CN100595273C - 一种胰腺癌高肝转移细胞系 - Google Patents
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Abstract
本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种具有高肝转移潜能的胰腺癌高肝转移细胞系SW1990HM。本发明细胞系具备特殊的转移表型，接种于裸鼠脾脏可发生100%肝转移，是国内首例具有高肝转移潜能的人胰腺癌细胞系。所述的高肝转移细胞株与源细胞遗传背景相同，具有侵袭力强、转移效率高和转移范围大的特点，为深入研究胰腺癌肝转移的机理，预防和治疗胰腺癌肝转移提供了适宜的实验平台。
Description
技术领域
本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种具有高肝转移潜能的胰腺癌高肝转移细胞系。
背景技术
我国胰腺癌发病率近年来呈上升趋势，大多数病例确诊时已属晚期。据报道，80％的患者在确诊时已发生远处转移或局部浸润，生存期4-6个月，5年生存率不足5％。肝转移在晚期胰腺癌中十分常见，肝转移发生率达50％以上，腹腔转移也有25％，术后患者局部复发率也达到50-80％，目前尚无有效的治疗手段。胰腺癌肝转移是一个复杂的过程，建立胰腺癌肝转移模型是研究肝转移机理和抗肝转移药物的筛选关键的一步。
1984年Kozlowski等首次提出研究人类肿瘤肝转移的最佳模型为脾脏内移植瘤细胞，这种模式很快广泛应用于消化道肿瘤肝转移的研究，人结肠癌、胃癌和胰腺癌等肝转移模型先后建立。纵观国内外的人胰腺癌动物模型，在胰腺癌的相关研究中目前仅见两篇报道。Vezeridis MP等曾采用体内连续筛选法，从人胰腺癌细胞株COLO357中成功分离并建立了L3.5。Shishido T曾采用体内连续筛选法，从人胰腺癌细胞株HPC-3中成功分离并建立了HPC-3H4。国内目前尚没有胰腺癌肝转移模型，胰腺癌肝转移的研究缺少良好的实验平台。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高肝转移潜能的人胰腺癌细胞系。本发明的人胰腺癌细胞系能为胰腺癌肝转移和抗肝转移药物筛选的研究建立良好的实验平台，有利于对胰腺癌转移的机理进行深入研究。
本发明通过连续人胰腺癌SW1990细胞脾脏移植法建立人胰腺癌细胞系。本发明采用人胰腺细胞SW1990细胞系作为源细胞，所述的人胰腺癌SW1990细胞株来源于分化II级的胰腺腺癌的脾脏转移瘤，建株于1978年，ATCC号：CRL-2712，由中山大学实验动物中心细胞库提供。本发明通过裸小鼠体内连续筛选法，建立了一种稳定的具有高肝转移潜能的胰腺细胞系。(human pancreatic carcinomacell line with high liver metastasis potential，SW1990HM)。已于2006年11月14日保藏，保藏单位：CGMCC，北京市海淀区中关村北一条13号，保藏编号：CGMCC No.1864，分类命名：人胰腺细胞高肝转移细胞株SW1990HM。本细胞株具有以下生物学特性：该细胞株体外培养生长良好，每3天传代一次；SW1990HM细胞呈圆梭型、胞浆丰富、贴壁生长、接触性生长抑制消失；细胞倍增时间约为56小时；主流染色体数目为65～78条，呈近三倍体型，而源细胞的主流染色体数目为67～75条，与ATCC提供的数据相符；流式细胞分析表明，SW1990HM细胞周期各时相的百分率分别为凋亡细胞G1期53.74％，S期31.89％，G2-M期14.37％，与源细胞无明显差异(P＞0.05)。CCT8法描记的细胞生长曲线提示，SW1990HM细胞增殖速度较源细胞快(P＜0.05)；体外细胞成瘤性结果证实，两种细胞的成瘤率均为100％，但SW1990HM组的移植瘤增长速度较源细胞组显著加快(P＜0.05)；浸润、迁徙实验的结果证实，SW1990HM细胞较源细胞有更强的侵袭能力(P＜0.05)。SW1990HM细胞MMP-2、VEGF、bFGF和E-cadherinmRNA表达水平均高于SW1990细胞，其中只有MMP-9mRNA表达水平低于SW1990细胞。
本发明经实验表明，SW1990HM细胞系脾脏移植裸鼠模型，其原位移植成瘤率100％，8周后裸鼠发生100％肝转移。
表1是SW1990和SW1990HM细胞系脾脏移植肝转移情况比较。
表1
| 胰腺癌细胞株 | 脾内注射细胞剂量 | 解剖时间 | 肝转移裸鼠/总移植裸鼠 | 肝转移率 |
| SW1990 | 5×10<sup>6</sup>(个/ml) | 8周 | 4/10 | 40％ |
| SW1990HM | 5×10<sup>6</sup>(个/ml) | 8周 | 10/10 | 100％ |
本发明采用裸小鼠体内连续筛选法，将具有人胰腺细胞SW1990细胞系接种于裸小鼠的脾脏部位，由于该部位具有特殊的血管丰富的组织结构，相当于持续向肿瘤细胞施加血道转移的压力，获得在一定时间内稳定的具有高肝转移潜能的细胞系。本发明包括如下步骤：
1.建立胰腺癌脾脏移植瘤模型：将对数生长期的SW1990人胰腺癌细胞采用胰酶消化制成细胞悬液(5×107/毫升)，按本领域公知的脾脏移植瘤模型建立方法，建立胰腺癌脾脏移植瘤模型。
2.体外原代培养扩增肝转移灶中的肿瘤细胞：8周后处死裸小鼠，无菌操作取出肝转移灶，剪碎，加入胶原酶消化2-3小时；离心祛除上清液，加入培养基移至培养皿培养。
3.步骤2中扩增的肿瘤细胞接种于裸小鼠脾脏，方法同步骤1，重复上述过程6轮。
4.细胞建系：经上述6轮筛选后，肿瘤细胞常规传代培养，培养液为RPMI1640加10％胎牛血清，培养温度为37℃，气体环境为5％CO2/95％空气，湿度为饱和湿度，隔天更换培养液，每3天传代一次，常规冻存后复苏成活良好。
经上述连续6轮裸小鼠肝转移筛选，建立了具有高肝转移潜能的人胰腺癌细胞系，命名为高肝转移潜能人胰腺癌细胞系SW1990HM(human pancreaticcarcinoma cell line with high liver metastasis potential)。
本发明细胞系具备特殊的转移表型，即接种于裸鼠脾脏可发生100％肝转移，是国内上首例具有高肝转移潜能的人胰腺癌细胞系。所述的高肝转移细胞株具有与源细胞遗传背景相同、侵袭力强、转移效率高和转移范围大的特点，为深入研究胰腺癌肝转移的机理，预防和治疗胰腺癌肝转移提供了适宜的实验平台。
附图说明
图1为培养的SW1990HM细胞，HE染色，200×；呈圆梭型、胞浆丰富上皮样细胞，贴壁生长，细胞核大而深染，核仁明显，可见病理性核分裂像。
图2为SW1990HM细胞的核型，主流染色体数目为65～78条，呈近三倍体型。
图3为SW1990细胞SW1990HM细胞脾脏种植8周后肝转移情况比较，其中，A中可见SW1990细胞脾脏移植肝转移灶；B中可见SW1990HM细胞脾脏移植肝转移灶，SW1990HM细胞的肝转移范围明显多于SW1990细胞。
图4A为SW1990HM细胞系脾脏种植肝转移灶HE染色，200×；B为SW1990HM细胞系脾脏种植瘤HE染色，200×。
具体实施方式
实施例1建立高肝转移潜能的人胰腺癌细胞系
1)建立胰腺癌脾脏移植瘤模型：将对数生长期的SW1990人胰腺癌细胞用胰酶消化，吹打成单细胞悬液，Trypan Blue染色计活细胞比率在98％以上，调整浓度至5×107/ml。0.4％的戊巴比妥钠溶液(45mg/kg)腹腔内麻醉裸鼠，腹部消毒，取上腹正中线左侧0.5cm处行纵行切口，长度约8mm，进腹后找到脾脏，暴露脾脏并固定，在脾脏下级缓慢注射上述肿瘤细胞悬液0.1ml，拔针后压迫止血，将脾脏轻轻送回腹腔，缝合腹壁肌层及皮肤。
2)体外原代培养扩增肝转移灶中的肿瘤细胞：常规饲养8周后，处死裸小鼠，并用75％的酒精浸泡消毒5分钟；无菌操作，解剖裸小鼠，完整取出肝脏，在生理盐水中漂洗3次；在解剖显微镜下，用眼科剪剪取肝转移灶，将其剪碎后，加入胶原酶移至培养皿中消化2-3小时；然后离心祛除上清液，加入培养基移至培养皿培养；待细胞贴壁后，更换新鲜细胞培养基；用半消化法和半机械法清除成纤维细胞；
3)步骤2中扩增的肿瘤细胞接种于裸小鼠脾脏，方法同步骤1。重复上述过程6轮。
4)细胞建系：经上述6轮筛选后，肿瘤细胞常规传代培养，培养液为RPMI1640加10％胎牛血清，培养温度为37℃，气体环境为5％CO2/95％空气，湿度为饱和湿度，隔天更换培养液，每3天传代一次，常规冻存后复苏成活良好。经上述连续6轮裸小鼠肝转移筛选，建立了具有高肝转移潜能的人胰腺癌细胞系。
实施例2 SW1990HM细胞系脾脏移植肝转移裸小鼠模型的应用
1)体外常规培养条件为含10％胎牛血清的RPMI1640培养液，37℃，5％CO2/95％空气，饱和湿度。
2)生长至对数生长期的SW1990HM细胞，用0.25％胰酶+0.1％EDTA常规消化，PBS洗涤细胞，台盼兰排除法计数活细胞，制备细胞悬液，浓度为5×107/毫升。
3)取上述细胞悬液0.1毫升(5×106个)，接种于10只4-6周龄BALB/C-nu/nu雄性裸小鼠的脾脏，无特殊病原体环境下饲养。
4)常规饲养8周后，处死裸小鼠，并用75％的酒精浸泡消毒5分钟；无菌操作，解剖裸小鼠，完整取出肝脏，在生理盐水中漂洗3次；10％福尔马林溶液固定，连续切片，常规HE染色后显微镜下观察肝转移情况，结果显示：SW1990HM细胞系脾脏原位移植成瘤率100％，8周后裸鼠发生100％肝转移，SW1990HM的肝转移范围明显多于SW1990。
Claims (2)
1、一种胰腺癌高肝转移细胞株，其特征是所述细胞株为人胰腺细胞高肝转移细胞株SW1990HM，保藏编号：CGMCC No.1864，具有以下生物学特性：细胞呈圆梭型、胞浆丰富、贴壁生长、接触性生长抑制消失；细胞倍增时间为56小时；其主流染色体数目为65～78条，呈近三倍体型，细胞周期各时相的百分率分别为凋亡细胞G1期53.74％，S期31.89％，G2-M期14.37％，细胞增殖速度比源细胞快；细胞的成瘤率为100％，移植瘤增长速度比源细胞快；侵袭能力比源细胞强。
2、按权利要求1所述的胰腺癌高肝转移细胞株，其特征在于，其中所述的源细胞是人胰腺癌SW1990细胞株，ATCC号：CRL-2712。
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