CN104404003A - 一种重组腺相关病毒、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种重组腺相关病毒、制备方法及其应用，涉及一种引入外来基因修饰材料的病毒、制备方法及其应用，尤其涉及一种重组腺相关病毒、制备方法及其应用。其目的是为了提供一种特异性杀伤肿瘤细胞的重组腺相关病毒、制备方法及其应用。本发明的重组腺相关病毒病毒滴度高，安全性强，使用方便；本发明的制备方法简单，制备效率高，可以大量扩增进行大规模生产；本发明的抗子宫颈癌的注射针剂可以高效感染宫颈癌细胞，而对正常细胞没有杀伤作用。本发明用于抗子宫颈癌的注射针剂制备领域。

Description

一种重组腺相关病毒、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种引入外来基因修饰材料的病毒、制备方法及其应用，尤其涉及一种重组腺相关病毒、制备方法及其应用。 

背景技术

子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位。据世界范围统计，每年估计有46.6万的子宫颈癌新发病例，其中中国估计有近10万新发病例，约占世界新发病例总数的1/5，并且每年约有3万妇女死于子宫颈癌。近年来，子宫颈癌治疗虽然取得一定进展，但整体效果欠佳，病死率仍居高不下，原因在于现阶段人们根据对子宫颈癌发生发展机制的认识和指定的癌症治疗方案仍欠缺特异性和高效性，特别是缺乏特异性杀伤子宫颈癌细胞而对正常细胞没有杀伤作用的治疗药物。大多数癌症治疗药物都导致非特异性治疗副作用的产生，对患者造成不同程度的伤害，甚至引起生命危险。因此，在我国经济飞速发展、人民健康水平空前提高的情况下，对子宫颈癌特异性治疗药物的研究有了更大的社会需求，也是我国持续发展和建设和谐社会的重要任务之一。 

目前，分子靶向药物是抗肿瘤新药研发的主要方向。但是，肿瘤的靶向治疗面临巨大挑战，主要是缺乏特异性杀伤肿瘤细胞的有效药物靶点。为解决这个难题，必须系统地理解肿瘤发生发展调控的相关机制，找出可以作为药物靶点的重要调控分子，实行特异性杀伤肿瘤治疗方案。所以，推动特异性靶点抗肿瘤新药研发，不仅是癌症患者的殷切希望，也是我国独立知识产权抗癌新药研发、民族制药产业发展和国家经济进一步腾飞的迫切需要。 

发明内容

本发明是为了解决以上技术问题，而提供的一种特异性杀伤肿瘤细胞的重组腺相关病毒、制备方法及其应用。 

本发明一种重组腺相关病毒，是将特异靶向RRP15基因的小分子干扰RNA(siRNA)插入腺相关病毒(AAV)的特异位点获得的。 

本发明一种重组腺相关病毒的制备方法，包括以下步骤： 

一、设计特异性人RRP15 RNAi靶向序列：设计人RRP15siRNA靶向序列第74至93碱基(aaatggtaactggagccgta)； 

二、化学合成以下引物： 

引物1:5’-GATTC aaatggtaactggagccgta A-3’， 

引物2:5’-AGCTT tacggctccagttaccattt G-3’； 

三、在T4连接酶缓冲液中分别加入10μM步骤二中合成的引物1和引物2，95℃孵育5分钟，放置室温，自然降温至室温后，连接入腺病毒载体pAAV-GFP，即得到pAAV-GFP-shRRP15； 

四、应用步骤三制得的pAAV-GFP-shRRP15和辅助载体质粒共转染293T细胞； 

五、细胞在37℃，CO₂浓度为5％的培养箱中培养2天后，收集细胞培养上清，以1：100比例稀释再次感染293T细胞； 

六、细胞在37℃，CO₂浓度为5％的培养箱中培养2天后，收集细胞培养上清，离心收集病毒液； 

其中，所述的辅助载体质粒为pAAV-RC2和pHelper。 

本发明一种重组腺相关病毒的应用，用于制备抗宫颈癌的注射针剂。 

核仁蛋白RRP15对核糖体大亚基的成熟至关重要。抑制细胞内RRP15的表达，将导致肿瘤细胞死亡，而正常细胞仅发生周期阻滞。间歇性抑制细胞内RRP15基因表达，最终导致所有肿瘤细胞死亡，相反不影响正常细胞的生长。因此，核仁蛋白RRP15可以作为特异性抗肿瘤治疗的靶标。 

腺相关病毒(AAV)具有自然缺陷、无包被和无致病原性，它能整合其基因组到19号染色体的一个特别位点并保持整合状态。AAV的位点特异性的整合能力、其自然缺陷以及其无致病原性使其成为基因治疗载体成为可能。在基因复制条件下AAV能复制产生子代病毒颗粒。因此，将特异靶向RRP15基因的小分子干扰RNA(siRNA)插入AAV的特异位点，利用其复制特性，使AAV感染的细胞持续产生RRP15siRNA。 

本发明一种重组腺相关病毒、制备方法及其应用与现有技术不同之处在于： 

1、本发明的一种重组腺相关病毒病毒滴度高，安全性强，使用方便。 

2、本发明的一种重组腺相关病毒的制备方法简单，制备效率高，可以大量扩增进行大规模生产。 

3、本发明的重组腺相关病毒制备的抗子宫颈癌的注射针剂，可以高效感染宫颈癌细胞，并持续表达特异靶向RRP15的siRNA，最终能够特异性杀伤宫颈癌细胞；而对正常细胞没有 杀伤作用。因此，重组腺相关病毒AAV-shRRP15的注射针剂可以作为治疗子宫颈癌的新型生物制剂。 

下面结合附图对本发明的一种重组腺相关病毒、制备方法及其应用作进一步说明。 

附图说明

图1为重组腺相关病毒AAV-shRRP15感染子宫颈癌细胞HeLa和正常转化二倍体细胞RPE1对比图；其中1为明场下观察的子宫颈癌细胞HeLa，2为明场下观察的正常转化二倍体细胞RPE1，3为荧光显微镜下观察的子宫颈癌细胞HeLa，4为荧光显微镜下观察的正常转化二倍体细胞RPE1； 

图2为重组病毒AAV-shRRP15感染HeLa和RPE1细胞后细胞内RRP15蛋白的表达鉴定对比图； 

图3为重组腺相关病毒AAV-shRRP15感染HeLa和RPE1细胞后的流式细胞仪监测分析图；其中，5为未感染病毒AAV-shRRP15的HeLa细胞，6为感染病毒AAV-shRRP15的HeLa细胞，7为未感染病毒AAV-shRRP15的RPE1细胞，8为感染病毒AAV-shRRP15的RPE1细胞； 

图4为分别注射AAV-shRRP15病毒液和AAV病毒液的成瘤裸鼠体内肿瘤体积的折线图； 

图5为为分别注射AAV-shRRP15病毒液和AAV病毒液的成瘤裸鼠体内肿瘤质量的柱状图； 

图6为重组腺相关病毒的制备流程图。 

具体实施方式

实施例1 

本实施例的一种重组腺相关病毒按以下步骤制备： 

一、设计特异性人RRP15 RNAi靶向序列：设计人RRP15siRNA靶向序列第74至93碱基(aaatggtaactggagccgta)； 

二、化学合成以下引物： 

引物1:5’-GATTC aaatggtaactggagccgta A-3’， 

引物2:5’-AGCTT tacggctccagttaccattt G-3’； 

三、步骤二中的引物退火：在T4连接酶缓冲液中分别加入10μM引物1和引物2，95°C孵育5分钟，放置室温，缓慢降温至室温； 

四、应用限制性内切酶EcoR I和Hind IIII酶切腺病毒载体pAAV-GFP，回收酶切片段； 

五、应用T4 DNA连接酶室温连接上述DNA片段，即得到pAAV-GFP-shRRP15； 

六、应用步骤五制备的pAAV-GFP-shRRP15和辅助载体质粒共转染293T细胞； 

七、细胞在37℃，CO₂浓度为5％的培养箱中培养2天后，收集细胞培养上清，以1：100比例稀释再次感染293T细胞； 

八、细胞在37℃，CO₂浓度为5％的培养箱中培养2天后，收集细胞培养上清，离心收集病毒液。 

重组腺相关病毒的制备流程图如图6所示。 

实施例2 

本实施例的一种重组腺相关病毒用于制备抗宫颈癌的注射针剂，按以下步骤制备： 

实施例1中制得的病毒扩增后的高滴度病毒液，经0.2μm孔径滤膜过滤后，用普通生理盐水(0.9％氯化钠水溶液)按体积比1:100稀释，分装1ml/安瓿，密封，4℃保存。 

采用逐孔稀释滴度测定法测定实施例2中制得的重组腺相关病毒的滴度： 

1)细胞准备：96孔板中接种100μl HEK-293细胞，每孔细胞数约1×10⁵个，以含2％血清的DMEM培养基培养。 

2)稀释病毒液准备：以2％DMEM将病毒液稀释成8个浓度(如10^-1-10^-8)，每个浓度重复10个，每孔加入病毒稀释液100μl。另留两排不加病毒液作为阴性对照。37℃下，孵箱培养10天。 

3)10天后在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度(TU/ml)＝(X+Y×10)×1000/2/X孔的病毒液的含量(μl)。 

经计算，实施例2中制得的重组腺相关病毒的滴度为5×10¹¹/ml。 

验证试验： 

1、重组腺相关病毒AAV-shRRP15对子宫颈癌细胞的感染 

通过以下方法对重组腺相关病毒AAV-shRRP15对子宫颈癌细胞的感染进行研究： 

一、体外培养宫颈癌细胞HeLa和正常细胞RPE1:在100mm平皿中分别培养宫颈癌细胞和RPE1细胞至对数生长期，细胞汇合度达到50％。 

二、以1:100比例稀释病毒液加入上述细胞，在感染24小时后在显微镜下观察，判断感染效率。 

三、病毒感染培养3天后收集细胞，裂解后进行蛋白电泳，转膜后应用特异性兔抗RRP15抗体进行Western Blot，明确RRP15蛋白表达抑制。 

子宫颈癌细胞HeLa和正常转化二倍体细胞RPE1感染重组腺相关病毒AAV-shRRP15。病毒感染24小时后，200倍荧光显微镜下观察细胞内荧光表达情况如图1所示。由于重组腺相关病毒AAV-shRRP15可以表达绿色荧光蛋白GFP，所以病毒感染的细胞可以通过荧光显微镜观察。图中，1、2为明场下观察的细胞，3、4为荧光显微镜下观察的细胞，对比可见，100％ 细胞内有绿色荧光蛋白表达。 

子宫颈癌细胞HeLa和正常转化二倍体细胞RPE1感染重组腺相关病毒AAV-shRRP15。细胞感染3天后，收集细胞裂解并电泳进行Western Blot。结果如图2所示，图中RRP15为细胞内RRP15蛋白的表达，Tubulin为细胞内微管蛋白(tubulin)对照；重组腺相关病毒AAV-shRRP15感染HeLa和RPE1细胞后导致细胞内RRP15蛋白表达水平大大下降，说明RRP15蛋白表达被抑制。 

2、重组腺相关病毒AAV-shRRP15对宫颈癌细胞的特异性杀伤作用 

通过以下方法对重组腺相关病毒AAV-shRRP15对宫颈癌细胞的特异性杀伤作用进行研究： 

一、以1:100比例稀释病毒液分别感染宫颈癌细胞HeLa和正常细胞RPE1； 

二、3天后，收集细胞，进行70％乙醇固定，PI染色后应用流式细胞仪检测分析细胞生长周期和凋亡情况。 

表1 重组腺相关病毒AAV-shRRP15感染HeLa和RPE1细胞后细胞生长周期变化 

子宫颈癌细胞HeLa和正常转化二倍体细胞RPE1感染重组腺相关病毒AAV-shRRP15，病毒感染3天后，收集细胞，进行70％乙醇固定，PI染色后应用流式细胞仪检测分析细胞生长周期和凋亡情况。结果如图3、表1所示，感染病毒AAV-shRRP15的HeLa细胞发生细胞凋亡(出现SubG1峰)。相反，感染病毒AAV-shRRP15的RPE1细胞没有发生细胞凋亡(无SubG1峰)，仅发生轻微G1期阻滞。 

3、重组腺相关病毒AAV-shRRP15抑制宫颈肿瘤在裸鼠内生长 

通过以下方法对重组腺相关病毒AAV-shRRP15抑制宫颈肿瘤在裸鼠内的生长进行研究： 

一、收集1×10⁶宫颈癌细胞，植入裸鼠腋窝皮下； 

二、2周后，在宫颈癌细胞成瘤部位注射AAV-shRRP15病毒液，对照组注射AAV病毒液； 

三、继续饲养小鼠6周，每周记录裸鼠内肿瘤体积大小； 

四、处死小鼠，取出肿瘤组织，进行重量检测。 

裸鼠皮下成瘤2周后，在瘤体部位注射病毒液。继续饲养裸鼠，并测量瘤体体积。结果如图4所示，注射重组腺病毒AAV-shRRP15的小鼠肿瘤体积增长速度比对照慢。 

将上述注射重组病毒裸鼠饲养6周后，取出裸鼠体内瘤体组织，称重。结果如图5所示，注射AAV-shRRP15重组病毒的瘤体组织质量是对照的28.5％。 

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。 

。

Claims (3)

1.一种重组腺相关病毒，其特征在于是将特异靶向RRP15基因的小分子干扰RNA(siRNA)插入腺相关病毒(AAV)的特异位点获得的。

2.一种重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一、设计特异性人RRP15 RNAi靶向序列：设计人RRP15siRNA靶向序列第74至93碱基(aaatggtaactggagccgta)；

二、化学合成以下引物：

引物1:5’-GATTC aaatggtaactggagccgta A-3’，

引物2:5’-AGCTT tacggctccagttaccattt G-3’；

三、在T4连接酶缓冲液中分别加入10μM步骤二中合成的引物1和引物2，95℃孵育5分钟，放置室温，自然降温至室温后，连接入腺病毒载体pAAV-GFP，即得到pAAV-GFP-shRRP15；

四、应用步骤三制得的pAAV-GFP-shRRP15和辅助载体质粒共转染293T细胞；

五、细胞在37℃，CO₂浓度为5％的培养箱中培养2天后，收集细胞培养上清，以1：100比例稀释再次感染293T细胞；

六、细胞在37℃，CO₂浓度为5％的培养箱中培养2天后，收集细胞培养上清，离心收集病毒液；

其中，所述的辅助载体质粒为pAAV-RC2和pHelper。

3.一种重组腺相关病毒的应用，用于制备抗宫颈癌的注射针剂。