JP5283265B2 - ヒトの早期癌、癌の進行および再発のマーカーの同定方法 - Google Patents
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Description
Rai et al., Ann. NY Acad. Sci. (2004) 1022:286-294 Diamandis, J. Natl. Cancer Inst. (2004) 96:353-356 Fidler、Cancer Research (1978) 38:2651-2660 Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99:3651:3656
一の実施形態において、この方法はさらに、ステップf)前記悪性ではないヒト癌細胞が悪性の種々のステージへと再度復帰するときの癌の進行に特異的な分泌レポーター連結タンパク質を同定することを、さらに含む。このとき、同定されたタンパク質は癌の進行および再発のマーカーである。この方法はまた、ステップg)悪性腫瘍へと進行する悪性度の低いヒト癌細胞において、in vitroおよびin vivoで分泌されるレポーター連結タンパク質を比較することを含むことができる。
ベクター構築およびウイルス製造
NL-neoプラスミドはNL 4-3分子クローンを主体としており、NsiI部位からBglII部位までの欠失を有する。pBKCMV (Stratagene)由来のSV40初期プロモーターおよびneo遺伝子配列を有する1,169-bp断片が、BamHI部位とXhoI部位の間に挿入されている。レンチウイルス主体の遺伝子トラップベクターを構築するために、緑色蛍光タンパク質 (GFP)を、XhoI部位とXbaI部位の間の長い3'末端反復(LTR)のU3領域に挿入し、ZR-2ベクター(図1)を得る(Lai、上記)。レポーター遺伝子の前にスプライス受容部位を配置し、上流の細胞特異的プロモーターからのその発現を可能にする。
種々の悪性度のヒト腫瘍細胞
種々のヒトクローンは記載されたように取得する(Jiang、上記)。
レンチウイルスGFPベクターを用いたトランスフェクション
種々の悪性度のヒト腫瘍細胞にレンチウイルス遺伝子トラップベクターZR-2を形質導入する。細胞は、12ウェル培養皿中のポリ-L-リシン(Becton Dickinson)でコーティングされた12mmの丸いカバースリップ上で2.2mLの培地中で増殖させる。トラップされた細胞株を作製するために、上記のように、細胞をレンチウイルスZR遺伝子トラップベクターと共に37℃にて3〜5時間インキュベートする(Lai、上記)。G418選択の後に、薬剤耐性コロニーを24ウェルプレートに移し、コンフルーエント状態まで増殖させ、蛍光顕微鏡下でGFP発現について観察する。トラップを形質導入した細胞は、最大で100%がGFP陽性であり、このことは形質導入が非常に効率的であったことを示す(Lai、上記)。
同所移植-前立腺
マウスをケタミン-キシラジン-マレイン酸アセプロマジン-カクテルで麻酔し、仰向けにする。弧状の皮膚弁を恥骨結合の直ぐ上に作り前立腺を露出させる。前立腺の周囲の筋膜を慎重に分離し、前立腺の2つの背面側部の葉を小さな外科用はさみを使用して小さな切開により露出させる。レンチウイルス性GFPを発現する前立腺癌細胞(106)を片方または両方の葉に注射する。6-0縫合糸を用いて腹部を閉じる。手術の全ての工程は7×解剖顕微鏡を用いて行う。
同所移植-胸部
次に外科的同所移植を以下のように行う。マウスをケタミン-キシラジン-マレイン酸アセプロマジン-カクテルで麻酔し、仰向けにする。右の第2乳腺を同所移植に使用する。乳頭の内側に沿って小さく切開する。鈍的切開により乳房脂肪体を露出させる。次にレンチウイルスGFPを発現する細胞を注射する。皮膚を6-0絹縫合糸で閉じる。全ての工程は5×解剖顕微鏡の下で行った。
同所移植-結腸
小さく正中切開し、腸の結腸盲腸部分を露出させる。結腸漿膜を除き、106個のGFP-レンチウイルス発現腫瘍細胞を注射する。腸を腹腔に戻し、6-0絹外科用縫合糸を用いて腹壁を閉じる。
蛍光顕微鏡法
光学および蛍光顕微鏡分析は、キセノンランプパワーサプライを備えたNikon顕微鏡を用いて行う。水銀灯パワーサプライを備えたLeica ステレオ蛍光解剖顕微鏡モデルLZ12を使用することもできる。いずれの顕微鏡にもGFPフィルターセット(Chroma Technology、Brattleboro、VT)がある。顕微鏡写真は、Image Pro Plus Version 3.0ソフトウェア(Media Cybernetics、Silver Spring、MD)を用いて明るさとコントラストを加工する。
蛍光イメージング
GFPおよびRFP蛍光の両方を同時に視覚化するために、励起をD425/60バンドパスフィルターおよび470 DCXR2色性ミラーにより生成する。発光された蛍光を長いパスフィルターGG475(Chroma Technology、Brattleboro、VT)により回収する。マクロイメージングはライトボックス(Lightools Research、Encinitas、CA)中で行う。GFPおよびRFP腫瘍の両方の蛍光励起は、ライトボックス中でスリット光ファイバーを用いて干渉フィルター(440+/-20 nm)を通して発生させる。蛍光は520nmロングパスフィルターを通して観察する。顕微鏡およびライトボックスからのイメージは、Hamamatsu C5810 3-チップ冷却カラーCCRカメラ(Hamamatsu Photonics Systems、Bridgewater、NJ)を用いてキャプチャーする。
In vitroにおける分泌GFP連結タンパク質の同定
GFPレンチウイルスベクターを発現している、正常状態へと復帰したRFP-発現癌細胞のクローン(13)を24ウェルディッシュ中で培養する。各ウェルからのならし培地を回収し、最初に蛍光光度計中でGFP蛍光(励起490nm/発光510nm)について分析する。次にならし培地がGFP蛍光を発する培養物を6ウェルプレート中で増殖させる。こうしたGFP連結タンパク質分泌培養物からのならし培地を濃縮する。次いで濃縮培地をネイティブポリアクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動にかける。蛍光下でゲルの写真を撮り、GFP連結分泌タンパク質の位置を決定する。次に同定することのできるGFP連結タンパク質を分泌するクローンをin vivoにおいてさらに評価する(下記参照)。
In Vivoにて分泌されたGFP連結タンパク質の同定
上記のような、in vitroにおいて特定のGFP連結タンパク質を分泌することが特定された、正常状態に復帰したRFP発現癌細胞のクローンを、上記のように、ヌードマウスに同所移植する。移植細胞を増殖させた動物からの血清を、上記のようにGFP連結タンパク質について分析する。血清からGFP連結分泌タンパク質が同定され得る癌細胞を、in vivoでその悪性状態へと再度復帰させ、これをRFP蛍光により追跡する。上記のように、腫瘍進行の種々のステージにおいて血清を回収し、GFP連結分泌タンパク質の存在について分析する。種々の悪性度および進行状態において細胞から分泌されるGFP連結分泌タンパク質全体を、ヒト細胞が悪性へと再度復帰する際の悪性の特定のステージのマーカー候補として、in vivoで、およびin vitroで継続的に分析する。
データ分析
ある特定の分泌GFP連結タンパク質の存在とある悪性ステージとの統計的有意性は、対応のあるt-検定により評価し、適当であれば分散分析(ANOVA)も使用する。悪性の初期ステージを次のように定義する。1) 5 mm未満の原発腫瘍、2) 1cm未満の原発腫瘍、3) 浸潤性局所領域型の癌の存在、4) 遠隔転移の存在。累積データを平均±SDおよび適当なp値で表現する。
研究に用いる動物
約500匹の無胸腺非近交系nu/nuヌードマウス(オス、5〜6週齢)を、種々の悪性度の移植細胞からのGFP-トラップ分泌タンパク質の分析のために使用する。
安定してGFPを発現し、予めヌードマウス中で皮下増殖させた、細胞または組織(1 mm3)をヌードマウス中に外科的同所移植(SOI)により移植する。移植を施す臓器を適当に露出させた後に、8-0外科用縫合糸を用いて組織片を突き通し、それを適当な同所臓器に縫いつける。皮膚の切開を7-0外科用縫合糸を用いて1つの層として閉じる。手術中に、ケタミン-キシラジン-マレイン酸アセプロマジン-カクテルを麻酔のために使用する。上記手術の全工程は、7×拡大顕微鏡(Leica MZ6、Nussloch、Germany)を用いて行う。最後に、106〜107 個の細胞の50μL懸濁物を宿主臓器に注射する。
同所のGFP発現細胞を上腹壁の上の皮膚弁ウィンドウを介して可視化する。手術中に、ケタミン-キシラジン-マレイン酸アセプロマジン-カクテルを麻酔のために使用する。皮下の結合組織を分離して皮膚弁を解放する。皮膚弁を開くことにより、ほぼ透明のマウス体壁を介して内部の臓器を露出させることができる。この手法はイメージングを行う臓器の深さを減らすのみならず、緑色蛍光の散乱を大幅に低下させることができる。本発明者らは、注意深く滅菌手術手法を用いると病的状態や感染無しに週に3回ウィンドウを開いたり閉じたりすることができることを見出した。皮膚弁を局所的ネオスポリンで処置する。動物は、飲料水中のアンピシリンと共に、バリア施設内のラミナーフローラックで飼育する。
Claims (9)
- 癌の分泌タンパク質マーカーの同定方法であって、以下のステップ、
a)種々の悪性度を有するが、悪性ではない状態へと復帰した複数のヒト癌細胞を、レポーター遺伝子を含むHIV-1レンチウイルス遺伝子トラップベクターでトランスフェクトすること;
b)レポーター連結タンパク質をin vitroで分泌するレポーター発現細胞株を同定すること;
c)各々の同定されたレポーター発現細胞株のクローンを動物に移植すること;
d)血清中のレポーター連結タンパク質を定量することにより、移植されたレポーター発現細胞株クローンから、レポーター連結タンパク質を血清中に分泌するものを同定すること;および
e)ステップd)で同定されたレポーター発現細胞株クローンが産生するレポーター連結タンパク質を同定することを含み、ここで、前記レポーター連結タンパク質は低〜高までの種々の悪性度ステージのヒト癌細胞に特異的なものであり、癌の各ステージのマーカーである、癌の分泌タンパク質マーカーの同定方法。 - f)悪性ではないヒト癌細胞が悪性の種々のステージへと再度復帰するときの癌の進行に特異的な分泌レポーター連結タンパク質を同定すること、をさらに含み、
ここで同定されるタンパク質が癌の進行および再発のマーカーである、請求項1に記載の方法。 - g)悪性へと進行する悪性度の低いヒト癌細胞において、in vitroおよびin vivoで分泌されるレポーター連結タンパク質を比較することをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記レポーター連結タンパク質に連結されるレポーターは緑色蛍光タンパク質(GFP)であり、かつステップb)がさらに以下のステップ、
b1)正常状態へと復帰したトランスフェクト癌細胞を、赤色蛍光タンパク質(RFP)を発現するように形質転換すること;
b2)GFP+細胞を単離しクローニングすること;
b3)GFP+クローンを培養すること;
b4)GFP+蛍光発光クローンを同定すること;および
b5)同定された蛍光発光クローンからGFPタンパク質を分泌する細胞を同定すること;
を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - ステップd)の後にさらに、レポーター-タンパク質またはGFP-タンパク質をin vivoで分泌する細胞のライブラリーを調製することを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- レポーター遺伝子が、GFPまたはβ-ラクタマーゼである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- レポーター遺伝子を含むHIV-1レンチウイルス遺伝子トラップベクターがHIV-1レンチウイルス-GFP-トラップベクターである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- HIV-1レンチウイルス-GFP-トラップベクターがpZR-1またはpZR-2である、請求項7に記載の方法。
- 移植されるクローンが、前立腺癌、精巣癌、肺癌、肝臓癌、絨毛癌、乳癌、及び結腸癌の細胞からなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
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