CN117721082A

CN117721082A - 来源于初发胶质瘤的人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用

Info

Publication number: CN117721082A
Application number: CN202410179588.5A
Authority: CN
Inventors: 曹明楠; 赵志刚; 姜睿琦; 季楠; 张扬; 王燚
Original assignee: Beijing Tiantan Hospital
Current assignee: Beijing Tiantan Hospital
Priority date: 2024-02-18
Filing date: 2024-02-18
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2044-02-18
Also published as: CN117721082B

Abstract

本发明公开了来源于初发胶质瘤的人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用，所述人脑胶质瘤细胞系的保藏编号为CGMCC No.45633，所述细胞系可连续稳定传代培养而保持人脑胶质瘤肿瘤细胞的生物学特性不变，与其他商品化的脑胶质瘤细胞系相比，本发明提供的人脑胶质瘤细胞系具有显著更优的增殖能力，并且可诱导小鼠原位成瘤，适合作为细胞模型和动物模型用于脑胶质瘤相关的治疗、诊断和药物研究中。

Description

来源于初发胶质瘤的人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及来源于初发胶质瘤的人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用。

背景技术

细胞模型是上世纪60年代在欧美国家发展起来的生物医药产业“芯片”，是生物医学基础研究和药物研发的核心要素与战略性源头资源，决定着生物医药产业的原始创新能力。肿瘤细胞系作为主要的体外模型，既是探索分子肿瘤生物学的标准，也是测试新的治疗方式的临床前模型。目前大多数癌症细胞模型已经使用了几十年，永生化的细胞系经过数千代培养，其细胞基因组成和生物学行为均发生改变。已广泛用于神经肿瘤学研究的细胞系包括LN-229、U-87MG、U-251等均来源于白种人，几乎没有具有亚洲人种遗传背景的脑胶质瘤（Glioma）细胞系，且明确分子分型的细胞系更少，脑胶质瘤细胞系稀少的问题严重地制约了脑胶质瘤的临床前研究。

基于此，本发明的发明人经过广泛而深入的研究构建得到了一种人脑胶质瘤细胞系，所述细胞系可稳定多次传代，具有成瘤性，基于所述细胞系可以制备出相应的肿瘤动物模型，其可用于人脑胶质瘤诊断试剂的研发、人脑胶质瘤药物的筛选、以及人脑胶质瘤的体外研究。另外，本发明的人脑胶质瘤细胞系的建立方法简单易操作，由于组织标本珍贵又少，使用本发明的培养方法进行原代培养更易成功，肿瘤细胞建系更易成功。相比于复制和维持的成本较高的人源肿瘤组织异种移植模型，本发明直接采用人脑胶质瘤组织进行原代培养操作简单、成本低、效率高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：目前本领域几乎没有具有亚洲人种遗传背景的脑胶质瘤细胞系，且明确分子分型的细胞系更少的问题。本发明提供了一种人脑胶质瘤细胞系glioma-zzg02，所述细胞系生长良好，形态均一，可稳定传代至50代以上，能够表达胶质瘤细胞的典型标记物，且较商品化的脑胶质瘤细胞系更为耐药、细胞活力显著更优，为药物测试等平台或肿瘤动物模型的构建提供了理想的细胞系模型。

基于此，本发明的发明人提出了本发明。本发明至少包括如下目的：

本发明的第一目的是提供一种人脑胶质瘤细胞系及其子代细胞系。

本发明的第二目的是提供上述人脑胶质瘤细胞系及其子代细胞系的相关应用，所述应用包括：在开发抑制人脑胶质瘤药物方面的应用、在制备人脑胶质瘤诊断试剂方面的应用、在人脑胶质瘤体外研究方面的应用、在构建人脑胶质瘤动物模型方面的应用、在构建人脑胶质瘤耐药细胞模型方面的应用、在筛选人脑胶质瘤相关生物标志物或鉴定分子靶点方面的应用等。

为了实现上述目的，本发明具体采用了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种人脑胶质瘤细胞系。

进一步，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45633，保藏日期为2023年07月25日。

在本发明中，所述人脑胶质瘤细胞系来源于胶质母细胞瘤患者，所述胶质母细胞瘤患者的具体信息如下：女，37岁，诊断为胶质母细胞瘤（NOS，CNS WHO 4级），为初发胶质瘤。在本发明的具体实施方案中，所述人脑胶质瘤细胞系是通过将上述患者来源的人脑胶质瘤细胞经过原代培养和传代培养制备获得，进一步通过一系列的实验验证发现本发明制备获得的所述人脑胶质瘤细胞系形态均一、生长状态良好、可稳定传代至50代以上，对于研究脑胶质瘤的侵袭和转移以及药物试验等均具有重要意义。

此外，本发明提供的人脑胶质瘤细胞系具有成瘤性，可以制备出肿瘤动物模型，其可用于人脑胶质瘤诊断试剂的研发、人脑胶质瘤药物的筛选、以及人脑胶质瘤的体外研究。另外，本发明提供的人脑胶质瘤细胞系的建立方法简单易操作，由于组织标本珍贵又少，使用本发明提供的培养方法进行原代培养更易成功，可直接获得原代贴壁肿瘤细胞及传代的子代细胞，肿瘤细胞建系更易成功。相比于复制和维持的成本较高的人源肿瘤组织异种移植模型，本发明直接采用人脑胶质瘤组织进行原代培养操作简单、成本低、效率高。

第二方面，本发明提供了一种子代细胞系。

进一步，所述子代细胞系由本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系传代得到。

在一些实施方案中，本发明所述的子代细胞系的构建方法包括如下步骤：取对数生长期的本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系在体外培养传代，细胞培养条件为：37℃、5% CO₂细胞培养箱；所用培养基为DMEM/F12培养基。按照上述传代方法培养三代后，第四代开始更换为10%血清培养与无血清培养基各半（含5%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、1%B27、0.5% N2、insulin (10 μg/mL)、bFGF (10 ng/mL)、EGF (10 ng/mL)、PDGF-AB (10 ng/mL)）进行培养。传代时，用TrypLE™Express消化细胞。

在一些实施方案中，本发明提供的人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系可采用本领域技术人员公知的常规方法进行冻存，所述冻存方法并无特别限制，例如，将人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系离心后重悬于细胞冻存液中，滴度冻存盒内-80℃静置过夜，然后迅速移入液氮中进行冻存，或其他任何适用于本申请的人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系的冻存方法。

复苏冻存的方法是本领域技术人员已知或者可以容易确定的，复苏冻存细胞的方法例如可以是从液氮中取出冻存细胞，置于温水水浴中，快速振摇使细胞快速融化，用新鲜的培养液悬浮细胞后，离心，细胞用适当体积的培养基悬起，进行传代培养。

第三方面，本发明提供了本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系在构建人脑胶质瘤耐药细胞模型中的应用。

在一些实施方案中，可将所述人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系接种于含特定药物的培养液中进行耐药诱导培养，进一步对耐药诱导成功的肿瘤细胞进行传代培养获得针对特定药物耐药的人脑胶质瘤细胞系。

在一些实施方案中，所述特定药物并无特别限制，任何本领域技术人员感兴趣的药物均在本发明的保护范围内。

在一些实施方案中，本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系本身即可作为脑胶质瘤细胞模型应用于脑胶质瘤相关的研究中。

第四方面，本发明提供了本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系在构建人脑胶质瘤动物模型中的应用。

在一些实施方案中，所述动物并无特别限制，包括但不限于：小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠等，在本发明的具体实施方案中，所述动物为免疫缺陷的小鼠，优选为BALB/C免疫缺陷小鼠（雄性，鼠龄6周）。

在一些实施方案中，所述人脑胶质瘤动物模型根据移植接种的方式不同，分为皮下成瘤模型、原位移植模型、尾静脉注射肿瘤转移模型。

其中，皮下成瘤模型是将肿瘤细胞或肿瘤组织直接接种在小鼠的皮下而建立的一种肿瘤动物模型。该肿瘤模型是一种用于临床前评估药物体内药效的简单而重要的工具，同时，在肿瘤的发病机制、药物作用的研究中亦起到重要作用。该模型操作简单方便，可以直观观察肿瘤的生长，方便检测动物体重、肿瘤生长曲线、肿瘤重量等重要数据；可以对组织和体液样本进行相关分析，广泛应用于生物医学研究与药物开发中。

原位移植模型是将肿瘤细胞或肿瘤组织块原位移植到免疫缺陷动物的组织器官内，使之产生肿瘤并形成自发性转移灶。其方法是将稀释好的肿瘤细胞直接接种到器官的浆膜下。或者先将肿瘤细胞皮下接种，达500-800 mm³左右，瘤组织取出切成1-3 mm³的小块，将准备好的癌组织块植入器官的浆膜下，缝合浆膜，这样也可以形成异种原位肿瘤。常用原位接种包括：脑、肝、肌肉、乳腺垫原位。原位移植模型能更好地模拟肿瘤细胞在体内生长的微环境，模拟肿瘤生长甚至转移的过程。

尾静脉注射肿瘤转移模型是通过尾静脉注射肿瘤细胞后，肿瘤细胞在动物体内某个或某些器官形成肿瘤而建立的一种肿瘤模型。肿瘤细胞经尾静脉注射后，先通过肺部的毛细血管网进入动脉血液循环系统，可造成全身多发转移灶。但是由于肿瘤细胞较为粘稠易聚团，一般会被困在小鼠肺部微血管，主要形成肺转移，可能后期会造成远端器官的转移。主要用于建立肿瘤转移模型或血癌模型或者肿瘤肺转移。

在本发明的具体实施方案中，所述人脑胶质瘤动物模型优选为原位注射成瘤模型，更优选为脑立体定位注射成瘤模型。

第五方面，本发明提供了本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系在筛选用于治疗和/或预防人脑胶质瘤的药物中的应用。

在一些实施方案中，可将所述人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系与待测试药物接触，观察并比较与待测试药物接触组和未与待测试药物接触组细胞系的生长形态，并进行测定，筛选能够治疗和/或预防人脑胶质瘤的药物。

在一些实施方案中，使人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系与待测试药物接触是指将上述人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系和待测试药物置于可接触的情况下。上述人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系与待测试药物的接触例如可以是向含有上述人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系的溶液中添加相应的待测试药物。

在一些实施方案中，所述待测试药物并无特别限制，可以是小分子化合物、蛋白质（例如抗体）、DNA、RNA、低分子干扰RNA或反义寡核苷酸等。待测试药物例如可以是用于治疗脑胶质瘤以外的疾病的药剂。待测试药物例如可以为一种或两种以上药物的混合物。

在一些实施方案中，对与上述待测试药物接触的人脑胶质瘤细胞系或其子代细胞系进行测定包括测定细胞活力的变化、细胞增殖能力的变化、细胞死亡情况的变化、细胞大小的变化、细胞数量的变化、构成细胞的标志物蛋白的表达情况等。其中，细胞大小的变化例如可以是测定细胞的尺寸，细胞的尺寸例如可以使用本领域公知的装置（例如显微镜或FACS）来测定。细胞的尺寸例如可以是细胞的周长、直径（例如长径和短径）或面积。

第六方面，本发明提供了本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系在制备人脑胶质瘤诊断或检测试剂中的应用。

在一些实施方案中，可采用本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系评价所述待测诊断或检测试剂是否能够用于准确有效区分胶质瘤细胞和正常细胞。

第七方面，本发明提供了本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系在研究人脑胶质瘤发病机制、发展和转移机理、相关生物标志物或治疗靶点中的应用。

第八方面，本发明提供了一种人脑胶质瘤动物模型。

进一步，所述动物模型是通过将本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系接种到非人哺乳动物体内构建得到。

第九方面，本发明提供了如下任一种方法：

(1) 本发明第八方面所述的人脑胶质瘤动物模型的构建方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系或本发明第二方面所述的子代细胞系接种到非人哺乳动物体内构建得到本发明第八方面所述人脑胶质瘤动物模型；

(2) 本发明第一方面所述的人脑胶质瘤细胞系的构建方法，所述方法包括如下步骤：获取临床人脑胶质瘤组织，对所述人脑胶质瘤组织进行原代培养，对所述原代培养的肿瘤细胞进行传代培养，获得本发明第一方面所述人脑胶质瘤细胞系。

进一步，所述非人哺乳动物为免疫缺陷的小鼠；

所述接种的细胞数量为2×10⁵个；

所述接种的方式为原位注射；优选为脑立体定位注射；

所述原代培养采用的培养基的组成为：DMEM/F12培养液、2% B27、1% N2、20 μg/mLinsulin、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、20 ng/mL PDGF-AB、1 vol%青霉素/链霉素；

所述传代培养的培养基的组成为：DMEM/F12培养液、5%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、1% B27、0.5% N2、10 μg/mL insulin、10 ng/mL bFGF、10 ng/mL EGF、10 ng/mL PDGF-AB。

本发明涉及的生物材料的保藏信息如下：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2023年07月25日；

保藏编号：CGMCC No.45633；

参据的生物材料（株）：glioma-zzg02；

分类命名：患者来源的原代胶质母细胞瘤细胞。

附图说明

图1：glioma-zzg02细胞的形态学观察结果图，其中，A图：100×，B图：100×，C图：100×；

图2：甲基化测序结果图；

图3：glioma-zzg02细胞免疫荧光染色结果图；

图4：商品化胶质瘤细胞系LN-229的替莫唑胺及多西他赛剂量效应曲线结果图，其中，A图：替莫唑胺（TMZ），B图：多西他赛；

图5：glioma-zzg02多西他赛剂量效应曲线结果图；

图6：glioma-zzg02替莫唑胺剂量效应曲线结果图；

图7：glioma-zzg02异种移植试验结果图；

图8：glioma-zzg02细胞系和商品化胶质瘤细胞系U87的增殖能力对比结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，具体实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1 人脑胶质瘤细胞系glioma-zzg02的构建方法

1、实验材料

Matrigel基质胶（BD Biocoat，356234）、无菌眼科剪、眼科镊、15 mL离心管、50 mL离心管、移液管、20 mL注射器、培养皿、无菌PBS、TrypLE™Express（Gibco，12604021）、DMEM/F12、胎牛血清、青霉素/链霉素（Gibco，货号15140122）、B27、N2、insulin、bFGF（Peprotech，100-18b）、EGF、PDGF-AB（PeproTech，100-00ab）、红细胞裂解液、70 μm细胞筛、25 cm²细胞培养瓶（Corning 430639）。

2、患者信息

患者信息：女，37岁，诊断为胶质母细胞瘤（NOS，CNS WHO 4级），为初发胶质瘤。

3、实验方法

（1）原代培养

将所述患者手术获得的新鲜脑胶质瘤切除标本（女，37岁，胶质母细胞瘤）立即置于预冷的DMEM/F12培养基（含1 vol%的青链霉素）中短暂存放，以保证样本在到达实验室前的活性，注意组织采集和运送过程中保持无菌。将2 mL 1%基质胶的无菌水（非PBS，无酶无菌水）平铺于培养瓶，培养箱孵育1 h，使用前吸除基质胶，置于培养箱5 min。在无菌超净工作台中取出样本，放置于10 cm无菌培养皿中，加入5 mL预冷的PBS缓冲液（pH=7.4）清洗3次，尽可能的洗去血液及杂质，然后用消毒好的眼科镊去除可辨认的坏死部位及血管后，将胶质瘤组织移入新的10 cm无菌培养皿中剪成2×2×3 mm的组织块，将剪碎的组织转移到15 mL离心管离心，去除PBS（300 g，2 min）。加入温和的胰酶替代品5 mL（Gbico的TrypLE™Express），涡旋1 min，37℃水浴锅裂解15-20 min，每5 min颠倒混匀一次，保证充分裂解。70 μm细胞筛置于50 mL无菌离心管，将裂解的组织液筛网过滤（注射器研磨），PBS洗涤2遍，PBS定容至10 mL。过滤的细胞液转移至15 mL无菌离心管，250 g离心4 min，去上清后加5mL红细胞裂解液。加入红细胞裂解液，吹匀后冰上静置5 min，250 g离心4 min（依据红细胞数裂解1-2次）。去除裂红液加3 mL PBS，吹匀250 g离心4 min。吸出上清，向沉淀中加入4mL DMEM/F12培养液（含2% B27、1% N2、insulin (20 μg/mL)、bFGF (20 ng/mL)、EGF (20ng/mL)、PDGF-AB (20 ng/mL)、1 vol%的青链霉素），混匀后置入25 cm²培养瓶中，于37℃恒温培养箱5%、CO₂条件下培养3天。

（2）传代培养

原代培养3天后，可以观察到形成贴壁细胞，根据细胞贴壁情况，3-4天细胞半换液，细胞生长至80-90%汇合度时进行传代培养。弃去旧培养基，加入2 mL PBS清洗，弃去PBS，要尽量吸干净。加入1 mL TrypLE™Express消化1-10 min，培养箱孵育1-10 min，镜下可见贴壁细胞呈现小圆形而悬浮游动，加入2 mL PBS稀释胰酶替代品终止消化，枪头反复吹打，动作注意轻柔，最大程度使胶质瘤细胞分散为单个细胞，然后移入15 mL无菌离心管，离心180 g，5 min。弃去上清，加入4 mL含细胞因子的DMEM/F12培养液，枪头反复吹吸分散细胞，注意动作轻柔，以1:1进行传代。将步骤培养后的得到的传代细胞记为L2代，当L2代细胞生长至80-90%汇合度时继续按上述传代培养方法进行传代。

细胞按上述传代方法继续培养三代，第四代开始更换为10%血清培养与无血清培养基各半（含5%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、1% B27、0.5% N2、insulin (10 μg/mL)、bFGF(10 ng/mL)、EGF (10 ng/mL)、PDGF-AB (10 ng/mL)）进行培养。

4、实验结果

采用上述构建方法构建得到人脑胶质瘤细胞系glioma-zzg02生长良好，形态均一，可传代至50代以上。

实施例2 glioma-zzg02细胞的形态学观察

将培养glioma-zzg02细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下进行观察，图1为glioma-zzg02细胞L1代培养的照片，结果可见glioma-zzg02细胞主体呈梭型，存在不规则分支或分叉（图1A，100×），图1B为glioma-zzg02细胞L20代培养的照片，图1C为glioma-zzg02细胞L50代培养的照片。由图1A-1C的比较可知，经过50次传代后，细胞的形态仍保持不变，表明本发明所制备的glioma-zzg02细胞能够稳定地传代，有助于长期深入研究该细胞系的生理病理特征、遗传特征，有助于将其作为药物测试等平台细胞系或诱导肿瘤动物模型的细胞系。

实施例3 glioma-zzg02细胞短片段重复序列(STR)分析

1、实验方法

取适量glioma-zzg02细胞用Chelex100提取DNA，采用CELL STR ID®扩增20个STR位点和性别鉴定位点，使用ABI 3130xl型遗传分析仪进行PCR产物检测，使用GeneMapperIDX软件（Applied Biosystems）对检测结果进行分析，并与美国典型培养物保藏中心（ATCC）、德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）数据库、日本细胞保藏中心（JCRB）、COG数据库等数据库进行比对。

2、实验结果

glioma-zzg02细胞株DNA进行细胞STR分型结果显示，D5S818、CSF1PO基因座出现三等位基因，其余基因座未出现多等位基因现象，细胞中没有发现人类细胞交叉污染，在Cellosaurus细胞库中未找到与其STR分型数据匹配度大于80%的细胞，glioma-zzg02细胞的STR位点和Amelogenin位点的基因分型结果见表1，该细胞株DNA扩增后图谱清晰，分型结果良好。

表1 glioma-zzg02细胞的STR位点和Amelogenin位点的基因分型结果

实施例4 glioma-zzg02细胞WGS测序分析

1、实验方法

取适量glioma-zzg02细胞，基因组DNA利用Covaris破碎仪随机打断成长度为350bp的片段，经末端修复、磷酸化以及加A尾后，片段两端分别连接接头，制备成DNA文库。文库构建完成后，先使用Qubit 3.0进行初步定量，随后使用NGS3K/Caliper对文库的insertsize（插入片段大小）进行检测，insert size符合预期后，使用qPCR方法对文库的有效浓度（3 nM）进行准确定量，以保证文库质量。库检合格后，根据文库的有效浓度及数据产出需求运用Illumina平台进行测序。获得原始测序序列（Sequenced Reads）后，在有参考序列或参考基因组（human_B37）的情况下，进行信息分析流程，大致包括以下两个部分：

测序数据质量评估：主要通过对测序错误率、数据量、比对率等进行统计，评估建库测序是否达到了标准，符合标准则进行后续的分析，否则需重新建库或加测。

变异检测：将高质量的序列比对到人参考基因组上，检测样本中的变异信息，并对检出的变异进行统计和注释。

2、实验结果

glioma-zzg02胶质瘤分子分型测序结果见表2，glioma-zzg02胶质瘤相关的其他突变基因包括COL12A1、DNAH11、ECE1、NAMPT、NME8、PPP4R1、SMAD6、UNC45B。

表2 glioma-zzg02胶质瘤分子分型测序结果

实施例5 glioma-zzg02细胞焦磷酸测序-MGMT启动子甲基化检测

1、实验材料和实验仪器

所采用的主要实验材料和实验仪器分别见下表3和表4。

表3 主要实验材料与试剂

表4 主要实验仪器

2、实验方法

焦磷酸测序技术（pyrosequencing）是一种新型的酶级联测序技术，焦磷酸测序法适用于对已知的短序列的测序分析。

焦磷酸测序原理：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放欧联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。

（1）DNA提取及质检

Ezup柱式动物组织基因组DNA抽提试剂盒，B518251，生工生物。

（2）引物设计

采用常规引物设计方法设计得到上游引物（MGMT-F）、下游引物（MGMT-BR）、测序引物（MGMT-FSN）和目的序列。

（3）PCR反应体系

PCR反应体系见下表5。

表5 PCR反应体系

（4）PCR反应条件

PCR反应条件见下表6。

表6 PCR反应条件

（5）测序

3、实验结果

甲基化测序结果如图2和表7所示，glioma-zzg02细胞MGMT启动子甲基化平均值为82.03%。

表7 甲基化测序结果

实施例6 glioma-zzg02细胞免疫荧光染色

1、实验材料

实验试剂：4%组织固定液、PBS、Triton X-100、BSA、荧光二抗、免疫荧光染色二抗稀释液、抗荧光猝灭封片液、IDH1、IDH2、GFAP和KI67一抗；

实验器材：6孔板，细胞爬片，载玻片，15 mL离心管。

2、实验方法

取无菌细胞爬片置于6孔板内，种入细胞培养液过夜，待细胞长至30-60%后，吸尽培养液，用2 mL PBS洗两次，加入1 mL固定液，室温固定15 min。去除固定液，用PBS润洗3次，每次5 min，摇床轻摇。用0.2% Triton X-100室温通透5 min，PBS润洗3次，每次5 min，摇床轻摇。用封闭液（2/1/0.5 mL/孔）封闭60 min。吸去封闭液（勿洗），用IDH1、IDH2、GFAP和KI67一抗（1 mL/孔）作用60 min或4℃过夜，摇床轻摇。去除一抗，PBS润洗3次，每次5min，摇床轻摇。弃PBS，加入1 mL/孔稀释的荧光二抗，室温避光孵育40 min，摇床轻摇。回收荧光二抗，PBS润洗3次，每次5 min，摇床轻摇。滴加DAPI（200 μL/孔）避光孵育5 min，PBS润洗4次，每次5 min，洗去多余的DAPI。用滤纸吸干爬片上的液体，滴1滴抗荧光猝灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，避免气泡，使细胞接触封片液，荧光显微镜观察蓝色荧光。

3、实验结果

结果如图3所示，结果显示神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白（GFAP）、IDH1、IDH2、标记细胞增殖状态的核抗原（KI67）呈较强阳性表达，结合病理诊断，该细胞为脑胶质瘤细胞。由上述结果可知，本发明的glioma-zzg02细胞能够表达胶质瘤细胞的典型标记物，进而判断该细胞系具有典型的肿瘤特征。

实施例7 glioma-zzg02体外药敏试验

1、实验材料

替莫唑胺（MCE，NSC 362856）、多西他赛（MCE，HY-B0011）、CCK8试剂盒（LABLEAD，AF2020-20T）。

2、实验方法

收集对数生长期G50代glioma-zzg02细胞，调整细胞悬液浓度，在96孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔），每孔10000个细胞，置于37℃、5% CO₂培养箱中预培养24小时后，分别加入0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 μM多西他赛；0、0.5、1、2.5、5、10、20、40、80 μM替莫唑胺以及空白对照。收集对数生长期的商品化的脑胶质瘤细胞系LN-229细胞，调整细胞悬液浓度，在96孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔），每孔5000个细胞，置于37℃、5% CO₂培养箱中预培养24小时后，分别加入0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、10、20 μM多西他赛；0、5、10、15、20、30、40、50、60 μM替莫唑胺以及空白对照。继续置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。药物作用72小时后，用CCK8试剂检测细胞活力。

具体步骤如下：吸尽孔板中细胞培养液，再向每孔中加入100 μL DMEM培养液（含10 vol%胎牛血清、1 vol%青链霉素）和10 μL CCK8溶液，将孔板再次放入培养箱内孵育1小时，利用酶标仪测定450 nm处的吸光度。使用graphpad prism 9.0绘制细胞活力曲线，将浓度取对数后进行非线性拟合，计算IC50结果。

3、实验结果

结果如表8、图4A-图4B（LN229）、图5（glioma-zzg02）和图6（glioma-zzg02）所示，结果显示，各治疗药物对glioma-zzg02细胞的生长抑制作用比对LN-229细胞的作用弱，其中，glioma-zzg02的替莫唑胺72小时IC50为39.55 μM，多西他赛72小时IC50为0.03909 μM，以上结果说明glioma-zzg02细胞较LN-229细胞更为耐药，能够作为筛选新型抗肿瘤药物的细胞模型。

表8 glioma-zzg02和商品化的LN-229的替莫唑胺及多西他赛IC50

实施例8 glioma-zzg02异种移植试验

1、实验材料

3% matrigel胶、PBS、1 mL注射器、EP管、骨蜡、布鲁卡因、粘合胶水、异氟醚。

2、实验方法

取新鲜培养的glioma-zzg02细胞，原位注射（脑立体定位注射）接种BALB/C免疫缺陷小鼠（北京维通利华，雄性，鼠龄6周），每只动物接种0.2 mL，含2×10⁵个细胞，每天观察和测量动物体重和肿瘤大小。接种约5天后，肿瘤开始形成并生长，成瘤率近100%。

3、实验结果

结果如图7所示，可见该glioma-zzg02细胞能在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。通过接种本发明构建得到的glioma-zzg02细胞能够在小鼠体内形成肿瘤，从而成功构建相应的肿瘤动物模型。

对比例 glioma-zzg02和商品化U87细胞系的增殖能力对比

1、实验材料

CCK8试剂盒（LABLEAD，AF2020-20T）。

2、实验方法

取新鲜培养的glioma-zzg02细胞和U87细胞系铺于96孔板内，细胞计数后，每孔的细胞量为3000个，每孔加入100 μL DMEM/F12培养液（含5%胎牛血清、1%青链霉素），对照孔加入100 μL PBS缓冲液（pH=7.4），各铺6个96孔板，分别于第24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时后取出对应96孔板，吸尽孔中的培养基后，每孔加入100 μL新鲜的DMEM/F12培养液（含5%胎牛血清、1%的青链霉素）与10 μL CCK8的混合溶液（LABLEAD，AF2020-20T）于37℃恒温箱内避光孵育1小时。酶标仪测定在450 nm处的吸光度值，作图并使用公式“倍增时间=log2/斜率”计算倍增时间。

3、实验结果

细胞动力学研究结果显示，U87细胞系的群体倍增时间约为50.52小时，而本发明构建得到的glioma-zzg02细胞的群体倍增时间约为41.71小时（见图8），表明glioma-zzg02细胞活力显著更优，比U87细胞系群体倍增时间更短，能作为细胞模型应用于胶质瘤相关的研究中。

Claims

1.一种人脑胶质瘤细胞系，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45633，保藏日期为2023年07月25日。

2.一种子代细胞系，其特征在于，所述子代细胞系由权利要求1所述的人脑胶质瘤细胞系传代得到。

3.权利要求1所述的人脑胶质瘤细胞系或权利要求2所述的子代细胞系在构建人脑胶质瘤耐药细胞模型中的应用。

4.权利要求1所述的人脑胶质瘤细胞系或权利要求2所述的子代细胞系在构建人脑胶质瘤动物模型中的应用。

5.权利要求1所述的人脑胶质瘤细胞系或权利要求2所述的子代细胞系在筛选用于治疗和/或预防人脑胶质瘤的药物中的应用。

6.权利要求1所述的人脑胶质瘤细胞系或权利要求2所述的子代细胞系在制备人脑胶质瘤诊断或检测试剂中的应用。

7.权利要求1所述的人脑胶质瘤细胞系或权利要求2所述的子代细胞系在研究人脑胶质瘤发病机制、发展和转移机理、相关生物标志物或治疗靶点中的应用。

8.一种人脑胶质瘤动物模型，其特征在于，所述动物模型是通过将权利要求1所述的人脑胶质瘤细胞系或权利要求2所述的子代细胞系接种到非人哺乳动物体内构建得到。

9.如下任一种方法：

(1) 权利要求8所述的人脑胶质瘤动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1所述的人脑胶质瘤细胞系或权利要求2所述的子代细胞系接种到非人哺乳动物体内构建得到权利要求8所述人脑胶质瘤动物模型；

(2) 权利要求1所述的人脑胶质瘤细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：获取临床人脑胶质瘤组织，对所述人脑胶质瘤组织进行原代培养，对所述原代培养的肿瘤细胞进行传代培养，获得权利要求1所述人脑胶质瘤细胞系。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为免疫缺陷的小鼠；

所述接种的细胞数量为2×10⁵个；

所述接种的方式为原位注射；

所述传代培养的培养基的组成为：DMEM/F12培养液、5%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、1%B27、0.5% N2、10 μg/mL insulin、10 ng/mL bFGF、10 ng/mL EGF、10 ng/mL PDGF-AB。