CN107937333B - 诱导成纤维细胞分化汗腺细胞培养基及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基及方法，该培养基为细胞基础培养基中添加有终浓度为12～55μg/mL的KGF、终浓度为5～70ng/mL的HGF、终浓度为1～10ng/mL的胰岛素、终浓度为1～20μg/mL的EGF、终浓度为18～55μg/mL的NGF、终浓度为1～7.5×10‑ 7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2～5×10‑4mol/L的腺嘌呤的。本发明通过采用上述特定成分和浓度的培养基，能够直接将单一种类的成纤维细胞诱导分化成汗腺细胞，快捷高效，克服了传统技术需将汗腺细胞与例如干细胞等进行共培养而导致汗腺细胞产量受限的缺陷。

Description

诱导成纤维细胞分化汗腺细胞培养基及方法
技术领域
本发明涉及干细胞分化技术领域，尤其涉及一种诱导成纤维细胞分化汗腺细胞培养基及方法。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，在抵御微生物入侵，紫外线辐射以及防止水分丢失、调节体温方面起重要作用，同时也是免疫系统的组成部分之一。皮肤创伤后的再生以及修复，主要是由邻近、健康的细胞分裂、增殖来实现的。但是大面积的烧伤、广泛瘢痕切除、外伤性皮肤缺损以及皮肤溃疡等导致的严重皮肤缺损，特别是大面积烧伤，伤及皮肤全层及其附属器，仅靠创面自身难以实现皮肤的再生，因而需要足够的皮肤替代物进行修复。虽然目前有很多组织工程产品，但是存在的一个共同问题是均不能重建毛囊、汗腺、皮脂腺等皮肤附属器，降低了皮肤对环境的适应能力，如何实现皮肤的功能重建成为当前创伤修复的研究热点。
随着组织工程学的发展，目前研究表明，模拟汗腺的发生机制来诱导干细胞向汗腺细胞定向分化，可能是重建汗腺的唯一途径。汗腺的发生是一个非常复杂的过程，目前对其形态发生、生长调控及相关基因表达等机制尚未完全明确。而体外诱导干细胞向汗腺分化，能够模拟体内的这一过程，为汗腺重建提供理论基础。
但是，传统的汗腺细胞制备方法中，需要采用汗腺细胞与干细胞进行共培养，不仅加大了研究的工作量，汗腺细胞有限的来源也限制了研究工作的快速发展。
因此，有必要开发一种便捷高效的汗腺细胞的制备方法。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基。
具体的技术方案如下：
一种诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，为细胞基础培养基中添加有终浓度为12～55μg/mL的KGF、终浓度为5～70ng/mL的HGF、终浓度为1～10ng/mL的胰岛素、终浓度为1～20μg/mL的EGF、终浓度为18～55μg/mL的NGF、终浓度为1～7.5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2～5×10-4mol/L的腺嘌呤的。
在其中一些实施例中，该培养基为细胞基础培养基中添加有终浓度为25～35μg/mL的KGF、终浓度为32～38ng/mL的HGF、终浓度为3～7ng/mL的胰岛素、终浓度为7～12μg/mL的EGF、终浓度为25～35μg/mL的NGF、终浓度为3.5～5.5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2～3×10-4mol/L的腺嘌呤的。
在其中一些实施例中，该培养基为细胞基础培养基中添加有终浓度为28～32μg/mL的KGF、终浓度为32～35ng/mL的HGF、终浓度为4.5～5ng/mL的胰岛素、终浓度为9～11μg/mL的EGF、终浓度为28～31μg/mL的NGF、终浓度为4.8～5.3×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2.5～2.8×10-4mol/L的腺嘌呤的。
在其中一些实施例中，该培养基为细胞基础培养基中添加有终浓度为30μg/mL的KGF、终浓度为35ng/mL的HGF、终浓度为5ng/mL的胰岛素、终浓度为10μg/mL的EGF、终浓度为30μg/mL的NGF、终浓度为5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2.5×10-4mol/L的腺嘌呤的。
在其中一些实施例中，所述细胞基础培养基为DMEM。
本发明的另一目的是提供采用上述培养基诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的方法。
一种诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的方法，包括如下步骤：
获取成纤维细胞；
向所述成纤维细胞加入上述的培养基，培养至出现多边形、铺路石样细胞，即获得汗腺细胞。
在其中一些实施例中，所述的获取成纤维细胞，包括：从离体组织样本中分离出成纤维细胞单细胞的步骤、对所得单细胞进行增殖培养获得成纤维细胞的步骤。
在其中一些实施例中，所述增殖培养采用的培养基为细胞基础培养基中添加有终浓度为20～100ng/mL的FGF、终浓度为1～50ng/mL的EGF、终浓度为1～10％的谷氨酰胺、终浓度为25～80ng/mL的胰岛素、终浓度为2～15ng/mL的HGF。
在其中一些实施例中，所述增殖培养采用的培养基为细胞基础培养基中添加有终浓度为40～60ng/mL的FGF、终浓度为20～40ng/mL的EGF、终浓度为6～8％的谷氨酰胺、终浓度为40～55ng/mL的胰岛素、终浓度为10～15ng/mL的HGF。
在其中一些实施例中，从离体组织样本中分离出成纤维细胞单细胞的步骤，包括：
(1)取离体组织样本，无菌条件下，用含8～12％双抗的DMEM反复冲洗；
(2)向步骤(1)冲洗过的离体组织样本中加入0.2～3％的胰酶，放于低温下过夜，次日分离表皮真皮；
(3)用含8～12％双抗的DMEM反复冲洗步骤(2)所得表皮真皮；
(4)将步骤(3)冲洗过的表皮真皮放于无菌生理盐水中并剪成小组织块，700～900g下离心3～7min，收集沉淀；
(5)以所述沉淀3～4倍的体积加入0.2～3％的IV型胶原酶，充分消化；
(6)所述消化后加入DMEM，混匀，过80～120μm的滤网，将所得滤液于280～320g下离心3～7min，所得沉淀即为成纤维细胞单细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过采用上述特定成分和浓度的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，能够直接将单一种类的成纤维细胞诱导分化成汗腺细胞，快捷高效，克服了传统技术需将汗腺细胞与例如干细胞等进行共培养而导致汗腺细胞获得受限的缺陷。
进一步地，本发明通过对培养基组分含量的优化，有益于汗腺细胞分化中均一生长、分化阶段一致，即能够使所得汗腺细胞的形态具有较好的一致性。
另外，本申请还提供了特定配方的成纤维细胞增殖培养基，该培养基与诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基配套使用，能够很好的控制细胞的生长、定向分化和增殖，以便后续获得活力、形态均良好的汗腺细胞。
本发明成纤维细胞的来源为人体离体组织样本，有效避免取血样、骨髓样等不必要的痛苦，同时避免伦理学顾虑，其具有长远的意义。
附图说明
图1为实施例1成纤维细胞流式检测表面标记物的表达情况测试结果图；
图2为实施例1汗腺细胞流式检测表面标记物的表达情况测试结果图；
图3为实施例1成纤维细胞免疫荧光检测情况测试结果图；
图4为实施例1汗腺细胞免疫荧光检测情况测试结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基及方法作进一步详细的说明。
实施例1
一、培养基的制备：
培养基A(成纤维细胞培养基)：细胞基础培养基为H-DMEM，添加有终浓度为55ng/mL的FGF、终浓度为25ng/mL的EGF、终浓度为5％(g/mL)的Glutamine(谷氨酰胺)、终浓度为45ng/mL的胰岛素、终浓度为10ng/mL的HGF，共计500mL。
培养基B(汗腺细胞诱导培养基及维持培养基)：细胞基础培养基为DMEM，终浓度为30μg/mL的KGF、终浓度为35ng/mL的HGF、终浓度为5ng/mL的胰岛素、终浓度为10μg/mL的EGF、终浓度为30μg/mL的NGF、终浓度为5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2.5×10-4mol/L的腺嘌呤，共计500mL。
二、成纤维细胞的分离培养
(1)取3～6岁健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮，无菌条件下，用含10％(g/mL)双抗(100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)的DMEM反复冲洗3次，去除血污并除去皮下结蹄组织；
(2)加入2mL 0.25％(g/mL)胰酶放于冰箱4℃过夜，次日分离表皮真皮；
(3)用含10％(g/mL)双抗(100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)的DMEM反复冲洗3次；
(4)将组织块放于50mL离心管中，加入2mL无菌生理盐水，用无菌弯剪将组织剪成小块，800g下离心5min；
(5)去除上清液，加入沉淀的组织体积量3～4倍的0.25％(g/mL)IV型胶原酶，37℃消化2h，在消化过程中可以适当摇动混悬液，以加快消化进程；
(6)向离心管中加入2mL DMEM，反复吹打组织块，过100μm滤网，制备单细胞悬液；
(7)细胞悬液300g，离心5min，弃去上清，1mL培养基A重悬细胞沉淀，细胞计数以2×106/mL接种量，采用培养基A接种于60cm2的培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔一天换液一次。
三、汗腺细胞的诱导及培养
(1)将上述制备好的成纤维细胞进行传代培养，待其融合度达到80％时，弃去培养基，DMEM洗一次，加入培养基B进行诱导分化；
(2)每天换液，培养5d左右，镜下可观察到多边形、铺路石样的细胞，即为汗腺细胞，继续培养，待其融合度达到90％，可进行传代与增殖。
实施例2
一、培养基的制备：
培养基A(成纤维细胞培养基)：细胞基础培养基为H-DMEM，添加有终浓度为20ng/mL的FGF、终浓度为1ng/mL的EGF、终浓度为1％(g/mL)的Glutamine、终浓度为25ng/mL的胰岛素、终浓度为2ng/mL的HGF，共计500mL。
培养基B(汗腺细胞诱导培养基及维持培养基)：细胞基础培养基为DMEM，添加有终浓度为12μg/mL的KGF、终浓度为5ng/mL的HGF、终浓度为1ng/mL的胰岛素、终浓度为1μg/mL的EGF、终浓度为18μg/mL的NGF、终浓度为1×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2×10-4mol/L的腺嘌呤，共计500mL。
二、成纤维细胞的分离培养
(1)取3～6岁健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮，无菌条件下，用含10％双抗(100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)的DMEM反复冲洗3次，去除血污并除去皮下结蹄组织；
(2)加入2mL 0.25％胰酶放于冰箱4℃过夜，次日分离表皮真皮；
(3)用含10％双抗(100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)的DMEM反复冲洗3次；
(4)将组织块放于50mL离心管中，加入2mL无菌生理盐水，用无菌弯剪将组织剪成小块，800g下离心5min；
(5)去除上清液，加入组织体积量3～4倍的0.25％IV型胶原酶，37℃消化2h，在消化过程中可以适当摇动混悬液，以加快消化进程；
(6)向离心管中加入2mL DMEM，反复吹打组织块，过100μm滤网，制备单细胞悬液；
(7)细胞悬液300g，离心5min，弃去上清，1mL培养基A重悬细胞沉淀，细胞计数以2×106/mL接种量，接种于60cm2的培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔一天换液一次。
三、汗腺细胞的诱导及培养
(1)将上述制备好的成纤维细胞进行传代培养，待其融合度达到80％时，弃去培养基，DMEM洗一次，加入培养基B进行诱导分化；
(2)每天换液，培养5d左右，镜下可观察到多边形、铺路石样的细胞，即为汗腺细胞，继续培养，待其融合度达到90％，可进行传代与增殖。
实施例3
一、培养基的制备：
培养基A(成纤维细胞培养基)：细胞基础培养基为H-DMEM，添加有终浓度为100ng/mL的FGF、终浓度为50ng/mL的EGF、终浓度为10％(g/mL)的Glutamine、终浓度为80ng/mL的胰岛素、终浓度为15ng/mL的HGF，共计500mL。
培养基B(汗腺细胞诱导培养基及维持培养基)：细胞基础培养基为DMEM，终浓度为55μg/mL的KGF、终浓度为70ng/mL的HGF、终浓度为10ng/mL的胰岛素、终浓度为20μg/mL的EGF、终浓度为55μg/mL的NGF、终浓度为7.5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为5×10-4mol/L的腺嘌呤，共计500mL。
二、成纤维细胞的分离培养
(1)取3～6岁健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮，无菌条件下，用含10％双抗(100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)的DMEM反复冲洗3次，去除血污并除去皮下结蹄组织；
(2)加入2mL 0.25％胰酶放于冰箱4℃过夜，次日分离表皮真皮；
(3)用含10％双抗(100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)的DMEM反复冲洗3次；
(4)将组织块放于50mL离心管中，加入2mL无菌生理盐水，用无菌弯剪将组织剪成小块，800g下离心5min；
(5)去除上清液，加入组织体积量3～4倍的0.25％IV型胶原酶，37℃消化2h，在消化过程中可以适当摇动混悬液，以加快消化进程；
(6)向离心管中加入2mL DMEM，反复吹打组织块，过100μm滤网，制备单细胞悬液；
(7)细胞悬液300g下离心5min，弃去上清，1mL培养基A重悬细胞沉淀，细胞计数以2×106/mL接种量，接种于60cm2的培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔一天换液一次。
三、汗腺细胞的诱导及培养
(1)将上述制备好的成纤维细胞进行传代培养，待其融合度达到80％时，弃去培养基，DMEM洗一次，加入培养基B进行诱导分化；
(2)每天换液，培养5d左右，镜下可观察到多边形、铺路石样的细胞，即为汗腺细胞，继续培养，待其融合度达到90％，可进行传代与增殖。
对比例1
本例是实施例1的对比例，对比之处仅在于，采用的培养基A的配方不同，本例的培养基A为现有无血清培养基，具体为：细胞基础培养基为490mL的H-DMEM，添加入5mL的FGS-2(成纤维细胞生长因子)、5mL的P/S(双抗)，共计500mL。
对比例2
本例是实施例1的对比例，对比之处仅在于，采用的培养基A的配方不同，本例的培养基A为现有无血清培养基，具体为：细胞基础培养基为H-DMEM，添加有终浓度为55ng/mL的FGF、终浓度为25ng/mL的EGF、终浓度为5％的谷氨酸终浓度为45ng/mL的皮质醇、终浓度为10ng/mL的HGF，共计500mL。
对比例3
本例是实施例1的对比例，对比之处仅在于，采用的培养基B的配方不同，本例的培养基B为现有培养基，具体为：SG培养基、KGM-2培养基以1：1体积比混合而成的培养基。
对比例4
本例是实施例1的对比例，对比之处仅在于，采用的培养基B的配方不同，本例的培养基B的配方具体为：细胞基础培养基为DMEM，终浓度为30μg/mL的KGF、终浓度为35ng/mL的HGF、终浓度为5ng/mL的皮质醇、终浓度为10μg/mL的EGF、终浓度为30μg/mL的NGF、终浓度为5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2.5×10-4mol/L的腺嘌呤,共计500mL。
对比例5
本例是实施例1的对比例，对比之处仅在于，采用的培养基B的配方不同，本例的培养基B的配方具体为：细胞基础培养基为DMEM，终浓度为35ng/mL的HGF、终浓度为5ng/mL的胰岛素、终浓度为10μg/mL的EGF、终浓度为30μg/mL的NGF、终浓度为5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2.5×10-4mol/L的腺嘌呤,共计500mL。
对比例6
本例是实施例1的对比例，对比之处仅在于，采用的培养基B的配方不同，本例的培养基B的配方具体为：细胞基础培养基为DMEM，终浓度为30μg/mL的KGF、终浓度为35ng/mL的HGF、终浓度为5ng/mL的胰岛素、终浓度为10μg/mL的EGF、终浓度为30μg/mL的NGF、终浓度为5×10-3mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为200μM的腺嘌呤,共计500mL。
性能检测与效果评价
1.MTT法检测细胞活力
(1)取各实施例与对比例1得到的成纤维细胞，采用MTT法检测，其活力如下表所示：
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2
活力(％) 95.58 82.69 80.19 75.11 63.88
其中实施例1制得的细胞的活力显著高于实施例2～3(p<0.05)且与对比例1、2相比差异明显(P<0.05)，说明本申请的无血清培养基培养效果要高于市售的无血清培养基，且谷氨酰胺、胰岛素能促进成纤维细胞的生长。
(2)取各实施例与对比例2得到的汗腺细胞，采用MTT法检测，其活力如下表所示：
Figure BDA0001531266910000111
其中实施例1制得的细胞的活力高于实施例2～3(p<0.05)且与对比例3、4、5、6相比差异明显(P<0.05)，说明本研究的无血清培养基培养效果要高于市售的SG、KGM-2混合培养基，且胰岛素、KGF能够促进汗腺细胞的生长，培养基中添加的三碘甲状腺原氨酸和腺嘌呤超出使用范围会抑制汗腺细胞的生长及其活力。
2.流式细胞仪检测细胞表面标志物
(1)成纤维细胞表型检测
1)0.25％胰酶消化成纤维细胞并收集细胞，细胞数为2×105个；
2)细胞胞重悬于1mL PBS中洗涤2次，200g，离心5min；
3)离心弃去上清液，加入200μL鼠源CK15、Vimentin一抗抗体(稀释度为1:100)常温下孵育30min；
4)1mLPBS洗涤，分别与FITC标记二抗IgG(稀释度为1:2000)常温避光孵育1h；
5)PBS洗两次后，弃去PBS，根据细胞量加入适量的PBS重悬细胞，利用流式细胞仪检测。
其中，对实施例1～3制得成纤维细胞的检测结果如图1。通过流式细胞仪分析显示，在成纤维细胞中Vimentin蛋白的阳性表达量分别为95.22％、90.73％、88.78％，CK15蛋白的阳性表达量为2.54％、4.26％、7.33％，均符合成纤维细胞表面标记物的表达结果。对比例1、对比例2的纤维细胞中Vimentin蛋白的阳性表达量分别为75.77％、70.38％，CK15蛋白的阳性表达量分别为8.22％、9.67％。
(2)汗腺细胞表型检测
1)0.25％胰酶消化汗腺细胞并收集细胞，细胞数为2×105个；
2)细胞重悬于1mL PBS中洗涤2次，200g，离心5min；
3)离心弃去上清液，加入200μL鼠源CK14、CEA、MSX-1一抗抗体(稀释度为1:100)常温下孵育30min；
4)1mLPBS洗涤，分别与FITC标记二抗IgG(稀释度为1:2000)常温避光孵育1h；
5)PBS洗两次后，弃去PBS，根据细胞量加入适量的PBS重悬细胞，利用流式细胞仪检测。
其中，对实施例1～3制得汗腺细胞的检测结果如图2。通过流式细胞仪分析显示，在汗腺细胞中CK14蛋白的阳性表达量分别为96.72％、91.78％、89.38％，CEA蛋白的阳性表达量分别为95.73％、88.28％、80.95％，MSX-1蛋白的阳性表达量为2.74％、4.56％、7.83％，均符合汗腺细胞表面标记物的表达结果。对比例3～6所得汗腺细胞中CK14蛋白的阳性表达量分别为77.28％、72.57％、68.48％、65.62％，CEA蛋白的阳性表达量分别为75.55％、72.77％、70.18％、68.24％，MSX-1蛋白的阳性表达量分别为8.22％、8.92％、9.38％、10.15％。
3.免疫荧光鉴定表面标志物
(1)成纤维细胞表型检测
1)0.25％胰酶消化成纤维细胞，以1×105的接种量接种于12孔板中，待其贴壁，4％的多聚甲醛固定2h，PBS洗三遍；
2)加200μL的一抗稀释液(PBS+10％血清+0.3％TritonX-100)常温封闭1～2h；
3)弃去一抗稀释液，加入200μL鼠源CK15、Vimentin一抗抗体(稀释浓度为1:100)，4℃孵育过夜，PBS冲洗三次3次，每次5min；
4)加200μL FITC标记羊抗鼠二抗(稀释度为1：400)，常温避光反应1h，PBS冲洗；上机检测前用PI染核；
5)结果判定：荧光下观察见绿色荧光为阳性。结果见附图3。
图3示本发明细胞显示绿色荧光，为成纤维细胞标志分子Vimentin，呈阳性表达，CK15为阴性表达，符合成纤维细胞表面标记物的表达结果。实施例2～3制得汗腺细胞的检测结果与此相似。
(2)汗腺细胞表型检测
1)0.25％胰酶消化汗腺细胞，以1×105的接种量接种于12孔板中，待其贴壁，4％的多聚甲醛固定2h，PBS洗三遍；
2)加200μL的一抗稀释液(PBS+10％血清+0.3％TritonX-100)常温封闭1-2h；
3)弃去一抗稀释液，加入200μL鼠源CK14、CEA一抗抗体(稀释度为1:100)，4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，每次5min；
4)加200μLPE标记羊抗鼠二抗(稀释浓度为1：400)，常温避光反应1h，PBS冲洗；加入DAPI染核，在荧光显微镜下观察，拍照。
结果判定，荧光素PE标记抗体与CK14、CEA单克隆抗体结合，在胞浆中显示红色荧光，DAPI染细胞核显示蓝色荧光。对实施例1制得汗腺细胞的检测结果如图4。从图4可以看出，CK14和CEA蛋白是汗腺细胞的特异性标记蛋白，CK14和CEA的表达量极高为阳性表达，说明诱导出的细胞为汗腺细胞。实施例2～3制得汗腺细胞的检测结果与此相似。对比例3～6中，CK14和CEA蛋白的表达量低于实施例1～3，说明对比例3～6的作用效果低于实施例1～3。
综上所述，本发明实施例通过采用上述特定成分和浓度的培养基，能够直接将单一种类的成纤维细胞诱导分化成汗腺细胞，快捷高效，克服了传统技术需将汗腺细胞与例如干细胞进行共培养而导致汗腺细胞产量受限的缺陷。进一步地，本发明通过对培养基组分含量的优化，有益于汗腺细胞分化中均一生长、分化阶段一致，使所得汗腺细胞的形态具有较好的一致性。另外，本申请还提供了特定配方的成纤维细胞增殖培养基，该培养基与诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基配套使用，能够很好的控制细胞的生长、定向分化和增殖。本发明实施例方法可使用人体离体组织样本作为取样标本，有效避免取血样、骨髓样等不必要的痛苦，同时避免伦理学顾虑，其具有长远的意义。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，其特征在于，为细胞基础培养基中添加有终浓度为12～55μg/mL的KGF、终浓度为5～70ng/mL的HGF、终浓度为1～10ng/mL的胰岛素、终浓度为1～20μg/mL的EGF、终浓度为18～55μg/mL的NGF、终浓度为1～7.5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2～5×10-4mol/L的腺嘌呤。
2.根据权利要求1所述的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，其特征在于，为细胞基础培养基中添加有终浓度为25～35μg/mL的KGF、终浓度为32～38ng/mL的HGF、终浓度为3～7ng/mL的胰岛素、终浓度为7～12μg/mL的EGF、终浓度为25～35μg/mL的NGF、终浓度为3.5～5.5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2～3×10-4mol/L的腺嘌呤。
3.根据权利要求2所述的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，其特征在于，为细胞基础培养基中添加有终浓度为28～32μg/mL的KGF、终浓度为32～35ng/mL的HGF、终浓度为4.5～5ng/mL的胰岛素、终浓度为9～11μg/mL的EGF、终浓度为28～31μg/mL的NGF、终浓度为4.8～5.3×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2.5～2.8×10-4mol/L的腺嘌呤。
4.根据权利要求3所述的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，其特征在于，为细胞基础培养基中添加有终浓度为30μg/mL的KGF、终浓度为35ng/mL的HGF、终浓度为5ng/mL的胰岛素、终浓度为10μg/mL的EGF、终浓度为30μg/mL的NGF、终浓度为5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2.5×10-4mol/L的腺嘌呤。
5.根据权利要求1至4任一项所述的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，其特征在于，所述细胞基础培养基为DMEM。
6.一种诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取成纤维细胞；
向所述成纤维细胞加入权利要求1至5任一项所述的培养基，培养至出现多边形、铺路石样细胞，即获得汗腺细胞。
7.根据权利要求6所述的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的方法，其特征在于，所述的获取成纤维细胞，包括：从离体组织样本中分离出成纤维细胞单细胞的步骤、对所得单细胞进行增殖培养获得成纤维细胞的步骤。
8.根据权利要求7所述的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的方法，其特征在于，所述增殖培养采用的培养基为细胞基础培养基中添加有终浓度为20～100ng/mL的FGF、终浓度为1～50ng/mL的EGF、终浓度为1～10％的谷氨酰胺、终浓度为25～80ng/mL的胰岛素、终浓度为2～15ng/mL的HGF。
9.根据权利要求8所述的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的方法，其特征在于，所述增殖培养采用的培养基为细胞基础培养基中添加有终浓度为40～60ng/mL的FGF、终浓度为20～40ng/mL的EGF、终浓度为6～8％的谷氨酰胺、终浓度为40～55ng/mL的胰岛素、终浓度为10～15ng/mL的HGF。
10.根据权利要求7所述的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的方法，其特征在于，从离体组织样本中分离出成纤维细胞单细胞的步骤，包括：
(1)取离体组织样本，无菌条件下，用含8～12％双抗的DMEM反复冲洗；
(2)向步骤(1)冲洗过的离体组织样本中加入0.2～3％的胰酶，放于低温下过夜，次日分离表皮真皮；
(3)用含8～12％双抗的DMEM反复冲洗步骤(2)所得表皮真皮；
(4)将步骤(3)冲洗过的表皮真皮放于无菌生理盐水中并剪成小组织块，700～900g下离心3～7min，收集沉淀；
(5)以所述沉淀3～4倍的体积加入0.2～3％的IV型胶原酶，充分消化；
(6)所述消化后加入DMEM，混匀，过80～120μm的滤网，将所得滤液于280～320g下离心3～7min，所得沉淀即为成纤维细胞单细胞。
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