones T2 de G400V, M543A, y L544A en el receptor de estrógenos. El plásmido pTE313 contiene un cásete que es el gen de fusión TetR-ERLBoT2 impulsado por el promotor CMV-MIE y un segundo cásete que es el gen de resistencia de blasticidina impulsado por el promotor SV40 (Fig. 1). pTE084 se construye al ligar el fragmento de 1,436 bp de Xba I a partir de pCAElOO que codifica el FcyRI humano (número de acceso de GenBank M21091) dentro del sitio Xba I de pRG821, un vector que codifica al gen de la neomicina fosfotransferansa II (npt) que le otorga resistencia a G418.

La orientación de hFcgRI en los plásmidos deseables que resultan de la ligación se examina por un mapeo de restricción con Not I, Pst I, Eco RI y Stu I. Un fragmento de ADN que codifica dos operadores en tándem TerR se colocaron inmediatamente en la dirección descendente del promotor/mej orador CMV-MIE en pTE084 para generar pTE158. (fig.2) . En este plásmido la transcripción de hFcyRI a partir del promotor CMV-MIE se regular por TetR o TetR-ERLBDT2.

Ej emplo 2. Construcción del derivado CHO Kl que expresa hFcy I impulsado por CMV-MIE/TetO. Las células CHO Kl (3 X 106 células) se transfectaron con pTE158 usando lipofectamina™ (LifeTec nologies Rockville, MD) siguiendo las sugerencias de los fabricantes. Se colocaron las células en el medio de cultivo (suero de bovino fetal al 10%, 90% de F-12 Ham, 2mM L-glutamina; todos los reactivos fueron de Life Technologies, Rockville, MD) que contiene 500 ug/ml G418 (Life Technologies) por 12 días. Las células resistentes al G418 se tripsinizaron, acumularon y tiñeron con IgG humana conjugada con FITC, fragmento Fe (FITC-hFc; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) . Brevemente, las células crecieron en placas de cultivo de 10 cm se lavaron una vez con solución salina amortiguada de fosfato Dulbecco (PBS) sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio (Life Technologies) . Dos mililitros de tripsina a 0.25% (Life Technologies) se agregaron a cada placa y se incubaron a 37*C por 4-5 min. Las placas se agitaron hasta que las células se desprendieron de la placa. Se agregaron inmediatamente 4 mi de medio de cultivo a cada placa de la célula desprendida. Las células luego se recolectaron por centrifugación a 1,000 x g por 4 minutos y luego se volvieron a suspender en 4 mi de 2 ug/ml FITC-hFc diluido de medio de cultivo. Las células luego se colocaron en un agitador de plataforma y se tiñeron por 1 hora a temperatura ambiente. Para retirar los FITC-hFc sin enlazar, se lavaron dos veces las células con 8 mi PBS. Las células lavadas que pueden enlazar a FITC-hFc se midieron por citometría de flujo en un clasificador de células Moflo™ (Cytomation Fort Collins, CO) . El FITC-hFc no tiñó a las células CHO Kl párenteles sin transíectar, sino que dio lugar a una distribución de la fluorescencia en el acumulado transfectado por pTE158 resisten al G418. El acumulado total de células fluorescentes a partir de la población resistente a G418 se recolectó por citometría de flujo, se expandió y luego se analizó por citometría de flujo para la expresión de hFcyRI. Las células que poseen la fluorescencia más elevada de 15% en esta población, se aislaron, acumularon y expandieron para producir una población de células resistentes a G418 que expresaron hFcyRI a altos niveles. Esta población de células se nombró como CHO Kl-FcR y se usó para aislar un clon que expresa el gen hFcyRI regulado por el TetR-ERLBD T2 RFP después de la transfección con pTE313.

Ejemplo 3. Construcción de lineas celulares CHO Kl con expresión hFcyRI regulada por TetR-ERLBDT2. Las células CHO Kl-FcR (2 x 106 células) se transfectaron con pTE313 usando Lipofectamina™. Las células transfectadas se seleccionaron con 500 ug/ml de G 18 y 10 ug/ml de blasticidina por 14 días para seleccionar los plásmidos pTE158 y pTE313. Dos días previos al análisis por citometría de flujo, se incubaron las células en un medio de cultivo que contiene 200 nM tamoxifen (OHT) para estabilizar la actividad de TetR-ERLBDT2 y reprimir la expresión de hFcgRI . Se tiñeron las células con FITC-hFc y aquellas células que poseen la fluorescencia más baja al 2%, indica la represión de la expresión de hFcyRI se recolectaron para producir el acumulado a uno. Este acumulado luego se usó como la fuente de células para las dos estrategias detalladas en la figura 3. Los clones que expresaron hFcyRI regulado por TetR-ERLBDT2 se aislaron a manipular la actividad de TetR-ERilBDT2 en presencia o ausencia de doxiciclina (Dox) . Una estrategia involucró el aislamiento de células que expresan altos niveles de hFcyRI en presencia de OHT y Dox seguido por el aislamiento de células que no expresan en presencia de OHT sin Dox. Alternativamente las células que expresan bajos niveles de hFcyRI en presencia de OHT sin Dox se aislaron primero, luego se aislaron las células de alta expresión a partir de este acumulado por la inducción por Dox en presencia de OHT. Ambas estrategias utilizaron una serie de aislamientos de células bajo condiciones represoras o inductoras alternas y un aislamiento final de células sencillas que expresó altos niveles de hFcyRI en ausencia de OHT y Dox (Fig.3) . Se expandió el acumulado Al durante 7 días en presencia de 200nM OHT, luego se dividió en dos placas, una placa contiene medio con 1 ug/ml Dox y la otra no contiene. Se incubaron las células por 3 días y luego se tiñeron con FITC-hFc para detectar la presencia de hFcyRI . El 60% superior de las células positivas hFcyRI a partir del cultivo inducido con 1 ug/ml Dox se aisló para producir el acumulado Bll, y las células con la menor fluorescencia 30% se aislaron a partir de células que crecen en medio sin Dox para producir el acumulado B12. Se hizo crecer el acumulado Bll en tamoxifen 200nM sin Dox y las células con la menor fluorescencia al 1% se recolectaron para producir el acumulado Cll. Se hizo crecer el acumulado B12 en 200nM OHT y lug/ml Dox y 1% superior de las células positivas con hFcyRI se recolectaron como un acumulado para producir el acumulado C12. El acumulado Cll y C12 luego se expandieron en ausencia de OHT y Dox. Las células que expresaron los niveles más elevados de hFcyRI (1% superior) en ausencia de OHT y Dox luego se clasificaron en placas de 96 pozos a una célula por pozo. Estas células deben tener una baja expresión no inducida de hFcyRI y altos niveles de hFcyRI cuando se inducen por el retiro de OHT como una consecuencia de alternar el aislamiento de la expresión reducida o reprimida de hFcyRI . Después de la expansión se caracterizaron 10 clones individuales para la inducción de hFcyRI por el retiro de OHT o la adición de 1 ug/ml Dox por inmunoteñido con FITC-hFc y análisis por citometría de flujos. El análisis de un clon (D124 a partir del acumulado C12) no mostró un nivel detectable de hFcyRI cuando el OHT estaba presente sin Dox, mientras que los altos niveles de la expresión de hFcyRI se observaron en ausencia de OHT y Dox. Adicionalmente , la adición de Dox a lug/ml a las células que crecen en presencia de OHT también resultó en altos niveles de expresión de hFcyRI . El nivel de expresión de hFcyRI en este clon que resulta de la inducción por la eliminación de OHT o por 1 ug/ml de doxiciclina, en presencia de OHT fueron indistinguibles (figura 4) .

Ejemplo 4 Construcción de pTE528, pTE529 y pTE534. El gen represor de P22 codifica un represor transcripcional de 53 aminoácidos (MI a A53 codificado por los nucleótidos 38,336 a 38,494 del ADN genómico del fago P22 numero de accedo al GenBank NC002371) . La transcripción de la represión mediada por Are involucra la adición secuencial de dímeros a los sitios medios del operador. Se demostró previamente que un dímero de cadena sencilla que consiste de dos proteínas Are conectadas por un ligador de 15 aminoácidos tuvo mayor afinidad por el ADN operador Are que el represor de tipo silvestre (Robinson et al. (1996) Biochesmistry 35: 109-116) . Para aprovechar la mayor afinidad del dímero de cadena sencilla para el ADN operador se diseño un ADN sintético que codificó este dímero Are de cadena sencilla fusionado a una secuencia de etiqueta His que consiste de 6 residuos de histidina. Este fragmento de ADN Xhol/Notl sintético de 444 pares base se clonó en pUC119 para producir pUC119-Arc2-His6 (Blueheron Technology Inc.). El gen dímero Arc2 luego se extirpó a partir de este plásmido y se clonó dentro de los sitios Xhol y Notl de pRG985 de manera tal que la expresión del gen Arc2 depende del promotor Ubc/intron ß-globina para producir pTE528. La proteína de fusión Arc2-ERLBDT2 (Fig.5) se construyó al ligar un fragmento de Bam HI de 3361 pares base a partir de pTE502 que contiene el ADN que codifica el ERLBDT2 humano como se describe arriba dentro de los sitios BamH I de pTE528 para producir pTE529. La proteína de fusión resultante Arc2-ERIJBDT2 tuvo la misma ligadura de 11 aminoácidos (AYSGSRELIL) (SEQ ID N0:1) entre el gen Arc2 y el gen E I,BDT2 como entre TetR y ERLBDT2 en TetR-ERLTET2 (SEQ ID NO: 3) .

Para cambiar los operadores Tet en el promotor CMV-MIE/TO a los operadores Are codificados por los pares base 38,273 al 38,293 en el genoma del fago P22 (acceso al Genbank NC002371) , se usó pTE158 como una plantilla para amplificar un fragmento de ADN por PCR con el siguiente conjunto cebador (5 ' GAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTT-3 ' (SEQ ID NO: ) Y 5' GAGAGATCTGAGTCGACATAGTAGAGTGCTTCTATGAATAGTAGAGTGCTTCTATCATGAG CTCTGCTTATATAAGACCTCCCA-3 ' ) (SEQ ID NO: 5). El producto por PCR que codifica los operadores en tándem Are se digirió con Ndel y Salí y se clonó en los mismos sitios en pTE158. El promotor híbrido CMV-MIE/AO tuvo dos operadores de arco en tándem inmediatamente en la dirección descendente del promotor/mejorador CMV-MIE (fig. 6) (SEQ ID NO: 6). Consecuentemente, el represor de la transcripción de Arc2-ERLBDT2 regulara la transcripción de hFcyRI desde el promotor CMV-MIE/AO en pTE534.

Ejemplo 5 Construcción de un derivado CHO Kl que expresa hFcyRI impulsado por un promotor CMV-MIE/Arc02. Las células CHO Kl (2 x 106) se transfectaron con pTE534 usando lipofectamina™ como se describe arriba. Se colocaron las células en el medio de cultivo (suero de bovino fetal al 10%, F-12 Ham al 90%, 2mML-glutamina; todos los reactivos fueron de Invitrogen Life Technologies, Carlsbab, CA) que contienen 400ug/ml G418 (Invitrogen Life Technologies) por 12 días. Se trataron con tripsina las células resistentes a G418, se acumularon y se tiñeron con IgG de humano conjugado con FITC en una cantidad de 2µ9/t?1, fragmento Fe (FITC-hFc) como se describe arriba. El FITC-hFc no tiñó las células parentales no transfectadas CHO Kl . Las células que expresaron hFcyRI enlazadas a FITC-hFc y se aislaron con base en su fluorescencia por citometría de flujo sobre un clasificador de células Moflo™. Se aislaron las células con la mayor fluorescencia al 3% en esta población, se acumularon y expandieron. Este acumulado positivo hFcyRI se enriqueció al repetir la tinción de superficie celular con FITC-hFc y clasificar el 30% superior de células más fluorescentes en la población para producir el acumulado B. Las células en el acumulado B que estuvieron entre el 20% superior que expresa hFcyRI se aislaron para producir el acumulado C. El acumulado C2/CH0K/pTE534) se usó para generar líneas celulares inducibles reguladas por Arc-ERLBD 2.

Ejemplo 6. Construcción de las líneas celulares CHO KI con una expresión de Arc-ERLBDT2- dependiente de hFcyRI. Las células CHOKl/pTE534 (2 x 106/platos) se transfectaron con pRG985, un vector vacío o pTE529 usando lipofectamina™. Se seleccionaron las células trasfectadas con 400 µg ml G418 y 10µg/ml de puromicina en ausencia de OHT por 14 días. Se tiñeron las células con FITC-hFc como se describe arriba y se analizaron por citometría de flujos. Las células transíectadas con pRG985 fueron similares a las células precursoras, y tuvo perfiles similares de tinción hHcyRI ya sea que crecieran o no en presencia de OHT previo al análisis. En contraste, la expresión de hFcyRI en células CHO l/pTE534 transíectadas con pTE529 mostró una respuesta marcada a la presencia de OHT en el medio de crecimiento. En ausencia de OHT en el medio de crecimiento, la mayoría de las células G418 y resistentes a la puromicina fueron positivas para la expresión hFcyRI, y las células positivas hFcyRI superior al 30% se clasificaron como un acumulado. Este acumulado se expandió en presencia de OHT por 10 días, se tiñó para la expresión en hFcyRi, y se analizó por citometría de flujo. Más del 70% de las células en este acumulado no expresó hFcyRI en presencia de OHT y se clasificaron aquellas células que expresan el menor 30% como un acumulado. Luego se expandieron estas células en ausencia de OHT en el medio. Las células que expresaron los mayores niveles de hFcyRI (el 1% superior) en ausencia de OHT se seleccionaron en una placa de 96 pozos a una célula por pozo. Los clones que muestran una regulación firme en respuesta a la presencia de OHT en el medio se caracterizaron además por citometría de flujo. La regulación dependiente de OHT de la expresión hFcyRI en estos clones se confirmó por inmunotinción con FITC-hFc seguido por un análisis de citometría de flujo. No se observó ningún nivel detectable de hFcyRI en un clon (C17) cuando estuvo presente el OHT en el medio, mientras que el crecimiento en ausencia de OHT indujo la expresión de hFcyRI en estos clones (figura 7) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones 1. Un método para inducir la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés en una célula eucariótica caracterizado porque comprende: (a) suministrar una célula eucariótica que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión reguladora (RPR) , en donde la proteína de fusión consiste de (1) un dominio de bloqueo de la transcripción que puede inhibir la expresión de una secuencia de nucleótido de interés y (2) un dominio de enlace a ligando; (ii) un promotor ligado operativamente a la secuencia de nucleótido de interés y controlado por un operador que se enlaza a la proteína de fusión y (iii) un operador que se puede enlazar al dominio del bloqueo de la transcripción y bloquear la transcripción desde el promotor adyacente. (b) hacer crecer la célula de la etapa (a) hasta una densidad deseada en presencia de un ligando que se enlaza al dominio de enlace a ligando de la proteína de fusión, en donde la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés se inhibe; y (c) retirar el ligando de la presencia de las células en donde la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés se induce . 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio de bloqueo de la transcripción se deriva de una proteína de bloqueo de la transcripción bacteriana, bacteriófago, eucariótica ó de levadura. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el dominio de bloqueo de la trascripción se deriva de una proteína de bloqueo de la transcripción bacteriana seleccionada del grupo que consiste de TetR, LexA, LacI, TrpR, Are, y LambdaCI . 4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el dominio de bloqueo de la transcripción se deriva de una proteína de bloqueo de la transcripción eucariótica que es GAL4. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio de bloqueo de la transcripción es una enzima de restricción mutada que puede enlazar pero no desdoblar al ADN y el operador es un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5 caracterizado porque el dominio de bloqueo de la transcripción es una enzima mutada Notl. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio de enlace a ligando se deriva de un receptor esteroide, tiroide, o retinoide. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el dominio de enlace a ligando se deriva de un receptor de estrógenos, y el ligando similar es un estrógeno . 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el dominio de enlace a ligando se deriva de un estrógeno y el ligando similar es el tamoxifen. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés se deriva de CMV, SV40, virus del sarcoma Rous, metalotioneina, nopalina sintetasa, virus mosaico de la coliflor 35S RNA, ribulosa bifosfato carboxilasa, Gal4, alcohol deshidrogenase, fosfoglicerol cinasa, alcalina fosfatasa, elastasa 1, insulina, inmunoglobulina, virus del tumor mamario de ratón, albúmina, a-fetoproteína, ccl -antitripsina, ß-globina y cadena 2 ligera de miosina. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10 caracterizado porque el promotor es CMV-MIE. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque la célula eucariótica se selecciona del grupo que consiste de una célula COS, CHO, 293, BH o NSO. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el operador es TetO o ArcO. 14. El método de conformidad cori la reivindicación 1, caracterizado porque el operador se coloca inmediatamente en la dirección descendente del promotor. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque el operador se coloca dentro de 10 pares base del promotor. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés en ausencia del ligando es al menos 20 veces mayor que la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés en presencia del ligando. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés, en ausencia del ligando es al menos 50 veces mayor que la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés en presencia del ligando. 18. Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una proteína de fusión reguladora, en donde la proteína de fusión consiste de (1) un dominio de bloqueo de la transcripción capaz de inhibir la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés y (2) un dominio de enlace a ligando en donde en presencia de un ligando similar capaz de enlazarse al domino de enlace a ligando, se estabiliza la proteína de fusión. 19. Una proteína de fusión reguladora caracterizada porque se codifica por la secuencia de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 18. 20. Una célula eucariotica capaz de una expresión inducible de una secuencia de nucleótidos de interés, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión reguladora en donde la proteína de fusión consiste de (1) un dominio de bloqueo de la transcripción que puede inhibir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés y (2) un dominio de enlace a ligando; (ii) un promotor ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés y controlado por un operador que se enlaza a la proteína de fusión y (iii) un operador que puede enlazarse al dominio de bloqueo de la transcripción y bloquear la transcripción del promotor adyacente . 21. Un animal transgénico caracterizado porque comprende la célula de conformidad con la reivindicación 20. 22. Un método para controlar la producción de un producto de una secuencia de nucleótidos de interés en una célula eucariotica caracterizado porque comprende: (a) suministrar una célula eucariotica que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión reguladora (RPR) , en donde la proteína de fusión consiste de (1) un dominio de bloqueo de la transcripción que puede inhibir la expresión de una secuencia de nucleótido de interés y (2) un dominio de enlace a ligando;- (ii) un promotor ligado operativamente a la secuencia de nucleótido de interés y controlado por un operador que se enlaza a la proteína de fusión y (iii) un operador que se puede enlazar al dominio del bloqueo de la transcripción y bloquear la transcripción desde el promotor adyacente. (b) hacer crecer la célula de la etapa (a) hasta una densidad deseada en presencia de un ligando que se enlaza al dominio de enlace a ligando de la proteína de fusión, en donde la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés se inhibe; y (c) retirar el ligando de la presencia de las célula en donde la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés se induce, y el producto de la secuencia de nucleótidos de interés se produce. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el producto de la secuencia de nucleótidos de interés es un ARN, una proteína o un fragmento de proteínas. 24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés en presencia del ligando es 100 veces menor que la expresión del nucleótido de interés en ausencia del ligando. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se describen composiciones y métodos para la expresión inducible de genes en células eucarióticas . La expresión de una secuencia nucleótida de interés se controla por la proteína de fusión reguladora que consiste de un dominio de bloqueo de transcripción y un dominio de enlace al ligando. Cuando el ligando cognado para el dominio enlazado al ligando se presenta, la transcripción de la secuencia de nucleótido de interés se bloquea. Una vez removido el ligando cognado, la secuencia de nucleótido de interés se transcribe. El método es útil para una producción a gran escala de un producto deseado en células eucarióticas. 2/3 Leu lie Arg Leu ser Ala Gly Asp Met Arg Ala Ala Asn Leu Trp Pro 130 135 140 Ser Pro Leu Met lie Lys Arg Ser Lys Lys Asn Ser Leu Ala Leu Ser 145 150 155 160 Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu Asp Ala Glu Pro Pro 165 170 175 lie Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro Phe Ser Glu Ala Ser 180 185 190 Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg Glu Leu Val His Met 195 200 205 lie Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val Asp Leu Thr Leu His 210 215 220 Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu Glu lie Leu Met lie 225 230 235 240 Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Val Lys Leu Leu Phe Ala 245 250 255 Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys Cys Val Glu Gly Met 260 265 270 Val Glu lie Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser Ser Arg Phe Arg Met 275 280 285 Het Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu Lys Ser lie lie Leu 290 295 300 Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser Thr Leu Lys Ser Leu 305 310 315 320 Glu Glu Lys Asp His lie His Arg Val Leu Asp Lys lie Thr Asp Thr 325 330 335 Leu lie His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr Leu Gln Gln Gln His 340 345 350 Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu lie Leu Ser His lie Arg His Met 355 360 365 Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met Lys Cys Lys Asn Val 370 375 380 Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Ala Ala Asp Ala His Arg Leu 3B5 390 395 400 His Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser Val Glu Glu Thr Asp Gln 405 410 415 Ser His Leu Ala Thx Ala Gly Ser Thr Ser Ser His Ser Leu Gln Lys «20 425 430 yr Tyr lie Thr Gly Glu Ala Glu Gly Phe Pro Ala Thr Val 435 440 445 <210> 4 <211> 26 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 4 gagtatttac ggtaaactgc ccactt 26 <210> 5 <211> 86 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 5 gagagatctg agtcgacata gtagagtgct tctatcatga atagtagagt gcttctatca 60 tgagctctgc ttatatagac ctccca 86