CN106916909A

CN106916909A - 一种HBV pgRNA的实时荧光定量RT‑PCR检测引物组、探针组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN106916909A
Application number: CN201710321213.8A
Authority: CN
Inventors: 张晓玮; 彭春梅; 张嘉; 邓可基; 李海茵; 谢丽娟; 李家导; 乐小炎; 林志豪; 罗园香; 张新; 陈观芝; 陈凤英; 林敏深; 石壮壮; 林若琳; 王星; 王法; 余培煜; 莫静嫣
Original assignee: GUANGZHOU SUPBIO BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU SUPBIO BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2017-05-09
Filing date: 2017-05-09
Publication date: 2017-07-04
Anticipated expiration: 2037-05-09
Also published as: CN106916909B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及病毒检测领域，更具体涉及一种HBV pgRNA的实时荧光定量RT‑PCR检测引物组、探针组、试剂盒及方法。所述的检测引物组和检测探针组包括：引物组1和探针组1；或引物组2和探针组2。而本发明提供的Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶的双聚合酶的扩增方法可以实现对常规检测方法难以正常扩增的疑难样品的扩增，因此具有更高的灵敏性的正确性。

Description

一种HBV pgRNA的实时荧光定量RT-PCR检测引物组、探针组、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及病毒检测领域，更具体涉及一种HBV pgRNA的实时荧光定量RT-PCR检测引物组、探针组、试剂盒及方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染呈世界性流行，其感染者已超过二十亿，是我国目前危害最严重的传染病之一。2006年全国乙肝流行病学调查显示，我国目前仍有乙肝表面抗原携带者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万，乙肝和肝癌患者约占全球的四分之一。慢性HBV感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和原发性肝癌的主要原因，并且每年导致1百余万人死亡，造成极大的社会危害。

研究表明，共价闭合环状DNA(cccDNA)，松弛环状DNA(rcDNA)和前基因组RNA(pgRNA)更可能代表活跃的HBV复制活动，它们的检测可用于推断和研究病毒体生产力(VP；rcDNA/cccDNA)，亚病毒颗粒生产力(SVP，HBsAg/cccDNA)和复制活性(RA；pgRNA/cccDNA)。而上述检测指标这些可以用于比较HBeAg阴性和阳性患者之间的相对HBV复制情况差异(赵克开,缪晓辉,ZHAOKe-kai,等.乙型肝炎病毒cccDNA检测的方法与临床意义[J].中华肝脏病杂志,2005,13(4):315-317)，从而可用于HBV感染的检测或鉴定。

还有研究表明，在HBeAg阳性期内，HBV DNA水平的降低，与较低的HBV cccDNA以及pgRNA水平有强相关性。在HBeAg阴性患者中，ihDNA水平较高，血清中的HBV DNA水平低于预期。较低的HBV DNA/HBsAg比率对应于较低的pgRNA/cccDNA(p<0.01)和较高的S-RNA/cccDNA比率(p<0.0001)，表明HBeAg阴性患者的pgRNA的转录被抑制了(马艳丽,任万华.乙肝病毒cccDNA的研究进展[J].临床肝胆病杂志,2006,22(3):221-222.)。

另外，还有研究表明，HBV pgRNA病毒粒子的存在与慢性乙肝(CHB)患者中断NAs药物治疗后病毒反弹的风险相关(Jie W,Tao S,Huang X,et al.Serum hepatitis B virusRNA is encapsidated pregenome RNA that may be associated with persistence ofviral infection andrebound[J].Journal of Hepatology,2016,65(4):700-710.)。

综上所述监控pgRNA水平，可以有效地了解HBV在患者体内的复制情况，进而有效地检测和鉴定HBV感染以及指导乙肝用药。

然而，目前对于HBV的核酸检测方法主要集中于HBV cccDNA。例如中国专利申请201410755640公开了一种HBV cccDNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用。中国专利申请201410453981公开了一种LAMP法检测石蜡包埋肝组织中HBV cccDNA的引物和试剂盒。中国专利申请201210576370公开了cccDNA标准品及其制备方法、定量检测乙肝病毒cccDNA的方法及试剂盒。

目前并没有针对HBV pgRNA的商品化的荧光PCR检测试剂盒，而用于HBV pgRNA的检测方法也比较少。

例如，中国专利申请201610364652公开了一种检测乙型肝炎患者血液中HBVPgRNA的方法、试剂盒及其应用，其有记载的准确检出的最低检出限为1×10³copies/ml。

现有技术对HBV pgRNA检测的灵敏度仍不能满足实际需求，其灵敏度仅为1×10³copies/ml左右

为了有效降低和控制HBV感染造成的经济损失，需要建立一种有效的方法，实现对HBV pgRNA的快速和高灵敏性的检测。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种HBV pgRNA的实时荧光定量RT-PCR检测方法以及用于检测HBV pgRNA的引物组和探针组及试剂盒。

术语：“W/V”指质量-体积浓度。

一个方面，本发明提供了一种用于检测HBV pgRNA的检测引物组和检测探针组。

所述的检测引物组和检测探针组包括：

引物组1和探针组1；

或引物组2和探针组2。

所述的引物组1包括以下4条引物：

引物F1：其核苷酸序列为5’-TGGTGTCTTTTGGAGTGTGGAT-3’(SEQ ID NO：1)，

引物R1：其核苷酸序列为5’-CCACCTTATGTGTCCAAGGAATACT-3’(SEQ ID NO：2)，

引物F2：其核苷酸序列为5’-TTC ACC TCA CCA TAC GGC ACT CAG GC-3’(SEQ IDNO：3)，

和引物R2：其核苷酸序列为5’-ATGAATGTCAGGAAAAGAAGGAGTTTGCC-3’(SEQ ID NO：4)。

所述的探针组1包括以下两条探针：

探针P1：其核苷酸序列为5’-CGC ACT CCT CCT GCA TAT AGA CCA TCA AA-3’(SEQID NO：5)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种，

和探针P2：5’-TCT CAA TCG CCG CGT CGC A-3’(SEQ ID NO：6)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种；探针P1和探针P2应具有相同的荧光基团。

所述的引物组2包括以下4条引物：

引物F3：其核苷酸序列为5’-TTT GGT GTC TTT TGG AGT GTG GA-3’(SEQ ID NO：7)，

引物R3：其核苷酸序列为5’-CTT ATG TGT CCA AGG AAT ACT AA-3’(SEQ ID NO：8)，

引物F4：其核苷酸序列为5’-GTT CAC CTC ACC ATA CGG CAC TCA GG-3’(SEQ IDNO：9)，

和引物R4：其核苷酸序列为5’-TGA ATG TCA GGA AAA GAA GGA GTT TGC CA-3’(SEQ ID NO：10)。

所述的探针组2包括以下两条探针：

探针P3：其核苷酸序列为5’-TTC GCA CTC CTC CTG CAT ATA GAC CAT CA-3’(SEQID NO：11)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种，

和探针P4：其核苷酸序列为5’-CTC AAT CGC CGC GTC GCA-3’(SEQ ID NO：12)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种；探针P3和探针P4应具有相同的荧光基团。

上述检测引物组和检测探针是根据HBV pgRNA序列特点设计完成的，可用于实时荧光定量RT-PCR技术，实现对HBV cccDNA的检测。

另一个方面，本发明提供了一种用于检测HBV pgRNA的试剂盒，所述的试剂盒包括上述检测引物组和检测探针组。

在一个优选的实施方案中，所述的试剂盒还包括酶系；所述的酶系包括：(1)TflDNA聚合酶；(2)MMLV反转录酶；(3)Stoffel片段。

在另一个优选的实施方案中，所述的试剂盒还包括反应试剂；所述的反应试剂包括：(1)Tris-硫酸；(2)MOPS缓冲液；(3)柠檬酸钠；(4)(NH₄)₂SO₄；(5)MgSO₄；(6)聚氧乙烯月桂醚(Brij-35)；(7)乙酰化BSA。

在另一个优选的实施方案中，所述的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

所述的阴性对照品为生理盐水。

所述的阳性对照品为采用本发明所述的检测引物组对HBV基因组扩增所获得的扩增片段。该扩增片段的长度为512bp。

再一个方面，本发明提供了一种HBV pgRNA的实时荧光定量RT-PCR检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：

(1)病毒RNA的提取；

(2)实时荧光定量RT-PCR反应：

实时荧光定量RT-PCR反应体系为：

实时荧光定量RT-PCR反应程序为：

第一步：45℃，20～45分钟；94～96℃，2分钟；

第二步：94～95℃，15～30秒；65～69℃，30～75秒；68～72℃，30～40秒；6～9个循环；

第三步：93～95℃，15～20秒；60℃，30秒；68～72℃，30秒；8个循环；

第四步：93～95℃，15秒；52～55℃，30～60秒；40个循环；55℃时收集荧光；

(3)结果判定：

判定：

1)阳性：检测样本Ct值小于等于35.0，且曲线有明显的指数增长期；

2)可疑：检测样本Ct值大于35.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值小于40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；

3)阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40。

所述的检测方法步骤(1)病毒RNA的提取可根据样本的类型使用本领域常规的提取方法，或使用由商业途径获得的试剂盒进行提取。

所述的检测方法步骤(2)中的PCR Mix包括：48mM的pH8.5的Tris-硫酸、18mM的pH7.9的MOPS缓冲液、3mM的柠檬酸钠、20mM的(NH₄)₂SO₄、7mM的MgSO₄、0.10％(W/V)的聚氧乙烯月桂醚、0.1mg/mL的乙酰化BSA、300～800nM的检测引物组、100～300nM的检测探针组、420mM的dNTP。

所述的检测方法步骤(2)中的酶混合液包括Tfl DNA聚合酶、MMLV反转录酶和Stoffel片段。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了特异性引物探针组，用以扩增肝组织中的HBV pgRNA，而不会将HBV的其他转录本(如S-RNA)扩增出来。

(2)本发明提供的用于检测HBV pgRNA的检测引物组和检测探针组对于HBV pgRNA扩增的特异性强，能够有效地提高检测准确性、特异性以及灵敏性。

(3)本发明提供了一种肝组织中HBV pgRNA的实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒，能够实现对肝组织中的HBV pgRNA进行快速检测，应用极为方便。由于引入了更适合RNA扩增的Tris、MOPS缓冲液和柠檬酸钠，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了普通RT-PCR方法特异性不高，以及无法对低浓度模版进行定量的缺点。

(4)本发明还引入了Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶的双聚合酶的扩增方法。其中Stoffel片段为去除5’-3’外切酶活性结构域的Taq DNA聚合酶，去除5’-3’外切酶活性的同时，恢复了少量3’-5’外切酶的校正活性，弥补了Tfl DNA聚合酶特异性不足的缺陷。而TflDNA聚合酶则提供切除taqman探针的5’-3’外切酶活性。

(5)Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶耐抑制剂能力都较强，使得根据本发明构建的荧光RT-PCR试剂盒中可以加入更多的模版。从而可以用于提升灵敏度。

(6)本发明所提供的检测方法，与传统的实时荧光定量PCR不同，本发明采用多个循环程序，并提高引物退火温度，使检测方法达到极高的灵敏度及特异性。

基于上述优点，本发明的试剂盒适合在各级疾控单位和医院进行推广，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实验例1中HBV pgRNA的检测结果。

具体实施方式

以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1一种用于检测HBV pgRNA的检测引物组和检测探针组

检测引物组包括以下4条引物：

引物F1：其核苷酸序列为5’-TGG TGT CTT TTG GAG TGT GGA T-3’(SEQ ID NO：1)，

引物R1：其核苷酸序列为5’-CCA CCT TAT GTG TCC AAG GAA TAC T-3’(SEQ IDNO：2)，

和引物R2：其核苷酸序列为5’-ATG AAT GTC AGG AAA AGA AGG AGT TTG CC-3’(SEQ ID NO：4)。

检测探针组包括以下两条探针：

探针P1：其核苷酸序列为5’-CGC ACT CCT CCT GCA TAT AGA CCA TCA AA-3’(SEQID NO：5)，其5’端标记有荧光基团FAM，其3’端标记有的淬灭基团BHQ1；

和探针P2：5’-TCT CAA TCG CCG CGT CGC A-3’(SEQ ID NO：6)，其5’端标记有荧光基团FAM，其3’端标记有的淬灭基团BHQ1。

检测引物组和探针组的设计选择跨C gene和P gene区域。

实施例2一种用于检测HBV pgRNA的检测引物组和检测探针组

检测引物组包括以下4条引物：

检测探针组包括以下两条探针：

探针P3：其核苷酸序列为5’-TTC GCA CTC CTC CTG CAT ATA GAC CAT CA-3’(SEQID NO：11)，其5’端标记有荧光基团FAM，其3’端标记有的淬灭基团BHQ1；

和探针P4：其核苷酸序列为5’-CTC AAT CGC CGC GTC GCA-3’(SEQ ID NO：12)，其5’端标记有荧光基团FAM，其3’端标记有的淬灭基团BHQ1。

检测引物组和探针组的设计选择跨C gene和P gene区域。

实施例3一种用于检测HBV pgRNA的试剂盒

该试剂盒包括：

(1)实施例1中的检测引物组和检测探针组；

(2)酶系：1)Tfl DNA聚合酶；2)MMLV反转录酶；3)Stoffel片段；

(3)反应试剂：1)Tris-硫酸；2)MOPS缓冲液；3)柠檬酸钠；4)(NH₄)₂SO₄；5)MgSO₄；6)聚氧乙烯月桂醚(Brij-35)；7)乙酰化BSA；

(4)阴性对照品：生理盐水。

(5)阳性对照品：以实施例1中的检测引物组对HBV基因组扩增所获得的扩增片段，该扩增片段的长度为512bp。

实施例4一种用于检测HBV pgRNA的试剂盒

该试剂盒包括：

(1)实施例2中的检测引物组和检测探针组；

(2)酶系：1)Tfl DNA聚合酶；2)MMLV反转录酶；3)Stoffel片段；

(4)阴性对照品：生理盐水。

(5)阳性对照品：以实施例2中的检测引物组对HBV基因组扩增所获得的扩增片段，该扩增片段的长度为512bp。

实施例5一种HBV pgRNA的实时荧光定量RT-PCR检测方法及其应用

一、采用实施例4所述的试剂盒进行检测。

二、样本来源：肝组织(活检)样品，采集自中山大学附属第三医院。

三、检测方法：

(1)病毒RNA的提取：称取50mg肝组织样本，液氮下研磨成粉末；加入140mL用DEPC处理水配制的PBS缓冲液溶解；采用购自北京天根Tiangen公司的病毒检测用RNA提取试剂盒(离心柱型，货号：SD101)，按照说明书方法进行病毒RNA的提取(在第一次洗涤步骤之前，加入DNAse I2U，37℃孵育15min)，获得待测RNA样品；

(2)制备阳性质控品：利用实施例4试剂盒中的阳性对照品，按常规方法合成MS2假病毒，作为阳性质控品；

(3)实时荧光定量RT-PCR反应：

实时荧光定量RT-PCR反应体系为：

其中，PCR Mix的成分见下表：

成分	浓度
		pH8.5的Tris-硫酸	48mM
pH7.9的MOPS缓冲液	18mM
		柠檬酸钠	3mM
	20mM
			7mM
Brij-35	0.10％(W/V)
		乙酰化BSA	0.1mg/mL
引物F3	80nM
		引物R3	80nM
引物F4	300nM
		引物R4	300nM
探针P3	120nM
		探针P4	120nM
dNTP	420mM

其中，酶混合液的成分见下表：

酶	添加量
		Tfl DNA聚合酶2U/μL，(购自美国ABI公司)	1μL
MMLV反转录酶200U/μL，(购自深圳菲鹏生物)	0.5μL
		Stoffel片段5U/μL(购自Cetus公司)	1μL

将上述反应体系混匀后，将各反应管放入定量PCR仪器(购自安捷伦公司，货号MX3000P荧光PCR仪)的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类(设置HBV pgRNA的报告基团为FAM，淬灭基团选择none)，设定RT-PCR反应程序：

第一步：45℃，40分钟；94℃，2分钟；

第二步：94℃，15秒；65℃，30秒；72℃，30秒；8个循环；

第三步：94℃，15秒；60℃，30秒；72℃，30秒；8个循环；

第四步：94℃，15秒；53℃，50秒；40个循环；55℃时收集荧光；

(3)结果判定：

1)阳性质控品显示阳性；

2)阴性对照品显示阴性；

对比实验1

一、采用实施例4所述的试剂盒进行检测。

二、检测方法：基本同实施例5，区别为：

将酶混合液的成分替换为下表：

酶	添加量
		Tfl DNA聚合酶2U/μL，(购自美国ABI公司)	1μL
MMLV反转录酶200U/μL，(购自深圳菲鹏生物)	0.5μL

对比实验2

一、采用实施例4所述的试剂盒进行检测。

二、检测方法：基本同实施例5，区别为：

将PCR Mix的成分替换为下表：

对比实验3

一、采用实施例4所述的试剂盒进行检测。

二、检测方法：基本同实施例5，区别为：

将PCR Mix的成分替换为下表：

成分	浓度
		pH8.5的Tris-HCl	66mM
	20mM
			7mM
Brij-35	0.10％(W/V)
		乙酰化BSA	0.1mg/mL
引物F3	80nM
		引物R3	80nM
引物F4	300nM
		引物R4	300nM
探针P3	120nM
		探针P4	120nM
dNTP	420mM

并且将酶混合液的成分替换为下表：

对比实验4

一、采用实施例4所述的试剂盒进行检测。

二、检测方法：基本同对比实验3，区别为：将待测RNA样品的添加量降低至5μL，并使用DEPC处理水将RT-PCR体系补足50μL。

实验例1特异性和灵敏度试验

分别采用实施例5和对比实验1-4中的检测方法对对血清HBV DNA检测为2.57x10⁶IU/mL(使用广州海力特生物的HBV DNA检测试剂盒，国械注准20163400199)的病人，取肝组织活检样本进行检测，HBV pgRNA的检测结果如图1所示，其中曲线1-5分别为实施例5、对比实验1-4的扩增曲线。

分组	样本量	扩增结果(Ct值)
			实施例5	25μL	18.14
对比实验1	25μL	无扩增
			对比实验2	25μL	19.65
对比实验3	25μL	无扩增
			对比实验4	5μL	20.12

检测结果显示：

采用对比实验1的检测方法结果无扩增。说明采用常规方法只采用Tfl DNA聚合酶对某些样品无法实现正常扩增，从而影响检测的准确性；而本发明提供的Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶的双聚合酶的扩增方法可以实现对常规检测方法难以正常扩增的疑难样品的扩增，因此具有更高的灵敏性的正确性。

采用对比实验2的检测方法检测待测样品的Ct值为19.65，显示阳性。虽然该方法也能获得阳性检出，然而根据灵敏度检测，对比实验1检测方法的灵敏度明显低于实施例5的检测方法。

采用对比实验3和4的检测方法分别得到无扩增以及20.12的Ct值，说明虽然在样本添加体积较小时(例如5μL)，常规的Taq DNA聚合酶和MMLV反转录酶的检测方法能够获得扩增，然而当样本体积增加到一定程度时(比如25μL)，常规的Taq DNA聚合酶和MMLV反转录酶的检测方法无法对抗PCR体系中不可避免的抑制剂，因此无法获得扩增。而本发明提供的检测方法则能够在样本添加体积较大时(例如25μL)获得正常的扩增，说明本发明提供的检测方法耐抑制剂能力较强，也就是RT-PCR反应体系中可以加入更多的模版，从而可以用于提升灵敏度和检测的准确性。

实验例2最低检出限

待测样品：肝组织(活检)样品，采集自中山大学附属第三医院。

采用HBV阴性血清对待测样品进行梯度稀释，分别采用本发明实施例5的检测方法和现有技术中的检测方法(例如中国专利申请201610202753、201610364652)对稀释后的样品进行HBV pgRNA检测，直至到无法获得扩增的稀释度为止，检测结果如下：

检测方法	无法获得扩增的稀释度
		本发明实施例5
201610202753
		201610364652

实验结果表明，当样本稀释度高达10⁶时，本发明提供的检测方法依然能够成功获得扩增和检测结果。而现有技术在样品稀释度到10³和10²时，已无法获得扩增，说明本发明提供的检测方法的灵敏度明显高于现有技术。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>广州海力特生物科技有限公司

<120>一种HBV pgRNA的实时荧光定量RT-PCR检测引物组、探针组、试剂盒及方法

<130> 2017/03/15

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

tggtgtcttt tggagtgtgg at 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

ccaccttatg tgtccaagga atact 25

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

ttcacctcac catacggcac tcaggc 26

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

atgaatgtca ggaaaagaag gagtttgcc 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

cgcactcctc ctgcatatag accatcaaa 29

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

tctcaatcgc cgcgtcgca 19

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

tttggtgtct tttggagtgt gga 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

cttatgtgtc caaggaatac taa 23

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

gttcacctca ccatacggca ctcagg 26

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 10

tgaatgtcag gaaaagaagg agtttgcca 29

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 11

ttcgcactcc tcctgcatat agaccatca 29

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 12

ctcaatcgcc gcgtcgca 18

Claims

1.一种用于检测HBV pgRNA的检测引物组和检测探针组，其特征在于：

所述的检测引物组和检测探针组包括：

引物组1和探针组1；

或引物组2和探针组2；

所述的引物组1包括以下4条引物：

引物F1：其核苷酸序列为5’-TGG TGT CTT TTG GAG TGT GGA T-3’；引物R1：其核苷酸序列为5’-CCA CCT TAT GTG TCC AAG GAA TAC T-3’；其核苷酸序列为5’-TTC ACC TCACCA TAC GGC ACT CAG GC-3’；和引物R2：其核苷酸序列为5’-ATG AAT GTC AGG AAA AGAAGG AGT TTG CC-3’(SEQ ID NO：4)；

所述的探针组1包括以下两条探针：

探针P1：其核苷酸序列为5’-CGC ACT CCT CCT GCA TAT AGA CCA TCA AA-3’(SEQ IDNO：5)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种，

和探针P2：5’-TCT CAA TCG CCG CGT CGC A-3’(SEQ ID NO：6)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种；探针P1和探针P2应具有相同的荧光基团；

所述的引物组2包括以下4条引物：

引物F3：其核苷酸序列为5’-TTT GGT GTC TTT TGG AGT GTG GA-3’；引物R3：其核苷酸序列为5’-CTT ATG TGT CCA AGG AAT ACT AA-3’；引物F4：其核苷酸序列为5’-GTT CACCTC ACC ATA CGG CAC TCA GG-3’；和引物R4：其核苷酸序列为5’-TGA ATG TCA GGA AAAGAA GGA GTT TGC CA-3’(SEQ ID NO：10)；

所述的探针组2包括以下两条探针：

探针P3：其核苷酸序列为5’-TTC GCA CTC CTC CTG CAT ATA GAC CAT CA-3’(SEQ IDNO：11)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种，

2.如权利要求1所述的检测引物组和检测探针组，其特征在于：

所述的检测引物组和检测探针组包括：引物组1和探针组1；

所述的引物组1包括以下4条引物：

引物F1：其核苷酸序列为5’-TGG TGT CTT TTG GAG TGT GGA T-3’；引物R1：其核苷酸序列为5’-CCA CCT TAT GTG TCC AAG GAA TAC T-3’；引物F2：其核苷酸序列为5’-TTC ACCTCA CCA TAC GGC ACT CAG GC-3’；和引物R2：其核苷酸序列为5’-ATG AAT GTC AGG AAAAGA AGG AGT TTG CC-3’；

所述的探针组1包括以下两条探针：

3.如权利要求1所述的检测引物组和检测探针组，其特征在于：

所述的检测引物组和检测探针组包括：

引物组2和探针组2；

所述的引物组2包括以下4条引物：

引物F3：其核苷酸序列为5’-TTT GGT GTC TTT TGG AGT GTG GA-3’；引物R3：其核苷酸序列为5’-CTT ATG TGT CCA AGG AAT ACT AA-3’；引物F4：其核苷酸序列为5’-GTT CACCTC ACC ATA CGG CAC TCA GG-3’；和引物R4：其核苷酸序列为5’-TGA ATG TCA GGA AAAGAA GGA GTT TGC CA-3’；

所述的探针组2包括以下两条探针：

4.一种用于检测HBV pgRNA的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括实施例1-3任意一项所述的检测引物组和检测探针组。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括酶系；所述的酶系包括：(1)Tfl DNA聚合酶；(2)MMLV反转录酶；(3)Stoffel片段。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括反应试剂；所述的反应试剂包括：(1)Tris-硫酸；(2)MOPS缓冲液；(3)柠檬酸钠；(4)(NH₄)₂SO₄；(5)MgSO₄；(6)聚氧乙烯月桂醚(Brij-35)；(7)乙酰化BSA。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述的阴性对照品为生理盐水；所述的阳性对照品为采用检测引物组对HBV基因组扩增所获得的扩增片段。

8.一种HBV pgRNA的实时荧光定量RT-PCR检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：

(1)病毒RNA的提取；

(2)实时荧光定量RT-PCR反应：

实时荧光定量RT-PCR反应体系为：

RNAase-free ddH₂O补至50μL；

实时荧光定量RT-PCR反应程序为：

第一步：45℃，20～45分钟；94～96℃，2分钟；第二步：94～95℃，15～30秒；65～69℃，30～75秒；68～72℃，30～40秒；6～9个循环；第三步：93～95℃，15～20秒；60℃，30秒；68～72℃，30秒；8个循环；第四步：93～95℃，15秒；52～55℃，30～60秒；40个循环；55℃时收集荧光；

(3)结果判定：

3)阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述的PCR Mix包括：48mM的pH8.5的Tris-硫酸、18mM的pH7.9的MOPS缓冲液、3mM的柠檬酸钠、20mM的(NH₄)₂SO₄、7mM的MgSO₄、0.10％(W/V)的聚氧乙烯月桂醚、0.1mg/mL的乙酰化BSA、300～800nM的检测引物组、100～300nM的检测探针组、420mM的dNTP。

10.如权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于：所述的酶混合液包括Tfl DNA聚合酶、MMLV反转录酶和Stoffel片段。