CN1338512A - 一种人肝癌细胞系 - Google Patents

Abstract

本发明属微生物动物细胞系领域,具体涉及从肺转移灶中建立有转移表型的人肝癌细胞系,本发明采用裸鼠肺转移灶瘤,通过裸鼠体内连续肺转移法筛选获得具备特殊转移表型、皮下接种即发生高度肺转移的人肝癌细胞系HCCLM3,本发明对深入研究肝癌肺转移的机理和防治肺转移提供了适宜的实验材料。

Description

一种人肝癌细胞系

技术领域

本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及从肺转移灶中建立有转移表型的人肝癌细胞系。

背景技术

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。手术切除是最有效的治疗措施。但即使是直径小于5cm的小肝癌，手术后的5年复发率也高达40-50％。肝癌侵袭和转移是成功治疗的最大障碍。在肝癌转移中，肺脏是最常见的转移器官，也是病人致死的重要原因之一。为深入了解肝癌细胞的侵袭和转移等恶性生物学行为，必须建立适宜的研究模型。目前普遍应用的人癌转移模型，是人癌接种于免疫缺陷动物，主要是指在裸小鼠体内形成的人癌裸鼠转移模型，和能在免疫缺陷动物体内发生转移的人癌细胞系。复旦大学肝癌研究所曾建立了人肝细胞癌裸小鼠模型(肿瘤1986，6：10-13)、高转移人肝细胞癌裸小鼠模型(Int J Cancer 1996，66：239-243)、高转移人肝细胞癌细胞系(Br J Cancer 1999，81：814-21)，不同转移潜能的人肝癌细胞克隆株(中华肝胆外科杂志，待发表)。这些为研究肝癌转移提供了可取的实验材料。然而，纵观国内外的人肝癌模型，尚无来自肺转移灶的人肝癌细胞系，无法对原发瘤细胞系和肺转移灶细胞系的生物学行为进行对比研究，也就难以寻找针对肺转移的有效防治策略。

发明内容

本发明的目的是从裸鼠肺转移灶中建立特殊表型人肝癌细胞系，以利于深入研究肝癌肺转移的机理，并为防治肺转移提供适宜的实验材料。本发明的另一目的是建立有特殊转移表型人肝癌细胞系的方法。本发明采用裸鼠体内连续筛选法，将高转移性人肝癌单克隆细胞株MHCC97-H接种于裸鼠肝脏，进而发生肺转移，连续筛选三次，建立有转移表型的人肝癌细胞系HCCLM3。具体方法如下：

1.第一轮裸鼠肺转移筛选，取MHCC97-H细胞5×10⁶/0.2mL接种于裸鼠皮下。裸小鼠为BALB/C-nu/nu，雄性，4-6周龄，购于中国科学院上海药物研究所，无特殊病原体环境下饲养。2周后皮下瘤生长至直径约1.0cm，取皮下瘤切成直径1mm的瘤组织小块原位接种于裸鼠肝脏，42天后裸鼠衰竭，取出肺转移灶复种植于裸鼠皮下，72天后，肺转移灶在裸鼠皮下扩增成直径1.5cm肿瘤。

2.第二轮裸鼠肺转移筛选，取上述裸鼠皮下瘤按第一轮方法复种裸鼠肝脏，行第二轮筛选，28天后，肺转移灶在裸鼠皮下扩增成直径1.5cm肿瘤。

3.第三轮裸鼠肺转移筛选，取出第二轮裸鼠肺转移筛选获得的皮下瘤，重复上述过程，25天后，肺转移灶在裸鼠皮下扩增成直径1.5cm肿瘤。

4.细胞培养建系，取出肺转移灶皮下扩增瘤进行细胞培养，培养液为高糖DMEM培养基(GIBCOBRL，Grand Island，NY，USA)加10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，Utah，USA)。培养温度为37℃，气体环境为5％CO₂/95％空气，湿度为饱和湿度。细胞生长稳定，隔天更换培养液，每5天传代一次，常规冻存后复苏成活良好。

本发明经上述连续3次裸鼠肺转移筛选，建立了特殊转移表型人肝癌细胞系HCCLM3(Human hepatocellular carcinoma cell linelung metastasis，3rd selection)。

本发明细胞系经检测，其一般生物学特性表明该细胞系为多边形上皮样细胞，贴壁生长，接触性生长抑制丧失，亚三倍体核型，染色体范围37-60条，细胞群体倍增时间44.5小时，克隆形成率32.4±3.2％，细胞随机运动速度20±2μm/h。流式细胞分析表明，细胞周期各时相的百分率分别为凋亡细胞9.18％，G1期56.37％，S期23.09％，G2-M期8.88％。免疫细胞化学染色表明，MHCCLM3细胞AFP、白蛋白、细胞角质蛋白8呈强阳性，P16阳性，P53，nm23，HBsAg阴性。荧光PCR法检测细胞基因组中有HBV DNA整合。

本发明细胞系成瘤性与转移性检测表明，5×10⁶细胞/0.2 ml剂量接种裸鼠皮下，成瘤率100％(10/10)，成瘤潜伏期为11.0±1.0天，皮下瘤生长迅速，接种后第15天，肿瘤表面即出现明显血管网；30天后肿瘤体积达3568.8±450mm³。5周后裸鼠发生100％肺转移，肺脏转移灶的中位数为121个/肺。

将皮下瘤切成直径1mm的瘤组织小块原位接种于裸鼠肝脏35天后，裸鼠出现广泛性癌转移：腹壁侵犯10/10，腹腔内转移(肝胃韧带、网膜、胰腺等)8/10，肝脏内转移10/10，膈肌转移7/10，肺转移10/10，肺脏转移灶中位数为268个/肺。

表1为本发明细胞系的成瘤性和转移性的测试数据。

上述结果表明，本发明细胞系展示了特殊的转移表型，即接种于裸鼠皮下即发生100％肺转移，且转移灶多，是具有特殊转移表型的、皮下接种即发生高度肺转移的人肝癌细胞系。为深入研究肝癌肺转移的机理，和防治肝癌肺转移提供适宜的实验材料。

表1

             检测项目                            结果肿    接种剂量                                5×10⁶细胞/0.2ml瘤细    接种裸鼠数                              10只胞    成瘤率                                  100％(10/10)裸鼠    成瘤潜伏期(天)                          11±1皮下    接种30天后皮下瘤体积(平均值±标准差)    3568.125±450 mm³接    接种5周后的肺脏转移率                   100％(10/10)种

  裸鼠肺脏转移灶的中位数                  121个/肺皮    瘤组织块接种剂量                        1×1×1 mm³/裸鼠下瘤    接种裸鼠数                              10只组    观察时间                                35天织小    35天后肝脏肿瘤的平均体积(平均值±标准差)5080±160mm³块接    35天后腹部的转移情况种       腹壁转移                             100％(10/10)裸       腹腔内转移                           80％(8/10)鼠       肝内转移                             100％(10/10)

     膈肌转移                             70％(7/10)肝脏    35天后肺转移率                          100％(10/10)

     肺转移灶的中位数                     268个/肺

附图说明

图1为培养的HCCLM3细胞，Giemsa染色，200×。多边形上皮样细胞，贴壁生长，细胞核大而深染，核仁明显，可见病理性核分裂像。

图2为HCCLM3细胞5×10⁶细胞/0.2 ml剂量接种裸鼠皮下35天后，形成肿瘤体积为3188mm³。

图3为HCCLM3细胞皮下瘤癌组织接种肝脏后35天，箭头所指是腹壁和腹腔内转移灶。

图4为HCCLM3细胞皮下瘤癌组织接种肝脏后35天，肝脏各叶见多个转移结节。

图5为HCCLM35×10⁶细胞/0.2ml剂量接种裸鼠皮下35天后，在肺部形成大转移灶，包围小支气管，HE染色，200×。

Claims (3)

1.一种人肝癌细胞系，其特征在于来源于裸鼠肺转移灶，通过裸鼠体内连续肺转移筛选获得，具备人肝癌细胞系的形态学和生物学特性，还具备特殊转移表型。

2.按权利要求1所述的人肝癌细胞系，其特征在所述的细胞系的特殊转移表型是接种于裸鼠皮下即可发生100％肺转移。

3. 一种按权利要求1所述的人肝癌细胞系的建立方法，其特征在于通过连续裸鼠肺转移筛选法建立，具体步骤如下：

(1)第一轮裸鼠肺转移筛选，取MHCC97-H细胞接种于裸鼠皮下，待皮下瘤生长至直径约1.0cm，取皮下瘤切成瘤组织小块原位接种于裸鼠肝脏，裸鼠衰竭后，取出肺转移灶复种植于裸鼠皮下，肺转移瘤在裸鼠皮下扩增成瘤。

(2)第二轮裸鼠肺转移筛选，取上述裸鼠皮下瘤复种裸鼠肝脏，方法同前，行第二轮筛选。

(3)第三轮裸鼠肺转移筛选，取出第二轮裸鼠肺转移筛选获得的皮下瘤，重复上述过程。

(4)细胞培养建系，取出肺转移灶皮下扩增瘤进行细胞培养，培养液为含10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，Utah，USA)的高糖DMEM培养基(GIBCOBRL，Grand Island，NY，USA)。培养条件：37℃，5％CO₂/95％空气，饱和湿度。隔天更换培养液，每5天传代一次。

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