JP4485523B2 - 腫瘍ワクチンなどへの養子免疫細胞 - Google Patents
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Description
癌に対する細胞免疫療法として、以下のような方法が知られている(Choi D et al.,Clin.Cancer Res.,4,2709−2716,1998、Hsu FJ et al.,Nat Med.,2,52−58,1996、Takamizawa M et al.,J Clin.Invest 95,296−303,1995、Reichardt VL et al.,Blood,93,2411−2419,1999、Wang J et al.,J.Immunol.,161,5516−5524,1998、Morse MA et al.,Clin.Cancer Res.,5,1331−1338,1999)。アフェレーシスにより樹状細胞(DC)/マクロファージを選択的に集め、次いでこのアフェレーシスで得られた細胞を、さらにインターロイキン4、GM−CSF及びTNF−αを添加した培養液中で培養し、分化誘導させる(Steinman RM et al.,Adv.Exp.Med.)。続いて細胞を、培養容器より、(i)酵素処理方法、(ii)スクレーパーにてかき取る方法、(iii)ピペットにて培養液を吹きつける方法のいずれかによって剥離回収する(Hodes RJ and Singer A.,Eur.J.Immunol.,7,892−,1977)。このようにして得られた成熟DC/マクロファージを、標的抗原を含む培養中にて共存培養し、標的抗原エピトープとMHCクラスII分子の複合体を持つ癌特異的抗原提示細胞を作成する。この、培養容器底面に付着した抗原提示細胞を(i)酵素処理方法、(ii)スクレーパーにてかき取る方法、(iii)ピペットにて培養液を吹きつける方法により剥離回収し、癌特異的抗原提示細胞として同一人へ投与する。
従来の免疫細胞療法においては、培養した細胞を、培養容器より、(i)酵素処理方法、(ii)スクレーパーにてかき取る方法、(iii)ピペットにて培養液を吹きつける方法のいずれかによって剥離回収することがなされてきている(Hodes RJ and Singer A.,Eur.J.Immunol.,7,892−,1977)。
酵素を用いた剥離回収方法
付着細胞の剥離回収方法として最も良く用いられる方法にトリプシンを用いる剥離方法がある(Hodes RJ and Singer A.,Eur.J.Immunol.,7,892−,1977)。この方法では、細胞の付着した培養容器をCa++、Mg++不含PBSにて洗浄後、0.05%トリプシン、0.024%EDTA添加PBSをフラスコ底面より深さが0.1−1mmになるよう加え、室温にて静置する。5−10分後に4℃に冷却した0.1−1%アルブミン添加培養液を加えゆるやかに撹拌後、浮遊細胞を集める。集めた細胞は、アルブミン添加培養液にて洗浄後、以後の実験に用いる。
しかし、酵素を用いた剥離方法では、付着性の免疫細胞の細胞膜上の機能タンパク分子を消化分解するため、剥離回収されても細胞機能を十分に発揮できないという問題がある。これまでは、テフロンフィルムなどを培養容器に用いる方法等(Van der Meer JWM,Bulterman D.,Van Zwet TL,Elzenga−Claasen I,and Van Furth R,J.Exp.Med.,147,271−,1978;Van der Meer JWM,Van de Gevel JS,Elzenga−Claasen I,and Van Furth R,J,Cell Immunol.,42,208,1979)が試されてはきているが、培養面への付着が阻害されるため、培養による機能獲得に難があった。そのため、「培養中は付着性を保ち、かつ、剥離回収時には細胞に対しての親和性を失う」という相反する性質を持つ培養基材の開発が望まれていた。
本発明の目的は、上記問題点を解決した培養基剤を用いることによって、細胞機能を十分に発揮することができる養子免疫細胞を提供することである。
1. 下記工程:
a.哺乳動物の抗原提示関連細胞を得ること、
b.得られた細胞を糖鎖含有高分子でコートされた培養容器で培養すること、
c.培養容器を振盪させ、細胞を剥離すること、ただし、細胞を酵素で処理することなく、かつ、細胞剥離用器具を用いない
を含む、養子免疫細胞の調製方法。
2.上記工程b.に用いる培養液が、生理活性物質及び抗原を含む、上記1記載の調製方法。
3.さらに、下記工程:
d.剥離された細胞を生理活性物質及び抗原を含む培養液で培養すること
を含む、上記1又は2に記載の調製方法。
4.生理活性物質が、PMA、PHA、蓮見ワクチン M、GM−CSF、IFN−α、TNF−α、IL−3、IL−4、SCF、TGF−α、TGF−β1、結核菌体成分、LPS、ピシバニール、ポリI:C及びヒアルロン酸結合物破片からなる群より選択される、上記2又は3に記載の調製方法。
5.抗原が、癌細胞溶解物、癌細胞酸抽出ペプチド、癌細胞関連合成ペプチド、IgMイディオタイプ、MUT1ペプチド、HPV16−E7ペプチド、p53変異ペプチド、MART1、gp100、チトシナーゼペプチド、TRP1、TRP2、チロシナーゼ、PSA、プロテイナーゼ3、MAGE−1、MAGE−3、BAGE、GAGE−1、GAGE−2、NY−ESO−1、β−カテニン、MUM−1、TPI、CASP−8、KIAA0205、bcr−abl(0210)、TEL−AML1、Her2/new、ras、WT1、CEA、SART−1、KIAAO156、シクロフィリンB、Lck、MUC−1、変異HLA−A2、HA1、HA2、H−Y、LacZからなる群より選択される、上記2又は3に記載の調製方法。
6.抗原提示関連細胞が、樹状細胞又はランゲルハンス細胞を含む、上記1〜5のいずれか1に記載の調製方法。
7.哺乳動物が、ヒトである、上記1〜6のいずれか1に記載の調製方法。
8.糖鎖含有高分子が、PVLA、P(VLA−co−SU)、PVGlcNAc、PVMA、PVCA、PVMea、PVLam又はPVManである、上記1〜7のいずれか1に記載の調製方法。
9.上記工程c.が、下記工程
c1.培養液を除去し、EDTAを含むPBSを加えること
c2.4−10℃で10分間、容器を静置すること
c3.容器を振盪し、細胞を剥離すること
を含む、上記1〜8のいずれか1に記載の調製方法。
10.EDTAの濃度が、0.02mM〜20mMである、上記9に記載の調製方法。
11.EDTAを含むPBSの液深が、2〜5mmである、上記9又は10に記載の調製方法。
12.上記1〜11のいずれか1に記載の調製方法で得られる養子免疫細胞。
13.上記1〜11のいずれか1に記載の調製方法に用いるための、糖鎖含有高分子でコートされた培養容器。
14.糖鎖含有高分子が、PVLA、P(VLA−co−SU)、PVGlcNAc、PVMA、PVCA、PVMea、PVLam又はPVManである、上記13に記載の培養容器。
15.上記13又は14に記載の培養容器を含む、養子免疫細胞ワクチン調製のためのキット
16.さらに、細胞分離用チューブ、抗原及び/又は培養液を含む、上記15に記載のキット。
17.上記12に記載の養子免疫細胞を用いる悪性腫瘍、I型糖尿病、アトピー型アレルギー疾患又は感染症を治療するための方法。
18.上記12に記載の養子免疫細胞を含む、悪性腫瘍、I型糖尿病、アトピー型アレルギー疾患又は感染症を治療するための医薬。
図2は、アロ抗原特異的細胞傷害性T細胞試験の結果を示す。x軸は、死んだ標的細胞数を示す。図中の標的細胞に関しては以下の略号を用いた。n;標的抗原細胞を加えない、a;アロ抗原細胞 C56Bl/6 (H−2b) MNL、s;同種同系細胞 BALB/c (H−2d) MNL. X−X−X;1項目は1° MLRの抗原、2項目はCTL誘導に用いた抗原、3項目は細胞傷害試験に用いた標的細胞を示す。具体的には、a−a−a;1°MLRの抗原はアロ抗原C57Bl/6 MNLを、CTL誘導にはアロ抗原C57Bl/6 MNLを、細胞傷害試験の標的細胞としてはアロ抗原C57Bl/6 MNLを用いた実験群。s−a−a; 1°MLRの抗原は同種同系細胞BALB/c MNLを、CTL誘導にはアロ抗原C57Bl/6 MNLを、細胞傷害試験の標的細胞としてはアロ抗原細胞C57Bl/6 MNLを用いた実験群。s−s−a; 1°MLRの抗原は同種同系細胞BALB/c MNLを、CTL誘導には同種同系細胞BALB/c MNLを、細胞傷害試験の標的細胞としてはアロ抗原細胞C57Bl/6 MNLを用いた実験群。n−s−a; 1°MLRの抗原はなにも添加しない、CTL誘導には同種同系細胞BALB/c MNLを、細胞傷害試験の標的細胞としてはアロ抗原細胞C57Bl/6 MNLを用いた実験群。
図3は、1°MLR培養細胞を剥離回収後の各実験群のフラスコ培養面に残存する細胞密度の比較を示す。
A実験群は、PVGlcNAc塗布培養フラスコ培養面より、EDTA/PBS(−)中にて震盪法により細胞の剥離回収操作後に、培養面に残存している細胞をギムザ染色法により染色し、顕微鏡撮影した。
A−1;倍率40倍。枠内に、ポリマー未塗布面(円形)と塗布面との境界における、剥離操作後における残存細胞密度差を示す。
A−2;倍率100倍。矢印は、ポリマー未塗布面(円形)と塗布面との境界における、剥離操作後における残存細胞密度差を示す。
A−3;倍率200倍。矢印は、ポリマー未塗布面(円形)と塗布面との境界における、剥離操作後における残存細胞密度差を示す。
B実験群は、P(VLA−co−SU)塗布培養フラスコ培養面より、EDTA/PBS(−)中にて震盪法により細胞の剥離回収操作後に、培養面に残存している細胞をギムザ染色法により染色し、顕微鏡撮影した。
B−1;倍率40倍。
B−2;倍率100倍。
B−3;倍率200倍。
C実験群は、市販培養フラスコ培養面より、タンパク質分解酵素(トリプシン)にて細胞の剥離回収操作後に、培養面に残存している細胞をギムザ染色法により染色し、顕微鏡撮影した。
C−1;倍率40倍。
C−2;倍率100倍。
C−3;倍率200倍。
D実験群は、市販培養フラスコ培養面より、EDTA/PBS(−)中にて震盪法により細胞の剥離回収操作後に、培養面に残存している細胞をギムザ染色法により染色し、顕微鏡撮影した。
D−1;倍率40倍。
D−2;倍率100倍。
D−3;倍率200倍。
E実験群は、市販培養フラスコ培養面より、EDTA/PBS(−)をピペットにて強く吹きつけることによる細胞の剥離回収操作後に、培養面に残存している細胞をギムザ染色法により染色し、顕微鏡撮影した。
E−1;倍率40倍。矢印は、培養面へピペットにてEDTA/PBS(−)を吹きつけた方向に沿って細胞が剥離した部分を示す。
E−2;倍率100倍。
E−3;倍率200倍。矢印は、培養面へピペットにてEDTA/PBS(−)を吹きつけた方向に向かって、付着細胞のラッフル(ruffle)辺縁部が捲れている様子を示す。
本発明は、下記工程:
a.哺乳動物の抗原提示関連細胞を得ること、
b.得られた細胞を糖鎖含有高分子でコートされた培養容器で培養すること、
c.培養容器を振盪させ、細胞を剥離すること、ただし、細胞を酵素で処理することなく、かつ、細胞剥離用器具を用いない
を含む、養子免疫細胞の調製方法に関する。
本発明で「抗原提示」とは、細胞外から取り込んだ抗原を分解処理し、その結果生じたフラグメントとMHC分子の複合分子を細胞膜上に発現し、これを抗原特異的免疫発現のためナイーブな免疫細胞へ提示することをいう。
本発明で「抗原提示関連細胞」とは、抗原提示能力を有する細胞又は抗原提示能力を有する細胞に分化することができる細胞をいう。
抗原提示能力を有する細胞とは、胸腺上皮細胞、単球、単球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞等を挙げることができるが、これらに限定されることはなく、抗原提示能力を有するあらゆる細胞をいう。
抗原提示能力を有する細胞に分化することができる細胞とは、胸腺上皮細胞、幹細胞、造血幹細胞、ES細胞、ES培養細胞、骨髄前駆細胞、骨髄芽球細胞、ミエロイド系前駆細胞等を挙げることができるが、これらに限定されることはなく、抗原提示能力を獲得することができるあらゆる細胞をいう。
本発明の「抗原提示関連細胞」は、それを含む組織又は体液から取得することができる。具体的には、幹細胞又は造血系幹細胞を含む組織及び体液、胎生初期の卵黄嚢、胎生期2ヶ月から出産までの期間の肝臓、胎生期2ヶ月から出産までの期間の脾臓、胎生期2ヶ月以降、及び出産後を含む骨髄、臍帯血、末梢血、重篤な感染症の回復期の末梢血、GM−CSF等の増血剤投与後の末梢血を挙げることができるが、これらに限定されることはなく、抗原提示関連細胞を取得することができるあらゆる生物学的資源を含む。
上記細胞の取得方法としては、従来知られている細胞の取得方法であれば任意の方法を用いることができ、例えば、全血又は骨髄液を採取すること、アフェレーシスにより、末梢血から単球部分を採取すること、又は単球由来初代培養細胞又は細胞株を増殖させることによって取得することができる。
本発明の調製方法に用いる培養液は、生理活性物質及び抗原を含むことができる。
本発明で「生理活性物質」とは、細胞、組織又は器官の生理的活性を調節することができる物質をいい、酵素、トキシン、細胞障害性タンパク、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、インターフェロンのようなタンパク質;ポリペチド;オリゴペプチド;糖;ヒト遺伝子、動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子、アンチセンスDNA、アンチセンスRNAのようなヌクレオチド;アミノ酸、及び、脂肪酸を挙げることができる。
より具体的には、生理活性物質は、PMA(ホルボール 12−ミリステート 13−アセテート)、LPS、ピシバニール、蓮見ワクチン M、PHA、ポリI:C、TSST−1(毒素性ショック症候群毒素−1)、コレラ毒素Bサブユニット、GM−CSF、M−CSF、IFN−α、IFN−β、INF−γ、TNF−α、IL−1β、IL−3、IL−4、IL−6、IL−7、IL−12、SCF、TGF−α、TGF−β1、結核菌菌体成分、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ブドウ球菌、百日咳菌、トキソプラズマ・ゴンディ(toxoplasma gondii)、細胞・細菌産物(リポ多糖類、リポタイコ酸、バクテリア熱ショックタンパク質、CpGモチーフ、ミコバクテリアトレハロース、ミコール酸、トキソプラズマ・ゴンディ由来可溶性抗原、リーシュウマニア・リポゾームタンパク質、2重鎖DNA等)、ヒアルロン酸結合物破片、エオタキシン−1α、MIP−1α、MIP−1β、MIP−3α、MCP−1、MCP−2、ELC、 RANTES、SLC、BACA−1、IL−8、MIP−2α、MIP−2β、MIG、SDF−1α、SDF−1βであることができる。
本発明で「抗原」とは、脊椎動物の宿主において、特異的抗体の形成を惹起する物質、または、その物質と反応する特異的リンパ球集団の発生を惹起する物質であり、抗原となりうる限り、有機・無機化合物を含む。例えば、タンパク質、核酸、炭水化物又は脂質、又はそれらの断片又は誘導体を挙げることができる。
より具体的には、抗原は、癌細胞溶解物、癌細胞酸抽出ペプチド、IgMイディオタイプ、β−Galタンパク質、MUT1ペプチド、HPV16−E7ペプチド、OVAペプチド、p53変異ペプチド、MART1、gp100、サイトキナーゼペプチド、TRP1、TRP2、チロシナーゼ、PSA、プロテイナーゼ3、MAGE−1、MAGE−3、BAGE、GAGE−1、GAGE−2、NY−ESO−1、β−カテニン、MUM−1、CDK4、TPI、CDC27、LDLR−FUT、CASP−8、KIAA0205、EF2、bcr−abl(0210)、TEL−AML1、Her2/new、ras、WT1、CEA、SART−1、KIAAO156、シクロフィリンB、Lck、F4.2、MUC−1ムチン、RAGE、HPV16−E7、EBV−EBNA−2,3,4,6、EBV−LMP2、HTLV−1tax、変異HLA−A2、HA1、HA2、H−Y、HB1、PRAME、GnT−V、p15、LacZ、MART−1、AFP、TRP−2、Netであることができる。
剥離された細胞を生理活性物質及び抗原を含む培養液で培養する工程は、上記細胞剥離工程の後に、行うこともできる。
本発明の好ましい哺乳動物は、ヒトである。
本発明で用いられる糖鎖含有高分子は、PVLAに代表され、PVLA(ポリ(p−N−ビニルベンジル−D−ラクトンアミド))は、ラクトースを側鎖にもつポリスチレン誘導体であり、ラクトース側鎖内のβ−ガラクトースが、肝実質細胞の膜表面に存在するアシアロ糖タンパク質レセプター(ASGPR)に特異的に認識され、肝細胞の機能化や組織化にとって非常に重要かつ有用であることが知られている。
PVLAは、下記構造式で示される。
ポリマー合成は、モノマーをDMSO、トルエン、シクロヘキサンなどの溶媒に熔解し、酸素を脱気処理により除いた後、AIBN,BPOなどの開始剤を加える。この後、密閉容器にて、開始剤の解裂温度以上で加熱し、2時間以上の適当な時間反応させることにより、容易に合成することができる。VLA(N−p−ビニルベンジル−O−β−D−ガラクトピラノシル−(1−4)−D−グルコアミド)のような糖鎖モノマーの場合、DMSO、DMFなどの比較的極性の高い溶媒が好ましく用いられるが、この溶媒に限定されるものではない。
VLAが溶解し、共重合させるモノマーが溶解しない溶媒を用いる場合は、両者が溶解する溶媒を選択するか、両者を溶解した溶液を混合することで容易にポリマーを合成することができる。
本発明の別の態様においては、VLAに変えて、VGlcNAc(N−p−ビニルベンジル−O−β−2−アセトアミド−2−デオキシ−D−グルコピラノシル−(1−4)−2−アセトアミド−2−デオキシ−D−グルコアミド、VMA(N−p−ビニルベンジル−O−α−D−グルコピラノシル−(1−4)−D−グルコアミド)、VCA(N−p−ビニルベンジル−O−β−D−グルコピラノシル−(1−4)−D−グルコアミド)、VMan(N−p−ビニルベンジル−O−β−D−マンノピラノシル−(1−4)−D−マンアミド)、VMea(N−p−ビニルベンジル−O−α−D−ガラクトピラノシル−(1−6)−D−グルコアミド)、VLAm(N−p−ビニルベンジル−O−α−D−グルコピラノシル−(1−3)−D−グルコアミド)あるいは、市販のモノマーを単独あるいは共重合体として用いることができる。
PVGlcNAcの構造式
P(VLA−co−SU)の構造式
本発明の好ましい糖鎖含有高分子としては、P(VLA−co−SU)又はPVGlcNAcを挙げることができる。
本発明の細胞剥離工程は、下記工程:
c1.培養液を除去し、EDTAを含むPBSを加えること
c2.4−10℃で10分間、容器を静置すること
c3.容器を振盪し、細胞を剥離すること
を含むことができる。
EDTAの濃度は、好ましくは、0.02mM〜20mMである。
EDTAを含むPBSの液深は、好ましくは、2〜5mmである。
また、本発明は、本発明の調製方法で得られる養子免疫細胞にも関する。
また、本発明は、本発明の調製方法に用いるための、PVLA、好ましくは、P(VLA−co−SU)又はPVGlcNAcでコートされた培養容器にも関する。
糖鎖含有高分子は、適当な水溶液としてシャーレにコーティングすることができる。好ましくは、0.01wt%の純水あるいはPBS溶液として用いることができるが、これに限定されるものではない。シャーレの大きさに応じて適量の糖鎖含有高分子溶液を添加して、コーティングすることができる。この際、好ましくはシャーレが溶液で覆われる量の液深を保つ必要があり、好ましくは1mmから5mmの液深を用いることができるが、これに限定されるものではない。コーティング時間は、1時間から24時間の処理を行うことでコーティングすることができるが、より好ましくは2時間の処理を行うことでコーティングできるが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、上記培養容器を含む、養子免疫細胞ワクチン調製のためのキットにも関する。本発明のキットには、さらに、細胞分離用遠心管、抗原及び/又は培養液を含むことができる。
また、本発明は、本発明の養子免疫細胞を用いる悪性腫瘍、I型糖尿病、アトピー型アレルギー疾患又は感染症を治療するための方法にも関する。
本発明の治療方法の具体的な態様を下記に例示するが、これに限定されるものではない。
1.腫瘍摘出後、被摘出者本人の造血の回復を待ってアフェレーシスにより末梢血単核球成分を主とした細胞分画を採取する。造血の回復は、末梢血中の各成分細胞数により担当医が確認する。
2.アフェレーシスにより得られた、血球分画をさらに比重遠心法(分離液;リンホセパールI、遠心条件;400×g、30分間)にて分画し赤血球・血小板等を含まない末梢血単核球成分を得る。これをPBMNL(末梢血単核白血球)と以後記述する。
3.得られたPBMNLを洗浄後、生理活性物質(例えば、PMA、PHA、蓮見ワクチン M、GM−CSF、IFN−α、TNF−α、IL−3、IL−4、SCF、TGF−α、TGF−β1、結核菌体成分、LPS、ピシバニール、ポリI:C、ヒアルロン酸結合物破片)を添加した培養液にて培養を開始する(樹状細胞の分化成熟誘導)。培養容器は、糖鎖含有高分子(例えば、P(VLA−co−SU)又はPVGlcNAc)を塗布したプラスチック培養容器をもちいる。培養期間を通じて、全ての培養細胞へ3日おきに新鮮培養液を加える。
培養7日目に、新鮮培養液とともに癌関連抗原溶液(例えば、癌細胞溶解物、癌細胞酸抽出ペプチド、癌細胞関連合成ペプチド、IgMイディオタイプ、MUT1ペプチド、HPV16−E7ペプチド、p53変異ペプチド、MART1、gp100、チトシナーゼペプチド、TRP1、TRP2、チロシナーゼ、PSA、プロテイナーゼ3、MAGE−1、MAGE−3、BAGE、GAGE−1.2、NY−ESO−1、β−カテニン、MUM−1、TPI、CASP−8、KIAA0205、bcr−abl(0210)、TEL−AML1、Her2/new、ras、WT1、CEA、SART−1、KIAAO156、シクロフィリンB、Lck、MUC−1、変異HLA−A2、HA1、HA2、H−Y、LacZ)を加え、更に7日間培養を続ける(癌特異抗原提示細胞の誘導)。
培養最終日に、培養容器より細胞を剥離回収する。付着細胞の剥離回収は、震盪法にて行う。震盪法による剥離回収方法は、以下のように行うことができる。浮遊細胞を遠心管に回収しEDTA/PBS(−)にてフラスコ底面を1回すすぐ。次いで、EDTA/PBS(−)を底面からの深さが2−5mmになるように加え、4℃にて10分間静置する。続いて振盪器にて振幅2.0−4.0cm、速度130−160回/分の条件で10分間震盪する。震盪後に剥離してくる細胞を回収する。フラスコを、さらにEDTA/PBS(−)にて2回洗浄し、剥離してくる細胞を前述の遠心管に集める。得られた細胞を該当癌抗原特異的抗原提示細胞と呼ぶ。
4.該当ガン抗原特異的抗原提示細胞の誘導培養工程と同時に平行して、活性化T細胞培養の誘導培養を行う。手順を以下に記述する。
前述2工程にて得られたPBMNLを、新鮮培養液にPHA(最終濃度;10μg/ml)を添加した培養液にて、3日間培養する。培養容器は、糖鎖含有高分子(例えば、P(VLA−co−SU)又はPVGlcNAc)を塗布したプラスチック培養容器をもちいる。培養期間を通じて、全ての培養細胞へ2日おきに新鮮培養液を加える。3日後、各培養中へイノマイシン(最終濃度;1μg/ml)を加え更に3時間培養する。
培養終了後に培養器中の細胞を集める。付着細胞の剥離回収は、震盪法にて行う。震盪法による剥離回収方法は、以下のように行うことができる。
浮遊細胞を遠心管に回収しEDTA/PBS(−)にてフラスコ底面を1回すすぐ。次いで、EDTA/PBS(−)を底面からの深さが2−5mmになるように加え、4℃にて10分間静置する。続いて振盪器にて振幅2.0−4.0cm、速度130−160回/分の条件で10分間震盪する。震盪後に剥離してくる細胞を回収する。フラスコを、さらにEDTA/PBS(−)にて2回洗浄し、剥離してくる細胞を前述の遠心管に集める。得られた細胞をAT細胞と呼ぶ。
5.該当癌抗原特異的抗原提示細胞及びAT細胞を新鮮培養液にて洗浄する。
パイロージェン・細菌汚染の有無を確認後に両細胞を、該当PBMNLを得た同一人へ投与する。
また、本発明は、養子免疫細胞を用いる悪性腫瘍、I型糖尿病、アトピー型アレルギー疾患又は感染症を治療するための医薬にも関する。
上記医薬は、本発明の養子免疫細胞をそのまま又は公知の薬学的に許容される担体(賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる)や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態(錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤;注射剤、点滴剤、外用剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤、坐剤などの非経口投与剤)等に応じて経口投与または非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なる。
<材料と方法>
動物
1)マウス:
C57Bl/6、BALB/cマウスは、オリエンタル酵母工業(株)より4週令雄を購入し用いた。
細胞
1)マウス単核白血球の調製
BALB/cマウスを頚椎切断法にて死亡させ無菌的に脾臓、胸腺、腹腔リンパ節を得た。得られた組織から、2枚のスライドグラスにて培養液中でゆるやかに解すことにより浮遊細胞を得た。この細胞浮遊液から、綿ろ過により組織片を除き、300×g、4℃にて7分間遠心した。遠心後上清を除き、培養液に再浮遊させた。この一連の手順を3回繰り返すことにより細胞以外の組織・細胞片を除いた。洗浄後、脾臓細胞・胸腺細胞・リンパ節細胞をプールした。これを、以下の実験ではMNL(mono−nuclear leukocyte)とよぶ。
2)コンカナバリンA芽細胞(ConA blast細胞)の調製
1−5×106細胞/mlの細胞浮遊液にConA(Sigma Chemical Co.,Cat #C−0412)を最終濃度2μg/mlとなるように加えてインキュベーターにて37℃、5%CO2の条件で培養した。48時間後に培養容器より浮遊細胞を50ml遠心管に回収し、培養液にて5回洗浄した。
3)マイトマイシンC(MMC)処理細胞の調製
1−5×106細胞/mlの細胞浮遊液にMMC(Sigma Chemical Co.,Cat #M−0503)を最終濃度が50μg/mlになるように加え、37℃にて静置した。
60分後培養液にて5回洗浄し、培養液に再浮遊させた。
4)免疫蛍光染色
免疫染色したい細胞の浮遊液を15ml遠心管にて遠心(300×g、4℃、7分間)した。上清を捨てペレットにした。ペレットをゆるやかに解し、これにFc BlockTM(日本ベクトンディッキンソン(株)Cat #01241D)を1×106細胞あたり2μl加えた。次いで、1×106細胞あたりPE−抗マウスI−Ad(日本ベクトンディッキンソン(株)Cat #06035A)を2μl、FITC−抗マウスCD11c(日本ベクトンディッキンソン(株)Cat #557400)を2μl、ビオチン−抗マウスCD80(日本ベクトンディッキンソン(株)Cat #553867)を2μl、ビオチン−抗マウスCD86(日本ベクトンディッキンソン(株)Cat #553690)を2μl加えた。この混合物を氷上にて30分間静置した。反応後洗浄バッファーを10ml加え、300×g、4℃、7分間遠心し上清をすてる操作を3回繰り返した。この細胞ペレットに、ストレプトアビジン−Cy−Chrome(日本ベクトンディッキンソン(株)Cat #554062)を2μl加え氷上に30分間静置した。反応後、細胞に洗浄バッファー10mlを加え300×g、4℃、7分間遠心し上清を捨てた。細胞について、この操作を3回繰り返し、洗浄バッファー1mlに再浮遊させ、フローサイトメトリー(日本ベクトンディッキンソン(株)Model FACSCaliburTM)にて蛍光ラベル抗体陽性の細胞の解析を行った。
5)1次混合白血球反応(mixed leukocyte reaction、1°MLR)
1°MLR培養によりアロ抗原に対する抗原特異的抗原提示細胞を得た。操作は、下記に従った。5×106細胞/mlに調整されたBALB/cマウス(H−2d)由来MNL12mlとMMC処理C57Bl/6(H−2b)由来MNL5×106細胞/ml 12mlとを75cm2培養フラスコに加え、ついでインターロイキン2(Sigma Chemical Co.,Cat #I−0523)を最終濃度20ng/mlになるよう加え、37℃、5%CO2にて培養した。
従来の方法により剥離回収に供する付着細胞用培養フラスコは日本ベクトンディッキンソン(株)のCat #353136のフラスコを用い、検定ポリマーをコートしたフラスコは日本ベクトンディッキンソン(株)のCat #353133のフラスコに各々ポリマーをコートしたものを用いた。培養は、12日間行いその間3日おきに新鮮培養液を2mlずつ加えた。
6)1°MLR培養フラスコからの細胞の剥離回収
1°MLR培養12日後に各フラスコより細胞を以下のようにして回収した。
ポリマーをコートしたフラスコについては、浮遊細胞を50ml遠心管に回収しEDTA/PBS(−)にてフラスコ底面を1回すすいだ。次いで、EDTA/PBS(−)を底面からの深さが2−5mmになるように加え、4℃にて10分間静置した。続いて振盪器(Nissin社、レシプロ振盪器 NA−201)にて振幅3.0cm、速度130−160回/分の条件で10分間震盪した。震盪後に剥離してくる細胞を回収した。フラスコを、さらに5mlのEDTA/PBS(−)にて2回洗浄し、剥離してくる細胞を前述の遠心管に集めた。
酵素処理方法で剥離回収した細胞は、以下のように調製した。
ポリマーコートをしていない付着細胞用フラスコより、1°MLR培養後浮遊細胞を50ml遠心管に回収した。フラスコ培養面にEDTA/PBS(−)5mlを加え前後にゆるやかに傾ける操作を4−5回繰り返した。この操作で浮遊してくる細胞も同じ遠心管にプールした。フラスコにトリプシン/EDTAを5ml加え、室温にて5−10分間静置した。時間が来たらフラスコをゆるやかに傾けては戻す操作(「すすぎ」操作)を5−6回繰り返し行い、浮遊してくる細胞を、培養液10mlを予め加えた50ml遠心管に回収した。フラスコ培養面をさらにEDTA/PBS(−)5mlにて2回すすいだ。得られた剥離細胞群を各実験群ごとに1つにプールした。
ピペッティング方法では、付着細胞用フラスコより1°MLR培養後浮遊細胞を50ml遠心管に回収した。フラスコ培養面にEDTA/PBS(−)5mlを加え、前後にゆるやかに傾ける操作を4−5回繰り返した。この操作で浮遊してくる細胞も同じ遠心管にプールした。次いで、10mlプラスチックピペット(日本ベクトンディッキンソン(株)Cat #357551)にてEDTA/PBS(−)を強く吹きつけるようにして全培養面を洗い込んだ。洗い込みは、毎回新しいEDTA/PBS(−)と置き換え3回繰り返した。洗い込みごとに得られた細胞を実験群ごとにプールした。
7)細胞傷害試験
細胞傷害性T細胞(CTL)によって傷害された標的細胞の死細胞数の測定は、7−アミノ−アクチノマイシン(7−AAD、日本ベクトンディッキンソン(株)Cat #555816)を用いて行った。操作は、1×106細胞ペレットをC57Bl/6標的MNLと特異的に反応するFITC−抗マウスH−2Db抗体20μlとFc BlockTM20μlとを混合し4℃にて30分間反応をおこなった。反応後、細胞を洗浄バッファー10mlにて1回洗浄し、7−AADを20μl加え室温にて静置した。10分後にフローサイトメトリー(日本ベクトンディッキンソン(株)、型式FACSCaliburTM)にてH−2Db陽性の細胞の比率と細胞数を求めた。この数値が、求めるCTLによって傷害された標的細胞を示している。
試薬
1)PVLAの合成
VLAの合成:
反応スキーム1 ビニルベンジルフタルイミドの合成
適量のナスフラスコ中でクロロメチルスチレン1kgをDMF3.2Lに溶解し、フタルイミドカリウム1.2kgを加えた。これを50℃、4時間反応させた。エバポレーターを用いてDMFを留去したのち、ベンゼン4.5Lを加えて残渣を溶解した。ベンゼンを0.2N NaOH溶液で数回洗浄した(全量3.25L)。ベンゼンを更に水で数回洗浄し(全量3.25L)、Na2SO4等で乾燥させた後、エバポレーターを用いて溶媒を留去した。残渣をメタノールから再結晶して目的物を得た。収量1.5kg
反応スキーム2 ビニルベンジルアミンの合成
適量のセパラブルフラスコ中で1kgのビニルベンジルフタルイミドを2.7Lのエタノールに溶解し、窒素気流下、加熱灌流させた。これに滴下ロートを用いて、80%ヒドラジン一水和物0.36kg/545ml エタノール溶液を滴下した(滴下時間40分程度)。反応は、90分間、加熱灌流させて行った。反応終了後、得られた固体を濾取し、これに、KOH溶液(1kg/6.5L H2O)を加えて溶解したのち、エーテルにて抽出した(全量3.6L×3)。エーテル層をさらに、2%K2CO3溶液で洗浄し、さらに水で数回洗浄した。エーテル層をNa2SO4上で乾燥した後、エーテルを留去し、残渣を減圧蒸留した。
沸点72−73℃/3mmHg
収量0.45kg
反応スキーム3 ラクトースラクトンの合成
ラクトース12gをメタノール300mlに分散させ、40℃に加熱した。これに、ヨウ素18gのメタノール溶液を滴下し、40分間反応させた。これに、4NのKOHメタノール溶液を、ヨウ素の着色が無くなるまで添加した。沈澱を濾取し、冷メタノールで数回洗浄後、エーテルで洗浄した。一旦秤量した。
その後、得られた結晶をごく少量の水に溶解し、アンバーライト120Bのプロトン型イオン交換樹脂にアプライし、酸性分画を単離した。得られた水溶液にメタノールとエタノールを添加してエバポレーションした。完全に乾固したのち、再び、メタノールとエタノールを加えて溶解し、エバポレーションした。この操作を数回繰り返し、ラクトースラクトンを作製した。
反応スキーム4 VLAの合成
適量のナスフラスコ中で、ラクトースラクトン1kgをメタノール5.4Lに70℃で溶解したのち、これにビニルベンジルアミン0.4kgを加え、120分、70℃で反応させた。反応終了後、21.7Lのアセトンを加えて、目的物を沈殿させた、これを4℃で数時間放置したのち、濾取し、沈殿をメタノールから再結晶した。収量1.1kg
ポリマーの合成
VLAを真空反応管に分注した。DMSOあるいはDMSO−トルエンの混合溶媒を加えて完全に溶解した後、凍結−脱気−融解を繰り返して、酸素を溶液中から取り除いた。これに100分の1モルのAIBNを添加して、溶解したのち、減圧密閉した。60℃で5時間反応させてポリマーを合成した。
得られた溶液を大過剰のメタノールに滴下して、ポリマーを沈澱させた。これを適当な溶媒に溶解し、再びメタノールに滴下してポリマーを沈澱させる操作を3回繰り返した。
最終的に得られたポリマーを蒸留水に溶解し、大過剰の水に対して透析した。その後、凍結乾燥により目的のポリマーを得た。
シクロヘキシル4−[(2’)−アクチルアミド−エチル]ベンゼンスルホニルウレア(SU)の合成
p−アミノエチルベンゼンスルホンアミド(8g 30mmol、東京化成工業試薬)と塩化アクリロイル(2.7g 30mmol、和光純薬試薬)をアセトン15ml中で混合し、1N NaOH水溶液15mlを加えて、室温で2時間攪拌し反応させた。その後、沈澱を回収し、メタノールで再結晶して4−[(2’)−アクチルアミド−エチル]ベンゼン スルホンアミドを得た。
4−[(2’)−アクチルアミド−エチル]ベンゼンスルホンアミド(3g、12mmol)をアセトン6mlに溶解し、1N NaOH溶液を6ml加えた。これに、シクロヘキシルイソシアネート(0.9ml、7mmol)をアセトン6mlに溶解したものを加えて、室温で16時間反応させた。塩酸で中和した後、生じた結晶を回収し、メタノールから再結晶し、目的物を得た。
コポリマー
VLAと共重合させるモノマーをモル比9:1、8:2、7:3等の割合で秤量し、真空反応管に分注した。DMSOあるいはDMSO−トルエンの混合溶媒を加えて完全に溶解した後、凍結−脱気−融解を繰り返して、酸素を溶液中から取り除いた。これに10mmolのAIBNを添加して、溶解したのち、減圧密閉した。60℃で5時間反応させてポリマーを合成した。
得られた溶液を大過剰のメタノールに滴下して、ポリマーを沈澱させた。これを適当な溶媒に溶解し、再びメタノールに滴下してポリマーを沈澱させる操作を3回繰り返した。
最終的に得られたポリマーを蒸留水に溶解し、大過剰の水に対して透析した。その後、凍結乾燥により目的のポリマーを得た。
コモノマーとしては、上記SUをはじめとして、上記糖鎖結合モノマーや市販のモノマーを好ましく用いることができる。
2)培養フラスコのポリマーコーティング方法:
PVLA、P(VLA−co−SU)、PVGlcNAcをそれぞれ0.01wt%水溶液とした。これら溶液を日本ベクトンディッキンソン(株)のCat #353133のフラスコに5mlずつ分注した。その後室温で、遮光下2時間コーティング処理を行った。その後、ポリマー溶液を回収し、各フラスコを純水10mlで3回洗浄し、各実験に用いた。
3)培養液:L−グルタミン(Sigma Chemical Co.,Cat #G−5889)0.6g、HEPES(Sigma Chemical Co.,Cat #H−4034)1g、NaHCO3(Sigma Chemical Co.,Cat #S−5761)2gをRPMI 1640(Gibco,Cat #31800−014)1Lに溶かし、次いで2−メルカプトエタノール(Sigma Chemical Co.,Cat #M−3148)を最終濃度5×10−5M、牛胎児血清(JRH BioSciences,Cat #12103−789)を最終濃度10%になるように加えた。以上を混合後に、0.22μm滅菌フィルター(日本ミリポア(株)、Sterivex−GS Cat #SVGSB1010)にてろ過滅菌を行った。これを以後培養液と呼ぶ。
4)Ca++、Mg++不含PBS
Oxoid Ltd.,のPBS(リン酸緩衝生理食塩水(Cat #BR0014G)10タブレットを純水(日本ミリポア(株)、Milli−Q超純水装置システムElix 5キット MilliQ Gradient)1Lに溶かしてオートクレーブにて121℃、20分間高温高圧滅菌を行った。以下、これをPBS(−)と記す。
5)0.2%EDTA/PBS(−)
PBS(−)1Lに対しEDTA(EDTA・4Na、和光純薬(株)、Cat #343−01883)を2g添加し、オートクレーブにて121℃、20分間高温高圧滅菌を行った。以下、これをEDTA/PBS(−)と記す。
6)0.05%トリプシン、0.024%EDTA添加PBS(−)
PBS(−)100mlにトリプシン(Sigma Chemical Co.,Cat #T−7409)を0.05g、EDTA(EDTA・4Na、和光純薬(株)、Cat #343−01883)を0.024g加え溶解後に0.22μm滅菌フィルター(日本ミリポア(株),Sterivex−GS Cat #SVGSB1010)にてろ過滅菌を行った。これを以後トリプシン/EDTAと呼ぶ。
7)洗浄バッファー
免疫蛍光染色に用いる洗浄バッファーを以下のように調製した。PBS(−)に牛血清アルブミン(Sigma Chemical Co.,Cat #A−3059)を最終濃度0.1%に、NaN3(和光純薬(株)Cat #195−11092)を最終濃度0.001%になるように加え、4℃に冷やして用いた。
8)滅菌溶液の滅菌テスト
調製された溶液を1ml無菌15ml遠心管に分注し37℃にて8時間培養しカビ、バクテリアの増殖の有無を顕微鏡下(×100)で確認した。
器具
1)浮遊細胞用培養フラスコ
ポリマーをコーティングするフラスコとして、日本ベクトンディッキンソン(株)の無処理ポリスチレン75cm2フラスコ、Cat #353133を用いた。
2)付着細胞用培養フラスコ
コントロールとして用いた付着細胞用フラスコは、以下の物を用いた。日本ベクトンディッキンソン(株)処理済みポリスチレン75cm2フラスコ、Cat #353136、日本ベクトンディッキンソン(株)処理済みポリスチレン25cm2フラスコ、Cat #353108。
3)細胞用遠心管
遠心管は以下のものを用いた。15ml遠心管は、旭テクノグラス(株)Cat #2315−015、50ml遠心管は、(株)アシストCat #62.548.004Sを用いた。
4)培養用プラスチックピペット
10mlプラスチックピペットは、日本ベクトンディッキンソン(株)Cat #357551を用いた。
<結果>
1°MLR培養中のCD80/86、CD11c、I−A d 陽性細胞の比較
CD80/86、CD11c、I−Ad陽性細胞の比較は、3カラー免疫蛍光染色によって行った。反応細胞(H−2d)と、抗原用細胞(H−2Db)の区別は、反応細胞のみを識別できるPE−抗マウスI−Ad抗体を用いることにより識別した。図1−aに剥離回収されてきた細胞中のCD80/86、CD11c、I−Ad陽性細胞数を比較した結果を示す。図に示される通りPVGlcNAc、P(VLA−co−SU)をコートしたフラスコからの震盪法によって剥離回収されてくるCD80/86、CD11c、I−Ad陽性細胞数は、従来の市販の付着細胞用フラスコを用い酵素処理・ピペッティング法・震盪法による剥離回収されてくるCD80/86、CD11c、I−Ad陽性細胞数より有意に高い。同様の傾向は、1°MLR培養フラスコより回収されたCD80/86、CD11c、I−Ad陽性細胞の全細胞数に対する割合(%)においても認められた(図1−b)。
剥離回収後の各実験グループのフラスコ培養面に残存する細胞密度の比較
細胞を剥離回収した後のフラスコは、直ちにギムザ染色原液(武藤化学(株)、Cat #1500−2)を3ml加え固定した。室温(15℃)にて30−60分間固定後に水道水を20ml加え染色を開始した。染色は室温にて1時間行った。染色後水道水にてフラスコの培養底面洗浄を行い風乾し顕微鏡。((株)ニコンインステック、型式DIAPHOT)にて写真((株)ニコンインステック、COOLPIXミクロシステムVI)を撮り残存細胞密度を比較した。
図3に結果を示す。市販の付着細胞用フラスコから各々酵素処理・ピペッティング法・震盪法により付着細胞を剥離回収した後のフラスコ培養面には、付着細胞が寄り集まったコロニーも認められ、ポリマーコートしたフラスコより震盪法にて付着細胞を剥離したフラスコに比べフラスコ面に残存する細胞の残存密度が高いことがわかる(図3)。
従来の剥離回収法であるピペッティング法(E−1、E−2、E−3)では、残存する細胞のうち特に強くEDTA/PBS(−)を吹きつけられたと思える周辺に細胞周縁が捲れたようになった細胞(E−3)が見られることから、引きはがされることにより細胞膜にかなりのダメージが加わったことが推測される。
C−3(×200)に見られるように、従来の方法ではトリプシンを用いた剥離方法においてさえ付着細胞のラッフルの伸展はよく細胞膜タンパクへのダメージの割に剥離回収効率は良くないことが分かる(C−1、C−2)。
アロ抗原特異的細胞傷害性T細胞試験
1°MLRにより得られた細胞の抗原提示能はさらに以下の方法によりアロ抗原特異的細胞傷害性T細胞を誘導することにより検定した。1°MLR培養より得られたBALB/c由来細胞を抗原提示細胞(H−2d)として1×105細胞/mlに調整し1.5mlを25cm2フラスコへ入れた。これにアロ抗原としてC57Bl/6由来ConA blast細胞をMMCで処理した。1×107細胞/mlの密度の細胞浮遊液1.5mlを加え、37℃、5%CO2条件下にて8日間混合培養した。培養期間中は3日目と6日目に各々新鮮培養液を2mlずつ加えた。培養8日目に浮遊細胞を50ml遠心管に集め、培養液にて3回洗浄後に1×107生細胞/mlになるよう培養液に再浮遊させ、その2mlを15ml遠心管に分注した。この遠心管に標的細胞としてC57Bl/6由来ConA blast細胞(1×105細胞/ml)を2ml加え6時間、37℃、5%CO2にて培養した。培養後に300×g、4℃、7分間遠心し上清を捨てた。この細胞ペレットにFITC−抗マウスH−2Db 20μlとFc BlockTM 50μlを加え30分間4℃にて静置した。10分間反応後に洗浄バッファーを1ml加えフローサイトメトリーにてH−2Db陽性、7AAD陽性の割合を求めた。結果を図2に示す。死細胞のうち標的細胞(H−2Db)であることは、FITC−抗マウス(H−2Db)にて免疫蛍光染色することにより確認した。
H−2Db陽性の死細胞数は、1°MLRステップ、CTL誘導ステップの各ステップに用いた標的細胞がアロ細胞(C57Bl/6由来 MNL)である場合(a−a−a;抗原特異的CTL誘導)について比較するとポリマーコートフラスコを用い調製した抗原提示細胞が、従来の酵素処理による剥離方法より有意に高いCTL誘導をおこなっていた。P(VLA−co−SU)をコートしたフラスコから剥離回収されてきた1°MLR培養細胞では1°MLR及びCTL誘導培養においてアロの標的細胞を用いてない(s−s−a、n−s−a)非特異的な反応のレベルは低く特異的抗原提示細胞の培養、剥離回収に利用価値が高いと思はれる。一方で、従来の酵素処理方法によっては、アロ抗原特異的CTL誘導が低くポリマー群に比べ抗原特異的反応と抗原非特異的反応の差が低いことが示される(図2)。
Claims (15)
- 下記工程:
a.哺乳動物の抗原提示関連細胞を糖鎖含有高分子でコートされた培養容器で培養すること、
b.培養容器を振盪させ、細胞を剥離すること、ただし、細胞を酵素で処理することなく、かつ、細胞剥離用器具を用いない
を含む、養子免疫細胞の調製方法。 - 上記工程a.に用いる培養液が、生理活性物質及び抗原を含む、請求の範囲第1項記載の調製方法。
- さらに、下記工程:
c.剥離された細胞を生理活性物質及び抗原を含む培養液で培養すること
を含む、請求の範囲第1項又は第2項に記載の調製方法。 - 生理活性物質が、PMA、PHA、蓮見ワクチン M、GM−CSF、IFN−α、TNF−α、IL−3、IL−4、SCF、TGF−α、TGF−β1、結核菌体成分、LPS、ピシバニール、ポリI:C及びヒアルロン酸結合物破片からなる群より選択される、請求の範囲第2項又は第3項に記載の調製方法。
- 抗原が、癌細胞溶解物、癌細胞酸抽出ペプチド、癌細胞関連合成ペプチド、IgMイディオタイプ、MUT1ペプチド、HPV16−E7ペプチド、p53変異ペプチド、MART1、gp100、チトシナーゼペプチド、TRP1、TRP2、チロシナーゼ、PSA、プロテイナーゼ3、MAGE−1、MAGE−3、BAGE、GAGE−1、GAGE−2、NY−ESO−1、β−カテニン、MUM−1、TPI、CASP−8、KIAA0205、bcr−abl(0210)、TEL−AML1、Her2/new、ras、WT1、CEA、SART−1、KIAAO156、シクロフィリンB、Lck、MUC−1、変異HLA−A2、HA1、HA2、H−Y、LacZからなる群より選択される、請求の範囲第2項又は第3項に記載の調製方法。
- 抗原提示関連細胞が、樹状細胞又はランゲルハンス細胞を含む、請求の範囲第1項〜第5項のいずれか1項に記載の調製方法。
- 哺乳動物が、ヒトである、請求の範囲第1項〜第6項のいずれか1項に記載の調製方法。
- 糖鎖含有高分子が、PVLA、P(VLA−co−SU)、PVGlcNAc、PVMA、PVCA、PVMea、PVLam又はPVManである、請求の範囲第1項〜第7項のいずれか1項に記載の調製方法。
- 上記工程b.が、下記工程
b1.培養液を除去し、EDTAを含むPBSを加えること
b2.4−10℃で10分間、容器を静置すること
b3.容器を振盪し、細胞を剥離すること
を含む、請求の範囲第1項〜第8項のいずれか1項に記載の調製方法。 - EDTAの濃度が、0.02mM〜20mMである、請求の範囲第9項に記載の調製方法。
- EDTAを含むPBSの液深が、2〜5mmである、請求の範囲第9項又は第10項に記載の調製方法。
- 請求の範囲第1項〜第11項のいずれか1項に記載の調製方法に用いるための、糖鎖含有高分子でコートされた培養容器の使用。
- 糖鎖含有高分子が、PVLA、P(VLA−co−SU)、PVGlcNAc、PVMA、PVCA、PVMea、PVLam又はPVManである、請求の範囲第12項に記載の培養容器の使用。
- 請求の範囲第12項又は第13項に記載の培養容器を含む、養子免疫細胞ワクチン調製のためのキット。
- さらに、細胞分離用チューブ、抗原及び/又は培養液を含む、請求の範囲第14項に記載のキット。
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