CN108467855B - 新的肺特异性转移肝癌细胞及其制备 - Google Patents

新的肺特异性转移肝癌细胞及其制备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肺特异性转移肝癌细胞3B‑LM，具体地，所述细胞3B‑LM是中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：C2016173的HEP‑3B器官特异性转移细胞系LM。

Description

新的肺特异性转移肝癌细胞及其制备
技术领域
本发明属于生物学和肿瘤学领域，具体地，本发明涉及一种肺特异性转移肝癌细胞。
背景技术
在世界范围内，肝细胞癌是导致肿瘤相关死亡的第二大因素，肝癌的高转移性导致肝癌病人使经过药物治疗后预后很差，临床常见的肝癌转移为肝内转移、肺转移和肺转移。
肝癌的转移涉及多个过程，包括肿瘤细胞在肝脏原位的脱落，侵袭周围组织，进入血液系统，在血液系统中的存活以及出血管进而在远端组织器官形成克隆，每个过程都涉及肿瘤细胞本身的变化以及肿瘤和微环境之间的相互作用，具体作用机制也并不完全清楚。
肿瘤细胞系在肿瘤的基础研究中具有重要地位，体外培养肿瘤细胞是较困难的，尤其建立能够长期生长、传代，又具有一定特征的人肿瘤细胞系，通常会遭遇传代特征不稳定、成瘤性差、遗传背景不一致或特异性标志物表达差异大等情况。在肿瘤转移研究中，乳腺癌居多，关于乳腺癌各个器官特异性转移细胞的构建得到肿瘤转移的研究者的认可和使用，如MDA-MB-231基础上得到的肺特异性转移细胞系1833以及肺特异性转移细胞系4175等，而肝癌特异性转移的细胞至今还没人构建，我们构建的hep-3B细胞器官特异性转移的子代细胞系能够作为为肝癌肺转移和肺转移研究的工具。
因此，本领域迫切需要开发一种适合现代肝癌细胞研究且可稳定用于动物模型建立的肝癌细胞系，尤其是常见的转移性肝癌细胞系。
发明内容
本发明提供了一种肺特异性转移肝癌细胞系。
本发明第一方面，提供了一种肺特异性转移肝癌细胞3B-LM，所述细胞3B-LM是中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：C2016173的HEP-3B器官特异性转移细胞系LM。
本发明第二方面，还提供了本发明第一方面所述肺特异性转移肝癌细胞的子代细胞，所述子代细胞能够导致裸鼠和/或人形成肺特异性转移的肝癌。
在另一优选例中，所述的子代细胞基本在另一优选例中，所述的子代细胞基本保留(≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)或全部保留了亲代的肺特异性转移肝癌细胞3B-LM的结构与特性。
在另一优选例中，所述的子代细胞是3B-LM细胞经过10代以内，较佳地，5代以内，更佳地、3代以内传代的子代细胞。
在另一优选例中，所述的子代细胞基本保留或全部保留了亲代的肺特异性转移肝癌细胞3B-LM的特性。
在另一优选例中，如本发明第一方面所述细胞(或本发明第二方面的子代细胞)，所述肺特异性转移肝癌细胞(或子代细胞)具有以下一个或多个特性：
(a)所述的细胞具有特定的miRNA表达谱，所述的miRNA表达谱包括以下特征：
Figure GDA0003182891990000021
(b)所述细胞的肺转移率≥80％；和/或
(c)所述细胞的肺以外脏器转移率＜20％。
本发明第三方面，提供了本发明第一方面所述肺特异性转移肝癌细胞(或本发明第二方面所述子代细胞)的用途，其特征在于，用于制备非人哺乳动物的肺特异性转移肝癌模型或用于筛选治疗肺特异性转移肝癌的候选化合物。
在另一优选例中，所述的哺乳动物选自大鼠、小鼠、兔、羊、狗、猴子。
在另一优选例中，所述的哺乳动物是免疫缺陷实验动物。
在另一优选例中，所述的动物为裸鼠(T细胞缺陷)
本发明第四方面，提供了一种建立肺特异性转移肝癌细胞动物模型的方法，包括步骤：(i)将5×105-1×106个本发明第一方面所述肺特异性转移肝癌细胞(或其子代细胞)接种于裸鼠；
(ii)培养(i)中的裸鼠21-42天，取出小鼠肺，剪碎，collagen酶消化获得单细胞悬浮液，DMEM培养基中培养待细胞贴壁后进行流式细胞仪分选GFP阳性细胞，从而获得肺特异性转移肝癌细胞动物模型。
在另一优选例中，所述细胞增长较快，10cm dish 1传4隔天能达到80％作用的密度，同时该细胞带有GFP以及m-cherry筛选标记。
在另一优选例中，所述的哺乳动物为免疫缺陷小鼠，如裸鼠，培养21-42天。
在另一优选例中，所述的接种是接种于以下部位：尾静脉、腹腔、尾静脉、皮下部位、肝脏或其组合。
本发明第五方面，提供了一种筛选治疗肺特异性转移肝癌的候选化合物的方法，包括步骤：
(a)将5×105—1×106本发明第一方面所述肺特异性转移肝癌细胞(或其子代细胞)接种于哺乳动物；
(b)培养步骤(a)的哺乳动物21-42天，获得肺特异性转移肝癌动物模型；和
(c)将测试化合物施用于步骤(b)的肺特异性转移肝癌动物模型，并与未施用测试化合物的步骤(b)的肺特异性转移肝癌动物模型进行比较，其中施用后导致肺特异性转移肝癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肺特异性转移肝癌的候选化合物；
或者所述方法包括：
(a1)测试组中，在本发明第一方面所述的肺特异性转移肝癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察肺特异性转移肝癌细胞的数量和/或生长情况；在对照组中，在肺特异性转移肝癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察肺特异性转移肝癌细胞的数量和/或生长情况；
其中，如果测试组中肺特异性转移肝癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对肺特异性转移肝癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗肺特异性转移肝癌的候选化合物。
本发明第五方面，提供了一种筛选潜在的肝癌肺转移相关基因的方法，包括步骤：
将本发明第一方面所述肺特异性转移肝癌细胞(或其子代细胞)中表达的基因与正常肝细胞中表达的基因比较，筛选出本发明第一方面所述肺特异性转移肝癌细胞中在统计学上表达上调或下调的基因，该基因为潜在的肺特异性转移肝癌相关基因。
在另一优选例中，所述的方法还包括：
对所获得的潜在的肺特异性转移肝癌相关基因进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以选出对于肝癌肺转移起确切作用的基因。
本发明第八方面，提供了一种体外培养肺特异性转移肝癌细胞系的方法，包括步骤：在适合的培养基中，培养本发明第一方面所述的肺特异性转移肝癌细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了所筛选的第一和第二代肝癌细胞系仍然具有随机多器官转移的特性。
图2其中A图显示了经过筛选后，本发明3B-BM细胞系具有极强的特异性肺转移能力；而B图为本发明3B-LM细胞系传代第25代时，仍然具有极强的特异性肺转移能力。
图3显示了本发明细胞系的增殖能力较其母代细胞有显著的增强。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，对数十例转移性肝癌的细胞系进行了大量的筛选和培养，最后建立了一种新的肺特异性转移的肝癌细胞，其成瘤性良好，肺部转移率极高，且传代特性稳定，可用于动物模型建立以及难治性肝癌(或耐药性肝癌)的治疗。更重要的是，本发明还对比了各个特异性转移细胞的特性，找出肝癌进入血液后转移的关键性因子，进而阐明肝癌转移在这一过程的机制。在此基础上，完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“肺特异性转移的肝癌细胞”、“HEP-3B器官特异性转移细胞系LM”“人肺特异性转移的肝癌细胞”、“本发明肝癌细胞”、“本发明细胞”、“3B-LM”可互换使用，均指本发明肺特异性转移的肝癌细胞系3B-LM，其在2016年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉、中国)，保藏编号为CCTCC NO：C2016173。
细胞系特点
对于肝癌细胞而言，其培养条件通常较为苛刻，例如，经本发明人研究，发现本发明采用的hep3B细胞的体外培养条件通常采用10％FBS+DMEM+1％双抗，细胞生长密度70-80％传代时间2天左右。当采用该培养条件下的肝癌细胞时，需注意消化条件，利用0.25％的胰酶，全程温度保持在37℃左右，且应当在细胞混匀至70％程度时立即进行转移细胞的接种。
然而，即使遵照谨慎及苛刻的培养条件进行细胞培养操作，本发明人发现hep-3B细胞的转移概率极低，且转移位点多发，数十个批次筛选后均为获得理想的特异性转移细胞系。本发明人又经过4×7(4代筛选，每代7个重复)批次的转移细胞培养，通过双标记(GFP和luciferase)多次筛选，不仅能在活体水平定位肿瘤细胞的位置，而且能在离体状态下准确分离肿瘤细胞，从而获得了本发明hep-3B肺转移细胞系，发现本发明hep-3B肺转移细胞系具有异常稳定的体外传代特性，在传20-25代之后，该细胞系仍然具有强肺定向转移特性。
一种优选地筛选方法包括步骤：通过两步连续的方式筛选肝癌特异性的肺转移细胞系，首先利用细胞带有的luciferase酶催化底物发光在活体水平定位特定器官的转移灶，从小鼠体内取出转移灶，在荧光显微镜下再次确认是标记的肝癌细胞系；接下来利用商业化的肿瘤消化试剂盒消化肿瘤组织，获得单细胞悬液，再通过流式细胞仪筛选带有GFP的肿瘤细胞，如此反复数十批次，直至获得稳定转移的肝癌细胞系。
筛选操作如下：离体的肿瘤组织在无菌环境下剪碎至1-2mm碎块，利用肿瘤消化试剂盒37度消化2-3小时，过细胞筛，获得单细胞悬液，离心，加入红细胞裂解液，去除红细胞，pbs洗3遍，dmem培养基中培养2-3天至细胞密度达到80％左右，温和消化细胞，以普通小鼠脏器细胞为对照，设定GFP分选的阈值，分选出GFP阳性细胞，即为一次筛选结果，定向重复筛选最终得到稳定转移的肝癌细胞系。
本发明肺特异性转移的肝癌细胞，具有以下一种或多种特征：
(a)所述的细胞具有特定的miRNA表达谱，所述的miRNA表达谱包括以下特征
名称 P值 倍数
hsa-miR-630 0.001395 7.517811004
hsa-let-7b* 0.007213 5.394736902
hsa-miR-31 0.0045 2.179836099
hsa-miR-221 0.00375 1.399764655
hsa-miR-1280 0.000398 1.35582161
hsa-miR-1238 0.005158 1.193000844
hsa-miR-196a 0.003233 0.855249286
hsa-let-7d 0.001348 0.766242289
hsa-let-7f 0.001965 0.755852305
hsa-miR-331-3p 0.002058 0.427181154
hsa-miR-154 0.000145 0.155292969
hsa-miR-296-5p 0.00018 0.117069634
hsa-miR-409-5p 0.000378 0.114102817
hsa-miR-377 0.003546 0.101635533
hsa-miR-409-3p 0.00012 0.026609118
hsa-miR-410 5.99E-08 0.015657723
(b)所述细胞的肺转移率≥80％；和/或
(c)所述细胞的肺以外脏器转移率＜20％。
此外，本领域技术人员可以根据本领域细胞传代培养的常规方法，对3B-LM细胞系进行传代从而获得CH-1的子代细胞。当然，为了保持3B-LM遗传特性的同一性，优选采用3B-LM传25代以内(更佳地为20代以内、15代以内、10代以内、5代以内、3代以内)的细胞系作为3B-LM的子代细胞，当传代至10代以上时，则需通过测序鉴定才能够确定保持子代细胞的同源性。通常，本领域会选用具有亲代细胞系95％以上同源性的子代细胞，且所述的子代细胞必须保持或基本保持亲代细胞的生物特性。
应用
本发明的肺特异性转移肝癌细胞系可用于制备肺特异性转移肝癌动物模型，还可用于筛选治疗肺特异性转移肝癌候选药物。
一种优选的建立肺特异性转移肝癌动物模型的方法，包括步骤：
(i)将5×105-1×106个本发明第一方面所述肺特异性转移肝癌细胞(或其子代细胞)接种于非人哺乳动物；
(ii)培养(i)中的哺乳动物18-35天，从而获得肺特异性转移肝癌细胞动物模型。
其中，所述的接种是接种于以下部位：肝脏、腹腔、尾静脉、皮下部位或其组合；所述的哺乳动物是免疫缺陷实验动物。
一种优选的筛选治疗肺特异性转移肝癌的候选化合物的方法，包括步骤：
(a)将5×105—1×106本发明第一方面所述肺特异性转移肝癌细胞(或其子代细胞)接种于哺乳动物；
(b)培养步骤(a)的哺乳动物，获得肺特异性转移肝癌动物模型；和
(c)将测试化合物施用于步骤(b)的肺特异性转移肝癌动物模型，并与未施用测试化合物的步骤(b)的肺特异性转移肝癌动物模型进行比较，其中施用后导致肺特异性转移肝癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肺特异性转移肝癌的候选化合物；
或者所述方法包括：
(a1)测试组中，在本发明第一方面所述的肺特异性转移肝癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察肺特异性转移肝癌细胞的数量和/或生长情况；在对照组中，在肺特异性转移肝癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察肺特异性转移肝癌细胞的数量和/或生长情况；
其中，如果测试组中肺特异性转移肝癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对肺特异性转移肝癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗肺特异性转移肝癌的候选化合物。
优选地，所述的哺乳动物是免疫缺陷小鼠(裸鼠)，其培养时间为35天。
此外，本发明肺特异性转移肝癌细胞系还可与肝特异性转移肝癌细胞系配对使用，用于筛选潜在的转移性肝癌的基因以及治疗不同部位转移性肝癌的药物筛选。
一种优选的筛选潜在的肺特异性转移肝癌相关基因的方法，包括步骤：
将所述肺特异性转移肝癌细胞或其子代细胞中表达的基因与常规肝癌细胞中表达的基因比较，选出肺特异性转移肝癌细胞中在统计学上表达上调或下调的基因，该基因为潜在的肺特异性转移肝癌相关基因，此外，本方法还包括对所获得的潜在的肺特异性转移肝癌相关基因进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以选出对于肺特异性转移肝癌其确切作用的基因。
根据对本发明肺特异性转移肝癌的mRNA、miRNA谱的测定以及数据分析，如下所示：
Figure GDA0003182891990000081
Figure GDA0003182891990000082
Figure GDA0003182891990000091
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1肺特异性转移肝癌细胞系的筛选与鉴定
该细胞首先标记了GFP，以便进行肺转移细胞的分离，其次，该细胞经改造稳定表达luciferase酶，能够进行小鼠活体成像检测细胞位置以及定量分析，同时由于改细胞在构建luciferase酶的同时标记m-cherry，作为luciferase阳性细胞的筛选标记。该细胞的迁移能力与原hep-3B细胞相比明显增强。
具体地，标记luciferase的hep-3B细胞尾静脉注射裸鼠，20-40天小鼠体内出现随机转移的肝癌病灶，也即原代的hep-3B细胞不具备转移的器官特异性。在随机转移的小鼠中挑选目标器官转移的小鼠，利用胶原酶消化病灶肿瘤块，过细胞筛得到单细胞悬液，培养48小时后流式细胞术分选带有GFP的肿瘤细胞，结果显示所获得的单细胞悬液中只有极少数的肿瘤细胞；其后，对分选出的GFP细胞进行扩大培养，并继续利用该细胞带有的m-cherry进行二次分选，确保得到的是肿瘤细胞，而非小鼠基质细胞。此次得到的细胞为第一代肺转移细胞系，利用该细胞，通过相同的方式得到的是第二代细胞系。第一、二代肺转移细胞系(共14批次)均不具备稳定的肺转移能力，肺转移率分别为30％和40％左右，回输小鼠体内发现仍然出现随机转移的现象，肺外转移较多，如图1所示。
通过活体成像技术以及形态学观察，再次重复以上步骤，筛选出肺转移能力较强的细胞，回输小鼠得到的第三、四代肺转移细胞系(共14批次)，逐渐表现出较强的转移能力，但大多数细胞株在传代后增殖能力逐渐减弱。结果在第四代肺转移中获得一株，具有极强的肺转移的倾向性，肺转移率约80％以上，该细胞株传代2代后(即本发明细胞系)的肺转移结果见图2中的A图，而肺外转移能力降低。该株细胞在稳定传代15次后仍具有上述特征，即稳定的肺转移特性。
实施例2肺特异性转移肝癌细胞小鼠模型的建立与鉴定
2.1将5×105-1×106个肺特异性转移肝癌细胞(或其子代细胞)接种于裸鼠21-42天取出小鼠肺，剪碎，collagen酶消化获得单细胞悬浮液，DMEM培养基中培养待细胞贴壁后进行流式细胞仪分选GFP阳性细胞，从而获得肺特异性转移肝癌细胞。
2.2传代活性鉴定
经鉴定，细胞传代活性较好，传代15-20代仍然能够稳定的特异性肺转移，如图2中的B图。
实施例3肺特异性转移肝癌细胞的基因表达谱鉴定
培养hep-3B细胞以及肺转移特异性细胞传代2次后一部分细胞送往保藏，平行传代的里一部分细胞进行遗传特征鉴定，包括基因测序、miRNA谱以及mRNA谱的差别检测，细胞贴壁，在培养皿中达到50-70％时胰酶消化，离心收集细胞，trizol法裂解细胞，RNA提取，反转录并进行mRNA表达芯片(上海伯豪生物技术有限公司)检测以及基因测序。结果发现保藏细胞以及各子代(2-15代)细胞遗传特征相同。
实施例4种植成瘤率鉴定
按常规方法对本发明肺转移特异性细胞的成瘤率进行了测定，结果发现，其尾静脉成瘤率为100％，其中肺转移特异性在75％以上。
细胞系保藏
本发明的HEP-3B器官特异性转移细胞系LM，于2016.10.18保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉，中国)，保藏号为CCTCC NO：C2016173。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种肺特异性转移肝癌细胞3B-LM，其特征在于，所述细胞3B-LM是中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：C2016173的HEP-3B器官特异性转移细胞系LM，并且所述细胞的肺转移率≥80％；和/或所述细胞的肺以外脏器转移率＜20％。
2.如权利要求1所述肺特异性转移肝癌细胞3B-LM，所述肺特异性转移肝癌细胞3B-LM或其子代细胞具有以下一个或多个特性：
(a)所述的细胞具有特定的miRNA表达谱，所述的miRNA表达谱包括以下特征：
Figure FDA0003182891980000011
(b)所述细胞的基因表达具有如下特征：
Figure FDA0003182891980000012
Figure FDA0003182891980000021
其中，所述的子代细胞是3B-LM细胞经过10代以内传代的子代细胞。
3.权利要求1所述肺特异性转移肝癌细胞3B-LM或其子代细胞的用途，其特征在于，用于制备非人哺乳动物的肺特异性转移肝癌模型或用于筛选治疗肺特异性转移肝癌的候选化合物，其中，所述的子代细胞是3B-LM细胞经过10代以内传代的子代细胞。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的哺乳动物选自大鼠、小鼠、兔、羊、狗、猴子。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的哺乳动物是免疫缺陷实验动物。
6.一种筛选治疗肺特异性转移肝癌的候选化合物的方法，其特征在于，包括步骤：
(a1)测试组中，在权利要求1所述的肺特异性转移肝癌细胞3B-LM的培养体系中添加测试化合物，并观察肺特异性转移肝癌细胞的数量和/或生长情况；在对照组中，在肺特异性转移肝癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察肺特异性转移肝癌细胞的数量和/或生长情况；
其中，如果测试组中肺特异性转移肝癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对肺特异性转移肝癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗肺特异性转移肝癌的候选化合物。
7.一种筛选潜在的肝癌肺转移相关基因的方法，其特征在于，包括步骤：
将权利要求1所述肺特异性转移肝癌细胞3B-LM或其子代细胞中表达的基因与正常肝细胞中表达的基因比较，筛选出权利要求1所述肺特异性转移肝癌细胞3B-LM中在统计学上表达上调或下调的基因，该基因为潜在的肺特异性转移肝癌相关基因。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：
对所获得的潜在的肺特异性转移肝癌相关基因进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以选出对于肝癌肺转移起确切作用的基因。
9.一种体外培养肺特异性转移肝癌细胞系3B-LM的方法，其特征在于，包括步骤：在适合的培养基中，培养权利要求1所述的肺特异性转移肝癌细胞3B-LM或其子代细胞，其中，所述的子代细胞是3B-LM细胞经过10代以内传代的子代细胞。
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