CN101955913B - 具有骨、肝、颌下腺转移高潜能的中国人肺腺癌细胞株 - Google Patents

Abstract

本发明属微生物动物细胞系领域。提供一种具有骨、肝、颌下腺转移高潜能的中国人肺腺癌细胞株。本发明采用肺腺癌首诊患者的胸水作细胞原代培养，该人肺腺癌细胞保藏编号：CGMCC No.3138，分类命名：人肺腺癌细胞系CPA-Yang4，具有致瘤率高达50％～100％；生长快速和代谢旺盛；以骨转移为主且有肝脏、颌下腺多器官转移并具有典型的荷瘤CPA-Yang4骨和颌下腺转移病理特点的生物学特性。本发明能对人肺腺癌骨转移进行早期诊断提供参考数据，能进一步分析肺癌转移相关的功能基因组以及转移的相关基因，为骨转移的早期诊断、评估疗效提供一种有效的分子检测方法。

Description

具有骨、肝、颌下腺转移高潜能的中国人肺腺癌细胞株

技术领域

本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，具体涉及一种具有骨、肝、颌下腺转移高潜能的中国人肺腺癌细胞株的用途。

背景技术

肺癌是严重威胁人类生存和发展的恶性疾病之一，已成为肿瘤疾病中的头号杀手。2006年，美国确诊肺癌新病例约174470人，约占全部肿瘤的13％(男性)和12％(女性)，发病率仅次于皮肤癌；死于肺癌者约162460人，约占全部肿瘤的31％(男性)和26％(女性)，死亡率位居第一^[1～2]。日本每年肺癌新发病例超过50000人，死亡率近90％^[3]。上海市近年的恶性肿瘤发病调查显示，肺癌(21.56％)高居上海男性恶性肿瘤发病率榜首，在女性则仅次于乳腺癌^[4]。肺癌死亡率长期居高不下的主要原因在于难以早期诊断和它的高转移性，许多患者首诊时即发现有多器官转移^[3]。骨转移占肺癌病人的30～70％，仅次于乳腺癌和前列腺癌^[5～7]。超过1/3的患者会发展成溶骨性病变，引起疼痛、病理性骨折、脊髓压迫和高钙血症。使患者的生活质量严重下降，最后导致死亡，病程一般不超过6个月^[3，8]。由于肺癌骨转移的生物学机制至今尚不明确，临床缺乏有效的治疗方法，因此，研究肺癌骨转移发病机制并探索有效的诊疗方法是国内外学者长期以来的努力方向。尽管随着分子生物学、信号传导途径、蛋白功能研究等基础学科的发展，人类对疾病发病机理的研究手段有了突飞猛进的发展，但由于种种客观限制，该领域的研究仍未有重要突破。

虽然宿主微环境因素，包括破骨细胞以及一些具有生长因子功能的基质蛋白等对肿瘤的转移具有一定的作用^[3，9～10]。肿瘤细胞自身生物学特性无疑是骨转移发生更为主要而直接的原因。

由于肺癌骨转移的发生大多见于晚期的手术禁忌患者，临床标本取材受限，这在很大程度上迟滞了肺癌骨转移诊疗研究的进展。因此，如能建立有效的人肺癌骨转移细胞模型，这不仅能更接近人类本身的生物学特性，而且所建的人肺腺癌细胞模型可以更有效地发现人肺腺癌骨转移的肿瘤生物学特性，，进而利用所建细胞模型研发相关的功能基因，直接进行干预性治疗研究或作为抗原做生物免疫治疗，其优越性是临床标本及其他模型所难以企及的。

肿瘤转移动物模型的理论基础在于肿瘤细胞体内自发转移大多具有相对固定的靶组织。经研究发现，这一特性是由肿瘤组织中少量亚群细胞所决定的。在一定的条件下，该类细胞会按相对固定的模式在特定靶组织形成肿瘤转移灶。因此，以肿瘤细胞株反复多代接种免疫缺陷动物筛选后，此类亚群细胞得到有效的富集，靶组织转移率渐进升高。但是本发现和建立的人肺腺癌细胞经动物实验证实该亲代细胞已具有仅限于骨转移的生物学特性，这将有助于提升肺癌转移的基础研究水平和临床诊疗水平。

无论是肺癌的基础研究，包括病理学、免疫学、遗传学、药物基因组学、肺癌功能基因组学还是肺癌的临床诊疗实践，都要求我们必须根据国情和中国人肺癌发病特点，走自己的研发之路。细胞是生命之源，肿瘤细胞是万恶之首。建立我国自己的新型的高转移的肺癌细胞模型将具有显著的科学意义和社会价值。

与本发明有关的现有技术有：

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发明内容

本发明的目的是提供一种具有骨、肝和颌下腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株(CPA-Yang4)。本发明的进一步目的是提供该肺癌细胞株的医用用途。

本发明采用取自肺腺癌首诊患者(57岁女性)的心包积液作细胞原代培养。四天后光镜下观察发现细胞培养瓶底约有20％的面积已长满细胞。细胞呈贴壁生长；贴壁细胞大多呈园形。培养初期细胞生长缓慢；细胞形态稳定，传至第8代，细胞形态和生长速度稍变快，冻存复苏后性状不变。在相差倒置显微镜下观察细胞生长情况：贴壁细胞多为大小不等的园形，核大、核仁1-6个，可见分裂相，分裂后细胞仍呈贴壁状，细胞异质性明显。

第3代后的亲代细胞经小鼠体内诱导后，接种裸鼠细胞悬液，20天后经微孔针孔活体成像方法能检出90％骨转移；解剖时肉眼发现有50％肝转移；100％颌下腺转移；取膝关节转移灶培养骨转移细胞成功扩增后再接种裸鼠，三周后行核素骨显像和X线拍片，核素骨显像检出骨转移灶，主要集中在：颌骨、膝关节、肱骨和脊柱。小鼠存活期3周，表明所述细胞具有较强侵袭能力；第三个循环后小鼠骨转移达100％。该细胞已于2009年7月2日保藏，保藏单位：CGMCC，北京市朝阳区大屯路甲3号，保藏编号：CGMCC No.3138，分类命名：人肺腺癌细胞株CPA-Yang4。(TheChinese Human Lung Adenocarcinoma cell with Highly Bone、Liver and SubmaxillaryGland Metastases，CPA-Yang4)。

本细胞株具有以下生物学特性：

1，致瘤率高

自采集新鲜心包积液做细胞培养的第四天已发现所有细胞培养瓶底都有部分细胞长出；第8天，对三瓶长满培养瓶底的细胞用胰酶消化分瓶为6瓶继养。两天后细胞基本贴满瓶底90％时胰酶消化取细胞数约为6×106，用生理盐水洗2遍后制成细胞悬液，浓度为1×107/mL。分别接种150万细胞在3只免疫缺陷小鼠一侧皮下。接种60天仍不长瘤。第三代细胞以同样的细胞数再接种6只小鼠皮下，一个半月后3只鼠分别长成0.5×0.6cm2，0.7×0.8cm2，0.5×0.8cm2瘤体。致瘤率50％。此后各代致瘤均为100％。

2，绘制CPA-Yang4的细胞生长曲线显示，生长快速和代谢旺盛。

3，以骨转移为主且有肝脏、颌下腺多器官转移

每只裸鼠左心室分别接种1×106/0.1mL细胞悬液，20天后经自创微孔针孔活体成像方法能检出90％骨转移；解剖时肉眼发现有50％肝转移；100％颌下腺转移；取膝关节转移灶培养骨转移细胞成功扩增后再给裸鼠左心室注射0.7×106/0.1mL三周后行核素骨显像和X线拍片，核素骨显像检出的骨转移灶主要集中在：颌骨、膝关节、肱骨和脊柱。小鼠左心室接种70万细胞，存活期3周。具有较强侵袭能力。第三个循环后小鼠骨转移达100％。

4，具有典型的荷瘤CPA-Yang4骨和颌下腺转移病理图。

本发明的具有骨、肝和颌下腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株CPA-Yang4是转移能力很强的多发器官转移肺癌细胞。经左心室注射仅70-80万该细胞2周后小鼠出现转移且小鼠严重消瘦，厌食。以至于本发明在研究过程中的多次实验中整笼小鼠全军覆没，但但却未见脑、肺、肾上腺转移。本发明细胞株CPA-Yang4骨转移细胞生长速度快，细胞形态系典型的上皮类细胞，均一性和重复性良好。经3个invivo-in vitro后骨转移达到100％。具有较高的研究国人肺腺癌的价值。

本发明建立了高潜能转移人肺腺癌亲代细胞株，能对人肺腺癌骨转移进行早期诊断提供参考数据，还可进一步建立相关基因芯片技术，评估探索各种药物包括化学、生物、免疫、中医药、放射性药物等治疗疗效。为探索诊疗人体肺癌骨转移提供了技术平台。同时，进一步分析肺癌转移相关的功能基因组以及转移的相关基因，可加深对肺癌转移分子机理的认识，为骨转移的早期诊断、评估疗效提供一种有效的分子检测方法。

附图说明

图1，第二代CPA-Yang4细胞(A×100)和(B×200)的相差显微镜图。

图2，CPA-Yang4细胞生长曲线。

图3，左心室注射CPA-Yang4 8×105细胞三周后活体成像后解剖，其中，A示：颌骨、颌下腺、肝转移；B示：下颌骨、颌下腺转移。

图4，CPA-Yang4小鼠骨显像，其中，A示下颌骨、脊柱、膝关节转移。

图5，荷瘤小鼠转移病理(HE×100)，其中，A：下颌骨转移，B：股骨转移，C：腰椎转移，D：颌下腺转移。

具体实施方式

实施例1

采用取自肺腺癌首诊患者(57岁女性)的心包积液作细胞原代培养。采集新鲜心包积液50毫升，每细胞培养瓶吸8毫升胸水加2毫升不含牛血清的RPMI1640培养液和双抗后稍摇匀，放入培养温度为37℃、CO2浓度为5％的德国贺利氏BB16型二氧化碳孵养箱内培养。四天后光镜下观察时发现细胞培养瓶底约有20％的面积已长满细胞。细胞呈贴壁生长；贴壁细胞大多呈园形。培养初期细胞生长缓慢；细胞形态稳定，传至第8代，细胞形态和生长速度稍变快。冻存复苏后性状不变。在相差倒置显微镜下观察CPA-Yang4细胞生长情况：贴壁细胞多为大小不等的园形，核大、核仁1-6个，可见分裂相，分裂后细胞仍呈贴壁状，细胞异质性明显。胰酶消化后计数2×10⁵细胞加入一细胞培养瓶按常规细胞培养。

第3代后的亲代细胞经小鼠体内诱导后给每只裸鼠左心室分别接种1×10⁶/0.1mL细胞悬液，20天后经自创微孔针孔活体成像方法能检出90％骨转移；解剖时肉眼发现有50％肝转移；100％颌下腺转移；取膝关节转移灶培养骨转移细胞成功扩增后再给裸鼠左心室注射0.7×10⁶/0.1mL三周后行核素骨显像和X线拍片，核素骨显像检出的骨转移灶主要集中在：颌骨、膝关节、肱骨和脊柱。小鼠左心室接种70万细胞，存活期3周。具有较强侵袭能力。第三个循环后小鼠骨转移达100％。

实施例2

人肺腺癌细胞(CPA-Yang4)70×10⁴，注入免疫缺陷小鼠血液系统，两周后隔天称重，第三周起每周进行核素骨显像检测，核素骨显像能证实该细胞是高潜能骨转移肺癌细胞。

所述的培养基为含10％胎牛血清RPMI1640或DMEM培养基，pH＝7，培养温度为37℃，5％CO₂。

实施例3

CPA-Yang4和八十年代初已建的SPC-A-1国人肺腺癌相比，首次转移时间短、速度快。SPC-A-1首次骨转移为2/19且活到120天时才发现。CPA-Yang4以同样方法接种左心室，3周左右出现严重消瘦，奄奄一息。

Claims (1)

1.一种具有骨、肝、颌下腺转移高潜能的中国人肺腺癌细胞株，其特征是所述细胞为具有骨、肝和颌下腺转移潜能的中国人肺腺癌细胞株CPA-Yang4，保藏编号：CGMCC No.3138，分类命名：中国人肺腺癌细胞系；具有以下生物学特性：

1)致瘤率高50％～100％；

2)生长快速和代谢旺盛；

3)以骨转移为主且有肝脏、颌下腺多器官转移；

4)具有典型的荷瘤CPA-Yang4骨和颌下腺转移病理图。

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