CN103649109A - 巨细胞病毒(cmv)的基因变体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及CMV基因变体，所述基因变体缺失CMV的IE区域的内含子2(CMV IEΔi2)。本发明也涉及这种基因变体以及从其转录的RNA剪接变体和从所述RNA剪接变体表达的蛋白的多种应用，例如用于诊断CMV相关癌症疾病，和鉴定个体患癌的风险或随着人样品转移CMV IEΔi2病毒的风险，并且就免疫治疗和疫苗接种而言通过靶向独特CMV IE蛋白进行预防和治疗。

Description

巨细胞病毒(CMV)的基因变体

技术领域

本发明涉及新的巨细胞病毒(CMV)基因变体，例如显示在癌症疾病患者中出现的基因变体。因此，本发明涉及癌症诊断方法的领域，更特定涉及出现巨细胞病毒(CMV)感染的癌症形式。本发明特别关注诊断成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肉瘤、肾癌、皮肤癌和胰腺癌，并且也适用于其他癌症形式。

发明背景

巨细胞病毒(CMV)是感染世界上大部分人口的常见病毒；60-100%的成年群体经历过这种感染，并且是所述病毒的载体。在初次感染后，CMV形成潜伏状态并有持久性，并且大部分感染是亚临床的。在健康载体中，优先发现所述病毒是骨髓谱系细胞中的潜伏病毒，并且病毒的重新活化依赖于细胞分化为成熟巨噬细胞或树突细胞，所述分化通常由炎症造成。直到20世纪70年代，仅认为严重的先天性感染病例代表所述病毒引起的人类疾病。随着社会中免疫抑制个体（例如AIDS患者和移植患者）的增加，CMV的重新活化成为在这些患者中造成高发病率和死亡率的主要临床问题。因此，在过去的几十年中，CMV的重要性和感兴趣程度增加，因为CMV疾病在这组患者中常见，并且可能危及生命。所述病毒通过炎症重新活化，并且越来越多的证据表明了所述病毒频繁地出现在炎症疾病患者的组织样品中。近来，越来越多的证据也提示了不同来源的癌症中存在活性CMV感染。我们定义了癌症中新的CMV基因变体，并且显示了新的患癌机理。

CMV感染和癌症

近期报导揭示了在某些恶性肿瘤中频繁出现CMV的基因组和蛋白，所述恶性肿瘤例如结肠癌、恶性胶质瘤(1-7)、髓母细胞瘤(8)、EBV阴性霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、前列腺癌和乳腺癌(综述参见(9,10))。我们证明了在99%恶性成胶质细胞瘤、>90%髓母细胞瘤(MB)和神经母细胞瘤(NB)、恶性黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、卵巢癌和宫颈癌中存在活性CMV感染(1,8)。重要地是，所述病毒感染在从相同患者获得的非癌症组织样品中和健康对照个体中保持潜伏(1,3)。

CMV和癌症调节（oncomodulation）:

在20世纪70年代，Fred Rapp小组已经报导了在前列腺癌中频繁出现CMV，并且从动物模型致癌肿瘤中分离出病毒株(11,12)。在数个稍后的研究中，CMV不能转化正常人体细胞，所以并不认为这种病毒是致癌的。相反，提出了术语癌症调节来描述CMV对由数种特定影响宿主细胞功能的病毒蛋白所介导肿瘤发生的间接影响(综述参见(13,14))。进化中，CMV发展出了影响很多不同细胞和免疫功能的复杂机理(15,16)。所述病毒在感染细胞中生成约170种蛋白，其中大约仅有50种对病毒生成是必需的(17)。因此，绝大部分病毒蛋白用于控制帮助病毒与其宿主共同生存的重要宿主功能。这些蛋白可以通过控制宿主功能对癌症发展起作用，并且通过调节免疫反应，受病毒感染的肿瘤细胞会受到保护避免被免疫系统发现(15)。可能涉及癌症发病的CMV机理称为癌症调节（oncomodulatory）机理(10,13)。

癌症调节定义为在肿瘤细胞提供的合适遗传环境中提高癌症发生过程的能力，所述癌症发生过程表征为破坏细胞内信号通路、转录因子和肿瘤抑制蛋白。CMV能阻滞细胞分化、干扰癌基因表达、诱导特异染色体断裂、抑制DNA修复机制、控制重要的表观遗传功能、控制细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导血管新生和细胞迁移，这些都提供了癌症调节机理(10,13)。较新的数据也提示了这种病毒可以是致癌的；一项研究显示了事实上，CMV蛋白US28的表达通过诱导的COX-2表达和VEGF生成造成自身造成鼠模型中的肿瘤发育(18,19)。靶向转基因小鼠肠上皮的US28的表达造成了肠增生、腺瘤（adenoma）和腺癌（adenocarcinoma）(20)。与Smits小组合作，我们近期显示了US28也引起STAT3磷酸化，生成IL-6并产生增殖表型。例如，成胶质细胞瘤中STAT3的磷酸化与成胶质细胞瘤患者的存活相关(6)。我们近期也发现了CMV蛋白IE72通过与启动子中SP-1结合位点的相互作用来诱导高端粒酶活性(7)。诱导端粒酶活性是致癌病毒的常见现象。有趣地是，我们发现了GBM肿瘤中仅仅CMV感染的细胞显示了增加的hTERT表达(7)。我们近期发现了CMV感染水平与成胶质细胞瘤患者存活延长相关联，进一步证明CMV感染在癌症中的重要作用(1)。再者，成胶质细胞瘤中CMV感染的水平是患者存活的较强预后因子。诊断中肿瘤低级CMV感染(定义为少于25%病毒阳性细胞)的患者存活时间比高级感染患者长2.5倍(21)。体外，更昔洛韦治疗抑制肿瘤生长达80-95%，并且动物模型显示了使用靶向病毒复制的药物使肿瘤生长抑制40-75%(8,22)。

CMV逃避免疫系统的检测CMV发展出设计成避免被免疫系统识别的复杂机理。例如，CMV抑制I类和II类HLA分子的表达和抗原呈递，其控制T细胞活化、抑制NK细胞活化、保护细胞免受从活化T和NK细胞释放的细胞溶解肽影响(16,23)。CMV也自身生成，并且控制细胞生成趋化因子、细胞因子和生长因子(15)。这些是使免疫系统不能识别感染细胞的策略示例，并且可以解释为什么CMV感染肿瘤不受免疫系统或针对其开发的免疫治疗的控制。因此免疫系统不能识别感染的肿瘤细胞(综述参见(16,23)，同时所述病毒依赖于炎症(24)。我们小组第一次鉴定了骨髓谱系细胞是潜伏病毒的主要循环载体(24)，并且T细胞的免疫活化和后续生成TNF-α和IFN-γ（造成巨噬细胞分化）是潜伏CMV重新活化的关键因素(24,25)。病毒感染也诱导COX-2(18,26-28)，并且我们近期发现了所述病毒也诱导5-LO表达(29)以诱导炎症和增强病毒复制，所述表达在肿瘤生物学中有高相关性。

CMV基因产物赋予化疗抗性

细胞凋亡，或程序性细胞死亡是NK细胞和细胞凋亡T细胞介导的杀伤机制的最后步骤。肿瘤细胞对药物诱导死亡的灵敏度减弱是抗癌症治疗失败的主要原因。至少五种不同的CMV蛋白(即IE1、IE2、UL36和UL37、UL38)抑制细胞凋亡，并且可以增强CMV感染肿瘤细胞的存活。这些蛋白也可以防止所需的化疗作用。神经母细胞瘤细胞中UL36的表达赋予化疗抗性(30)，支持了这种假说。

癌症中CMV致密体的关键作用

越来越多的数据显示了不同来源的癌症中频繁检测出CMV蛋白。>90的成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌、胰腺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、卵巢癌、宫颈癌显示了肿瘤细胞中的高CMV蛋白表达，但是肿瘤周围的非肿瘤组织中都是病毒阴性。我们也检测了患者活检，并且发现它们就CMV蛋白表达而言都为高阳性。CMV蛋白在肿瘤中广泛表达，并且CMV RNA转录物容易检测，但与此形成鲜明对比的是，相同组织样品中难于检测CMV DNA。这是一个迷惑了本领域诸多研究员的有争议的议题，并且这是否是人为假象（artefact）也引起了关注。

因此，本领域长期需要揭示CMV感染策略和其如何影响如癌症的开始或进展，并对其进行广泛研究。这归因于以下事实：这种揭示可以发现能更早治疗所需患者的潜在诊断方法以及可能的新治疗处理。

发明内容

本发明人现在通过定义新的巨细胞病毒(CMV)基因变体解决了本文提出的问题，所述基因变体显示缺失快速早期基因(IE)CMV基因组的内含子2(SEQ IDNO:17)，所述基因变体命名为CMV IEΔi2。本发明也涉及方法和应用，所述方法和应用包含发现的名为CMV IEΔi2的新CMV基因变体，表示通过缺失主要快速早期基因中内含子2(SEQ ID NO:17)的野生型CMV和/或新病毒株的变体，以及从所述基因变体转录的剪接变体和基因变体翻译的蛋白。所述方法应用于诊断例如癌症倾向和已经发展的癌症疾病。

附图说明

图1：通过免疫组织化学检测人巨细胞病毒(CMV)蛋白。在获自GBM(多形性成胶质细胞瘤)患者(A)、神经母细胞瘤NB(B)、髓母细胞瘤MB(C)和结肠癌组织(G)以及乳腺癌组织(H)的脑肿瘤组织中检测到CMV立即早期抗原(CMV-IEA)。针对平滑肌细胞α肌动蛋白的抗体(D,E,F)和针对角蛋白20(I)和细胞角蛋白(J)的抗体用作对照。非特异条=50μm。

图2：乳腺癌样品中人巨细胞病毒立即早期(CMVIE)和晚期(LA)蛋白的免疫组化染色。CK表示肿瘤细胞的细胞角蛋白染色作为阳性或染色对照，阴性(Neg)对照表示同种型对照抗体。照片显示了CMV的限制性表达，即肿瘤细胞中的CMV蛋白。

图3：淋巴结中乳腺癌肿瘤淋巴结大量转移的人巨细胞病毒立即早期(CMVIE)和晚期(LA)蛋白的免疫组化染色。CK表示肿瘤细胞的细胞角蛋白染色作为阳性（即染色对照），阴性对照表示同种型对照抗体。照片显示了CMV蛋白在肿瘤细胞和肿瘤转移中的限制性表达。

图4：就人巨细胞病毒立即早期抗原(CMV IEA)和pp65而言细胞系(髓母细胞瘤D283)的流式细胞术染色。在不同来源的肿瘤细胞系中经常检测到不同蛋白表达水平的CMV蛋白表达(n=40;CMV阳性细胞在0.5-69%之间变化，并且在相同细胞系的不同取样时间也不同)。

图5：野生型中人巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)基因和CMV IE基因区域PCR所用不同引物定位的示意图。在CMV IEΔi2中，内含子2缺失，这通过使用主要立即早期(MIE)外引物和MIE内引物对的巢式PCR或者使用仅允许缺失变体生成阳性信号的跨越外显子2和3的探针的Taqman PCR确证。

图6：巢式PCR在癌症患者中扩增218bp的PCR DNA片段；大小与实验室巨细胞病毒株(CMV)感染细胞的RNA样品的cDNA相似(C3)，而相同培养的DNA制品扩增332bp的PCR片段(C2)。从健康供体(HD)和有感染性单核细胞增多症(IMN)的病毒血症（viremic）患者中扩增野生型DNA片段。HD：健康供体，CC：结肠癌，NTC：无模板对照，NB：神经母细胞瘤，BrC；乳腺癌，OvC：卵巢癌，C1：未感染的成纤维细胞，C2：CMV感染的成纤维细胞的DNA，C3：CMV感染的成纤维细胞的cDNA。

图7：显示载有CMV IEΔi2变体的癌症患者(A)或健康供体野生型变体(B)中内含子2缺失的色谱图。图显示了载有CMV IEΔi2变体的癌症患者中内含子2缺失位点(A)(序列：GTG GCC TTG GTC ACG GGT GTC TCG GCC GTG GCA CCT TGG AGGAAG GGC CCT)或健康供体野生型变体中内含子2缺失位点(B)(序列：ACG TCGTGG CCT TGG ACA CGG GTG TCT CGG CCT AAA CAC ATT AGA AAT AG)。

图8：A和B)测序PCR产物的比对显示了在不同来源癌症中发现的人巨细胞病毒(CMV)IEΔi2株的内含子2缺失。指示了外显子2和外显子3，以及用于巢式PCR的引物定位。在例如乳腺癌、结肠癌、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤和成胶质细胞瘤中发现了CMV IEΔi2，但是病毒血症患者或健康对照载野生型CMV株。

图9：常用于实验室研究的三种不同病毒株的巢式PCR；VR1814、TB40、AD169扩增332bp的野生型片段。样品从病毒储液或感染细胞中制备。NTC：阴性对照，C2：感染细胞的cDNA扩增218bp片段。

图10：巢式PCR从动脉粥样硬化患者和感染性单核细胞增多症患者(IMN)的血清样品中扩增318bp的野生型DNA片段。C2：CMV野生型感染细胞的cDNA样品也显示了野生型DNA条带(所述样品没有经DNA酶处理)，这在相同细胞的DNA制品中可以观察到(C3)。

图11：健康血液供体中的DNA扩增。C2：DNA野生型(wt)CMV的阳性对照。在12-13%的检测对照中发现一个有CMV IEΔi2株的个体(22)。

图12：A和B)GBM RNA转录物的序列比对，所述转录物如来自成胶质细胞瘤原代细胞培养物(从3个不同烧瓶中收集)的CMV DNA，显示了快速早期(IE)基因中内含子2缺失。IE1、IE9、IE17.5和IE19的编码序列与外显子2和外显子3的Merlin参照序列(基因库AY446894.2)一起显示。

图13：使用人巨细胞病毒(CMV)单克隆抗体(克隆810R)对神经母细胞瘤(NB)原发性肿瘤的Western印迹分析。CMV蛋白立即早期(IE)55、IE72和IE86并不丰富；仅一个样品显示了IE55(NB7)。相反，新蛋白重新表达的大小是38、31、20和10kDa。图14显示阳性对照。

图14：使用人巨细胞病毒(CMV)单克隆抗体(克隆810)对成胶质细胞瘤原发性肿瘤的Western印迹分析。CMV蛋白立即早期IE55、IE72和IE86并不丰富；仅两个样品显示了IE72(42,50)。相反，表达的新蛋白的大致分子量是50、53、28、24、19和10kDa。阴性对照是未感染的成纤维细胞MRC-5；阳性对照在感染后15天感染的MRC-5。

图15：使用针对IE86的人巨细胞病毒(CMV)肽抗体对成胶质细胞瘤原发性肿瘤细胞培养物的Western印迹分析。两次曝光以显示有野生型CMV株VR1814的病毒感染细胞的阳性对照。在原代培养中CMV蛋白IE55和IE86以及40kDa和20kDa蛋白非常丰富，而缺失在原发性成胶质细胞瘤中表达的数种独特蛋白。仅有两个样品表达50、53kDa蛋白(30,46)，三个样品表达28kDa蛋白(42,47,48)。相反，新蛋白重新表达的大小是50、53、28、24、19和10kDa。

图16：使用包含细菌人工染色体(BAC)载体中人巨细胞病毒(CMV)全基因组的CMV探针的荧光原位杂交(FISH)分析。A)感染7天后CMV野生型感染细胞(AD169)。B)CMV野生型病毒的健康载体。C)成胶质细胞瘤的印迹显示了CMV基因组的外周定位，有时扩增为如D)另一个成胶质细胞瘤患者所示。CMV基因组的外周定位模式在载有癌细胞CMV IEΔi2株的癌症患者中极不同，并且可重复(n=40;100%)。

图17：A)使用包含细菌人工染色体(BAC)载体中人巨细胞病毒(CMV)全基因组的CMV探针的荧光原位杂交(FISH)分析显示了成胶质细胞瘤患者肿瘤细胞中CMV基因组整合入染色体17。表示染色体17的两个染色单体上所存在CMV DNA的两个小点在更高放大倍数下可见(B)。

图18：A)GBM患者中发现RNA转录物的序列比对。已知来自Awasthi等J Virol，2004年8月，第8191-8200页(31)的剪接变体的示意图。来自发表杂志(Awasthi等，J Virol，2004年8月，第8191-8200页(31)，显示IE1和IE2的氨基酸比对和剪接变体)的立即早期(IE)19、IE17.5和IE9的序列比对。B)附图显示来自IE基因的外显子2、3、4和5的多个剪接变体。

发明详述

定义

本文所述“内含子”是基因中通过RNA剪接除去以生成基因最终成熟RNA产物的任意核苷酸序列。术语内含子指基因中的DNA序列，但是在有内含子的基因转录的RNA转录物相应序列中除去。

本文所述“外显子”指转录成信使RNA的蛋白合成信息编码DNA的核酸序列。

本文定义的“CMV IEΔi2”也称为“CMVIEΔint2”，指作为CMV独立株的CMV基因变体，对应图5中所示CMV IE基因组的核酸序列，但是其中称为立即早期区域的内含子2对应部分(IE的内含子2示于SEQ ID NO:17)DNA中缺失、缺少或删除，如图6、7和8所示。所述野生型CMV株参照基因库(AY446894.2 Merlin)，在包含IE基因的碱基对位点170689-176186有立即早期基因，如图5中是参照基因，和图8缺失内含子2的CMV IEΔi2。因此，所述基因变体还表征为所述基因变体缺失Merlin参照序列AY446894.2(野生型CMV)的位点173903到位点174019的核酸序列。

“立即早期”(IE)基因是在急性感染和响应广泛细胞刺激中短暂和快速活化的基因。这表示感染中CMV基因组转录的第一组基因，随后是其控制转录的早期和晚期基因。IE基因表示在任何新蛋白合成前，对刺激的第一轮响应中于转录水平活化的有效反应机理。定位在CMV基因组的病毒长独特（Unique long）(UL)基因片段上的主要立即早期基因UL123/122，指位于野生型CMV Merlin株(基因库AY446894.2)的碱基对位点170689-176186的区域。主要立即早期基因在主要立即早期(MIE)启动子控制下转录，生成编码数个IE蛋白(IE1或IE72、IE2或IE82-86、IE86、IE2-55或IE55)的正义RNA转录物。这些蛋白共有外显子2和外显子3，并且因此有相同的蛋白N末端。除了这些主要IE蛋白，其他IE蛋白通过翻译修饰的mRNA分子转录物生成(见下)。

本文所述巨细胞病毒(CMV)“基因变体”指仅缺失内含子2的CMV变体或新的CMV病毒株，新的CMV病毒株与其他CMV株相比是变体，其中通常称为CMV基因组的立即早期区域(见图5)已改变并且不包含区域内含子2(见图6、7和8)。因此，所述变体是“基因改变“或“遗传改变”，因为变体已经在CMV病毒的DNA水平发生，并且因此在这个基因变体的CMV蛋白转录和翻译后的事件（下文进一步解释）中扩大。SEQ ID NO:1核酸序列定义了本文定义的以及与野生型CMV相比的基因变体的DNA区域特征。这个区域对应野生型CMV的外显子2和3，由于内含子2缺失，其直接连接到野生型CMV基因变体的DNA上。如果CMV病毒有这种修饰区域，其能用于鉴定这种CMV病毒是野生型CMV的基因变体。这能使用PCR方法或本文进一步定义的方法进行。

“剪接变体”由有时称为可变剪接(或差异剪接)的过程生成，通过所述过程由基因转录(初级基因转录物或前mRNA)生成的RNA外显子（例如本文中的基因变体CMVIEΔi2）在RNA剪接中以多种方式重新连接。在分子生物学中，“RNA剪接”是转录后对RNA的修饰，其中移除内含子并连接外显子。这对于典型真核细胞信使RNA(mRNA)而言，在其能用于通过翻译生成正确蛋白之前是必需的。对很多真核内含子而言，由剪接体（小核核糖核蛋白(snRNP)复合物）催化的一系列反应完成剪接，但是也有自我剪接的内含子。

所得的不同mRNA可以翻译成不同的蛋白同种型，并且都由野生型CMV感染的5’末端转录生成。在主要IE基因中，已知6个已知的剪接变体生成变体IE蛋白，例如包含外显子2和外显子3(见图5和8)；IE9(AY445661.1；外显子2和3和外显子4的2个氨基酸；预测是10kD，但在感染细胞中不能观察到的蛋白)、IE19(AY436380.1；外显子2,3和外显子4的片段，生成38kD蛋白)、IE17.5(AY445660.1；外显子2,3和外显子4的小片段，共有IE19，生成31kDa蛋白)、IE18(SEQ ID NO:2；外显子2,3和5，生成18kDa蛋白)。两个IE蛋白从外显子5生成；IE40(SEQ ID NO:3;40kDa蛋白)和IE60(SEQ ID NO:4;60kDa蛋白)。因此，单个基因可以编码多个蛋白。因而，本文不同的“剪接变体”通过基因变体CMV IEΔi2转录中发生的不同剪接事件生成，以生成新的IE RNA转录物和IE蛋白。

因此，本发明涉及巨细胞病毒(CMV)的基因变体，本文称为CMV IEΔi2或CMVIEΔint2，所述基因变体缺失CMV基因组的IE基因的内含子2。所述CMV基因变体显示在遭受癌症疾病的患者中有高流行性，这在下文进一步说明。

发现CMV IEΔi2在有不同癌症形式的患者中有高流行性(72/86,84%)，而在病毒血症患者(1/19,10%)和健康群体(15/100；2010年测试的15%，1995年测试的0/285)中检测出的频率较低(32)。有这种CMV基因变体感染的肿瘤细胞表达RNA剪接变体和新的CMV IE蛋白，进一步帮助癌症的建立和发展。这种新的CMV株检测为活性病毒感染，在不同组织/器官的肿瘤细胞中生成病毒蛋白，而肿瘤周边的非肿瘤组织仍保持CMV蛋白阴性。

所述CMV IEΔi2分离自100个临床分离物中的3个。在全部三个示例中，所述CMV IEΔi2病毒用野生型CMV病毒分离，并且似乎有更低的生长速率和更低的复制效率。

目前还不知道CMV IEΔi2株的载体对癌症或CMV阳性肿瘤发展的终身风险是什么，仅有84%载有CMVIEΔi2株。因此，还不知道10-15%感染有CMV IEΔi2株的个体中有多少会患癌，但出于多种原因仍需要鉴定这种CMV IEΔi2株的载体，这在下文会进一步说明。

目前还不知道基因变体CMV IEΔi2的转录是怎样调节的。在肿瘤组织样品中，存在CMV IEΔi2与剪接CMV变体IE蛋白的高表达相关联。

因此，本发明的一方面中，可以检测哺乳动物癌症的倾向和/或诊断癌症形式，所述检测和/或诊断通过鉴定CMVΔIEi2株的载体，例如通过检索SEQ ID NO:1中公开的变体鉴定标记，和使用多种常用技术。这种信息能用于避免通过生物样品在个体之间转移CMVΔIEi2株，所述生物样品例如通过血液捐赠、器官和干细胞移植以及哺乳。

约70%的成年群体是巨细胞病毒(CMV)的载体。近期在>90%不同来源的肿瘤中发现CMV蛋白和核酸，所述肿瘤包含成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和前列腺癌。越来越多的证据提示许多CMV蛋白是致癌或癌症调节性的，但是仅有少数CMV载体患癌。在84%肿瘤患者、原发性肿瘤培养物(89%)或细胞系中检测到至今未知的CMV病毒株，而仅在0-15%健康血液供体和10%CMV病毒血症患者中发现此病毒株。所述病毒株通过在CMV基因组立即早期区域中缺失内含子2来鉴定。剪接RNA变体和独特（unique）病毒蛋白在肿瘤细胞中通过CMV IEΔi2株生成。CMV IEΔi2株在个体中引起癌症的致癌能力外显率仍然有待揭示。经血液输入扩散这种病毒能通过所述方法防止，以测定哺乳动物中存在这种CMV株，如本发明所示例。

本发明公开了确切证据，显示肿瘤中CMV感染描述了与不同癌症形式高度有关的新CMV变体(CMV IEΔi2)。有这种CMV变体的癌细胞感染表示新的感染实体，从癌症干细胞中生成缺陷性颗粒“致密体”，因而提出了癌症诊断和发展的新模型。作为支持，揭示了新的CMV遗传变体，在CMV基因组的主要立即早期区域中恒定缺失内含子2。

在原发性肿瘤、原发性肿瘤培养物和细胞系中，CMV感染的肿瘤细胞生成新RNA转录物和CMV IE蛋白。RNA转录物和蛋白通过致密体或外来体（exosome）从CMV DNA阳性细胞递送到周围细胞，在不复制病毒的细胞中引起CMV蛋白表达，从而使得细胞转化，因为其不经历裂解感染。

不受特定理论的限制，患肿瘤的组织/器官可能依赖于载有CMVΔIEi2株的潜伏感染细胞向组织的募集和病毒再活化，通过主要递送缺陷性病毒颗粒（即致密体或外来体）中的CMV蛋白和RNA造成靶标组织中细胞的致癌转移和癌症发展。由于炎症是潜伏CMV重新活化的驱动力，癌症开始的起始步骤可能依赖于炎症这一熟知的癌症风险因子。当活化时，所述CMV IEΔi2会从CMV IE区域生成新的RNA转录物(正义和反义RNA，如图12中由CMV IEΔi2生成所述)。在CMV致密体中的细胞之间转移IE蛋白，是很多癌症形式的主要原因。

CMV IEΔi2株在已建立癌中如此普遍的事实进一步加强了其潜在高度恶性潜能的猜疑。变体CMV株(CMV IEΔi2)的检测因而可以在输入血液或干细胞移植物、在器官移植前进行，以避免貌似致癌CMV株的转移，和避免在患者生命晚期发展疾病。这可以如本发明所示方面来进行。

再者，多于90%CMV血清阳性哺乳母亲在其乳汁中有重新活化的潜伏CMV，并且一岁孩童中CMV的流行性是30-40%，主要归因于通过乳汁的病毒转移。因此，哺乳期母亲会选择测试其是否是CMV IEΔi2株的载体，以避免哺乳和把貌似致癌CMV株转移给其小孩，并且因而降低未来患癌的风险。所述测试方法也应用于可以包含病毒的新鲜和存储精液，以避免通过精子注射转移病毒。因而，本发明也涉及从哺乳母亲获得的生物样品中鉴定和/或检测本文所述基因变体的方法。

人样品中存在CMV IEΔi2(组织，或体液如血液、血清、血浆、乳汁、精液、尿液和唾液，或干细胞样品)用特异检测立即早期基因缺失内含子2的PCR技术来诊断，并且新蛋白使用Western印迹或ELISA方法检测。本文公开了本发明所包含并且在材料和方法部分详述的三个诊断PCR方法示例，显示了从获自有不同常见癌症形式的患者生物样品的野生型CMV株中检测CMV IEΔi2株的可行性。

使用不同CMV特异抗体通过Western印迹检测肿瘤细胞的细胞裂解液中由CMVIEΔi2株生成的新蛋白。

使用这些蛋白特异抗体的ELISA用于匹配蛋白，以进一步在夹心ELISA设置中检测。因此，这可以用于本发明的某些方面。另外，从5’末端或3’末端转录的新型正义和反义转录物蛋白分别用于ELISA以检测针这些独特蛋白生成的抗体，筛选其在血清或血浆中的存在以定义CMV IEΔi2株的载体，并且用作疾病的生物标记。在本发明的其他方面，静脉内免疫球蛋白中CMV的抗体或对CMV IEΔi2株所生成致密体包膜中存在的CMV蛋白特异的单克隆或多克隆抗体用于在人样品（如血清或血浆）中富集这些颗粒，以检测CMV IEΔi2株的活性形式。PCR、Western印迹或ELISA技术用于确证核酸或新蛋白的存在。

因此，一方面，本发明涉及巨细胞病毒(CMV)的基因变体，所述基因变体表征为CMV基因组的立即早期(IE)基因缺失内含子2(CMV IEΔi2)，IE的内含子2序列示于SEQ ID NO:17。所述基因变体能因此进一步表征为缺失SEQ ID NO:17核酸，即Merlin参照序列AY446894.2的位点173903到位点174019的核酸序列。其中相较野生型株，所述基因变体CMV IEΔi2中去除或删除所述序列(SEQ ID NO:17)，在所述基因组的区域，如SEQ ID NO:1特定所示生成DNA序列，即其中由于缺失内含子2，外显子2和3邻接。

SEQ ID NO:1通过使用SEQ ID NO:7和8特定所示引物生成，并且用于扩增CMVDNA。引物位置是Merlin序列AY446894.2的位点173741－174073。

本文其他方面中，包含本文所定义基因变体转录获得的RNA剪接变体。在另一个方面，本发明涉及基因变体CMV IEΔi2转录获得的RNA剪接变体。一方面，所述RNA剪接变体由CMV IE基因的外显子2和3，和/或其部分组成。

本发明内容中，包含外显子一个或多个部分的RNA剪接变体指RNA剪接变体，其由例如一个外显子的一部分和完整的另一外显子构成，如图12b所示。

另一方面，所述RNA剪接变体由CMV IE基因的外显子2、3和4或其部分组成。另一方面，所述RNA剪接变体由CMV IE基因的外显子2、3和5和/或其部分组成。应理解，在本文所示本发明的所有方面，本文所述基因变体(CMV IEΔi2)和/或RNA剪接变体和/或蛋白能用于例如本发明的任何方法或应用或试剂盒，以鉴定CMVIEΔi2株和其载体。

本发明另一方面涉及本文所定义RNA剪接变体编码的蛋白，所述蛋白选自大小约为150、125、86、72、55、53、50、40、38、36、32、31、24、20、19、18、14、12和10kDa的CMV蛋白。

本发明另一方面涉及在所述生物样品中检测是否存在CMV基因变体(CMVIEΔi2)和/或如本文所定义从其转录的一个或多个RNA剪接变体，和/或从本文所定义剪接变体翻译的一种或多种蛋白，所述方法包括步骤：a)从哺乳动物提供生物样品，b)通过对步骤a)所得样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述一种或多种剪接变体翻译的一种或多种蛋白。

本发明另一方面涉及在所述生物样品中检测是否存在CMV基因变体(CMVIEΔi2)和/或其转录的RNA剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白，所述方法包括步骤：a)对所述样品进行技术分析，并且其后，b)在所述生物样品中检测是否存在CMV基因变体和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从剪接变体翻译的一种或多种蛋白。

另一方面，本发明涉及检测哺乳动物患癌倾向的方法，所述方法包括步骤：a)从所述哺乳动物提供生物样品，和b)通过对步骤a)所得样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从剪接变体翻译的一种或多种蛋白，和c)基于所述哺乳动物的所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白以测定患癌的倾向。

一方面，本文定义了检测哺乳动物患癌倾向的方法，所述方法包括步骤：a)通过对生物样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从剪接变体翻译的一种或多种蛋白，和b)基于所述哺乳动物的所述生物样品中是否存在CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白以测定患癌的倾向。

另一方面，本发明涉及诊断哺乳动物（所述哺乳动物有CMV感染）巨细胞病毒(CMV)相关癌症形式的方法，所述方法包括步骤：a)从所述哺乳动物提供生物样品，和b)通过对步骤a)所得样品进行技术分析以测定所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白，并且基于所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体和/或其转录的一个或多个RNA剪接变体和/或其翻译的蛋白以诊断所述哺乳动物是否有CMV相关癌症疾病。

另一方面，本文定义了诊断哺乳动物（所述哺乳动物有CMV感染）巨细胞病毒(CMV)相关癌症的方法，所述方法包括步骤：a)通过对生物样品进行技术分析以测定所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白，和b)基于所述生物样品中是否存在本文定义的CMV基因变体和/或其转录的剪接变体和/或其翻译的蛋白以诊断所述哺乳动物是否有CMV相关癌症疾病。

本文定义的方法中，是否存在本文定义的CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白是根据所述哺乳动物中是否存在上述基因变体、剪接变体和/或蛋白的抗体来测定。

另外，在本文定义的方法中，是否存在本文定义的CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白可以通过所述哺乳动物中是否存在针对本文所定义CMV基因变体，针对从CMV基因变体转录的一种或多种剪接变体和/或针对从其翻译的一种或多种蛋白的T细胞来测定。

本文定义方法中使用的所述生物样品可以是本文定义的任意生物样品，从这些样品中可以分离出病毒颗粒以用于检测。如果所述生物样品包含细胞，这些细胞可以在检测病毒材料前裂解，并且所述病毒材料之后从其中分离。所述生物样品也可以是除了细胞样品之外的血浆样品。因此，本发明内容中，所述生物样品可以选自但不限于血液样品、血浆样品、组织样品、干细胞样品、器官移植物样品、精液样品、尿液样品、唾液样品和乳汁样品。

在本文所述方法中，所述技术分析可以通过DNA检测方法例如ISH(原位杂交)来进行。

一方面，本发明涉及本文定义的方法，其中所述方法的所述技术分析通过包含聚合酶链式反应(PCR)的方法来进行，所述PCR方法例如TaqMan

实时PCR或序列捕获PCR。一方面，所述PCR可以通过扩增CMV的IE基因外显子2和3的至少部分来进行，以测定SEQ ID NO:1的存在，即在所述样品中检测CMV IEΔi2。这是通过使用图5和图8和表1中示例的引物来进行。这种方法也用于在载有CMV IEΔi2潜伏形式的干细胞中检测CMV IEΔi2，例如在CD34阳性造血干细胞、在循环或组织驻留CD133阳性干细胞和在循环或组织驻留内皮祖细胞中，所述细胞通过其表达血管内皮细胞生长因子2(VEGFR2)来鉴定。

另一方面，本发明所述方法的技术分析通过使用FISH技术(荧光原位杂交)进行。FISH是用于检测和定位染色体上是否存在特异DNA序列的方法。FISH使用的荧光探针仅仅结合到与其有高度序列相似性的染色体部分上。荧光显微镜能用于发现荧光探针结合到染色体的哪个部分。FISH经常用于发现DNA中的特异元件以用于基因建议、医疗和特异性鉴定。FISH也能用于检测和定位组织样品中的特异mRNA。在这种背景下，其能在细胞和组织中帮助定义基因表达的空间－时间模式。在其他方面，FISH技术能包含DNA或RNA探针，以分析检测基因变体CMV IEΔi2感染细胞中的DNA定位特异模式，以及鉴定CMV IEΔi2 DNA整合到人染色体中。与潜伏野生型CMV或野生型CMV活性复制相比，CMV阳性肿瘤细胞中的DNA定位模式显著不同。

另一方面，使用抗体进行本发明方法的技术分析。这种抗体可以例如针对CMV基因组立即早期(IE)区域的外显子2和3（即在其上编码蛋白），并且因此测定在要分析的生物样品中是否存在CMV基因变体。其他方面中，也能使用针对其他区域的抗体，例如针对非感染CMV颗粒的抗体，所述CMV颗粒如来自癌症患者血液、血浆或血清的致密体或外来体。本发明的其他方面中，本文所述的不同技术分析方法能联合鉴定是否存在CMV IEΔi2基因变体和/或一个或多个RNA剪接变体和/或从所述RNA剪接变体表达的一种或多种蛋白，如抗体检测然后PCR或Western印迹，或任意其他组合。抗体也能用于检测是否存在非感染性或缺陷性CMV颗粒，包含从基因变体CMV IEΔi2翻译的致密体。本发明内容中，本文所示例方法能用于诊断癌症，其中所述癌症选自：成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、恶性黑素瘤、皮肤癌和肉瘤、肾癌、胰腺癌及其转移。如果癌症形式涉及本文定义的CMV基因变体，也可以诊断本文没有描述的其他癌症形式。

本文公开的方法中，用SEQ ID NO:1所含的核酸（例如通过扩增所述区域的PCR方法）来检测本文定义的CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白。

本文公开的任何方法也可以是体外方法。

另一方面，本发明也涉及使用本文定义的CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或其转录的一个或多个RNA剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白，以检测哺乳动物的癌症倾向。

另一方面，本发明涉及使用本文定义的CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或其转录的一个或多个RNA剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白，以诊断哺乳动物巨细胞病毒(CMV)相关癌症形式。所述能诊断的癌症形式可选自：成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、恶性黑素瘤、皮肤癌、肉瘤、基底细胞癌和胰腺癌。如果癌症形式涉及本文定义的CMV基因变体，也可以诊断本文没有描述的其他癌症形式。本文也涉及使用CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白，其中所述变体通过使用SEQ ID NO:1所含核酸检测，例如通过在扩增所述区域的PCR方法中使用SEQ ID NO:1。

本发明内容中，本文所述哺乳动物能是任意哺乳动物，例如人类。

一方面，本发明也涉及试剂盒，所述试剂盒包含在获自哺乳动物的生物样品中诊断、和/或检测是否存在CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或其转录的一个或多个RNA剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白，也包含载有潜伏CMV IEΔi2的细胞例如CD34和VEGFR2阳性细胞。一方面，所述试剂包含进行聚合酶链式反应(PCR)的试剂。另一方面，所述试剂包含抗体。

一方面，本发明也涉及诊断方法/试剂盒，所述诊断方法/试剂盒包含诊断试剂，和/或检测针对患者血清或血浆样品中CMV IEΔi2株的剪接变体IE蛋白生成的抗体（使用方法以检测对CMV IEΔi2株相关肽特异的抗体），和更高水平的这些抗体；例如使用IE剪接变体蛋白涂层的ELISA板、膜或珠，等等，作为癌症或患癌风险的生物标记。

一方面，本发明也涉及诊断方法/试剂盒，所述诊断方法/试剂盒包含试剂以诊断、和/或检测患者中与CMV IEΔi2株生成肽反应的T细胞，作为癌症或患癌的生物标记。

另外，常见人癌症形式中CMV IEΔi2株感染的细胞表示恶性转化的细胞。在肿瘤细胞中鉴定以更高丰度生成的本文所定义新IE CMV蛋白允许靶向新CMV蛋白的免疫治疗和治疗性疫苗接种，并且因而有效消除CMV IEΔi2株感染的细胞。显示了肿瘤中的干细胞都表达这些CMV蛋白以及高水平I类和II类MHC分子，显示了将其靶向特异免疫治疗的可行性。

通过血浆去除术从癌症患者富集的抗原呈递细胞（例如树突细胞）用载体中的CMV IEΔi2 DNA、RNA离体培养以在细胞中生成蛋白，或者来自肿瘤的纯化蛋白或外显子2和外显子3的重组蛋白会用于呈现患者的自体T细胞。培养中扩增的活性T细胞作为过继性治疗再给予患者以治愈癌症。或者，在树突细胞疫苗接种方案中，树突细胞通过系列注射给予回患者以刺激体内T细胞扩增成CMV IEΔi2相关肽。两种方案的目的是杀死癌症患者中病毒感染的肿瘤细胞和肿瘤干细胞。

所述CMV IEΔi2株蛋白用于诱导抗体生成，包含细胞凋亡诱导抗体，旨在用于转移至癌症患者以发现和杀死病毒感染的肿瘤细胞和肿瘤干细胞。因此，本发明一方面涉及本文所述的这种治疗方法。

其他方面中，本文所述的CMV IEΔi2基因变体用于发展保护疫苗以从社会中消除这种病毒株。基于蛋白的表达载体和技术用于表达新的CMV IEΔi2 IE蛋白，所述蛋白用于生成就预防和治疗疫苗而言针对CMV IEΔi2株的亚基疫苗。发展新型CMVIEΔi2株的DNA疫苗以表达新的IE蛋白，所述蛋白用于靶向CMV IEΔi2株的预防和治疗疫苗。因此，本发明的其他方面涉及用作治疗或预防疫苗的编码CMV IEΔi2株的疫苗载体。另一方面，本发明涉及本文定义的CMV基因变体(CMV IEΔi2)，或使用SEQ ID NO:1，和/或其转录的一个或多个RNA剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白，以制备针对CMV感染进行治疗或预防疫苗接种的的疫苗载体。在一些方面，RNA转录物能用于表达本文公开的来自CMVIEΔi2IE区域的新CMV蛋白，所述蛋白用作治疗或预防疫苗接种的疫苗载体。在其他方面，从CMVIEΔi2的IE区域生成的IE蛋白能用于过继性治疗以(离体)刺激T细胞。另外，本文所述转录物和蛋白能如本文所示例进一步用作免疫治疗的靶标并且用于开发预防和治疗疫苗。在本发明的一些方面，颗粒可以从血液中选择，并且用作原发性癌症或转移疾病的生物标记。这种颗粒也可以从肿瘤细胞培养物分离并且用于疫苗接种。载有基因变体CMVIEΔi2的循环肿瘤细胞能用PCR检测，例如作为癌症和转移疾病的生物标记。

本发明的其他方面中，能避免通过人组织或细胞移植来转移CMV IEΔi2株（包含血液灌注、干细胞或器官移植物、或从哺乳期妇女到小孩）从而消除癌症风险的转移，所述避免是通过检测获自哺乳动物（如人）的生物样品中是否存在基因变体CMV IEΔi2和/或其转录的一个或多个RNA剪接变体和/或其翻译的一种或多种蛋白。所述方法也能用于匹配CMV IEΔi2器官和血液供体与载有相同株的受体。

实验部分

缩写

方法

临床样品

我们从下列肿瘤的固定石蜡包埋肿瘤样品中获得超过400个样品：成胶质细胞瘤(n=120)、髓母细胞瘤(n=37)、神经母细胞瘤(n=49)、结肠癌(41)、乳腺癌(69)、前列腺癌(n=17)、卵巢癌(25)、宫颈癌(40)、胰腺癌(n=10)，以及乳腺癌转移淋巴癌(n=35)和89个结肠和乳腺癌转移脑癌，对这些样品分析CMV蛋白表达。我们获得33个成胶质细胞瘤、23个神经母细胞瘤、2个髓母细胞瘤、18个结肠癌、20个乳腺癌、10个卵巢癌、10个胰腺癌样品和24个GBM患者的原代肿瘤细胞培养物的新鲜或冷冻肿瘤样品以用于制备DNA和RNA（可能时）。

检测CMV蛋白

免疫组织化学(IHC)

使用针对CMV IE、pp65和晚期蛋白的三种CMV特异抗体通过免疫组织化学就CMV蛋白染色切片。所有石蜡包埋的组织切片脱蜡并通过醇系列脱水，并且通过所述灵敏免疫组织化学染色(1,3)。使用的一级抗体是针对CMV-IEA的抗体(抗IE1-72和IE1-86、IgG2a、美国开米康国际公司（Chemicon International）)、针对HCMV-LA的抗体(IgG 2a,开米康国际公司)、针对CMV-pp65的抗体(IgG1，美国徕卡公司（NovoCastra）)和针对平滑肌细胞α肌动蛋白的抗体(IgG2a，加利福尼亚州圣拉蒙的生物基因公司（Biogenex）)，并且血管假性血友病因子(IgG1，丹麦大科细胞公司（DakoCytomation）)作为同种型对照。

流式细胞术

对于GBM组织的单细胞悬浮，用无菌手术刀片在包含Accutase（西格玛-艾尔德里奇公司（Sigma-Aldrich））的皮氏培养皿中把肿瘤切成小块。肿瘤在37℃孵育15分钟。这段时间内，一旦离开培养箱就移除肿瘤并且通过移液器分离。培养后，肿瘤通过抽吸进一步分离并且转移到50-ml管的细胞过滤器中(75μm)(法尔肯（Falcon），瑞典斯德哥尔摩的BD生物科学法敏进公司(BD BiosciencesPharmingen))。2-ml注射器柱塞用于通过细胞过滤器切碎肿瘤。PBS用于清洗所述过滤器，并且此后以1200rpm离心8分钟。

按照生产商说明书，使用试剂盒Perm 2(BD生物科学公司)透化细胞。使用以下抗体：CMV-IEA(小鼠单克隆IgG M0854，大科细胞公司)、CMV-IEA(小鼠单克隆11-003 Argene，Parc技术公司（Parc Technologique）)、CMV-IEA(小鼠单克隆MAB810R(810)，美国加利福尼亚州特美克拉的开米康公司(Chemicon))和CMV-pp65(小鼠单克隆，徕卡公司)。细胞用一抗在4℃孵育30分钟。用PBS洗涤细胞，然后用二抗（多克隆兔抗小鼠IgG FITC或PE偶联(大科细胞公司)）在4℃孵育30分钟。孵育后，细胞用PBS洗涤，并用1%多聚甲醛固定。细胞用CyAn(贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter）)和Summit4.3软件分析。

使用流式细胞术就CMV蛋白分析成胶质细胞瘤的原代细胞培养物。就CMV蛋白检测下列市售可得的细胞系：胰腺细胞(ASPC1、Bxcp3、panc1、MiapaCa2、capan2、capan 1、patu 8902)、前列腺癌细胞(LWG、PC3)、结肠癌(CACO2)、肺癌(U1810、H23)、乳腺癌细胞系(skf3、MCF7、MDA231)。将来自多形性成胶质细胞瘤患者的经切除新鲜GBM肿瘤组织样品(斯德哥尔摩地区伦理委员会的伦理许可号2008/628-31)切成小切片，并且酶促(使用0.5%胰蛋白酶-EDTA)和机械分解成单细胞悬浮液。分离细胞在补充有7%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM/F12(英杰公司（Invitrogen）)中繁殖。在包含培养基的血清中生长的细胞名为GBM细胞。

VGEF-2和CD34表达细胞的FACS分选

接收来自健康供体（伦理许可号01/420）的暗黄层并且在室温下振荡过夜（o/n），然后按照生产商说明，使用淋巴细胞分离剂(挪威奥斯陆的轴盾公司（Axis-Shield）)分离外周血单核细胞(PMBC)。用RBC缓冲液[pH8.0]裂解10分钟以除去红细胞。

25-30x10⁶纯化的PBMC在200μl的各抗体VGEF R2/KDR-FITC(R&D,FAB357F)和CD34-PE(拜来及公司(Biolegend)，343506)中稀释，加入PBS到终体积5ml并且在37℃避光孵育1h。离心细胞(5min,1500rpm)，用PBS洗涤一次，并且通过40μm细胞过滤器(BD法尔肯公司)。细胞保持在冰上，直到用MoFlo Cytomation设备分选。分选后，分别收集对任一抗体阳性或双重阳性的细胞，和作为对照的无标记细胞一起，按照生产商说明使用DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒(凯杰公司（Quiagen）)来提取DNA。在本文所述Taq Man PCR中使用纯化的DNA以确定病毒含量。

PCR和测序MIE基因

DNA提取

按照生产商说明，使用QIAGEN试剂盒(加利福尼亚州巴伦西亚)通过盐析技术或Trizol提取从肿瘤组织、肿瘤细胞和血细胞中提取DNA以从相同样品中获得DNA、RNA和蛋白。

巢式PCR检测IE基因中内含子2的缺失

从肿瘤组织、肿瘤细胞和血细胞中提取的DNA样品通过巢式PCR扩增，使用MIE基因外显子2和3的正向和反向引物(SEQ ID NO:5-8;等1993，美国微生物协会)。这种方法已广泛使用，并且原先从来没有在健康对照、CMV病毒血症患者或多种CMV株感染的不同来源细胞类型(成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、癌细胞)的实验研究中检测到缺失内含子2的CMV IE基因组变体。

内部巢式PCR如先前我们实验室所述来进行(参考文献：Soderberg等，J.Virol1993,67(6),3166-3175(33))，稍有修改。简单说，在PCR第一步的总共40轮循环中，使用1.25U的Taq聚合酶(英杰公司)扩增约50-300ng的DNA或cDNA。在PCR第二步中，使用1μl的第一PCR产物，然后进行30轮的扩增循环。如所述扩增对照、阳性和阴性样品，并且最终扩增子在1.5%GelRed染色的琼脂糖凝胶上进行电泳。切下条带、纯化(凯杰（Qiagen）凝胶纯化试剂盒)并且送去测序(Karolinska研究所的测序中心实验室)。所述测序结果使用免费软件Chromas分析并用EMBOSS配对比较进行比对。

检测内含子2删除变体(CMV IEΔi2)的Taq Man PCR

通过使用覆盖全CMV MIE基因的引物来发展一步PCR。简单说，约70-200ng的DNA用于由PCR缓冲液(应用生物系统公司(Applied Biosystems))组成的PCR反应混合物。在PCR仪器上进行扩增循环(应用生物系统公司)。50轮扩增循环由下面构成：50℃下UNG活化2分钟，95℃下热启动10分钟，95℃下变性10秒，60℃下退火和延伸1分钟。从未感染或CMV(AD169或VR1814或TB40)感染的MRC-5细胞中提取DNA和RNA。对于有OligodT₂₀的RT-PCR，使用SuperScript III第一链合成系统制备cDNA。包含GelRED核酸凝胶染色(加利福尼亚州海沃德的Biotium公司)的扩增PCR产物在1.5-2%琼脂糖凝胶上跑胶，并用UV光观察。切下PCR扩增条带，纯化并通过自动测序分析(ABI 3730 DNA分析仪)。国家生物技术信息中心BLAST搜索用于确证CMV基因组。通过使用比对软件，所有的测序数据针对参照CMV-IE基因组(MERLIN)进行比对。根据使用手册，在有快速96孔模块（BlockModule）的应用生物系统公司7900HT快速实时PCR系统上使用TaqMan

快速通用PCR主混液进行Taqman PCR。默认热模式设定用于50轮循环和使用下列引物/探针的10μl样品体积：

IEcDNA:

SEQ ID NO:9:正向:5’-TGACGAGGGCCCTTCCT-3’,

SEQ ID NO:10:反向:5’-CCTTGGTCACGGGTGTCT-3’,

SEQ ID NO:11:探针:5’FAM-AAGGTGCCACGGCCCG-NFQMGB-3’

SEQ ID NO:12:IEDNA:正向:5’-GTGACCCATGTGCTTATGACTCTAT-3’,

SEQ ID NO:13:反向:5’-CTCAACATAGTCTGCAGGAACGT-3’,

SEQ ID NO:14:探针:5’FAM-TTGGTCACGGGTGTCTCNFQMGB-3’

用三个密切相关疱疹病毒（即HHV-6、HSV-1和HSV-2）测试Taqman PCR的特异性。使用两个引物/探针没有发现扩增。与试剂对照、作为阴性对照的无模板对照一起，各个样品重复三次。DNA的阳性对照是AD169感染的MRC-5成纤维细胞，VR1814感染的巨噬细胞作为cDNA对照。只有所述阳性和阴性对照工作良好时，才认为结果可靠。有时，PCR产物在1.5%(w/v)高分辨GelRed染色(西格玛公司)琼脂糖凝胶上跑胶，纯化并且送去DNA测序以进一步证实扩增子。

单个和巢式PCR使用跨越全部IE基因的IE引物和MIE启动子区域的2组引物

图5描述了使用的引物。使用应用生物系统公司Veriti 96孔热循环仪进行PCR，所述PCR模式是94℃2分钟，35轮循环的94℃30秒；55℃或60℃(如表所示),40秒；72℃50秒，最终在72℃延伸7分钟，并且保持在4℃。DNA或cDNA样品被扩增，并且揭示了检测CMV IE基因片段的高度灵敏度和特异性方法。PCR产物在1.5%GelRed染色琼脂糖凝胶上跑胶，并用伯乐公司(Bio-Rad)凝胶记录系统（documentation system）观察。

序列捕获PCR

DNA提取

根据生产商说明书，通过使用奥美嘉生物技术公司(Omega bio-tek）试剂盒(美国佐治亚州)从3ml全血中提取DNA，并且稀释到100ul H₂O。

序列捕获PCR(从Mangiapan等，1996(34)改进的方法)

通过在95℃下加热DNA10分钟来使DNA变性。所述样品在冰上冷却10分钟以保持链分离。然后，加入包含0.125pmol各生物素化捕获引物的36.4μl 3.75MNaCl。

下列捕获引物(也用于巢式PCR和在所述Taqman引物结合区域外的杂交)在5’用生物素标记，并用HPLC纯化(赛伯基因公司（Cybergene）)：

SEQ ID NO:15:MIE II 5’-生物素:GAG AAA GAT GGA CCC TGA TAA T(23聚体)

SEQ ID NO:16:MIE II 3’-生物素:CTC GGG GTT CTC GTT GCA AT(21聚体)

通过在60℃水浴中孵育管3小时，使引物与DNA杂交。根据生产商说明书，洗涤2μl M-280链霉亲和素Dynabead(挪威奥斯陆的Dynal)，然后加入到管中，并且室温下温和旋转再孵育2小时。根据生产商说明书，有生物素标记的捕获引物和杂交DNA的磁珠使用Dynal磁体吸取出并且洗涤，然后最终悬于50μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA[pH8])。

3μl珠悬浮液直接用作前述Taqman PCR的模板。

蛋白提取和Western印迹分析

细胞球团或组织样品溶解于补充有完全蛋白酶抑制剂混合物(罗氏公司)、磷酸酶抑制剂混合物(西格玛公司)和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀试验(RIPA)蛋白提取缓冲液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5%脱氧胆酸钠、1%曲通X-100和2mM EDTA)。根据生产商方案(英杰公司)，使用TRIZOL分离DNA和RNA，然后从肿瘤组织中提取蛋白。使用微量BCA蛋白试验试剂盒(皮尔斯公司（Pierce）)定量蛋白浓度。用0.1M二硫苏糖醇(DTT)在NovexTricine SDS样品缓冲液(英杰公司)中制备样品，并且煮沸5分钟。将等量蛋白(25μg/泳道)加样到NuPAGE

 Novex

 4-12% Bis-Tris凝胶(英杰公司)，由十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并且使用transblot设备(伯乐公司)电转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(安玛西亚公司（Amersham）)上。所述膜在溶解于补充有0.05%吐温20的Tris-HCl-缓冲盐水(TBST)的5%脱脂奶粉中封闭45分钟。用特定稀释的下列一抗进行免疫标记：小鼠单克隆抗立即早期抗原(IEA)(1:1000；Argene)和兔多克隆抗IE72(1:2000)和抗IE86(1:1000；美国俄勒冈州健康与科学大学的JayNelson教授友情提供)。等量加样蛋白通过用小鼠单克隆抗β-肌动蛋白(1:3000)免疫标记来确证。三次TBST洗涤之后，所述膜用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的抗小鼠(1:3000)或抗兔IgG(1:3000)孵育。结合抗体通过ECL加强(plus)试剂盒检测(安玛西亚公司)。

荧光原位杂交(FISH)

对探针制备而言，根据生产商推荐，使用切口平移试剂盒(美国伊利诺伊州唐纳斯格罗夫的Vysis公司)标记包含全CMV基因组的质粒(由波兰Nelson博士友情提供)。对于载玻片制备，细胞用秋水仙酰胺(colcemid)(吉布可公司（Gibco）)处理，并用HBSS洗涤。所述细胞球团在4%冷KCl中重新悬浮，并且在37℃下孵育14-16小时。通过离心收集细胞，并且再重新悬浮于4%KCl中。将冷的固定溶液(3:1甲醇:乙酸)缓慢加入到细胞悬浮液中，并且冰上孵育1h。洗涤固定细胞，在固定溶液中再悬浮，并且20℃保存，直到使用。20ul细胞悬浮液用于载玻片的制备。将约200ng探针加入到8ul杂交混合物(2ul Hybrizol、2ul Cot-1 DNA（都来自英杰公司），溶于0.5Mol乙酸钠pH5.2，西格玛-奥德里奇公司)和30ul乙醇(95%)，并且在干冰上孵育15分钟。离心后，弃去上清，并且加入70%乙醇到球团(探针)中，再次离心以纯化所述探针。探针溶解在8ul hybridisol和2ul蒸馏水中，并且加入到载玻片上，72℃下变性8分钟，然后37℃孵育过夜。载玻片在2X柠檬酸钠盐水(SSC)中70℃洗涤3分钟，并且脱水，然后用Vectashield(Vector(载体)，Vectashield)封固。

结果

通过免疫组织化学或流式细胞仪分析，发现所有检测的肿瘤样品和所有检测的肿瘤转移中超过90%是CMV蛋白阳性(图1A、B，表1)。另外，流式细胞仪揭示了21个成胶质细胞瘤的原代细胞培养物表达CMV IE、pp65和晚期蛋白(图1)。CMV蛋白阳性细胞的数目在细胞系之间和相同细胞系中不同取样时间有变化(图4和从4-69%变化)。然而，在相同取样时间，使用针对IE、pp65和晚期CMV蛋白的四种抗体获得了对阳性细胞数目而言相当一致的结果(图4所示例)。在所有检测样品(n=18)中发现了CMV阳性的恶性黑素瘤、皮肤癌、肉瘤、肾癌和胰腺癌样品。尽管肿瘤细胞中有高蛋白表达，我们不能通过共同培养组织样品或者成纤维细胞或内皮细胞肿瘤组织的细胞裂解液，从髓母细胞瘤、神经母细胞瘤和成胶质细胞瘤的新鲜肿瘤组织(n=21)中获得感染病毒(未显示)。从有上呼吸道感染的一岁男孩和两个有CMV综合征的骨髓移植患者(移植后由于潜伏CMV重新活化引起的CMV感染)中分离CMV IEΔi2变体。

因为所述IE蛋白在调节早期和晚期基因表达中起重要作用，我们假设肿瘤中可能存在特异性基因变体，可以由于缺少关键病毒蛋白的表达而造成非复制性感染。这种情况可能有危险，因为所述剪接变体蛋白可以作用于未经历裂解感染的细胞。如图5所示，设计了跨越全CMV IE基因的引物对；在启动子区域的2个引物对，和用于IE基因的引物对。所有引物组扩增期望大小的PCR产物，且PCR产物的DNA测序证实了在体外感染细胞和CMV病毒血症患者的DNA样品中的IE DNA。从用作特异性对照的HSV-1、HSV-2或HHV-6感染细胞培养物的DNA提取物中没有扩增出PCR产物。测试了12个CMV病毒血症患者(10个单核细胞增多症和2个移植病人)和体外感染细胞(AD169、TB40和VR1814株)的DNA；一个单核细胞增多症患者有CMV IEΔi2变体，所有其他患者有CMV野生型变体。4个PCR产物的DNA测序证实了单核细胞增多症患者样品中存在正常的全长DNA，以及在60/60(100%)癌症患者和一个单核细胞增多症患者中存在缺失内含子2的删除变体。

使用1993年设计的IE基因外显子2和外显子3中引物对的巢式PCR。这种巢式PCR试验从72/86(84%)恶性肿瘤(成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌)、肿瘤患者的细胞培养物(12/15;80%)和血液(9/33;27%)的DNA样品中扩增约218个碱基对的较短PCR产物。PCR产物的DNA测序揭示了PCR产物中不存在内含子2(图6-8和表1)。另外，12/15个患者的成胶质细胞瘤肿瘤原代培养中含有缺失内含子2的CMV株。所述株名为CMV IEΔi2。

从100个健康血液供体的血细胞、100个富含单核细胞的供体、12个CMV病毒血症患者(单核细胞增多症和移植病人)的血清、和24个诊断有心肌梗塞的患者(心血管疾病患者)和100个临床CMV分离物中制备DNA。而15/100(15%)的富含单核细胞的健康血液供体就CMV IEΔi2而言是CMVIEΔi2阳性，15%有野生型，晚期显示为52/100(52%)，不富含单核细胞的血细胞DNA样品无一是CMV阳性。再者，从全血制备的心血管疾病患者或健康对照DNA都没有CMVIEΔi2株。9个病毒血症患者以及来自CMV实验室株VR1814、TB40和AD169体外感染细胞的DNA有野生型株。

晚期分析中，2/24(8%)的心血管疾病患者、20/100(20%)的健康对照和1/11(9%)的病毒血症患者有CMV IEΔi2株。11个病毒血症患者以及来自CMV实验室株VR1814、TB40和AD169体外感染细胞的DNA有野生型株。1个单核细胞增多症患者载有CMV IEΔi2株；这个患者也诊断有前列腺癌。100/100(100%)临床分离物是CMV野生型病毒阳性；其中3个（3/100%）也有CMV IEΔi2株。其中注意的是，在1995年，使用巢式PCR检测了285个血液CMV供体(145个血清阳性和140个血清阴性)；其中仅有一个载有缺失内含子2的CMV株。

另外，开发了Taq Man PCR试验，使用cDNA和DNA特异性探针以检测cDNA但不是正常的DNA IE变体。跨越外显子2和3的cDNA探针用于在制备自肿瘤患者和对照的血液和组织的DNA样品中区分cDNA与DNA变体。这种方法高度特异，仅仅识别体外感染细胞中RNA制品的cDNA，但不识别相同感染培养物中制备的DNA。此试验中HSV-1、HSV-2和HHV-6感染细胞培养物的DNA制品是阴性的。

使用cDNA探针通过Taqman PCR，30/32(94%)的原发肿瘤组织DNA样品和16/21的原代成胶质细胞瘤细胞培养物样品为阳性。再者，使用这种方法从成胶质细胞瘤患者制备的DNA为阴性，而3个体外感染细胞培养物(株AD169、TB40E和VR1814)制备的cDNA为阳性。使用所述cDNA探针，来自体外感染细胞(株AD169、TB40E和VR1814)或7个有单核细胞增多症的CMV病毒血症患者的DNA制品为阴性。然而，在一个有前列腺癌和单核细胞增多症的与潜伏病毒重新活化有关的CMV病毒血症患者中，检测到了缺失内含子2的CMV变体。晚期分析显示了使用cDNA探针通过Taqman PCR，81/106(76.4%)的原发肿瘤组织DNA样品和19/24(79%)的原代成胶质细胞瘤细胞培养物样品为阳性。使用所述cDNA探针，来自体外感染细胞(株AD169、TB40E和VR1814)或7个有单核细胞增多症的CMV病毒血症患者的cDNA制品为阳性。使用所述cDNA探针，从3个体外感染的细胞培养物(株AD169、TB40E和VR1814)制备的DNA为阴性。

为了增加检测CMV IEΔi2变体的灵敏度和特异性，我们开发了序列捕获PCR方法。使用这种方法，成功捕获CMV IEΔi2 DNA，并且用于通过所述巢式PCR方法或TaqMan PCR试验扩增生物素化的捕获DNA(表1)。

表1.

表1：使用来自荧光活化细胞分选(FACS)的DNA的TaqMan PCR结果总结，分选出健康供体外周血单核细胞作为模板。表达CD34和/或VGEF2R的细胞主要载有野生型或IEΔi2的人巨细胞病毒。

已知骨髓中CD34阳性细胞含有潜伏CMV；这些干细胞生成造血细胞、成熟血细胞以及内皮细胞。因此通过流式细胞术或磁珠(MiniMACS，加利福尼亚州的密耳特伊生物技术公司(Miltenyi Biotec Inc))，使用针对CD34或血管内皮生长因子2(VEGFR2，用于循环内皮细胞)，从患者或健康载体的血液样品中分选以选择这些细胞。发现了在血液内的CD34阳性细胞和VEGFR2阳性细胞中存在CMV IEΔi2 DNA；这提示造血干细胞或内皮细胞的干细胞群中包含CMV IEΔi2 DNA。也鉴定了成胶质细胞瘤中的CD133阳性细胞有CMV IEΔi2 DNA；CD133是成胶质细胞瘤和髓母细胞瘤的假定干细胞标记。因此，这两种选择潜伏感染细胞的方法以及序列捕获PCR方法能用于在健康载体或癌症患者中优化检测CMV IEΔi2 DNA。

20个原代成胶质细胞瘤、11个成胶质细胞瘤细胞培养物、11个神经母细胞瘤、4个卵巢癌、6个乳腺癌和5个结肠癌肿瘤样品的细胞裂解物通过western印迹检测，并且检测到不同大小的CMV IE蛋白(图13、14、15)。在肿瘤和成胶质细胞瘤患者的原代培养细胞培养物样品中，使用针对IE CMV蛋白的单克隆和多克隆抗体检测到不同大小的IE蛋白。CMV特异性抗体识别肿瘤细胞中具有下列重量的IE蛋白：150、125、86、76、72、55、53、50、40、38、36、30、31、26、25、19、18、14、12、10kDa，和体外感染成纤维细胞中的125、86、72、55、47、38、18kDa蛋白。在不同肿瘤类型中蛋白模式不同，但是在不同肿瘤和成胶质细胞瘤的原代细胞培养物中相当类似(图13、14、15)。相较肿瘤中鉴定的其他125、53、50、40、38、31、25、18、14、10kDa CMV蛋白，最常见IE蛋白IE86、IE72和IE55的丰度在肿瘤样品中通常极低。这些结果显示了相较体外野生型CMV感染的细胞，肿瘤细胞生成不同大小的IE蛋白。最常见IE活性蛋白是约53、50、38和25、19和14和10kD的尺寸较小蛋白，这些似乎是肿瘤生成的最常见IE蛋白。所述蛋白可以从成胶质细胞瘤原代细胞中观察到的新IE转录物合成，使用图5设计和图18显示的不同IE引物进行引物延伸。使用全CMV基因组作为探针，开发了荧光原位杂交(FISH)方法。第1代培养物(n=5)中经秋水仙酰胺(colcemide)处理的原代成胶质细胞瘤细胞极少显示病毒基因组整合到染色体上(17)。病毒DNA似乎整合到不同染色体上(观察到整合至染色体1、3、9、17上)。与体外感染细胞中经常观察到的鹰眼形成的中心定位相反，在未经历有丝分裂的细胞中观察到CMV DNA定位在肿瘤细胞细胞核的周边(图16)。因此，CMV的cDNA和DNA变体整合到染色体上，并且生成缺陷型病毒颗粒。

这些观察显示了：

1)缺失立即早期基因内含子2(CMV IEΔi2)的新CMV基因变体是癌症患者中最常见的CMV变体，在84%的示例样品中存在。此病毒株存在于15%的健康供体和10%病毒血症患者血浆中，并且在临床CMV分离物中的流行性是3%。

2)肿瘤细胞中CMV IEΔi2变体生成多个CMV蛋白。

3)在人的CD34阳性细胞中检测到CMV IEΔi2变体。

4)在人的内皮生长因子-2(VEGFR2)阳性细胞中检测到CMV IEΔi2变体。

5)在人的CD133阳性细胞中检测到CMV IEΔi2变体。

6)如FISH所示，与野生型感染细胞或有野生型CMV DNA的健康供体中的中心定位相反，CMV IEΔi2 DNA位于癌细胞细胞核的周边。

7)癌细胞中的CMV IEΔi2感染在肿瘤细胞内是不允许的，但是生成与调节病毒RNA和蛋白转移到靶标细胞的外来体/微粒/致密体相似的缺陷型病毒颗粒。

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Claims (32)

1.一种巨细胞病毒(CMV)基因变体，其特征在于，缺失CMV基因组立即早期(IE)基因的内含子2(SEQ ID:17)(CMV IEΔi2)。

2.如权利要求1所述的基因变体，其特征在于，缺失的是Merlin参照序列AY446894.2(野生型CMV)的位点173903到位点174019的核酸序列。

3.一种从权利要求1-2中任一项所述的基因变体转录获得的RNA剪接变体。

4.如权利要求3所述的RNA剪接变体，其特征在于，所述剪接变体由CMVIE基因的外显子2和3，和/或其一个或多个部分组成。

5.如权利要求3所述的RNA剪接变体，其特征在于，所述剪接变体由CMVIE基因的外显子2、3和4，和/或其一个或多个部分组成。

6.如权利要求3所述的RNA剪接变体，其特征在于，所述剪接变体由CMVIE基因的外显子2、3和5，和/或其一个或多个部分组成。

7.一种由权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体或由权利要求3-6中任一项所述的RNA剪接变体所编码的蛋白，所述蛋白选自大小约150、125、76、75、72、55、53、50、40、38、36、32、31、30、25、19、18、14、12和10kDa的CMV蛋白。

8.在生物样品中检测是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的RNA剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供来自所述哺乳动物的生物样品；

b)通过对步骤b)所得样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求4-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白。

9.在生物样品中检测是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的RNA剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

a)对所述样品进行技术分析，然后

b)在所述生物样品中检测是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白。

10.检测哺乳动物患癌倾向的方法，所述方法包括如下步骤：

a.提供来自所述哺乳动物的生物样品，

b.通过对步骤a)所得样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白，和

c.在所述生物样品中检测是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从其翻译的一种或多种蛋白，以测定所述哺乳动物患癌的倾向。

11.检测哺乳动物患癌倾向的方法，所述方法包括如下步骤：

a)通过对生物样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白，和

b)基于所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从其翻译的一种或多种蛋白确定所述哺乳动物患癌的倾向。

12.诊断哺乳动物巨细胞病毒(CMV)相关癌症形式的方法，所述哺乳动物载有CMV感染，所述方法包括如下步骤：

a)提供来自所述哺乳动物的生物样品；

b)通过对步骤a)所得样品进行技术分析测定所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从其翻译的一种或多种蛋白，和

c)基于在所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的剪接变体和/或从其翻译的蛋白诊断所述哺乳动物是否有CMV相关癌症疾病。

13.诊断哺乳动物巨细胞病毒(CMV)相关癌症形式的方法，所述哺乳动物载有CMV感染，所述方法包括如下步骤：

a)通过对生物样品进行技术分析来测定所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从其翻译的一种或多种蛋白，和

b)基于所述生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的剪接变体和/或从其翻译的蛋白诊断所述哺乳动物是否患有CMV相关癌症疾病。

14.如前面权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白是根据所述哺乳动物中是否存在上述基因变体、剪接变体和/或蛋白的抗体来测定的。

15.如前面权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白是根据所述哺乳动物中是否存在针对如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体、针对权利要求3-7中任一项所述从CMV基因变体转录的一种或多种剪接变体和/或针对从其翻译的一种或多种蛋白的T细胞来测定的。

16.如前面权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物样品选自血液样品、组织样品、干细胞样品、器官移植物样品、精液样品、尿液样品、唾液样品、细胞拭子或乳汁样品。

17.如前面权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述技术分析通过DNA检测方法如ISH(原位杂交)进行。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述技术分析通过包含聚合酶链式反应(PCR)如Taqman PCR或序列捕获PCR试验的方法来进行。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述PCR通过扩增CMV的IE基因外显子2和3的至少部分来进行。

20.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述技术分析使用FISH技术(荧光原位杂交)进行。

21.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述技术分析使用抗体来进行。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗体针对从CMV基因组立即早期(IE)区域的外显子2和外显子3翻译的蛋白。

23.如前面权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症选自：成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、恶性黑素瘤、皮肤癌、和肉瘤、肾癌、胰腺癌及其转移。

24.如前面权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，用SEQ ID NO:1包含的核酸来测定如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白。

25.如前面权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法是体外方法。

26.如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的RNA剪接变体和/或从其翻译的蛋白在检测哺乳动物癌症倾向中的应用。

27.如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的RNA剪接变体和/或从其翻译的蛋白在诊断哺乳动物巨细胞病毒(CMV)相关癌症中的应用。

28.如权利要求26-27中任一项所述的应用，其特征在于，所述癌症形式选自：成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、恶性黑素瘤、皮肤癌、和肉瘤、肾癌和胰腺癌。

29.如前面权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，用SEQ ID NO:1包含的核酸来测定如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMV IEΔi2)和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的一种或多种剪接变体和/或从所述剪接变体翻译的一种或多种蛋白。

30.一种包含试剂的试剂盒，所述试剂诊断、和/或检测获自哺乳动物的生物样品中是否存在如权利要求1-2中任一项所述的CMV基因变体(CMV IEΔi2)，和/或如权利要求3-7中任一项所述从其转录的剪接变体和/或从其翻译的蛋白。

31.如权利要求30所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包含进行聚合酶链式反应(PCR)或序列捕获PCR试验的试剂。

32.如权利要求30所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包含抗体。

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