CN113499440B - 下调rbms1表达的试剂在制备治疗肺癌的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及下调RBMS1表达的试剂在制备治疗肺癌的药物中的应用，属于诊断试剂盒技术领域。本发明提供了下调RBMS1表达的试剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。本发明所述应用有助于实现治疗肺癌的药物的制备。

Description

下调RBMS1表达的试剂在制备治疗肺癌的药物中的应用
技术领域
本发明涉及诊断试剂盒技术领域，具体涉及下调RBMS1表达的试剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。
背景技术
肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。深入了解肺癌发病机理，发现疾病进展过程中重要环节和关键因子，并从中寻找新的治疗靶点，是实现有效防治及改善预后亟待解决的重要问题。
RNA结合蛋白参与转录后层次的所有步骤调控，是基因转录后水平调控的关键调控因子，通过调节pre-mRNA的剪接、聚腺苷酸化、稳定性、定位、翻译成蛋白质和降解来影响基本的细胞过程，决定细胞中每个转录本的状态与命运。其异常表达与肿瘤发生发展密切相关。当RNA结合蛋白的表达水平、作用活性及胞内定位发生改变时会影响肿瘤相关基因的表达及生物学功能，从而影响肿瘤的进展。深入探究RNA结合蛋白生理功能及其调控的RNA网络，有利于为今后的肿瘤治疗提供全新的潜在靶点。目前仍缺乏肺癌相关靶标。
发明内容
本发明的目的在于提供下调RBMS1表达的试剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。本发明所述应用有助于实现治疗肺癌的药物的制备。
本发明提供了下调RBMS1表达的试剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。
本发明还提供了下调RBMS1表达的试剂在制备抑制肺癌细胞生长和/或增殖的药物中的应用。
本发明还提供了下调RBMS1表达的试剂在制备抑制肺癌成瘤能力的药物中的应用。
本发明还提供了下调RBMS1表达的试剂在制备抑制肺癌细胞转移和/或侵袭的药物中的应用。
本发明还提供了下调RBMS1表达的试剂在制备抑制铁死亡相关因子SLC7A11的表达的药物中的应用。
本发明还提供了下调RBMS1表达的试剂在制备促进erastin诱导细胞铁死亡的药物中的应用。
本发明还提供了下调RBMS1表达的试剂在制备下调肺癌细胞内谷胱甘肽水平和/或升高肺癌细胞内脂质过氧化水平的药物中的应用。
本发明还提供了检测RBMS1表达量的试剂在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。
本发明还提供了下调RBMS1表达的RBMS1敲降用载体。
本发明还提供了上述技术方案所述RBMS1敲降用载体的构建用引物，包括RBMS1shN1引物对和/或RBMS1 shN2引物对；所述RBMS1 shN1引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的RBMS1 shN1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的RBMS1 shN1-R；所述RBMS1shN2引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的RBMS1 shN2-F和核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的RBMS1 shN2-R。
本发明提供了下调RBMS1表达的试剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。下调RBMS1表达的试剂能够用于制备治疗肺癌的药物、下调RBMS1表达的试剂能够用于制备抑制肺癌细胞生长和/或增殖的药物、抑制肺癌成瘤能力的药物、抑制肺癌转移和/或侵袭的药物以及抑制与癌症转移相关信号通路的药物中的应用，此外，检测RBMS1表达量的试剂能够用于检测肺癌早期诊断的检测试剂盒，有助于实现临床上对肺癌的早期发现和预后的预测。试验结果表明，本发明利用蛋白质免疫印迹分析，相比肺癌患者的正常组织，RBMS1在肺癌组织中高表达，组织芯片免疫组化发现RBMS1肺癌病人组织中高表达，且高表达RBMS1的肺癌患者总生存期更短(p<0.01)。利用蛋白质免疫印迹分析，与正常肺成纤维细胞相比，RBMS1肺癌细胞中呈高表达。构建稳定低表达RBMS1人肺癌细胞株，通过生长曲线和平板克隆实验结果表明敲低RBMS1能够明显抑制肺癌细胞的生长和克隆形成能力(增殖)。利用Dox诱导RBMS1敲降的稳转细胞系，通过裸鼠皮下移植瘤实验结果表明敲低RBMS1能抑制裸鼠成瘤能力。利用稳定低表达RBMS1人肺癌细胞株，通过transwell实验结果表明敲低RBMS1抑制H1299肺癌细胞的转移和侵袭能力。探究具体机制发现敲低RBMS1能显著抑制铁死亡相关因子SLC7A11的表达，进一步通过GSH-Glo Glutathione Assay试剂盒发现敲低RBMS1下调肺癌细胞内谷胱甘肽(GSH)水平，而升高肺癌细胞内脂质过氧化的水平，进一步证实下调RBMS1促进erastin诱导细胞铁死亡。在敲低RBMS1的细胞中回复SLC7A11的表达可以回复细胞的生长及平板克隆形成能力以及裸鼠皮下移植瘤生长。
附图说明
图1为本发明提供的RBMS1在肺癌患者组织中的表达情况图；其中，A为westernblot检测RBMS1在肺癌患者正常组织(N)与癌组织(T)中的表达情况图；B为应用免疫组织化学方法检测RBMS1在人肺癌组织(NSCLC)及邻近正常组织(Normal)中的表达情况的代表图；C为统计RBMS1在人肺癌组织(NSCLC)及邻近正常组织(Normal)免疫组化结果；D为RBMS1表达水平与肺癌患者总生存期的相关性结果图；
图2为本发明提供的通过western blot检测RBMS1在不同细胞系中的蛋白表达量结果图；
图3为本发明提供的利用pLKO.1-RBMS1-sh1/2敲低RBMS1抑制H1299肺癌细胞增殖能力结果图；其中，A为通过western blot检测利用pLKO.1-RBMS1-sh1/2敲低H1299细胞RBMS1(RBMS1 shN1，RBMS1 shN2)的效果验证，pLKO.1空载细胞作为对照(Empty Vector)，GAPDH作为内参；B为敲低RBMS1对细胞生长曲线的影响；C为敲低RBMS1对H1299肺癌细胞平板克隆形成能力的影响；
图4为本发明提供的利用pLKO.1-RBMS1-sh1/2敲低RBMS1对A549肺癌细胞增殖能力的影响；其中，A为通过western blot检测利用pLKO.1-RBMS1-sh1/2敲低A549细胞RBMS1(RBMS1 shN1，RBMS1 shN2)的效果验证，pLKO.1空载细胞作为对照(Empty Vector)，GAPDH作为内参；B为敲低RBMS1对细胞生长曲线的影响；C为敲低RBMS1对A549肺癌细胞平板克隆形成能力的影响；
图5为本发明提供的利用pLKO.1-Tet-On-RBMS1-sh1载体在H1299细胞中敲低RBMS1对裸鼠皮下移植瘤生长的影响结果图；其中，A为western blot检测通过pLKO.1-Tet-On-RBMS1-sh1载体构建的Dox诱导的H1299稳转细胞RBMS1的表达情况；B为Dox诱导敲低RBMS1对裸鼠皮下移植瘤生长的影响结果；C为B图中裸鼠皮下移植瘤的重量统计图；D为裸鼠皮下移植瘤的体积；
图6为本发明提供的通过transwell实验检测RBMS1对H1299肺癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响结果图；其中，A为通过Transwell(无基质胶)实验检测敲低RBMS1对H1299肺癌细胞迁移能力的影响；B为迁移效率的统计图；C为通过Transwell(有基质胶)实验敲低RBMS1对H1299肺癌细胞侵袭能力的影响；D为侵袭效率的统计图；
图7为本发明提供的western blot检测RBMS1敲低(pLKO.1-RBMS1-sh1和pLKO.1-RBMS1-sh2)对SLC7A11、ACSL4、AIFM2和GPX4蛋白表达的影响图；其中，A为H1299细胞中敲低RBMS1对SLC7A11、ACSL4、AIFM2和GPX4蛋白表达的影响；B为A549细胞中敲低对SLC7A11、ACSL4、AIFM2和GPX4蛋白表达的影响；
图8为本发明提供的通过GSH-Glo Glutathione Assay试剂盒检测敲低RBMS1(pLKO.1-RBMS1-sh1和pLKO.1-RBMS1-sh2)对H1299细胞内谷胱甘肽(GSH)水平的影响；
图9为本发明提供的通过BODIPY 581/591 C11探针检测敲低RBMS1(pLKO.1-RBMS1-sh1和pLKO.1-RBMS1-sh2)对H1299细胞脂质过氧化的影响；
图10为本发明提供的敲低RBMS1对铁死亡诱导剂erastin(Era)诱导细胞铁死亡的影响；其中，A为对照组(不加erastin，-Era)、3μMerastin(+Era)组、以及erastin(3μM)+Ferrostatin-1(Ferr-1)(2μM)(+Era+Ferr-1)组分别处理敲低RBMS1的H1299(pLKO.1-RBMS1-sh1和pLKO.1-RBMS1-sh2)及对照组H1299细胞(pLKO.1空载，Empty Vector)16.5小时然后检测细胞死亡比例；B为对照组(不加erastin，-Era)、10μMerastin(+Era)组、以及erastin(10μM)+Ferrostatin-1(Ferr-1)(2μM)(+Era+Ferr-1)组分别处理敲低RBMS1的A549(pLKO.1-RBMS1-sh1和pLKO.1-RBMS1-sh2)及对照组A549细胞(pLKO.1空载，EmptyVector)22小时然后检测细胞死亡比例；
图11为本发明提供的敲低RBMS1回复SLC7A11对H1299细胞生长的影响；其中，A为western blot检测H1299稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1+ControlVector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载))、H1299稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1)中再过表达SLC7A11(pCDH-SLC7A11)及对照组细胞(Empty Vector(pLKO.1空载)+Control Vector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载))中SLC7A11和RBMS1蛋白表达量；B为生长曲线实验检测敲低RBMS1过表达SLC7A11对细胞生长曲线的影响；C为通过平板克隆检测敲低RBMS1过表达SLC7A11对细胞平板克隆形成能力的影响；
图12为本发明提供的敲低RBMS1回复SLC7A11对A549细胞生长的影响；其中，A为western blot检测A549稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1+ControlVector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载))、A549稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1)中再过表达SLC7A11(pCDH-SLC7A11)及对照组细胞(Empty Vector(pLKO.1空载)+Control Vector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载))中SLC7A11和RBMS1蛋白表达量；B为生长曲线实验检测敲低RBMS1过表达SLC7A11对细胞生长曲线的影响；C为通过平板克隆检测敲低RBMS1过表达SLC7A11对细胞平板克隆形成能力的影响；
图13为本发明提供的敲低RBMS1回复SLC7A11检测对裸鼠皮下移植瘤生长的影响；其中，A为western blot检测H1299稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1+ControlVector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载))、H1299稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1)中再过表达SLC7A11(pCDH-SLC7A11)及对照组细胞(Empty Vector(pLKO.1空载)+Control Vector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载)))中SLC7A11和RBMS1蛋白表达量；B为对裸鼠皮下移植瘤生长的影响；C为B图中裸鼠皮下移植瘤的重量统计图；D为裸鼠皮下移植瘤的体积。
具体实施方式
本发明提供了下调RBMS1表达的试剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。在本发明中，所述下调RBMS1表达的试剂优选包括下调RBMS1表达的载体。在本发明中，下调RBMS1表达的载体的骨架载体优选包括pLKO.1载体或pLKO-Tet-ON载体；构建所述下调RBMS1表达的载体用引物优选包括RBMS1 shN1引物对和/或RBMS1 shN2引物对；所述RBMS1 shN1引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的RBMS1 shN1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的RBMS1 shN1-R；所述RBMS1 shN2引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的RBMS1 shN2-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的RBMS1 sh2-R。
本发明还提供了下调RBMS1表达的试剂在制备抑制肺癌细胞生长和/或增殖的药物中的应用。在本发明中，所述下调RBMS1表达的试剂优选包括下调RBMS1表达的载体。在本发明中，下调RBMS1表达的载体的骨架载体优选包括pLKO.1载体或pLKO-Tet-ON载体；构建所述下调RBMS1表达的载体用引物优选包括RBMS1 shN1引物对和/或RBMS1 shN2引物对；所述RBMS1 shN1引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的RBMS1 shN1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的RBMS1 shN1-R；所述RBMS1 shN2引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的RBMS1 shN2-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的RBMS1 shN2-R。在H1299和A549肺癌细胞中构建RBMS1低表达的稳定细胞系，通过生长曲线实验表明敲低RBMS1能够明显抑制肺癌细胞的生长；平板克隆实验表明敲降RBMS1能够明显抑制H1299和A549细胞的克隆形成能力。
本发明还提供了下调RBMS1表达的试剂在制备抑制肺癌成瘤能力的药物中的应用。在本发明中，所述下调RBMS1表达的试剂优选包括下调RBMS1表达的载体。在本发明中，下调RBMS1表达的载体的骨架载体优选包括pLKO.1载体或pLKO-Tet-ON载体；构建所述下调RBMS1表达的载体用引物优选包括RBMS1 shN1引物对和/或RBMS1 shN2引物对；所述RBMS1sh1引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的RBMS1 shN1-F和核苷酸序列如SEQID NO.2所示的RBMS1 shN1-R；所述RBMS1 shN2引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的RBMS1 shN2-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的RBMS1 shN2-R。本发明利用Teton系统在H1299细胞里构建了Dox诱导RBMS1敲降的稳转细胞系。按照3×106个细胞/只细胞量接种到4周龄裸鼠皮下，并通过2mg/mLDox进行诱导表达。结果表明与对照组(-Dox)相比，敲降RBMS1(+Dox)的裸鼠皮下肿瘤大小和重量受到明显抑制，肿瘤生长速度也更加缓慢。
本发明还提供了下调RBMS1表达的试剂在制备抑制肺癌细胞转移和/或侵袭的药物中的应用。在本发明中，所述下调RBMS1表达的试剂优选包括下调RBMS1表达的载体。在本发明中，下调RBMS1表达的载体的骨架载体优选包括pLKO.1载体或pLKO-Tet-ON载体；构建所述下调RBMS1表达的载体用引物优选包括RBMS1 shN1引物对和/或RBMS1 shN2引物对；所述RBMS1 shN1引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的RBMS1 shN1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的RBMS1 shN1-R；所述RBMS1 shN2引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的RBMS1 shN2-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的RBMS1 shN2-R。利用敲低RBMS1的稳转细胞系，通过transwell(不铺基质胶与铺基质胶)实验探究RBMS1对肺癌细胞迁移和侵袭的影响，结果表明，敲低RBMS1抑制H1299肺癌细胞的转移和侵袭能力。
本发明还提供了下调RBMS1表达的试剂在制备抑制铁死亡相关因子SLC7A11的表达的药物中的应用。
本发明还提供了下调RBMS1表达的试剂在制备促进erastin诱导细胞铁死亡的药物中的应用。
本发明还提供了下调RBMS1表达的试剂在制备下调肺癌细胞内谷胱甘肽水平和/或升高肺癌细胞内脂质过氧化水平的药物中的应用。
在本发明中，所述下调RBMS1表达的试剂优选包括下调RBMS1表达的载体。在本发明中，下调RBMS1表达的载体的骨架载体优选包括pLKO.1载体或pLKO-Tet-ON载体；构建所述下调RBMS1表达的载体用引物优选包括RBMS1 shN1引物对和/或RBMS1 shN2引物对；所述RBMS1 shN1引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的RBMS1 shN1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的RBMS1 shN1-R；所述RBMS1 shN2引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的RBMS1 shN2-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的RBMS1sh2-R。本发明利用westernblot检测敲低RBMS1对铁死亡重要调控因子蛋白表达的影响。结果发现，SLC7A11在敲降RBMS1后显著降低。敲低RBMS1下调细胞内谷胱甘肽(GSH)水平，而升高细胞内脂质过氧化的水平，证实下调RBMS1促进erastin诱导细胞铁死亡。在敲低RBMS1的细胞中回复SLC7A11的表达可以回复细胞的生长及平板克隆形成能力以及裸鼠皮下移植瘤生长。本发明表明，敲低RBMS1通过抑制SLC7A11表达促进细胞铁死亡从而影响肺癌细胞增殖能力。因此，靶向RBMS1将为肺癌早期诊断或治疗提供新的思路和潜在新靶点。
本发明还提供了检测RBMS1表达量的试剂在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。在本发明中，所述试剂优选包括抗体，本发明对所述抗体的来源没有特殊限定，使用能够检测RBMS1表达量的常规市售抗体即可，如RBMS1(Abcam ab150353)。本发明通过蛋白质免疫印迹分析发现，相比正常肺癌组织，RBMS1在肺癌组织中高表达，组织芯片免疫组化发现RBMS1肺癌病人组织中高表达，且高表达RBMS1的肺癌患者总生存期更短。具体的，对两株肺成纤维细胞(HFL1和MRC5)以及六株肺癌细胞(A549、H460、H2170、H1299、H358、H446)进行了RBMS1蛋白水平的检测，结果表明：与正常肺成纤维细胞相比，RBMS1肺癌细胞中呈高表达。检测RBMS1表达量的试剂能够用于制备肺癌诊断试剂盒，助于实现临床上对肺癌的早期发现和预后的预测。
本发明还提供了下调RBMS1表达的RBMS1敲降用载体。
在本发明中，所述RBMS1敲降用载体的骨架载体优选包括pLKO.1载体或pLKO-Tet-ON载体。
本发明还提供了上述技术方案所述RBMS1敲降用载体的构建用引物，包括RBMS1shN1引物对和/或RBMS1 shN2引物对；所述RBMS1 shN1引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的RBMS1 shN1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的RBMS1 shN1-R；所述RBMS1shN2引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的RBMS1 shN2-F和核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的RBMS1 shN2-R。
下面结合具体实施例对本发明所述的下调RBMS1表达的试剂在制备治疗肺癌的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
以下为载体构建以及实施例中进行的操作所涉及的具体材料与方法，下述材料与方法中未涉及到的内容，视为使用了本领域常规使用的试剂和方法。
1.材料
1.1.细胞系
HEK293T细胞购于ATCC细胞库，培养条件：DMEM含10％FBS，培养于恒温37℃，5％CO2的孵箱。A549细胞购于ATCC细胞库，培养条件：90％F-12K含10％FBS，培养于恒温37℃，5％CO2的孵箱。NCI-H1299细胞(以下简称H1299)购于ATCC细胞库，培养条件：90％RPMI-1640含10％FBS，培养于恒温37℃，5％CO2的孵箱。HFL1细胞购于ATCC细胞库，培养条件：90％F-12K含10％FBS，培养于恒温37℃，5％CO2的孵箱。MRC5细胞购于ATCC细胞库，培养条件：90％MEM含10％FBS，培养于恒温37℃，5％CO2的孵箱。H460细胞购于ATCC细胞库，培养条件：90％RPMI-1640含10％FBS，培养于恒温37℃，5％CO2的孵箱。H2170细胞购于ATCC细胞库，培养条件：90％RPMI-1640含10％FBS，培养于恒温37℃，5％CO2的孵箱。H358细胞购于ATCC细胞库，培养条件：90％RPMI-1640含10％FBS，培养于恒温37℃，5％CO2的孵箱。H446细胞购于ATCC细胞库，培养条件：90％RPMI-1640含10％FBS，培养于恒温37℃，5％CO2的孵箱。
1.2试剂及耗材
1.2.1质粒构建相关试剂：
Figure BDA0003223949210000071
Max DNA Polymerase(Takara)、T4 DNA ligase(Takara)、PCR引物、AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(Axygen)、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Axygen)、AxyPrep质粒中量制备试剂盒(Axygen)、Reverse-trans-scribed with SuperScript III Kit(Takara)、TRIzol(Invitrogen)、Agarose(Coolaber)、限制性内切酶(Takara)、DH5α感受态细胞(生工生物工程(上海)股份有限公司)、DNAmarker(Takara)、GelStain(上海翊圣生物科技有限公司)。
1.2.2细胞培养和病毒包装相关试剂：
DMEM培养基(ThermoFisher)、RPMI-1640培养基(ThermoFisher)、MEM(HyClone)、胎牛血清(Biochrom AG)、细胞冻存液(新赛美生物科技有限公司)、0.25％胰蛋白酶(Gibco)、嘌呤霉素(Invitrogen)、doxycycline(Dox美伦生物MB1088)、Polybrene(sigma)、PAX2、pMD2(实验室保存质粒)、Lipoplus(Sage)、滤器(0.45μm Millipore)、各规格细胞培养皿和培养瓶、离心管、冻存管(Thermo)、Transwell小室(Corning，3422)、基质胶Matrigel(Corning，354234)。
1.2.3Western blot相关试剂：
RIPA细胞/组织裂解液(碧云天)、PMSF(Takara)、Na3VO4磷酸酶抑制剂(Sigma)、Cocktail蛋白酶体抑制剂(Sigma)、BCA法测蛋白浓度试剂盒(碧云天)、5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(新赛美)、30％Acr-Bis(29:1)(碧云天)、过硫酸铵(Amresco)、TEMED(碧云天)、10％SDS(碧云天)、1M Tris-HCl，pH6.8(碧云天)、1.5M Tris-HCl，pH8.8(碧云天)、Triton-x100(Amresco)、Tween-20(Amresco)、预染蛋白marker(ThermoFisher)、10×PBS(Takara)、一抗稀释液(碧云天)、脱脂牛奶(BD)、兔二抗(Jackson 111-035-003)、鼠二抗(Jackson115-035-003)、各规格离心管(Eppendorf)、配胶玻璃板、梳子、滤纸(Bio-rad)、、PVDF膜、化学发光底物(Millipore)、NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4(国药)。
RBMS1(Abcam ab150353)、xCT/SLC7A11(Abcam ab37185)、Vinculin(Proteintech66305-1-Ig)、GAPDH(Proteintech 60004-1-Ig)、ACSL4(SANTA sc-271800)、AIFM2(Proteintech 20886-1-AP)、GPX4(Proteintech 67763-1-Ig)。
1.2.4其他试剂
erastin(简写Era)(AbMole M2679)、Ferrostatin-1(简写Ferr-1)(Sigma-Aldrich SML0583)，DAB显色剂(中杉金桥ZLI-9017)，组织芯片(芯超，OD-CT-RsLug01-007肺癌)
1.3仪器和设备
梯度PCR仪(ABVeriti 96 well Thermal Cycler)、恒温细胞培养箱(ThermoFisher)、酶标仪(TECAN)、高速冷冻离心机(Eppendorf)、生物安全柜(ThermoFisher)、凝胶成像仪(Tanon)、垂直电泳槽(Bio-Rad)、转膜槽(Bio-rad)、化学发光成像系统(SAGECREATION)、Nanodrop2000c(Thermo Scientific)、微量移液器(Eppendorf)、常温离心机(安徽中科中佳)、多功能酶标仪(Perkin Elmer)、流式细胞仪(BD)、-80℃超低温冰箱(Thermo Scientific)、微波炉(Midea)、脱色摇床(大连竞迈生物科技有限公司)、恒温金属浴(上海一恒)。
1.4常用溶液配制
1.4.1 10×SDS-PAGE电泳缓冲液(1L)：称取Tris-base：30.3g；Glycine 144g；SDS10g，溶于ddH2O，充分搅拌溶解，定容至1000mL。
1.4.2 10×转膜缓冲液：称取30.3gTris-base、144g甘氨酸溶于800mL蒸馏水，磁力搅拌器上使其充分溶解，定容至1L，置于室温备用。使用前稀释为1×并补充20％甲醇，置于4℃保存备用。
1.4.3 LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶于800mL蒸馏水中，充分溶解后，加入NaOH调节pH至7.0，定容至1L。高温高压蒸汽灭菌，置于4℃保存备用。
1.4.4 Amp固体培养板：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，7.5g Agar溶于800mL蒸馏水中，充分溶解后，加入NaOH调节pH至7.0，定容至1L。高温高压蒸汽灭菌，待温度降至50℃加入1mL Amp，混匀倒板。冷凝后置于4℃保存备用。
2.方法
2.1质粒构建
2.1.1引物设计与扩增
RBMS1基因shRNA引物和SLC7A11过表达质粒引物设计如表1，空载质粒作为对照。引物合成是由金唯智生物工程有限公司完成。
表1 RBMS1基因shRNA引物和SLC7A11过表达质粒引物
Figure BDA0003223949210000081
2.1.2载体酶切及连接
1)pLKO.1-RBMS1-sh1、pLKO.1-RBMS1-sh2与pLKO-Tet-ON-RBMS1-sh1载体构建：
a)寡核苷酸退火：分别加入去离子水溶解引物，使各引物终浓度为10μM。于1.5mLEP管内按照下表所示反应体系配制反应体系。在烧杯内倒入800mL温度为95℃的水，将EP管用浮漂装载置放入烧杯中，烧杯中置入温度计显示水温，放于实验台上，缓慢降温至室温。反应体系如表2。
表2反应体系
Figure BDA0003223949210000091
备注：pLKO.1-RBMS1-sh1使用的引物为RBMS1 shN1-F和RBMS1sh1-R；
pLKO.1-RBMS1-sh2用的引物为RBMS1 shN2-F和RBMS1 shN2-R；
pLKO.1-Tet-ON-RBMS1-sh1使用的引物为RBMS1 shN1-F和RBMS1sh1-R。
b)酶切plKO.1载体/pLKO-Tet-ON载体(均购自Addgene)：首先进行AgeⅠ酶切，反应体系如表3。
表3 AgeⅠ酶切酶切反应体系
Figure BDA0003223949210000092
上述产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收，接着用EcoRⅠ酶切，体系如表4。
表4 EcoRⅠ酶切反应体系
Figure BDA0003223949210000093
然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收并纯化，得到最终连接用产物。
c)连接，体系见表5：
表5连接体系
Figure BDA0003223949210000094
构建得到pLKO.1-RBMS1-sh1、pLKO.1-RBMS1-sh2与pLKO-Tet-ON-RBMS1-sh1载体。
2)SLC7A11过表达载体构建
a)SLC7A11目的基因的获得，如表6：
表6 SLC7A11扩增体系
Figure BDA0003223949210000095
Figure BDA0003223949210000101
PCR反应条件：98℃10分钟；98℃10秒，55℃15秒，72℃15秒，35个循环；72℃10分钟。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并确定目的基因分子量大小，进行切胶回收。
b)酶切pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(购自Addgene)载体和基因片段
首先进行NheⅠ酶切，反应体系如表7：
表7 NheⅠ酶切反应体系
Figure BDA0003223949210000102
上述产物进行PCR回收，后继续用NotⅠ酶切，体系如表8：
表8 NotⅠ酶切体系
Figure BDA0003223949210000103
后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收并纯化，得到最终连接用产物。
c)连接：将酶切好的载体与片段进行连接，16℃连接3h，连接体系如表9。
表9连接体系
Figure BDA0003223949210000104
构建得到pCDH-SLC7A11载体。
2.1.3质粒转化与扩增
1)混合孵育：将2.1.2获得的pLKO.1-RBMS1-sh1、pLKO.1-RBMS1-sh2、pLKO-Tet-ON-RBMS1-shRNA、pCDH-SLC7A11连接产物5μL分别加入到50μLTrans5a感受态中，轻弹混匀，冰上放置30分钟。
2)热激：42℃水浴热激45秒后，冰上2分钟。
3)培养：加入不含抗生素的500μl的LB液体培养基，37℃摇床培养1h。
4)涂板：室温短暂离心，弃上清保留约100μL，用移液器吹打混匀沉淀加到含氨苄青霉素的LB固体琼脂板上，用灭菌的玻璃珠混匀菌液，20分钟后，37℃培养箱倒置培养过夜。
5)挑单菌落：12-16小时后出现菌落说明连接转化成功。用无菌枪头挑取菌落，加入含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床150rpm摇菌过夜。
6)质粒抽提：构建的pLKO.1-RBMS1-sh1、pLKO.1-RBMS1-sh2、pLKO-Tet-ON-RBMS1-shRNA、pCDH-SLC7A11质粒采用QIAGEN Plasmid MiniKits进行质粒抽提、纯化。然后委托苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序结果表明测序序列正确，载体构建成功。
2.2细胞培养
H1299肺癌细胞系：RPMI-1640培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO2培养箱中培养。A549肺癌细胞系：F-12K培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO2培养箱中培养。每2-3天换液并观察细胞状况，但细胞生长密度达到90％时弃去培养基，加入0.25％胰酶溶液，37℃放置1-2分钟，加入培养基终止消化，1000rpm离心3分钟，用新的培养基重悬细胞并均匀分到2-4个10cm培养皿中。
2.3稳定细胞系构建
2.3.1慢病毒制备
1)准备细胞：转染前24h，将适量的HEK-293T细胞接种至10cm培养皿，保证第二天转染时细胞密度达到80～90％，用含10％FBS新鲜的DMEM完全培养基培养。
2)转染：配制DNA混合液，将10μgpLKO.1-RBMS1 shN1或pLKO.1-RBMS1 shN2或pLKO-Tet-ON-RBMS1-sh1或PCDH-SLC7A11以及对应的空载质粒分别与7.5μgpPAX2、2.5μgpMD2慢病毒包装质粒溶于1.5mLOpti-MEM培养基中，混合均匀。配制脂质体溶液，将60μL转染试剂Lipoplus和1.5mLOpti-MEM混合均匀，室温静置5分钟。然后将脂质体溶液加入到DNA混合液中，轻轻混匀，室温静置20分钟后加入HEK-293T细胞中，轻轻摇匀。
3)收集病毒：转染12～16h后，将转染后的HEK293T细胞传至15cm细胞培养皿中，用含10％FBS新鲜的DMEM完全培养基培养。培养48小时后，收集培养皿内培养基到15mL离心管中，1500rpm离心5分钟。用0.45μm滤膜过滤离心管内离心得到的上清液，即为含病毒颗粒的培养基，分装至无菌EP管，-80℃保存。
2.3.2慢病毒感染及筛选
1)准备细胞：感染前24小时，将H1299(或A549)细胞接种至6孔板，保证转染时细胞密度达到70～80％。
2)换液：转染时，弃尽原培养液，加入1mLRPMI1640培养基(A549使用F-12K培养基)。
3)加病毒液：将1mL的病毒液加入六孔板内的培养基中，加入促转染剂polybrene(终浓度8μg/mL)，混匀放入孵箱培养。转染24小时后，将含有病毒的培养液倒入含有84的废液桶中，并将细胞传至10cm皿培养。
4)筛选感染pLKO.1-RBMS1 shN1或pLKO.1-RBMS1 shN2及pLKO.1空载的慢病毒的细胞：传代24小时左右，待细胞密度达到70～80％，用含浓度为5μg/mL嘌呤霉素的10％FBSRPMI 1640(A549细胞使用F-12K)培养基培养。维持嘌呤霉素5μg/mL，连续培养5天。
筛选感染pLKO-Tet-ON-RBMS1-sh1慢病毒的H1299细胞：传代24小时左右，待细胞密度达到70～80％，用含浓度为5ug/ml嘌呤霉素的10％FBS RPMI 1640培养基筛选5天。
5)验证、冻存：收集适量pLKO.1-RBMS1 shN1或pLKO.1-RBMS1 shN2慢病毒感染的H1299细胞和A549细胞与对照组细胞(pLKO.1空载病毒感染的H1299和A549细胞)，提取蛋白，Western blot验证pLKO.1-RBMS1sh1/sh2慢病毒感染的H1299细胞和A549细胞与对照组细胞(pLKO.1空载病毒感染的H1299和A549细胞)相比，RBMS1表达水平明显下降，表明敲低RBMS1的H1299和A549稳转细胞构建成功(H1299：图3中的A；A549：图4中的A)。
pLKO-Tet-ON-RBMS1-sh1慢病毒感染的H1299细胞，加入2μg/mL doxycycline诱导48小时，收蛋白，Western blot验证doxycycline诱导后与不诱导的H1299相比，RBMS1蛋白表达水平明显下降，表明doxycycline诱导敲降RBMS1的H1299细胞构建成功(图5中的A)。
2.4蛋白质免疫印迹(Western blot实验)
2.4.1提取细胞总蛋白及浓度定量
取对数生长期细胞置于冰上，用PBS清洗3遍，加入适量RIPA裂解液(提前加入Na3VO4磷酸酶抑制剂及Cocktail蛋白酶抑制剂)，用细胞刮刀收集细胞转入1.5mL离心管中，冰上裂解30分钟，期间多次震荡，使其充分裂解。然后4℃12000rpm离心15分钟，取上清进行蛋白定量或-80℃保存备用。蛋白定量采用BCA法，按照试剂盒说明书操作。
2.4.2聚丙烯酰胺凝胶电泳
制胶：配制10％的下层分离胶(30％聚丙烯酰胺、pH8.8Tris-HCl、10％APS、10％SDS、TEMED)和5％的上层浓缩胶(30％聚丙烯酰胺、pH6.8Tris-HCl、10％APS、10％SDS、TEMED)，凝固后拆下凝胶玻璃板，拔出梳子，蒸馏水冲洗胶孔去除残留胶粒。将玻板固定于电泳装置内，加入预冷的电泳缓冲液，并用移液枪再次吹打每个胶孔。取20-30μg细胞总蛋白，加入上样缓冲液，混合均匀，95℃煮5分钟，使其充分变性。冷却并离心，缓慢加入上样孔。浓缩胶阶段80V电泳20分钟后，调节电压至100V至溴酚蓝移动到玻板最底部，电泳结束。
2.4.3蛋白质转移至NC膜
采用Bio-rad湿转装置，槽子内从下到上顺序依次为两层网格板，负极板，一层网格板，三层海绵，滤纸，SDS-PAGE胶，NC膜，滤纸，两层海绵，一层网格板，正极板，塑料板放入转膜的槽子内上，使用电压0.8A转膜90分钟。
2.4.4封闭、抗体孵育、显色
将转膜后的NC膜置于封闭液(含5％脱脂奶粉的PBS溶液)中，室温封闭1小时。根按照抗体使用说明书用3％BSA的PBST溶液稀释一抗，4℃过夜孵育。用PBST(1×PBS中加入0.1％Tween-20)洗3次，每次5分钟。按照抗体使用说明书用3％BSA的PBST溶液稀释相应二抗，室温孵育1h。然后用TBST洗膜3次，每次5分钟。使用ECL发光试剂盒中的A液和B液等量混合，并将混合液均匀滴加的PVDF膜上。室温作用2分钟，用化学发光成像系统(SAGECREATION)检测特异性条带。
2.5免疫组织化学染色(immunohistochemistry，IHC，简称免疫组化)(对应图1中的B-图1中的D)
对60对人肺癌组织(NSCLC)及邻近正常组织(Normal)进行RBMS1免疫组织组化学染色(肺癌组织n＝60，邻近正常组织n＝60)，RBMS1表达水平根据免疫组化染色被划分为三个等级弱阳性/阴性(weak positive/negative)、强阳性(strong positive)、超强阳性(extra-strong positive)，统计结果表明RBMS1在肺癌患者癌组织中表达水平更高。使用通用SP试剂盒(北京中杉金桥，SP9000)具体步骤如下：
2.5.1脱蜡水化：石蜡切片浸入二甲苯I、II各5分钟。取出切片置于100％乙醇I、II→95％乙醇→70％乙醇→50％乙醇各2分钟。用PBS冲洗三次，每次3分钟。
2.5.2抗原修复：(1)切片置于0.01Msodiumcitrate中高档微波5分钟，取出室温放置20分钟不开盖，再将修复液放置于中高档微波3分钟，室温放置15分钟开盖，PBS冲洗三次，每次3分钟。
2.5.3清除内源性过氧化氢酶：切片组织上滴加3％H2O2(PBS)室温30分钟，PBS冲洗三次，每次5分钟。
2.5.4使用如下配方的配制封闭液封闭组织1小时：
Blockingbuffer 共30mL
goatserum 3mL
BSA 0.9g3％
PBS 27mL
TritonX-100 30μL1‰
2.5.5 RBMS1一抗孵育：封闭液配制RBMS1一抗(1：50)，4℃湿盒中过夜(用封口膜盖上)，Blockingbuffer用PBS1：10稀释后洗3次，每次10分钟。
2.5.6二抗孵育，滴加1滴二抗B液到组织上，室温孵育1小时，然后PBS洗三次，每次5分钟。
2.5.7滴加1滴抗试剂盒C液到组织上，室温孵育1小时，然后PBS洗三次，每次5分钟。
2.5.8 DAB显色，滴加新鲜配制的显示剂DAB工作液，室温孵育3-5分钟，镜下观察控制显色时间，显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显示。
2.5.9苏木精染核：苏木精染色3分钟，自来水冲洗，然后PBS冲洗。
2.5.10脱水、透明、封片：50％-100％逐级酒精脱水，每级3分钟，最后置于二甲苯透明两次，每次5分钟。滴加中性树脂封片。
2.6细胞生长曲线测定
取对数生长期细胞用胰酶消化后离心，用培养液重悬，进行细胞计数。以每孔5000个细胞的浓度接种于24孔板中，每种作为第0天，细胞接种3个复孔，于37℃培养箱中培养过夜，从第二天开始计数，每天(或每隔一天)数一次记录细胞数目做出生长曲线图。
2.7平板克隆实验
取对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液。将细胞悬液梯度倍数稀释后计数，取1000个细胞接种到10cm培养皿中，置于37℃，5％CO2孵箱内，培养2周左右时间，期间每隔3天更换新鲜培养基。观察细胞，当培养皿内出现肉眼可见的克隆，弃去培养液，PBS清洗2次。加入4％多聚甲醛，室温固定15分钟。弃固定液，PBS清洗1次，加入0.1％结晶紫染15分钟。流水缓慢洗去染色液，倒扣培养皿室温干燥。拍照并统计克隆数目。
2.8 Transwell细胞迁移、侵袭实验(对应图6)
在24孔板中放入Transwell小室(侵袭实验放入事先铺有Matrigel的小室)，缓慢加入600μL含20％血清的培养基，取对数生长期的pLKO.1-RBMS1-sh1敲低的H1299及pLKO.1空载的H1299细胞消化成细胞悬液，加入无血清培养基重悬，用细胞计数仪进行计数。迁移实验和侵袭实验每孔均匀加入含5万个细胞的悬液，迁移实验37℃培养箱培养17小时，侵袭实验37℃培养箱培养30小时。结晶紫染色，用棉签去除上层未迁移的细胞，最后在显微镜下观察并拍照，利用ImageJ软件计算迁移的细胞数。
2.9裸鼠皮下移植瘤实验
选取4-6周龄裸鼠，进行随机分组。
RBMS1敲降体内验证实验：利用pLKO-Tet-ON-RBMS1-sh1构建的Dox诱导RBMS1敲降的稳转细胞系，按照3×106/100μL/只的细胞量接种到裸鼠腋窝侧表皮下面，注射完后敲降组裸鼠饮水改为含2mg/mLDox，5％蔗糖的水(锡箔纸包裹避光)，对照细胞的裸鼠饮水换为含5％蔗糖的水，在接种完细胞一周后开始观察皮下成瘤情况，肿瘤大小测量为每隔2天一次，用游标卡尺测量皮下肿瘤最长直径(L)和垂直方向最大横径(W)，根据公式计算肿瘤体积：V＝L×W2/2。(对应图5)
RBMS1敲降SLC7A11功能回复实验分为3组。利用稳转细胞经消化计数后用无血清培养基重悬，按照2.5×106/100μl/只的细胞量接种到裸鼠腋窝侧表皮下面，在接种完细胞一周后开始观察皮下成瘤情况，肿瘤大小测量为每隔2天一次，用游标卡尺测量皮下肿瘤最长直径(L)和垂直方向最大横径(W)，根据公式计算肿瘤体积：V＝L×W2/2。(对应图13)
2.10 GSH水平测定(对应图8)
GSH水平通过GSH-Glo Glutathione Assay试剂盒(Promega)检测，在96孔板中铺6000个细胞每孔，第二天移走培养基，每孔加入100uL1×GSH-GLO Reagent试剂，轻轻拍打混匀，室温孵育30分钟。然后，每孔加入100μL reconstituted Luciferin DetectionReagent，轻轻拍打混匀，室温孵育15分钟。用多功能酶标仪检测荧光信号。
2.11脂质过氧化实验(对应图9)
脂质过氧化实验通过BODIPY 581/591 C11来检测，它是一种亲脂染料，能积累在细胞膜内，用488nm和568nm激发光激发，将检测到530nm和590nm发射光(红色荧光)，当染料被氧化后，发射光将从590nm迁移到510nm(绿色荧光)，与膜的脂质过氧化水平成正比，通过流式细胞仪来分析。
取对数生长期细胞用胰酶消化后离心，用培养液重悬，进行细胞计数。以每孔1×105个细胞的浓度接种于6孔板中，每种细胞接种3个复孔，于37℃培养箱中培养过夜。次日，用5μMBODIPY581/591C11(D3861，Thermo Fisher)处理细胞，37℃30分钟。然后1mL1×PBS洗两遍，用胰酶消化细胞，收集到EP管中，离心得到细胞沉淀，1×PBS洗两遍后用500μLPBS重悬。用流式细胞仪检测荧光的变化。
2.12细胞死亡检测(对应图10)
为了检测细胞死亡，在12孔板中铺pLKO.1-RBMS1-sh1敲低的H1299及pLKO.1空载的H1299细胞(或pLKO.1-RBMS1-sh1敲低的A549及pLKO.1空载的A549细胞)，第二天分为三组分别处理：第一组(对照组-Era)：不加erastin，第二组(+Era)：添加erastin组，第三组(+Era+Ferr-1)：+erastin+Ferrostatin-1(Ferr-1)(2μM)。其中H1299细胞使用的erastin浓度为3μM，处理时间16.5小时，A549细胞使用的的erastin浓度为10μM。胰酶消化细胞，得到细胞沉淀并用PBS重悬。取100μL细胞悬液和200μL0.02％台盼蓝混匀染色1分钟后用计数仪计数，得到死细胞的比例。
2.13统计学分析
用GraphPad Prism8.0软件对实验结果进行整理和统计分析。计量资料用平均数±标准差(Mean±SEM)表示。用t检验对连续资料的两样本进行比较。One-way ANOVA进行多组样本的比较。利用Kaplan-Meier曲线分析影响因子与与总体生存的关系，用log-rank检验分析两组间差异。所有分析结果P<0.05时认为差异有统计学意义，P<0.01时认为差异有显著统计学意义
实施例1
RBMS1高表达的肺癌患者总生存期更短
图1为RBMS1在肺癌患者组织中的表达情况。通过蛋白质免疫印迹分析7例肺癌患者正常组织与肿瘤组织RBMS1表达情况，图1中的A是western blot检测RBMS1在肺癌患者正常组织(N)与癌组织(T)中的表达情况图，结果表明RBMS1在肺癌组织中高表达；对60对人肺癌组织(NSCLC)及邻近正常组织(Normal)进行RBMS1免疫组织化学染色(肺癌组织n＝60，邻近正常组织n＝60)，RBMS1表达水平根据免疫组化染色被划分为三个等级弱阳性/阴性(weak positive/negative)、强阳性(strongpositive)、超强阳性(extra-strongpositive)；图1中的B是应用免疫组织化学方法检测RBMS1在人肺癌组织(NSCLC)及邻近正常组织(Normal)中的表达情况的代表图，在肺癌组织中RBMS1染色更深，表明RBMS1在肺癌组织中表达比正常组织中高。图1中的C是统计RBMS1在人肺癌组织(NSCLC)及邻近正常组织(Normal)免疫组化结果(肺癌组织n＝60，邻近正常组织n＝60)，RBMS1表达水平根据免疫组化染色被划分为三个等级弱阳性/阴性(weak positive/negative)、强阳性(strongpositive)、超强阳性(extra-strong positive)，统计结果表明RBMS1在肺癌患者癌组织中表达水平更高。图1中的D是RBMS1表达水平与肺癌患者总生存期的相关性。结果表明RBMS1在肺癌患者癌组织中表达水平更高，且RBMS1高表达(High RBMS1)的肺癌患者总生存期更短(P＝9.7×10-3)，RBMS1低表达(Low)肺癌患者生存期更长。
实施例2
敲低RBMS1抑制肺癌细胞体外和体内增殖
对两株肺成纤维细胞(MRC5和HFL1)以及六株肺癌细胞(A549、H460、H2170、H1299、H358、H446)进行了RBMS1蛋白水平的检测，图2是通过western blot检测RBMS1在不同细胞系中的蛋白表达量结果图；图中，MRC5和HFL1为正常人肺成纤维细胞，A549、H460、H2170、H1299、H358、H446为人肺癌细胞系，GAPDH作为内参。结果表明：与人正常肺成纤维细胞相比，RBMS1的蛋白表达量在肺癌细胞系中呈高表达。
在H1299和A549肺癌细胞中构建RBMS1低表达的稳定细胞系，共设计了两条shRNA，通过pLKO.1-RBMS1-sh1与pLKO.1-RBMS1-sh2慢病毒系统感染H1299和A549成功构建RBMS1稳定敲低细胞系及对照组细胞系(pLKO.1空载)。图3是利用pLKO.1-RBMS1-sh1/2敲低RBMS1抑制H1299肺癌细胞增殖能力结果图；其中A图是通过western blot检测利用pLKO.1-RBMS1-sh1/2敲低H1299细胞RBMS1(RBMS1 shN1，RBMS1 shN2)的效果验证，pLKO.1空载细胞作为对照(Empty Vector)，GAPDH作为内参；结果表明与对照组细胞相比，RBMS1在RBMS1shN1和sh2细胞中低表达，表明敲低RBMS1的H1299稳转细胞构建成功；B图是敲低RBMS1对细胞生长曲线的影响，以每孔5000个细胞的浓度接种于24孔板中，作为第0天，每种细胞接种3个复孔，从第二天开始计数，每天数一次记录细胞数目做出生长曲线图，结果表明敲低RBMS1抑制H1299细胞生长。C图是敲低RBMS1对H1299肺癌细胞平板克隆形成能力的影响，敲低RBMS1后克隆显著减少，表明敲低RBMS1抑制H1299细胞克隆形成能力。
图4是利用pLKO.1-RBMS1-sh1/2敲低RBMS1对A549肺癌细胞增殖能力的影响；其中A图是通过western blot检测利用pLKO.1-RBMS1-sh1/2敲低A549细胞RBMS1(RBMS1 shN1，RBMS1 shN2)的效果验证，pLKO.1空载细胞作为对照(Empty Vector)，GAPDH作为内参，结果表明与对照组细胞相比，RBMS1在RBMS1 shN1和sh2细胞中低表达，表明敲低RBMS1的A549稳转细胞构建成功。B图是敲低RBMS1对细胞生长曲线的影响，以每孔5000个细胞的浓度接种于24孔板中，作为第0天，每种细胞接种3个复孔，从第二天开始计数，每隔一天数一次记录细胞数目做出生长曲线图，结果表明敲低RBMS1抑制A549细胞生长。C图是敲低RBMS1对A549肺癌细胞平板克隆形成能力的影响，敲低RBMS1后克隆显著减少，表明敲低RBMS1抑制A549细胞克隆形成能力。
综上，图3中的A和图4中的A是在肺癌细胞中敲低RBMS1的验证。进一步通过生长曲线实验表明敲低RBMS1能够明显抑制肺癌细胞的生长(图3中的B和图4中的B)。平板克隆实验表明敲降RBMS1能够明显抑制H1299和A549细胞的克隆形成能力(图3中的C和图4中的C)。
此外，利用Teton系统在H1299细胞里构建Dox诱导RBMS1敲降的稳转细胞系(pLKO.1-Tet-On-RBMS1-sh1)。图5是利用pLKO.1-Tet-On-RBMS1-sh1载体在H1299细胞中敲低RBMS1对裸鼠皮下移植瘤生长的影响结果图；其中，A图为western blot检测通过pLKO.1-Tet-On-RBMS1-sh1载体构建的Dox诱导的H1299稳转细胞RBMS1的表达情况，即敲降效率的验证，按照3×106个细胞/只细胞量接种到4周龄裸鼠皮下，并通过2mg/mL Dox进行诱导表达，结果表明，与未加Dox的对照组相比，2μg/mL Dox处理48小时后细胞中RBMS1表达明显下降，表明Dox诱导的H1299稳转细胞构建成功；B图是Dox诱导敲低RBMS1对裸鼠皮下移植瘤生长的影响结果，利用pLKO-Tet-ON-RBMS1-sh1构建的Dox诱导RBMS1敲降的稳转细胞系，按照3×106/100μL/只的细胞量接种到裸鼠皮下，注射完后敲降组裸鼠饮水改为含2mg/mLDox，5％蔗糖的水(锡箔纸包裹避光)，对照细胞的裸鼠饮水换为含5％蔗糖的水，在接种完细胞一周后开始观察皮下成瘤情况，32天后取瘤拍照，结果表明Dox诱导RBMS1敲降后抑制裸鼠皮下移植瘤的生长；C图是B图中裸鼠皮下移植瘤的重量统计图，结果表明Dox诱导RBMS1敲降后抑制裸鼠皮下移植瘤的重量；D图是裸鼠皮下移植瘤的体积，注射一周后每隔2天测一次，用游标卡尺测量皮下肿瘤最长直径(L)和垂直方向最大横径(W)，根据公式计算肿瘤体积：V＝L×W2/2。实验结果表明Dox诱导RBMS1敲降抑制裸鼠皮下移植瘤体积的大小。综上，Dox诱导的H1299稳转细胞构建成功，与对照组(-Dox)相比，敲降RBMS1(+Dox)的裸鼠皮下肿瘤大小和重量受到明显抑制，肿瘤生长速度也更加缓慢。
实施例3
敲低RBMS1抑制肺癌细胞迁移和侵袭
利用pLKO.1-RBMS1-sh1敲低RBMS1的稳转细胞系，通过transwell(不铺基质胶与铺基质胶)实验探究RBMS1对肺癌细胞迁移和侵袭的影响。图6是通过transwell实验检测RBMS1对H1299肺癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响结果图；其中，A图是通过Transwell(无基质胶)实验检测敲低RBMS1对H1299肺癌细胞迁移能力的影响，在24孔板中放入Transwell小室，向下室中缓慢加入600μL含20％血清的培养基，取对数生长期的pLKO.1-RBMS1-sh1敲低的H1299及pLKO.1空载的H1299细胞消化成细胞悬液，加入无血清培养基重悬，用细胞计数仪进行计数。每孔均匀加入含5万个细胞的悬液，迁移实验37℃培养箱培养17小时，用结晶紫染色；B图是迁移效率的统计图，结果表明敲低RBMS1显著抑制H1299肺癌细胞的迁移能力；C图是通过Transwell(有基质胶)实验敲低RBMS1对H1299肺癌细胞侵袭能力的影响，在24孔板中放入Transwell小室，加入1：30稀释的Matrigel，置37℃1小时使Matrigel聚合成凝胶，向下室中缓慢加入600μL含20％血清的培养基，取对数生长期的pLKO.1-RBMS1-sh1敲低的H1299及pLKO.1空载的H1299细胞消化成细胞悬液，加入无血清培养基重悬，用细胞计数仪进行计数。每孔均匀加入含5万个细胞的悬液，侵袭实验37℃培养箱培养30小时，用结晶紫染色；D图是侵袭效率的统计图，结果表明敲低RBMS1显著抑制H1299肺癌细胞的侵袭能力。综上，RBMS1敲低能显著抑制H1299肺癌细胞的迁移(转移)和侵袭能力。
实施例4
敲低RBMS1通过调控SLC7A11的表达促进细胞铁死亡
图7是western blot检测RBMS1敲低(pLKO.1-RBMS1-sh1和pLKO.1-RBMS1-sh2)对SLC7A11、ACSL4、AIFM2和GPX4蛋白表达的影响图；western blot检测结果显示敲降RBMS1抑制SLC7A11的蛋白表达，而对铁死亡通路中的其他关键分子ACSL4、AIFM2、GPX4没有影响；其中A图为H1299细胞中敲低RBMS1对SLC7A11、ACSL4、AIFM2和GPX4蛋白表达的影响，westernblot检测结果显示敲降RBMS1抑制SLC7A11的蛋白表达，而对铁死亡通路中的其他关键分子ACSL4、AIFM2、GPX4没有影响；B图为A549细胞中敲低RBMS1对SLC7A11、ACSL4、AIFM2和GPX4蛋白表达的影响，western blot检测结果显示敲降RBMS1抑制SLC7A11的蛋白表达，而对铁死亡通路中的其他关键分子ACSL4、AIFM2、GPX4没有影响。
图8是通过GSH-Glo Glutathione Assay试剂盒检测敲低RBMS1(pLKO.1-RBMS1-sh1和pLKO.1-RBMS1-sh2)对H1299细胞内谷胱甘肽(GSH)水平的影响，GSH水平测定结果显示敲低RBMS1显著抑制H1299细胞内GSH的水平。
图9是通过BODIPY 581/591C11探针检测敲低RBMS1(pLKO.1-RBMS1-sh1和pLKO.1-RBMS1-sh2)对H1299细胞脂质过氧化的影响，结果显示敲降RBMS1能够增加绿色荧光信号，表明敲降RBMS1能够增加细胞脂质过氧化的水平。
图10是敲低RBMS1对铁死亡诱导剂erastin(Era)诱导细胞铁死亡的影响；A图是对照组(不加erastin，-Era)、3μMerastin(+Era)组、以及erastin(3μM)+Ferrostatin-1(Ferr-1)(2μM)(+Era+Ferr-1)组分别处理敲低RBMS1的H1299(pLKO.1-RBMS1-sh1和pLKO.1-RBMS1-sh2)及对照组H1299细胞(pLKO.1空载，Empty Vector)16.5小时然后检测细胞死亡比例，结果表明敲低RBMS1细胞在erastin处理后细胞死亡比例更高，表明敲低RBMS1能够促进erastin诱导细胞铁死亡，当erastin处理的细胞同时添加铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Ferr-1)(2μM)则能阻断erastin诱导的铁死亡；B图是对照组(不加erastin，-Era)、10μMerastin(+Era)组、以及erastin(10μM)+Ferrostatin-1(Ferr-1)(2μM)(+Era+Ferr-1)组分别处理敲低RBMS1的A549(pLKO.1-RBMS1-sh1和pLKO.1-RBMS1-sh2)及对照组A549细胞(pLKO.1空载，Empty Vector)22小时然后检测细胞死亡比例，结果表明敲低RBMS1细胞在erastin处理后细胞死亡比例更高，表明敲低RBMS1能够促进erastin诱导细胞铁死亡，当erastin处理的细胞同时添加铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Ferr-1)(2μM)则能阻断则能阻断RBMS1敲低对erastin诱导的铁死亡的敏感性。
图11是敲低RBMS1回复SLC7A11对H1299细胞生长的影响；其中A图是western blot检测H1299稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1+ControlVector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载))、H1299稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1)中再过表达SLC7A11(pCDH-SLC7A11)及对照组细胞(Empty Vector(pLKO.1空载)+Control Vector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载))中SLC7A11和RBMS1蛋白表达量，结果显示RBMS1在H1299稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1+Control Vector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载))、H1299稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1)中再过表达SLC7A11(pCDH-SLC7A11)细胞中表达下调，表明敲降成功。SLC7A11在H1299稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1)中再过表达SLC7A11(pCDH-SLC7A11)细胞中明显升高，表明过表达成功；B图是生长曲线实验检测敲低RBMS1过表达SLC7A11对细胞生长曲线的影响。结果表明敲低RBMS1抑制H1299细胞生长，而在敲低RBMS1细胞中过表达SLC7A11能够部分回复细胞的生长；C图是通过平板克隆检测敲低RBMS1过表达SLC7A11对细胞平板克隆形成能力的影响，结果显示敲低RBMS1抑制H1299细胞克隆形成能力，而在敲低RBMS1细胞中过表达SLC7A11能够部分回复细胞克隆形成能力。
图12是敲低RBMS1回复SLC7A11对A549细胞生长的影响。其中A图是western blot检测A549稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1+ControlVector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载))、A549稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1)中再过表达SLC7A11(pCDH-SLC7A11)及对照组细胞(Empty Vector(pLKO.1空载)+Control Vector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载))中SLC7A11和RBMS1蛋白表达量，结果显示RBMS1在A549稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1+Control Vector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载))、A549稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1)中再过表达SLC7A11(pCDH-SLC7A11)细胞中表达下调，表明敲降成功。SLC7A11在A549稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1)中再过表达SLC7A11(pCDH-SLC7A11)细胞中明显升高，表明过表达成功；B图是生长曲线实验检测敲低RBMS1过表达SLC7A11对细胞生长曲线的影响；结果表明敲低RBMS1抑制A549细胞生长，而在敲低RBMS1细胞中过表达SLC7A11能够部分回复细胞的生长；C图是通过平板克隆检测敲低RBMS1过表达SLC7A11对细胞平板克隆形成能力的影响，结果显示敲低RBMS1抑制A549细胞克隆形成能力，而在敲低RBMS1细胞中过表达SLC7A11能够部分回复细胞克隆形成能力。
图13是在敲低RBMS1回复SLC7A11检测对裸鼠皮下移植瘤生长的影响；A图是western blot检测H1299稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1+ControlVector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载))、H1299稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1)中再过表达SLC7A11(pCDH-SLC7A11)及对照组细胞(Empty Vector(pLKO.1空载)+Control Vector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载))中SLC7A11和RBMS1蛋白表达量，结果显示RBMS1在H1299稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1+ControlVector(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro空载))、H1299稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1)中再过表达SLC7A11(pCDH-SLC7A11)细胞中表达下调，表明敲降成功；SLC7A11在H1299稳定敲低RBMS1细胞(pLKO.1-RBMS1-sh1)中再过表达SLC7A11(pCDH-SLC7A11)细胞中明显升高，表明过表达成功；B图是对裸鼠皮下移植瘤生长的影响；利用pLKO.1-RBMS1-sh1构建的H1299稳定敲低RBMS1细胞系，按照2.5×106/100μL/只的细胞量接种到裸鼠皮下，在接种完细胞一周后开始观察皮下成瘤情况，32天后取瘤拍照；结果表明RBMS1敲降后抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，RBMS1敲降后过表达SLC7A11能部分回复裸鼠皮下移植瘤的生长；C图是B图中裸鼠皮下移植瘤的重量统计图，结果表明RBMS1敲降后抑制裸鼠皮下移植瘤的重量，RBMS1敲降后过表达SLC7A11能部分回复裸鼠皮下移植瘤的重量；D图是裸鼠皮下移植瘤的体积，注射一周后每隔2天测一次，用游标卡尺测量皮下肿瘤最长直径(L)和垂直方向最大横径(W)，根据公式计算肿瘤体积：V＝L×W2/2。实验结果表明RBMS1敲降抑制裸鼠皮下移植瘤体积的大小，RBMS1敲降后过表达SLC7A11能部分回复裸鼠皮下移植瘤的体积。
综上，本发明利用western blot检测敲低RBMS1对铁死亡重要调控因子蛋白表达的影响。结果发现，SLC7A11在敲降RBMS1后显著降低，而RBMS1敲降对铁死亡通路中的其他关键分子ACSL4、AIFM2、GPX4没有影响(图7)。SLC7A11(也称为xCT)是xc–系统的亚基，xc–系统是不依赖钠离子的胱氨酸和谷氨酸反向转运蛋白，对于细胞外的胱氨酸转运至细胞内并维持了细胞内正常的谷胱甘肽水平是至关重要的。敲低RBMS1下调细胞内谷胱甘肽(GSH)水平(图8)，而升高细胞内脂质过氧化的水平(图9)。铁死亡诱导剂erastin，可以诱导细胞发生铁死亡，而Ferrostatin-1是铁死亡的抑制剂，pLKO.1-RBMS1-sh1和pLKO.1-RBMS1-sh2敲低RBMS1的H1299和A549细胞在erastin处理后细胞死亡比例更高，表明敲低RBMS1能够促进erastin诱导细胞铁死亡，增加细胞对铁死亡的敏感性。当erastin处理的细胞同时添加铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Ferr-1)则能阻断RBMS1敲低对erastin诱导的铁死亡的敏感性(图10)。
在敲低RBMS1的细胞中回复SLC7A11的表达可以回复细胞的生长及平板克隆形成能力(图11和图12)以及裸鼠皮下移植瘤生长(图13)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 大连医科大学
<120> 下调RBMS1表达的试剂在制备治疗肺癌的药物中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggccacag aacctttatt gtgtactcga gtacacaata aaggttctgt ggtttttg 58
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattcaaaaa ccacagaacc tttattgtgt actcgagtac acaataaagg ttctgtgg 58
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggccatat acctttcaac ctaatctcga gattaggttg aaaggtatat ggtttttg 58
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattcaaaaa ccatatacct ttcaacctaa tctcgagatt aggttgaaag gtatatgg 58
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
actgctagcg tcagaaagcc tgttgtgtcc 30
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actgcggccg ctcataactt atcttcttct gg 32

Claims (4)

1.下调RBMS1表达的试剂在制备治疗肺癌的药物中的应用；所述下调RBMS1表达的试剂为RBMS1基因shRNA。
2.下调RBMS1表达的试剂在制备抑制肺癌细胞生长和/或增殖的药物中的应用；所述下调RBMS1表达的试剂为RBMS1基因shRNA。
3.下调RBMS1表达的试剂在制备抑制肺癌成瘤能力的药物中的应用；所述下调RBMS1表达的试剂为RBMS1基因shRNA。
4.下调RBMS1表达的试剂在制备抑制肺癌细胞转移和/或侵袭的药物中的应用；所述下调RBMS1表达的试剂为RBMS1基因shRNA。
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