KR20090003149A

KR20090003149A - 인간 암의 초기, 암의 진행 및 재발 마커의 동정 방법

Info

Publication number: KR20090003149A
Application number: KR1020087010596A
Authority: KR
Inventors: 밍수 수; 유잉 탄; 레비 코펠로비치
Original assignee: 안티캔서, 인코포레이티드; 더 유나이티드 스테이츠 가번먼트 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크레터리 디파트먼트 오브 헬스 앤드 휴먼 서비시즈
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2006-09-29
Publication date: 2009-01-09
Also published as: WO2007041472A2; US8217222B2; US20120316321A1; EP1954809A2; CN101305094A; JP5283265B2; WO2007041472A3; CA2624213A1; JP2009510453A; AU2006299539A1; US20070196821A1; EP1954809B1

Abstract

암의 악성 단계를 동정하는 분비된 단백질을 동정하는 방법이 기술된다. 상기 단백질은 임의의 유전자에 삽입할 수 있는 벡터를 함유하는 형광 단백질로 이들을 트랩함으로써 처음에 동정된다. 상기 분비된 단백질은 이들의 형광에 의하여 처음에 동정된다. 악성 정도가 특이적인 종양을 동정하는 분비된 단백질을 분리하여, 이들이 암 진행의 마커로서 사용될 수 있는지를 결정한다.

Description

인간 암의 초기, 암의 진행 및 재발 마커의 동정 방법 {METHODS FOR IDENTIFYING MARKERS FOR EARLY-STAGE HUMAN CANCER, CANCER PROGRESSION AND RECURRENCE}

본 발명은 암의 분비된 단백질 마커를 동정하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 유전자 발현시의 변화를 탐지가능한 유전자 트랩 기술을 이용한다.

암으로 인한 사망은 대부분 현재의 치료법으로 비효율적인 시기에 뒤 늦게 진단되기 때문에 발생한다. 질량 분석법 및 기타 기술을 사용한 단백질 유전 정보학 연구로 혈청, 혈장 및 소변 중의 단백질을 특성화하는 것이 가능할지라도, 대다수의 암 유형에 대한 유용한 초기 마커는 여전히 부족하다 (Rai et al ., Ann .　 NY Acad. Sci . (2004) 1022:286-294; Diamandis, J.　 Natl . Cancer Inst . (2004) 96:353-356).

역사적으로 종양 마커 후보 (candidate tumor marker)는 종양 세포 추출물에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 동정되었다 (Fidler, Cancer Research (1978) 38:2651-2660). 이들 후보의 스크리닝과 평가가 신규 종양 마커를 동정하는 전통적인 방법이었다. 그러나, 이러한 기술은 한계가 있다. 다수의 후보 마커를 평가하는 것은 노동 집약적이고, 시간 소모적이다.

또한, 특정 유형의 암에 민감하고 특이적인 마커를 동정하는 것은 매우 어려운 일이었다. 대다수의 암의 유형에 있어서 미세 잔류 질환을 진단, 예후, 시기 결정, 재발 및 탐지하는 마커를 동정하는 것은 여전히 어렵다.

현재 혈청 분석에 사용되는 SELDI-TOF 질량 분석 기술로는 농도가 1 ㎍/㎖ 미만인 혈청 성분을 탐지하지 못한다 (Lai et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA (2002) 99:3651:3656). 이 농도 범위는 현재 공지의 종양 마커의 농도보다 약 1000배 더 높은 것이다 (표 1) (Lai, supra).

[표 1]

단백질	대략적인 농도 pmol/L	암 유형
고전적인 종양 마커 알파-태아 단백질 전립선 특이 항원 암배 항원 인간 융모 생식선 자극 호르몬 인간 융모 생식선 자극 호르몬-β서브 유닛	150 140 30 20 2	간암, 고환 전립선 결장, 폐, 유방 고환, 융모막 암종 고환, 융모막 암종

참고: Diamandis, supra.

유전자 트랩 벡터는 내생 유전자를 표지하고 유전자 발현시의 변화를 탐지가능하다. 유전자 표지는 특이적 프로모터 및 이에 상응하는 유전자의 기능 연구를 가능하게 한다. 그러나, 대부분이 플라스미드 또는 레트로바이러스 기재 벡터인 유전자 트랩 벡터는 낮은 효율성, 단기 발현 또는 세포 분할 제한으로 인하여 제한되어 왔다. 최근 개발된 HIV-1-기재 렌티바이러스 벡터는 이러한 장애를 극복하여, 시험관 내에서 유전자 전달용으로의 이용이 점차 증가하고 있다. 이들 벡터는 중추 신경계 (CNS), 조혈 기관 계통, 망막, 근육, 간 및 이자섬 세포에서 생체 내 장기 (長期) 유전자 발현을 초래하였다 (Lai, supra).

HIV-1 렌티바이러스 벡터는 분할 세포 및 비분할 세포 유전자로 통합되어 안정적으로 외래 도입 유전자 (transgene)를 발현시킨다. 2개의 HIV-1 기재 렌티바이러스 벡터 유도체인 pZR-1 및 pZR-2는 시험관 내 및 생체 내에서 포유 동물 세포에서의 유전자 트랩을 발전시켰다 (Lai, supra). 이들 렌티바이러스 유전자 트랩 벡터는 3' LTR (long terminal repeat)의 U3 부위 안으로 삽입된 β-락타메이즈 또는 녹색 형광 단백질(GFP)인 리포터 유전자를 함유한다. 트랩 벡터 2개 모두 편리한 형질 감염 기술을 사용하여 쉽게 숙주 유전자로 통합하여, GFP 또는 β-락타메이즈를 발현시킨다. 이 기술은 트랩된 세포의 신속한 농축 및 클로닝을 촉진시킨다. 리포터 유전자는 상류 세포 특이적 프로모터에 의하여 유도된다 (Lai, supra).

본 발명의 방법은 인간 암의 초기 단계, 암의 진행 및 재발 등 악성인 정도가 다양한 악성 종양에 대한 마커로서 작용할 분비된 단백질을 동정하기 위하여, 유전자 트랩 기술을 사용한다. 한 가지 대표적인 실시 상태로서, 정상 상태로 돌아간 악성 인간 암의 최초 변이체 (Jiang et 　 al ., Proc . Am . Assoc . for Cancer Res . (2004) 45:937)를 전술한 GFP-유전자-트랩 벡터로 형질 감염시킨다. GFP 발현 세포주를, 이들이 GFP-트랩 단백질을 분비하는 지를 측정하기 위하여 동정한다. GFP 결합 단백질을 분비하는 세포의 클론을, GFP 결합 단백질이 혈청에서 분비되는 지를 측정하기 위하여 마우스 내에 이식한다. 악성이 아닌 (non-malignan) 변이체에 특이적인 분비된 GFP 결합 단백질을 동정하기 위하여, 생체 내에서 이러한 클론을 평가한다. 악성이 아닌 인간 변이체가 그 악성 정도가 다양한 단계의 악성 종양으로 다시 되돌아간 동물을 이용하는 연속 실험을 통하여, 암의 진행에 특이적인 분비된 GFP 결합 변이체를 동정한다. 악성 종양으로 진행하는 인간 세포 내의 생체 내 및 시험관 내에서의 분비된 GFP 결합 단백질들을 비교하기 위하여, 저(低) 악성 종양 인간 세포 변이체에 대한 대응하는 시험관 내 실험을 수행한다 (Jiang, supra).

한 가지 측면에서, a) 악성인 정도가 다양하고, 악성이 아닌 상태로 되돌아간 다수의 인간 암 세포를, 리포터 유전자를 함유하는 HIV-1 렌티바이러스 유전자 트랩 벡터로 형질 감염시키고, b) 시험관 내에서 리포터 결합 단백질을 분비하는 리포터 발현 세포주를 동정하며, c) 상기 동정된 리포터 발현 세포주 각각의 클론을 동물 내에 이식하고, d) 혈청에서, 리포터 결합 단백질을 분비하는 이식된 리포터 발현 세포주 클론을 동정하며, e) 저(低) 단계로부터 고(高) 단계까지 악성인 정도가 다양한 악성 종양의 인간 암 세포에 특이적인, 단계 d)로부터 분비된 리포터 결합 단백질을 동정하는데, 여기서 상기 동정된 단백질은 각각의 암의 단계에 대한 마커인 것을 포함하는, 암에 대한 분비된 단백질 마커를 동정하는 방법이 본원에서 제공된다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 방법은 f) 악성이 아닌 인간 암 세포가 악성인 정도가 다양한 악성 종양으로 다시 되돌아가는 암의 진행에 특이적인 분비된 리포터 결합 단백질을 동정하는 것을 더 포함하는데, 여기서 상기 동정된 단백질은 암의 진행 및 재발에 대한 마커이다. 상기 방법은 또한, g) 악성 종양으로 진행하는, 생체 내 및 시험관 내의 저-악성 종양 인간 암 세포 내에 분비되는 리포터 결합 단백질을 비교하는 것을 더 포함할 수도 있다.

일부 실시 상태에 있어서, 상기 리포터는 GFP이고 단계 b)는 b1) 정상으로 되돌아가는 형질 감염된 암 세포를 RFP로 형질 전환시키고, b2) GFP+세포를 분리 및 클로닝하며, b3) GFP+ 클론을 배양하고, b4) GFP+ 형광 클론을 동정하며, b5) 동정된 형광 클론으로부터 GFP-단백질을 분비하는 세포를 동정하는 것을 더 포함한다.

상기 방법은 단계 d) 이후에, 세포가 생체 내에서 리포터 또는 GFP-단백질을 분비하는 세포의 라이브러리를 제조하는 것을 더 포함할 수 있다.

본원에서 제공되는 상기 방법 중의 리포터 유전자는 GFP 또는 β-락타메이즈일 수 있다. 리포터 유전자를 함유하는 HIV-1 렌티바이러스 유전자 트랩 벡터는 pZR-1 또는 pZR-2 등의 HIV-1 렌티바이러스-GFP 트랩 벡터일 수 있다. 이식된 클론은 전립선암, 고환암, 폐암, 간종양, 융모암, 유방암 또는 결장암 세포에서 선택될 수 있다.

또 한 가지 측면에서, 본원에서 제공되는 방법에 의하여 동정된 단백질이 본원에서 제공된다.

또 한 가지 측면에서, 본원에서는 악성인 정도가 다양한 인간 암 세포를 포함하는 라이브러리가 제공되는데, 상기 세포는 그 각각이 리포터 유전자를 함유하는 랜덤하게 트랩 유전자를 가진다. 일부 실시 상태에 있어서, 상기 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현시킨다. 인간 암 세포의 한 부분이 분비된 단백질을 코딩할 수 있는 리포터 트랩 유전자를 함유한다는 것이 고찰된다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 리포터 트랩 유전자는 시험관 내에서 분비된 단백질을 발현시킬 수 있다. 일부 실시 상태에 있어서, 상기 리포터 트랩 유전자는 생체 내에서 분비된 단백질을 발현시킬 수 있다. 리포터 트랩 유전자는 암 세포가 특정 정도의 악성 종양을 가질 때, 생체 내 또는 시험관 내에서 분비된 단백질을 발현시킬 수 있다. 때때로, 암 세포는 세포가 침입 또는 전이 능력을 가질 정도의 악성 종양을 가진다. 이러한 세포에 있어서, 상기 리포터 트랩 유전자는 때로 생체 내 및 시험관 내에서 분비된 단백질을 발현시킬 능력이 있고, 리포터 트랩 유전자를 발현시키는 세포로 이식된 설치류의 혈청에서 탐지될 수 있다.

한 가지 측면에서, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의하여 동정된, 암 진행의 단백질 마커를 발현시킬 수 있는 분리된 유전자의 라이브러리가 본원에서 제공되는데, 여기서 상기 유전자는 종양 진행의 특정 단계 동안 리포터 유전자 또는 유전자 트랩 벡터를 함유하지 않는다.

발명을 수행하는 방법

본 발명의 방법은 악성 정도가 다양한 인간 암 세포로 전염된 리포터 유전자를 함유하는 HIV-1 렌티바이러스 유전자 트랩 벡터를 이용한다. 한 가지 측면에서, 정상 상태로 되돌아간 "악성이 아닌" 인간 암 세포로 여겨지는 인간 암 세포에 특이적인 단백질을 동정한다. 세포가 악성이 아닌 상태로부터 악성 종양으로 약하게 진행할수록, 저 악성 인간 암 세포가 전이될 수 있다. 그 정도가 다양한 악성 종양으로 다시 되돌아가는 악성이 아닌 인간 암 세포들이 암의 진행 및 재발을 동정하는 데에 적당하다. 따라서, "악성인 정도가 다양한 악성 종양"이라는 용어는 그 정도가 다양한 단계의 악성 종양 및/또는 악성이 아닌 종양인 암 세포를 지칭하는 것이다.

본 발명의 유전자 트랩 벡터는 HIV-1 렌티바이러스 유전자 트랩 벡터인 것이 좋다. 이러한 벡터는 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 β-락타메이즈 등의 리포터 유전자를 함유한다. 기타 리포터 유전자 역시 사용될 수 있다. 리포터 유전자는 청색 형광 단백질 (BFP) 또는 적색 형광 단백질 (RFP) 등의 또 다른 형광을 내는 물질을 발현시킬 수 있다. 리포터를 렌티바이러스 유전자 트랩 벡터로 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 사용 가능하게 연결하는 방법도 본 발명의 범위 내에 속한다. GFP를 발현시키는 리포터 유전자가 좋다.

본 발명의 방법은 먼저 시험관 내 단계를 포함한다. 리포터 결합 단백질을 분비하는 리포터 발현 세포주를 시험관 내, 무혈청 배지에서 동정한다. 리포터 렌티바이러스 벡터를 발현시키는 암 세포, 좋기로는 정상으로 되돌아간 암 세포를 배양하고 리포터 발현, 좋기로는 GFP 형광을 분석한다. 리포터에 의하여 동정된 배양을 분리하여 성장시킨다. 리포터 결합 단백질 분비 배양으로부터의 배지를 농축하고 나서, 농축 배지의 성분을 천연 폴리아크릴아미드 겔 등으로 분리하여, 전기 영동 및 형광 분석으로 리포터 결합 분비된 단백질의 위치를 측정할 수 있다. 이 후, 동정 가능한 리포터 결합 단백질을 분비하는 클론을 생체 내에서 더 평가한다.

생체 내 평가는 리포터 결합 단백질을 분비하는 것으로 동정된 세포를 누드 마우스 등과 같은 실험 동물에 이식하는 것을 포함한다. 전형적으로 실험 동물은 마우스, 래트 또는 래빗과 같은 설치류뿐만 아니라, 원숭이와 같은 기타 포유류도 있을 수 있다. 리포터 결합 단백질은 세포가 동정가능한, 검출 가능한 양으로 분비되는 것이 좋다. 이 세포들을 동물로 성장시키고, 혈청을 수집하여, 전술한 바와 같이 생체 내에서 분석되는 것과 유사한 방법으로 분석한다.

본 발명은 또한, 리포터 결합 분비된 단백질을 분비하는 세포의 진행과 악성인 정도가 다양한 악성 종양을 분석하는 것을 제공한다. 세포는 리포터, 좋기로는 단백질에 결합된 리포터와 상이한 리포터로 형질 전환되는 것이 좋다. 예를 들어, 렌티바이러스 유전자 트랩 벡터가 GFP 리포터 유전자를 함유한다면, 상기 세포가 RFP 등 상이한 리포터 유전자로 형질 전환되는 것이 이로울 것이다. 리포터 결합 분비된 단백질과 관련된 암 세포는 생체 내에서 이들의 악성 상태로 다시 돌아갈 수 있고, 이러한 진행 뒤에 유전자 트랩 벡터에 함유되어 있는 것과 상이한 리포터 유전자의 발현을 관찰할 수 있다. 그러므로, 진행 정도가 상이한 종양에서 혈청 시료를 수집하여, 전술한 방법을 사용하여 리포터 결합 분비된 단백질의 존재를 위하여 상기 혈청 시료를 분석할 수 있다. 이 자료는 인간 세포가 악성 종양으로 다시 되돌아갈 때, 생체 내에서 특정 종양 단계에서뿐만 아니라 시험관 내에서 연속적으로 마커의 후보를 동정하는 데에 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시 상태를 설명하는 실험 공정도이다.

도 2는 라이 (Lai (supra))로부터 HIV-1 렌티바이러스 유전자 트랩 벡터 시스템의 성분을 나타낸 것이다. (A) 벡터 구조. (i) 스플라이스 수용 부위에 의하여 선행되는 리포터 유전자, GFP (ZR-2)를 함유하는 유전자 트랩 벡터. (ii) HIV-1 렌티바이러스 조절 벡터. BLAK, β-락타메이즈 코딩 유전자; SA, 스플라이스 수용체 부위. (B) 헬퍼 (패키징) 구조. (C) 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSV-G) (Lai, supra)을 코딩하는 외피 구조 (Envelope construct).

실시예 1

벡터 구조 및 바이러스 생산

플라스미드 NL-네오는 NL 4-3 분자 클론에 기초하며, NsiI 자리에서 BglII 자리까지 결실을 전달한다. 네오 유전자 서열과 pBKCMV (Stratagene)에서 유도된 SV40 초기 프로모터를 전달하는 1,169-bp 단편을 BamHI 자리와 XhoI 자리 사이에 삽입한다. 렌티바이러스 기초한 유전자 트랩 벡터를 제조하기 위하여, XhoI와 XbaI 사이의 3' 장(長) 말단 반복 (LTR)의 U3 부위로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 삽입하여, ZR-2 벡터를 산출한다 (Fig.　1) (Lai, supra). 스플라이스 수용 자리는 리포터 유전자 앞에 놓여져, 상류 (upstream) 세포 특이적 프로모터로부터 발현되게 한다.

융합 전사체의 유효한 번역을 얻기 위하여, 유전자 카세트 (gene cassette)에 있는 폴리아데닐화 시그널은 융합 유전자로부터 전사를 멈출 것이다 (Lai, supra). 내부 SV40 초기 프로모터에 의하여 유도된 박테리아 네오 유전자를 렌티바이러스 유전자 트랩 벡터의 BamHI와 XhoI 사이에 위치될 것인데, 이것은 G418 선택을 허용한다 (Lai, supra). 또한, pZR-2는 3' LTR의 U3 부위가 제거되고 EGFP 유전자에 의하여 대체되는 자기 불활성 (SIN) 렌티바이러스 유전자 트랩 벡터로서 생성된다. SIN 프로바이러스에서 장 말단 반복의 전사 불활성이 복제 경쟁 바이러스에 의한 이동을 저지하여야 하기 때문에 (Lai, supra), 렌티바이러스 유전자 트랩 벡 터의 변형은 벡터 매개 유전자 전달의 안정성을 증가시키고 비분할 세포로의 유전자 형질 도입을 증가시켜야 한다 (Lai, supra).

HIV-1 모조형 (pseudotype)을 제조하기 위하여, 헬퍼 플라스미드 DNA (5 ㎍), Env 플라스마 DNA (5 ㎍) 및 벡터 플라스미드 DNA (5　㎍)를 형질 감염 키트 (Stratagene)를 사용하여 서브컨플루언트 (subconfluent) 293 T　세포로 형질 감염시킨다 (cotransfect) (Lai, supra). 웰당 대략 2　X 10⁶세포를 형질 감염 전 24 내지 30시간 전에 6-웰 플레이트로 평판 배양한다. 축적 바이러스를 형질 감염 후 60 내지 65 시간에 거두어 들이고, 구멍 크기가 0.45 ㎛인 여과기로 여과, 분할 및 -80℃에서 냉각한다 (Lai, supra).

실시예 2

다양한 정도의 악성 종양이 있는 인간 종양 세포

다양한 인간 클론을 기술한 것과 같이 얻을 것이다 (Jiang, supra).

실시예 3

렌티 -바이러스- GFP 벡터로 형질 감염

다양한 정도의 악성 종양의 인간 종양 세포를 렌티바이러스 유전자 트랩 ZR-2로 형질 도입한다. 세포를 2.2 ㎖ 배지의 12-웰 배양 접시에서 폴리-L-리신 (Becton Dickinson)으로 코팅된 12-mm 둥근 커버슬립 상에서 성장시킨다. 트랩 세포주의 형성을 위하여, 기술된 바와 같이 37℃에서 3 내지 5시간 동안 렌티바이러스 ZR 유전자 트랩 벡터와 함께 세포를 배양시킨다 (Lai, supra). G418 선택 후 약물 저항 콜로니 (colony)를 24-웰 플레이트로 옮기고 컨플루언스 (confluence)까지 신장시켜 형광 현미경 하에 GFP 발현을 관찰한다. 100%까지 트랩으로 도입된 세 포는 형질 도입이 매우 효율적이라는 것을 나타내는 GFP 양성이다 (Lai, supra).

실시예 4

동소 이식-전립선

마우스를 케타민-자일라진-아세프로마진 말리에리트-칵테일 (ketamine-xylazine-acepromazine maleate-cocktail)로 마취시키고 반듯하게 위치시켰다. 호(arc)형 피부 플랩 (flap)이 치골 결합 우측 상부에 만들어져 전립선을 노출시킨다. 전립선을 둘러싼 근막을 조심스럽게 분리하고, 선의 2개의 배측엽 (dorsal lateral lobe)을 한 쌍의 예리한 외과용 가위를 사용하여 작은 절개로 노출시킨다. 렌티-바이러스 GFP를 발현시키는 전립선 암 세포 (10⁶)를 1개 또는 2개의 엽으로 주입한다. 복부를 6 내지 0 봉합을 사용하여 봉합한다. 모든 수술 절차는 7X 절개 현미경으로 수행한다.

실시예 5

동소 이식-유방

그리고 나서, 외과적 동소 이삭을 다음과 같이 수행한다. 마우스를 케타민-자일라진-아세프로마진 말리에리트-칵테일로 마취시키고 반듯하게 위치시켰다. 우측 두 번째 유선을 동소 이식에 사용한다. 유두의 내측면을 따라 작은 절개가 만들어진다. 유방 지방 패드가 무딘 절개를 통하여 노출된다. 렌티-바이러스 GFP를 발현시키는 세포가 주입된다. 피부를 6 내지 0 실크 봉합사를 사용하여 봉합한다. 모든 절차는 5X 절개 현미경으로 수행하였다.

실시예 6

동소 이식- 결장

작은 정중선 절개가 만들어지고 소장의 콜로세컬 (colocecal) 부분을 몸 밖으로 낸다. 결장의 장막을 제거하고 10⁶ GFP 렌티바이러스 발현 종양 세포를 주입한다. 상기 소장을 복강으로 되돌리고 복벽을 6 내지 0 실크 봉합을 사용하여 봉합한다.

실시예 7

형광 현미경법

광학 및 형광 현미경법을 크세논 램프 분말 공급이 장착된 니콘 현미경으로 수행할 것이다. 수은 램프 분말 공급이 장착된 라이카 스테레오 형광 해부 현미경 모델 LZ12도 역시 사용될 수 있다. 이 2가지 현미경 모두 GFP 여과기 세트 (Chroma Technology, Brattleboro, VT)를 가지고 있다. 현미경 사진을 광도 처리하고 이미지 프로 플러스 버전 3.0 소프트웨어(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)와 대조한다.

실시예 8

형광 이미지화

GFP 및 RFP 형광 2가지 모두 가시화하기 위하여, D425/60 대역 필터 및 470 DCXR 이색성 거울을 통하여 자극을 생성한다. 발산된 형광을 장파장 통과 필터 GG475 (Chroma Technology, Brattleboro, VT)를 통하여 수집한다. 거시이미지화를 라이트 박스(Lightools Research, Encinitas, CA)에서 수행한다. GFP 및 RFP 종양 2가지 모두의 형광 자극을 슬릿 광섬유를 사용하여 간섭 필터 (440+/-20 nm)를 통하여 라이트 박스에서 생성한다. 형광은 520　nm 장파장 통과 필터를 통하여 관찰된다. 현미경과 라이트 박스로부터의 이미지를 하마마쓰 (Hamamatsu) C5810 3-칩 쿨드 컬러 CCR 카메라 (Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater, NJ)로 포착한다.

실시예 9

시험관 내에서 분비된 GFP -결합 단백질의 동정

GFP 렌티바이러스 벡터를 발현시키는 정상 (13)으로 되돌아가는 RFP-발현 암 세포의 클론을 24-웰 접시에서 배양할 것이다. 각 웰로부터 조건 배지를 수집하고 처음에 형광계에서 GFP 형광 (자극 490　nm / 발산 510　nm)을 분석할 것이다. 이후에 조건 배지에서의 GFP 형광으로의 배양은 6-웰 플레이트에서 성장될 것이다. 이들 GFP 결합 단백질 분비 배양으로부터 조건 배지는 농축될 것이다. 이후, 농축 배지를 천연 폴리아크릴아미드 겔에 도포하고 전기 영동을 수행할 것이다. 상기 겔을 형광하에 촬영하여 GFP 결합 분비 단백질의 위치를 측정할 것이다. 동정 가능한 GFP 결합 단백질을 분비하는 클론을 생체 내에서 더 평가할 것이다 (이하의 내용 참조).

실시예 10

생체 내에서 분비되는 GFP 결합 단백질의 동정

후술하는 바와 같이 시험관 내에서 특이 GFP 결합 단백질을 분비하기 위하여 동정된, 정상으로 되돌아간 REF 발현 암 세포의 클론을 전술한 바와 같이 누드 마 우스에 동소 이식할 것이다. GFP 결합 단백질을 위하여 동물에 이식된 세포가 성장한 동물의 혈청을 전술한 바와 같이 분석할 것이다. 혈청에서 GFP 결합 분비 단백질이 동정될 수 있는, 암세포들을 생체 내에서 이들의 악성 상태로 다시 되돌아가게 하고, 이어서 RFP 형광을 한다. 그 진행 상태가 다양한 종양에서, 혈청을 수집하여 전술한 바와 같이 GFP 결합 분비된 단백질의 존재 하에서 분석할 것이다. 악성 정도와 그 진행이 다양한 세포로부터 분비된 GFP 결합 분비된 단백질 전체를 인간 세포가 악성으로 다시 되돌아갈 때 계속적으로 시험관 내뿐만 아니라 생체 내 특정 악성 단계의 마커로서의 후보자로 분석될 것이다.

실시예 11

자료 분석

분비된 GFP 결합 특정 단백질의 존재와 악성 상태 사이에 통계적인 유의성을 짝을 이룬 t-시험에 의하여, 적절한 경우 변수 (ANOVA)를 분석하여 평가할 것이다. 악성의 초기 상태는 다음과 같이 정의될 것이다: 1) 5 mm 미만의 제1 종양; 2) 1 cm 미만의 제1 종양; 3) 암의 국소 부위 침입의 존재; 4) 원거리 전이의 존재. 누적 자료를 적절한 p 값으로 평균 ±SD로서 나타낼 것이다.

실시예 12

조사에 이용된 동물

대략 500 마리의 athymic outbred nu / nu 누드 마우스 (수컷, 5~6주령)를 악성인 정도가 다양한 이식 세포로부터 GFP 트랩 분비된 단백질을 분석하는 데에 사용할 것이다.

외과 동소 이식 ( SOI )

누드 마우스의 피하에서 미리 성장되고 GFP를 안정적으로 발현시키는 세포 또는 조직 (1 mm³)을 누드 마우스 안에 외과적 동소 이식(SOI)으로 이식한다. 이식될 조직을 적절히 노출시킨 후에, 8-0 외과적 봉합사를 사용하여 조직 조각을 통과하고 이들을 적절한 동소 기관에 부착한다. 피부의 절개 부분을 1개 층으로 7-0 외과 봉합사로 봉합한다. 수술 중, 케타민-자일라진-아세프로마진 말레에이트-칵테일을 사용하여 마취할 것이다. 전술한 모든 수술 과정은 7X 배율 현미경(Leica MZ6, Nussloch, Germany)으로 수행한다. 마지막으로 10⁶-10⁷ 세포의 50 ㎕ 현탁액을 숙주 기관에 삽입한다.

피부 플랩 윈도우 모델

동소 GFP 발현 세포를 상부 배벽 위로 피부 플랩 윈도우를 통해 가시화한다. 수술 중, 케타민-자일라진-아세프로마진 말레에이트-칵테일을 사용하여 마취할 것이다. 피하 결합 조직을 분리하여 피부 플랩을 분리한다. 이 피부 플랩을 개방하여 거의 투명한 마우스 체벽을 통하여 내부 기관을 노출시킬 수 있다. 이러한 과정은 이미지화할 기관의 깊이를 감소시킬 뿐만 아니라 녹색 형광의 산란을 크게 감소시킨다. 본 발명자들은 주의 깊게 외과적인 무균 기술에 의하여, 사망하거나 형질 감염되는 일이 없이, 창이 1주에 3회 개폐될 수 있다는 것을 알게 되었다. 피부 플랩을 국소 네오스포린 (neosporin)으로 처리한다. 동물을 식수에 암피실린이 있는 배리어 (barrier) 시설이 있는 라미나 플로우 (laminar flow) 선반에 넣어 둔다.

Claims

a) 악성인 정도가 다양하고, 악성이 아닌 상태로 되돌아간 다수의 인간 암 세포를 리포터 유전자를 함유하는 HIV-1 렌티바이러스 유전자 트랩 벡터로 형질 감염시키는 단계와,

b) 시험관 내에서 리포터 결합 단백질을 분비하는 리포터 발현 세포주를 동정하는 단계와,

c) 상기 동정된 리포터 발현 세포주 각각의 클론을 동물 내에 이식하는 단계와,

d) 혈청에서 리포터 결합 단백질을 분비하는 이식된 리포터 발현 세포주 클론을 동정하는 단계와,

e) 저(低) 단계로부터 고(高) 단계까지 악성인 정도가 다양한 인간 암 세포에 특이적인 단계 d)로부터 분비된 리포터 결합 단백질을 동정하는 단계를 포함하는데,

여기서, 상기 동정된 단백질은 각각의 암의 단계에 대한 마커인 것인, 암에 대한 분비된 단백질 마커를 동정하는 방법.
제1항에 있어서, f) 악성이 아닌 인간 암 세포가 악성 정도가 다양한 악성 종양으로 다시 되돌아가는 암의 진행에 특이적인 분비된 리포터 결합 단백질을 동정하는 것을 더 포함하는데,

여기서, 상기 동정된 단백질은 암의 진행 및 재발에 대한 마커인 것인 방법.
제2항에 있어서,

g) 악성으로 진행하는, 생체 내 및 시험관 내의 저-악성 인간 암 세포 내에 분비되는 리포터 결합 단백질들을 비교하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리포터는 GFP이고, 단계 b)는

b1) 정상으로 되돌아가는 형질 감염된 암 세포를 RFP로 형질 전환시키는 단계와,

b2) GFP +세포를 분리 및 클로닝하는 단계와,

b3) GFP + 클론을 배양하는 단계와,

b4) GFP + 형광 클론을 동정하는 단계와,

b5) 동정된 형광 클론으로부터 GFP-단백질을 분비하는 세포를 동정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 d) 이후에, 세포가 생체 내에서 리포터 단백질 또는 GFP 단백질을 분비하는 세포의 라이브러리를 제조하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 GFP 또는 β-락타메이즈인 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리포터 유전자를 함유하는 상기 HIV-1 렌티바이러스 유전자 트랩 벡터는 HIV-1 렌티바이러스-GFP-트랩 벡터인 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 HIV-1 렌티바이러스-GFP-트랩 벡터는 pZR-1 또는 pZR-2인 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 이식된 클론은 전립선암, 고환암, 폐암, 간암, 융모막 암종, 유방암 또는 결장암 세포로부터 선택되는 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 동정된 단백질.
각각 리포터 유전자를 함유하는, 랜덤하게 트랩된 유전자를 가지는 것인, 악성인 정도가 다양한 인간 암세포를 포함하는 라이브러리.
제11항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현시키는 것인 라이브러리.
제11항에 있어서, 상기 세포의 서브셋은 분비된 단백질을 코딩할 수 있는 리포터 트랩 유전자를 함유하는 것인 라이브러리.
리포터 트랩 유전자는 시험관 내에서 분비되는 단백질을 발현시킬 수 있는 것인, 제13항의 세포 라이브러리로부터 리포터 트랩 유전자의 라이브러리.
리포터 트랩 유전자는 생체 내에서 분비된 단백질을 발현시킬 수 있는 것인, 제13항의 세포 라이브러리로부터 리포터 트랩 유전자의 라이브러리.
제11항에 있어서, 상기 리포터 트랩 유전자는, 암세포가 특정된 정도의 악성을 가질 때, 시험관 내 또는 생체 내에서 분비되는 단백질을 발현시킬 수 있는 것인 라이브러리.
제16항에 있어서, 상기 암세포는 세포가 침입 또는 전이 능력을 가질 정도의 악성 정도를 가지는 것인 라이브러리.
제17항에 있어서, 상기 리포터 트랩 유전자는 시험관 내 및 생체 내에서 분비되고, 리포터 트랩 유전자를 발현시키는 세포가 이식된 설치류의 혈청에서 탐지가능한 단백질을 발현시킬 수 있는 것인 라이브러리.
종양 진행의 특정 단계 동안, 유전자가 리포터 유전자 또는 유전자 트랩 벡터를 함유하지 않는, 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 동정되는 암 진행에 대한 단백질 마커를 발현시킬 수 있는 분리된 유전자의 라이브러리.