CN103131667A - 一种淋巴道高转移活性的胰腺癌细胞系 - Google Patents

Abstract

本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种淋巴道高转移活性的胰腺癌细胞系。本发明采用人胰腺癌BxPC-3细胞系为源细胞，通过裸鼠爪垫皮下连续接种法，在母系BxPC-3细胞中分离不同转移潜能的淋巴转移瘤细胞亚系，通过体内外实验，筛选出淋巴道高转移活性的胰腺癌细胞系BxPC-3-LN，保藏编号：CGMCC No.5421，保藏日期：2011年10月28日。本发明所述的细胞系与母系BxPC-3细胞遗传背景相同，具有侵袭力强、转移效率高和转移集中的特点，为胰腺癌转移机理的研究、抗肿瘤药物的筛选提供了适宜的实验平台，具有非常重要的意义和应用前景。

Description

一种淋巴道高转移活性的胰腺癌细胞系

技术领域

本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种具有淋巴道高转移活性的胰腺癌细胞系。 

背景技术

胰腺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，据报道，近年来胰腺癌的发病率在全球范围内呈上升趋势。胰腺癌其生物学行为特殊，肿瘤转移发生早，手术切除率低，临床治疗效果不佳。临床研究显示，淋巴道转移是胰腺癌主要的转移方式，也是影响其预后的决定性因素，其特点表现为：①转移发生早，即使是小于2cm的小胰癌，已有50％发生淋巴转移；②转移发生率高，胰头癌淋巴转移发生率高达71.2％；③影响预后的关键性因素，据有关统计，胰腺癌淋巴结转移阴性者5年生存率可达15％～40％，而转移阳性的患者5年生存率仅为0％～7.7％；④淋巴转移机制迄今不明，发生率与肿瘤大小、组织学类型等相关性尚不清楚。 

虽然，胰腺癌淋巴道转移特性研究越来越受到重视，但目前国内外尚未有理想的胰腺癌淋巴道转移模型，胰腺癌淋巴转移过程和机制的研究缺少良好的实验平台。目前，国内崔宏等建立了不同转移潜能的人胰腺癌JF305单克隆细胞亚系，研究了其裸小鼠原位移植瘤特性，但与淋巴转移无明确相关；Kawano等用胰腺癌SUIT-4细胞分别注射于裸鼠的皮下和腹腔，出现局部淋巴结转移，并进行相关调控研究，但尚没有建立稳定表型的转移细胞系，其转移潜能强弱、器官亲和性及稳定性等都不明确。 

目前，国内外尚未见有关高淋巴转移特性胰腺癌细胞系的报道。 

发明内容

本发明的目地是提供一种人胰腺癌细胞系，尤其是具有淋巴道高转移活性的人胰腺癌细胞系。该细胞系能为深入研究胰腺癌淋巴转移的机理，预防和治疗胰腺癌淋巴转移提供适宜的实验平台。 

本发明通过将人胰腺癌细胞株BxPC-3裸鼠爪垫皮下连续接种法建立淋巴道转移模型；具体而言，本发明采用人胰腺癌BxPC-3细胞系(ATCC号：CRL1687，由中国科学院上海生命科学研究院提供)作为母细胞，通过裸鼠爪垫皮下连续接种法，在母系BxPC-3 细胞中分离不同转移潜能的淋巴转移瘤细胞亚系，通过体内外实验，筛选出淋巴道高转移活性的胰腺癌细胞系(human pancreatic carcinoma cell line with lymphaticmetastasis potential，BxPC-3-LN)，已于2011年10月28日保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.5421，分类命名：一种淋巴道高转移活性的人胰腺癌细胞系BxPC-3-LN。 

本发明通过下述步骤筛选和建立淋巴道高转移细胞系(如图2所示)： 

1、构建裸小鼠人胰腺癌细胞株BxPC-3淋巴道自发性转移模型 

(1)实验裸小鼠6只，分别在其右后肢爪垫皮下接种1×10⁷个对数生长期BxPC-3细胞； 

(2)8-10周后待原位移植瘤最大径＞2cm时，常规处理，取肉眼可见的(最大的)淋巴结转移灶组织，制成单细胞悬液，200目筛洗滤收集细胞培养； 

(3)将上述步骤(2)获得的细胞接种到另外6只实验裸鼠(接种部位和细胞数同步骤(1))； 

(4)上述步骤反复6次，建立淋巴道转移模型； 

2、单细胞克隆技术分离淋巴结转移亚系 

(1)将上述连续传代法获得的淋巴结转移灶组织，分组培养，分别作为母系细胞； 

(2)细胞培养：BxPC-3淋巴转移细胞在37℃，5％CO₂条件下，在含10％小牛血清的RPMI1640培养液中培养，待细胞近长满瓶底时进行传代； 

(3)有限稀释法稀释细胞使其密度等于或少于10个细胞/ml； 

(4)加入96孔培养板，培养，在倒置显微镜下观察培养板各孔细胞数，挑选只含一个细胞的孔扩增、标记、保存； 

3、细胞建系 

(1)测定单细胞克隆株电泳率； 

(2)流式细胞仪检测单细胞克隆株的细胞周期； 

(3)肿瘤细胞克隆形成试验； 

(4)细胞克隆株稳定性实验，连续传代30次后特性仍稳定，获得淋巴道高转移活性人胰腺癌细胞系BxPC-3-LN。 

本发明的淋巴道高转移活性人胰腺癌细胞系BxPC-3-LN具有以下生物学特性： 

(1)形态：两维培养状态下，BxPC-3-LN细胞呈不规则的圆形，贴壁生长，接触抑制消失，扫描电镜检测发现高转移细胞形态明显异性，除了大量的绒毛样结构外，还伴有板状伪足、丝状伪足和不规则的细胞突触，投射电镜检测发现细胞核浆比例失调，细胞核仁大，细胞器丰富，尤以线粒体和吞噬小体为多； 

(2)倍增时间约36个小时，BxPC-3-LN较母系细胞明显缩短(P＜0.05)，MTT检测发现BxPC-3-LN细胞的增殖速度明显快于母系细胞(P＜0.05)； 

(3)流式细胞分析结果表明，BxPC-3-LN细胞G1期57.6％，S期23.9％，G2-M期18.7％，与母系细胞无明显差异； 

(4)BxPC-3-LN细胞迁移和侵袭力明显强于母系细胞(P＜0.05)，而粘附力较母系细胞低(P＜0.05)； 

(5)BxPC-3-LN细胞接种于裸鼠足垫皮下，其原位成瘤能力明显强于母系细胞(P＜0.05)； 

(6)BxPC-3-LN细胞接种于裸鼠足垫皮下，原位成瘤10周后，其淋巴结转移的发生率100％，明显高于母系细胞(P＜0.05)； 

(7)基因表型：BxPC-3-LN细胞表达明显上调的基因包括TIMP1、ADRM1、RHOF、FLOT2和FLNA等，表达下调的基因包括ROBO1、ADH1C、CDH6、PCDH20和PCDH7等。 

本发明经实验表明，获得的淋巴道高转移活性的胰腺癌细胞系BxPC-3-LN，其裸鼠爪垫皮下移植成瘤率100％，10周后裸鼠淋巴结转移(腘窝、腹股沟、髂血管旁、腹主动脉旁、肾周、肠系膜淋巴结两组以上)发生率100％，结果如图1及表1所示。 

表1.母系和淋巴道高转移活性细胞系淋巴结转移情况比较 

其中，Abbreviations：M，metastatic；T.total；LNs，lymph nodes。 

本发明通过构建裸小鼠人胰腺癌细胞株BxPC-3淋巴道转移模型，克隆分离不同转移潜能的淋巴结转移细胞亚系，筛选获得淋巴道高转移活性人胰腺癌细胞系BxPC-3-LN。 所述的细胞系具有特殊的转移表现，接种于裸鼠爪垫可发生100％淋巴结转移，为国内首例具有高淋巴道转移的人胰腺癌细胞系；该细胞系与母系BxPC-3细胞遗传背景相同，具有侵袭力强、转移效率高和转移集中的特点，为胰腺癌转移机理的研究、抗肿瘤药物的筛选提供了适宜的实验平台，具有非常重要的临床意义和应用前景。 

附图说明

图1为裸鼠淋巴道转移模型中的各组(N1，2，3)淋巴结示意图，其中， 

N1：PO腘窝IN腹股沟，N2：IL髂血管PA腹主动脉旁，N3：PR肾周ME肠系膜。 

图2显示了两维培养状态(LM)、扫描电镜(SEM)和投射电镜(TEM)下细胞的形态和结构，其中，BxPC-3-LN细胞呈不规则的圆形，贴壁生长，接触抑制消失；扫描电镜检测发现高转移细胞形态明显异性，除了大量的绒毛样结构外，还伴有板状伪足、丝状伪足和不规则的细胞突触，投射电镜检测发现细胞核浆比例失调，细胞核仁大，细胞器丰富，尤以线粒体和吞噬小体为多。 

图3显示了裸鼠爪垫皮下接种BxPC-3-LN细胞后淋巴结转移情况。 

图4为BxPC-3-LN细胞系爪垫接种淋巴结转移灶HE染色图。 

具体实施方式

实施例1 建立高淋巴道转移潜能的人胰腺癌细胞系 

1.细胞和动物： 

(1)人胰腺癌细胞株：BxPC-3，ATCC号：CRL1687。购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。 

(2)实验动物：裸鼠，雄性，5～7周龄，18～20g。在无特殊病原体环境下饲养，恒温25～27℃，置于层流超净架上，每只饲养箱内饲养4～6只裸鼠。 

2.方法：本实验采用裸鼠体内连续接种、连续筛选方法 

(1)裸鼠爪垫皮下接种：取BxPC-3细胞0.1ml(1～2×10⁷cell/ml)接种于实验裸鼠左侧爪垫内侧皮下位置，每轮6～8只；接种裸鼠在无特殊病原体环境下饲养；7～8周后常规处理实验裸鼠；无菌条件下取得同侧腘窝、腹股沟、髂总动脉旁和肾门等处的转移淋巴结。 

(2)体外原代培养扩增转移淋巴结内的肿瘤细胞：将上述取得的淋巴结置于无菌细胞培养皿内，用PBS清洗2～3次，剔除淋巴结之外的结缔组织；在200目不锈钢细 胞筛网上轻轻研磨，采用含10％胎牛血清的RPM1640培养基冲洗筛网2～3次得到单细胞悬液；将获得的细胞悬液转移至24孔板内(1ml/孔)常规培养，24小时后换液，换液时缓慢冲洗孔底，除去不粘附的淋巴细胞及细胞碎屑，继续培养。 

(3)传代培养和细胞纯化：原代培养的细胞80％汇合后，常规消化细胞然后转移至6孔板中，逐级扩大培养；转移至25cm²培养瓶后进入常规培养阶段；在肿瘤细胞扩增时联合应用机械刮除法和梯度消化法除去混杂的成纤维细胞，前者是先在倒置显微镜下划出成纤维细胞密集的区域，再用细胞刮棒刮除之；后者是应用消化液消化时肿瘤细胞和成纤维细胞脱壁时间不同的特性，严格控制消化时间，分离两种细胞，在逐级扩大培养过程中联合应用上述两种方法，扩增并纯化转移淋巴结中的肿瘤细胞。 

(4)将上述步骤培养所得细胞再次接种于实验裸鼠爪垫皮下，相同方法重复上述2.1～2.3步骤若干轮。 

3.细胞建系：上述若干轮体内连续筛选后所得淋巴结内肿瘤细胞再经细胞原代培养和细胞纯化，转移至细胞常规培养，培养液为含10％小牛血清的RPM1640培养液，培养环境：37℃、5％CO2、饱和湿度，1～2天更换培养液；每4～5天传代一次，获得的淋巴道高转移活性的胰腺癌细胞系BxPC-3-LN；常规冻存后细胞复苏存活良好。 

实施例2 BxPC-3-LN细胞系淋巴道转移裸小鼠模型 

1.细胞和动物： 

(1)高淋巴道转移潜能的人胰腺癌细胞系BxPC-3-LN。 

(2)实验动物：裸鼠，雄性，5～7周龄，18～20g。在无特殊病原体环境下饲养，恒温25～27℃，置于层流超净架上，每只饲养箱内饲养4～6只裸鼠。 

2.方法：淋巴道转移实验裸小鼠模型 

(1)裸鼠爪垫皮下接种：取BxPC-3-LN细胞0.1ml(1×10⁷cell/ml)接种于上述裸鼠左侧爪垫内侧皮下位置，每组8只，接种裸鼠在无特殊病原体环境下饲养，8～10周后常规处理，无菌条件下取得同侧腘窝、腹股沟、髂总动脉旁和肾门等处的转移淋巴结。 

(2)检测结果显示，实验裸鼠爪垫皮下移植成瘤率为100％，裸鼠淋巴结转移(腘窝、腹股沟、髂血管旁、腹主动脉旁、肾周、肠系膜淋巴结两组以上)发生率为100％。 

Claims (6)

1.一种具有淋巴道高转移活性的人胰腺癌细胞株，其特征在于，所述细胞的分类命名：淋巴道高转移活性人胰腺癌细胞系BxPC-3-LN，保藏编号：CGMCC No.5421，保藏日期：2011年10月28日，其生物学特征为：(1)形态：两维培养状态下，细胞呈不规则的圆形，贴壁生长，接触抑制消失；扫描电镜检测细胞形态明显异性，具大量绒毛样结构，伴有板状伪足、丝状伪足和不规则的细胞突触；投射电镜检测细胞核浆比例失调，细胞核仁大，细胞器丰富，以线粒体和吞噬小体为多；(2)倍增时间36个小时，增殖速度快于母系细胞；(3)BxPC-3-LN细胞G1期57.6％，S期23.9％，G2-M期18.7％；(4)BxPC-3-LN细胞迁移和侵袭力强于母系细胞，粘附力较母细胞低；(5)BxPC-3-LN原位成瘤能力强于母细胞。

2.按权利要求1所述的具有淋巴道高转移活性的人胰腺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株其源细胞是人胰腺癌BxPC-3细胞系株ATCC号：CRL1687。

3.按权利要求1所述的具有淋巴道高转移活性的人胰腺癌细胞株，其特征在于，所述的BxPC-3-LN细胞的原位成瘤10周后，其淋巴结转移的发生率为100％。

4.按权利要求1所述的具有淋巴道高转移活性的人胰腺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株其表达的基因TIMP1、ADRM1、RHOF、FLOT2和FLNA明显上调，其表达的基因ROBO1、ADH1C、CDH6、PCDH20和PCDH7下调。

5.权利要求1所述的具有淋巴道高转移活性的人胰腺癌细胞株的筛选和建立方法，其特征在于，其包括步骤：

1)构建裸小鼠人胰腺癌细胞株BxPC-3淋巴道自发性转移模型

(1)裸小鼠6只，分别在右后肢爪垫皮下接种1×10⁷个对数生长期BxPC-3细胞；

(2)8-10周后待原位移植瘤最大径＞2cm，时处理裸小鼠，取淋巴结转移灶组织，制成单细胞悬液，200目筛洗滤收集细胞培养；

(3)将步骤(2)获得的细胞接种到另外6只实验裸鼠，接种部位和细胞数与步骤(1)相同；

(4)反复上述步骤6次，建立淋巴道转移模型；

2)单细胞克隆技术分离淋巴结转移亚系

(1)将上述连续传代法获得的淋巴结转移灶组织，分组培养，分别作为母系细胞；

(2)细胞培养：BxPC-3淋巴转移目细胞在37℃，5％CO₂条件下，在含10％小牛血清的RPMI1640培养液中培养，待细胞满瓶底时进行传代；

(3)有限稀释法稀释细胞使其密度等于或少于10个细胞/ml；

(4)加入96孔培养板，培养，挑选只含一个细胞的孔扩增、标记、保存；

3)细胞建系

(1)测定单细胞克隆株电泳率；

(2)流式细胞仪检测单细胞克隆株的细胞周期；

(3)肿瘤细胞克隆形成试验；

(4)细胞克隆株稳定性实验，连续传代30次后特性仍稳定，获得淋巴道高转移活性人胰腺癌细胞系BxPC-3-LN。

6.权利要求1所述的具有淋巴道高转移活性的人胰腺癌细胞株在筛选抗胰腺癌转移药物中的用途。

Images