JP2022191225A - C型肝炎ウイルスを検出するための方法およびデバイス - Google Patents
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Abstract
Description
って利益を得るかどうかを決定するための方法を提供する。これらの方法は、マイクロサ
ンプリングデバイスを使用して収集される少量の乾燥生体液サンプル中のHCV RNA
および/または抗HCV抗体を検出することに基づく。本方法の実施において使用するた
めのキットも提供される。
供され、本発明の開示に対する従来技術を記載または構成することを認めるものではない
。
な病原体とみなされ(Rustgi VK.J Gastroenterol.42:5
13-521(2007))、全てではないがほとんどの血液媒介性の非A、非B肝炎(
NANBH)原因因子とみなされている。抗HCV抗体の存在は、個体が、HCVに感染
している可能性があること、およびHCV感染を伝染させる能力を有する可能性があるこ
とを示す。
を有する一本鎖のプラス鎖RNAウイルスである。HCVは、血液媒介性ウイルスとして
、血液や血液製剤によって伝染する。HCV感染の発生率は、静注薬物乱用に関して最大
であり、それより低い程度であるが他の経皮曝露でも起こっている(Lauer GM
& Walker BD,N Engl J Med 345:41-52(2001)
)。世界保健機関によれば、約1億3000万~1億7000万の人がHCVに慢性的に
感染しており、毎年350,000人を超える人がC型肝炎関連の肝疾患で死亡している
。疾病管理センターは、1.8%または390万人の米国人がC型肝炎に感染しており、
そのうち270万人が慢性的に感染していると見積もっている。未処置のままの場合、C
型肝炎は、肝臓がん、肝臓の傷害、最終的には肝不全に至る可能性がある。
できる、よりロバストで高感度の方法への実質的な必要性がある。
ある患者においてHCV感染を検出するための方法を提供する。本発明の技術の方法はま
た、出生前期の間にHCVに罹る高いリスクがある新生児を同定するために、妊娠した女
性においてC型肝炎感染に関してスクリーニングするために使用することもできる。
CV)を検出するための方法であって、(a)マイクロサンプリングデバイスの吸収性チ
ップから溶出させた乾燥生体液サンプルから、リボ核酸を抽出すること;(b)抽出され
たリボ核酸を逆転写して、複数のcDNA:RNAハイブリダイゼーション複合体を生成
すること;(c)cDNA:RNAハイブリダイゼーション複合体を、HCVゲノムの5
’UTRに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて増幅して、HCVアンプリ
コンを産生すること;および(d)工程(c)で産生されたHCVアンプリコンが検出さ
れる場合、乾燥生体液サンプルにおけるHCVを検出することを含む、方法を提供する。
一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血
である。乾燥生体液サンプル中に存在するHCVの遺伝子型は、遺伝子型1a、遺伝子型
1b、遺伝子型2a、遺伝子型2b、遺伝子型2c、遺伝子型2d、遺伝子型3a、遺伝
子型3b、遺伝子型3c、遺伝子型3d、遺伝子型3e、遺伝子型3f、遺伝子型4a、
遺伝子型4b、遺伝子型4c、遺伝子型4d、遺伝子型4e、遺伝子型4f、遺伝子型4
g、遺伝子型4h、遺伝子型4i、遺伝子型4j、遺伝子型5a、および遺伝子型6aか
らなる群から選択される1つまたは複数の遺伝子型であり得る。特定の実施形態において
、乾燥生体液サンプルは、肝炎の徴候または症状を示す患者、またはHCV感染のリスク
がある患者から単離される。一部の実施形態において、cDNA:RNAハイブリダイゼ
ーション複合体は、Z05またはZ05D DNAポリメラーゼを用いて増幅される。
の吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルは、指先穿刺を介して患者から収集される。特定
の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、MITRA(登録商標)チップ
である。乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを
溶解緩衝液と接触させることによって実行することができる。一部の実施形態において、
溶解緩衝液は、グアニジンイソチオシアネート、および任意選択でβ-メルカプトエタノ
ールを含む。加えて、または代替として、一部の実施形態において、乾燥生体液サンプル
の溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、溶解緩衝液と、37℃で少
なくとも30分接触させることによって実行される。一部の実施形態において、マイクロ
サンプリングデバイスのサンプル体積は、30μL以下、25μL以下、20μL以下、
15μL以下、または10μL以下である。
を、検出可能に標識されたプローブと接触させることをさらに含む。一部の実施形態にお
いて、検出可能な標識は、4-アセトアミド-4’-イソチオシアナトスチルベン-2,
2’ジスルホン酸、アクリジンおよび誘導体(アクリジン、アクリジンイソチオシアネー
ト)、Alexa Fluor(Alexa Fluor(登録商標)350、Alex
a Fluor(登録商標)488、Alexa Fluor(登録商標)546、Al
exa Fluor(登録商標)555、Alexa Fluor(登録商標)568、
Alexa Fluor(登録商標)594、Alexa Fluor(登録商標)64
7(Molecular Probes))、5-(2’-アミノエチル)アミノナフタ
レン-1-スルホン酸(EDANS)、4-アミノ-N-[3-ビニルスルホニル)フェ
ニル]ナフタルイミド-3,5ジスルホネート(ルシファーイエローVS)、N-(4-
アニリノ-1-ナフチル)マレイミド、アントラニルアミド、BODIPY(登録商標)
R-6G、BOPIPY(登録商標)530/550、BODIPY(登録商標)FL、
ブリリアントイエロー、Cal Fluor Red 610(登録商標)(CFR61
0)、クマリンおよび誘導体(クマリン、7-アミノ-4-メチルクマリン(AMC、ク
マリン120)、7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン〔trifluoromethylcoulu
arin〕(クマリン151))、Cy2(登録商標)、Cy3(登録商標)、Cy3.5(
登録商標)、Cy5(登録商標)、Cy5.5(登録商標)、シアノシン〔cyanosine〕
、4’,6-ジアミジノ〔diaminidino〕-2-フェニルインドール(DAPI)、5’
,5”-ジブロモピロガロール-スルホンフタレイン(ブロモピロガロールレッド)、7
-ジエチルアミノ-3-(4’-イソチオシアナトフェニル)-4-メチルクマリン、ジ
エチレントリアミン五酢酸、4,4’-ジイソチオシアナトジヒドロ-スチルベン-2,
2’-ジスルホン酸、4,4’-ジイソチオシアナトスチルベン-2,2’-ジスルホン
酸、5-[ジメチルアミノ]ナフタレン-1-スルホニルクロリド(DNS、ダンシルク
ロリド)、4-(4’-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、4-
ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-4’-イソチオシアネート(DABITC)、E
clipse(商標)(Epoch Biosciences Inc.)、エオシンお
よび誘導体(エオシン、エオシンイソチオシアネート)、エリスロシンおよび誘導体(エ
リスロシンB、エリスロシンイソチオシアネート)、エチジウム、フルオレセインおよび
誘導体(5-カルボキシフルオレセイン(FAM)、5-(4,6-ジクロロトリアジン
-2-イル)アミノフルオレセイン(DTAF)、2’,7’-ジメトキシ-4’5’-
ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(JOE)、フルオレセイン、フルオレセイン
イソチオシアネート(FITC)、ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(HE
X)、QFITC(XRITC)、テトラクロロフルオレセイン(TET)、フルオレサ
ミン、IR144、IR1446、ランタニド系〔lanthamide〕蛍光体、マラカイトグリ
ーンイソチオシアネート、4-メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、
ニトロチロシン、パラローズアニリン、フェノールレッド、B-フィコエリトリン、R-
フィコエリトリン、アロフィコシアニン、o-フタルジアルデヒド、Oregon Gr
een(登録商標)、ヨウ化プロピジウム、ピレンおよび誘導体(ピレン、ピレンブチレ
ート、スクシンイミジル1-ピレンブチレート)、QSY(登録商標)7、QSY(登録
商標)9、QSY(登録商標)21、QSY(登録商標)35(Molecular P
robes)、リアクティブレッド4(Cibacron(登録商標)ブリリアントレッ
ド3B-A)、ローダミンおよび誘導体(6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、
6-カルボキシローダミン(R6G)、リサミンローダミンBスルホニルクロリド、ロー
ダミン(Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミングリーン、ローダミ
ンXイソチオシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スルホローダ
ミン101の塩化スルホニル誘導体(テキサスレッド)、N,N,N’,N’-テトラメ
チル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミン、テトラメチ
ルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、リボフラビン、ロゾール酸、テルビウ
ムキレート誘導体、Quasar 670(登録商標)、ならびにVIC(登録商標)か
らなる群から選択される蛍光性レポーターである。
、少なくとも1~5IU/mL、少なくとも5~10IU/mL、少なくとも10~15
IU/mL、少なくとも15~20IU/mL、少なくとも20~40IU/mL、少な
くとも40~60IU/mL、少なくとも60~80IU/mL、少なくとも80~10
0IU/mL、少なくとも100~150IU/mL、少なくとも150~200IU/
mL、少なくとも200~250IU/mL、少なくとも250~300IU/mL、少
なくとも300~350IU/mL、少なくとも350~400IU/mL、少なくとも
400~500IU/mL、少なくとも500~600IU/mL、少なくとも600~
700IU/mL、少なくとも700~800IU/mL、少なくとも800~850I
U/mL、少なくとも850IU/mL、または少なくとも900IU/mLである。
HCV)を検出するための方法であって、(a)マイクロサンプリングデバイスの吸収性
チップから、乾燥生体液サンプルを溶出させること;および(b)溶出させた乾燥生体液
サンプル中で、少なくとも1つのHCVがコードする抗原に対する抗HCV抗体が検出さ
れる場合、乾燥生体液サンプルにおけるHCVを検出することを含む、方法を提供する。
一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血
である。乾燥生体液サンプル中に存在するHCVの遺伝子型は、遺伝子型1a、遺伝子型
1b、遺伝子型2a、遺伝子型2b、遺伝子型2c、遺伝子型2d、遺伝子型3a、遺伝
子型3b、遺伝子型3c、遺伝子型3d、遺伝子型3e、遺伝子型3f、遺伝子型4a、
遺伝子型4b、遺伝子型4c、遺伝子型4d、遺伝子型4e、遺伝子型4f、遺伝子型4
g、遺伝子型4h、遺伝子型4i、遺伝子型4j、遺伝子型5a、および遺伝子型6aか
らなる群から選択される1つまたは複数の遺伝子型であり得る。特定の実施形態において
、乾燥生体液サンプルは、肝炎の徴候または症状を示す患者、またはHCV感染のリスク
がある患者から単離される。一部の実施形態において、少なくとも1つのHCVがコード
する抗原は、c22-3、c200、およびNS5からなる群から選択される。
の吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルは、指先穿刺を介して患者から収集される。特定
の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、MITRA(登録商標)チップ
である。乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを
、リン酸緩衝食塩水および0.5%BSAを含む混合物と接触させることによって実行す
ることができる。特定の実施形態において、乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサン
プリングデバイスの吸収性チップを、リン酸緩衝食塩水および0.5%BSAを含む混合
物と、室温で少なくとも2時間、または2~8℃で一晩接触させることによって実行され
る。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスのサンプル体積は、30μ
L以下、25μL以下、20μL以下、15μL以下、または10μL以下である。
炎の症状を示す患者を選択するための方法であって、(a)血液細胞からのリボ核酸の放
出が起こる条件下で、乾燥血液サンプルを溶出させることであって、乾燥血液サンプルは
、マイクロサンプリングデバイスを用いて患者から収集される、溶出させること;(b)
溶出させた乾燥血液サンプルから、リボ核酸を単離すること;(c)単離したリボ核酸を
逆転写して、複数のcDNA:RNAハイブリダイゼーション複合体を生成すること;(
d)cDNA:RNAハイブリダイゼーション複合体を、HCVゲノムの5’UTRに特
異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて増幅して、蛍光標識されたHCVアンプ
リコンを産生すること;(e)工程(d)で産生された蛍光標識されたHCVアンプリコ
ンを検出すること;および(f)蛍光標識されたHCVアンプリコンが検出される場合、
HCV感染を阻害する治療剤での処置のために患者を選択することを含む、方法を提供す
る。
る治療剤での処置のために、肝炎の症状を示す患者を選択するための方法であって、(a
)乾燥血液サンプルを、0.5%BSAを含む緩衝溶液を用いて溶出させることであって
、乾燥血液サンプルは、マイクロサンプリングデバイスを用いて患者から収集される、溶
出させること;(b)溶出させた乾燥血液サンプルにおいて、少なくとも1つのHCVが
コードする抗原に対する抗HCV抗体を検出すること;および(c)抗HCV抗体が検出
される場合、HCV感染を阻害する治療剤での処置のために患者を選択することを含む、
方法を提供する。一部の実施形態において、少なくとも1つのHCVがコードする抗原は
、c22-3、c200、およびNS5からなる群から選択される。一部の実施形態にお
いて、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水をさらに含む。
アルファコン-1、ペグ化および/または非ペグ化インターフェロンアルファ-2b、ペ
グインターフェロンアルファ-2a、リバビリン、テラプレビル、ボセプレビル、ソホス
ブビル、シメプレビル、ダクラタスビル、ベルパタスビル、オムビタスビル、パリタプレ
ビル、リトナビル、ダサブビル、レジパスビル、エルバスビル、ダノプレビル、グラゾプ
レビル、GS-7977、β-インターフェロン、γ-インターフェロン、アマンタジン
、ならびに3TCからなる群から選択される1種または複数の薬剤である。一部の実施形
態において、マイクロサンプリングデバイスは、MITRA(登録商標)チップである。
乾燥血液サンプル中に存在するHCVの遺伝子型は、遺伝子型1a、遺伝子型1b、遺伝
子型2a、遺伝子型2b、遺伝子型2c、遺伝子型2d、遺伝子型3a、遺伝子型3b、
遺伝子型3c、遺伝子型3d、遺伝子型3e、遺伝子型3f、遺伝子型4a、遺伝子型4
b、遺伝子型4c、遺伝子型4d、遺伝子型4e、遺伝子型4f、遺伝子型4g、遺伝子
型4h、遺伝子型4i、遺伝子型4j、遺伝子型5a、および遺伝子型6aからなる群か
ら選択される1つまたは複数の遺伝子型であり得る。
のキットも本明細書で開示される。一部の実施形態において、キットは、マイクロサンプ
リングデバイス、溶解緩衝液、逆転写酵素、および任意選択でHCVゲノムの5’UTR
に特異的にハイブリダイズするプライマー対を含む。特定の実施形態において、キットは
、HCVゲノムの5’UTRに特異的にハイブリダイズする検出可能に標識されたプロー
ブを含む。
グデバイス、0.5%BSAを含むPBS溶液、および抗HCV一次抗体に特異的に結合
する検出可能に標識された二次抗体を含む。特定の実施形態において、キットは、c22
-3、c200、およびNS5からなる群から選択される少なくとも1つのHCVがコー
ドする抗原でコーティングされたウェルを含む固体基層をさらに含む。
イスは、MITRA(登録商標)チップである。
CV)を検出するための方法であって、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ(
例えば、MITRA(登録商標)チップ)から溶解緩衝液を用いて溶出させた乾燥生体液
サンプルから、HCV RNAを単離することを含む、方法を提供する。一部の実施形態
において、HCV RNAは、逆転写およびリアルタイムPCRを使用して検出される。
特定の実施形態において、溶解緩衝液は、グアニジンイソチオシアネート、および任意選
択でβ-メルカプトエタノールを含む。
HCV)を検出するための方法であって、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ
(例えば、MITRA(登録商標)チップ)から0.5%BSAを含む緩衝溶液を用いて
溶出させた乾燥生体液サンプルから、抗HCV抗体を単離することを含む、方法を提供す
る。一部の実施形態において、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水をさらに含む。特定の実施
形態において、抗HCV抗体は、c22-3、c200、およびNS5からなる群から選
択されるHCV抗原に結合する。抗HCV抗体は、酵素結合免疫吸着検査法(ELISA
)を使用して検出してもよい。
かを決定するための方法を提供する。これらの方法は、マイクロサンプリングデバイスを
使用して収集される少量の乾燥生体液サンプル中のHCV RNAおよび/または抗HC
V抗体を検出することに基づく。本方法の実施において使用するためのキットも提供され
る。本明細書で開示される方法は、指先穿刺を介してMITRA(登録商標)チップ収集
デバイスを用いて得られた少量の乾燥生体液サンプル中の低いウイルス負荷量を検出する
ことが可能である。さらに、MITRA(登録商標)チップから溶出させた乾燥生体液サ
ンプル中のHCV RNAは、指先穿刺を介した収集から1カ月後に溶出を実行した場合
でも、安定なままであったことが決定された。本発明の技術の方法は、RNA分解を予防
するように、MITRA(登録商標)チップを、尿素、塩、キレート化剤、またはRNア
ーゼ阻害剤などの添加剤で事前処置することを必要としないため、この結果は予想外であ
った。
別段の指定がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、本
発明の技術が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明
細書で使用される場合、別段の指定がない限り、単数形「1つの〔a〕」、「1つの〔an
〕」、および「その〔the〕」は、複数形の指示対象を包含する。したがって、例えば、
「オリゴヌクレオチド〔an oligonucleotide〕」への言及は、複数のオリゴヌクレオチド
分子を包含し、「核酸〔a nucleic acid〕」への言及は、1つまたは複数の核酸への言及
である。
定がない限り、または文脈からそうではないことが明白でない限り、その数値のいずれか
の方向で(それより大きいかまたはそれより小さい方向で)1%~10%の範囲内に入る
数値を包含すると解釈される。
意図した機能を発揮させるために対象に導入または送達するあらゆる経路を包含する。投
与は、経口、鼻腔内、非経口(静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下)、または局所など
のあらゆる好適な経路によって行うことができる。投与は、自己投与および他者による投
与を包含する。
ンプル中の核酸配列の集団としてあるものを増加させる方法を指す。増幅反応においてイ
ンビトロで生成した特定の標的核酸配列のコピーは、「アンプリコン」または「増幅生成
物」と呼ばれる。増幅は、指数関数的であってもよいし、または一次関数的であってもよ
い。標的核酸は、DNA(例えば、ゲノムDNAおよびcDNAなど)であってもよいし
、またはRNAであってもよい。後述される例示的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(P
CR)を使用した増幅に関するが、例えば等温法、ローリングサークル方法などの多数の
他の方法が当業者周知である。当業者は、これらの他の方法が、PCR方法の代わりに、
またはそれと一緒に使用できることを理解するであろう。例えば、Saiki,“Amp
lification of Genomic DNA”in PCR Protoco
ls,Innis et al.,Eds.,Academic Press,San
Diego,CA 1990,pp 13-20;Wharam,et al.,Nuc
leic Acids Res.29(11):E54-E54(2001)を参照され
たい。
わち、オリゴヌクレオチドまたは標的核酸などのヌクレオチドの配列)の言及において使
用される場合、ワトソン/クリックの塩基対合ルールを指す。核酸配列の相補物は、本明
細書で使用される場合、一方の配列の5’末端が他方の3’末端と対合するように核酸配
列と並べた場合に「逆平行会合」の状態であるオリゴヌクレオチドを指す。例えば、配列
「5’-A-G-T-3’」は、配列「3’-T-C-A-5’」に相補的である。本明
細書に記載される核酸中に、天然に存在する核酸に一般的に見出されない特定の塩基が包
含されていてもよい。そのようなものとしては、例えば、イノシン、7-デアザグアニン
、ロックド核酸(LNA)、およびペプチド核酸(PNA)が挙げられる。相補性は必ず
しも完全でなくてもよく、安定な二重鎖は、ミスマッチした塩基対、変性性の、またはマ
ッチしない塩基を含有する場合もある。核酸技術分野の当業者は、例えば、オリゴヌクレ
オチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、ミスマッチした塩基対のイオ
ン強度および発生率などの可変値の数を経験的に検討して、二重鎖の安定性を決定するこ
とができる。また相補配列は、DNA配列に相補的なRNA配列またはその相補配列であ
ってもよいし、cDNAであってもよい。
ェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。当業者は
、実質的に相補的な配列が、必ずしもそれらの全長にわたりハイブリダイズしていなくて
もよいことを理解するであろう。特に、実質的に相補的な配列は、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズする隣接する塩基配列に対して
3’または5’に位置する標的配列にハイブリダイズしない隣接する塩基配列を含んでい
てもよい。
たは標的HCV抗原に特異的に結合する抗体の存在を決定することを指す。検出は、10
0%の感度および/または100%の特異性をもたらすための方法を必要としない。
される場合、12週間の療法後に、HCV RNAレベルにおける2logまたはそれよ
り大きい減少、またはHCV RNAの検出不可能なレベルが患者において観察されるこ
とを意味する。
達成するのに十分な量を指し、例えば、HCV感染またはHCV感染に関連する1つもし
くは複数の症状の予防、またはそれらの減少をもたらす量を指す。治療または予防的適用
の状況において、対象に投与される治療剤の量は、疾患のタイプおよび重症度、ならびに
個体の特徴、例えば全身の健康状態、年齢、性別、体重および薬物耐性によって決まる。
またこのような量は、疾患の程度、重症度およびタイプによっても決まる。当業者は、こ
れらおよび他の要因に応じて適切な投薬量を決定できるであろう。治療薬物または薬剤の
「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、HCV感染の生理学的作用が最低限でも
改善されるレベルを意味する。治療有効量は、1回または複数の投与で与えることができ
る。
の細胞性物質から核酸またはタンパク質を分離すると解釈されるあらゆる作用を指す。抽
出または単離という用語は、機械的または化学的な溶解、界面活性物質またはプロテアー
ゼの添加、または他の細胞性物質の沈殿および除去を包含する。
光を吸収し、その後より長い波長の光(放出周波数)を放出する分子を指す。用語「ドナ
ーフルオロフォア」は、本明細書で使用される場合、クエンチャー部分に近接すると、放
出エネルギーをクエンチャーに供与するまたは移動させるフルオロフォアを意味する。ク
エンチャー部分にエネルギーを供与する結果として、ドナーフルオロフォアそれ自体は、
近接して位置するクエンチャー部分の非存在下で有する特定の放出周波数で、より少ない
光を放出する。
(少なくとも14から25ヌクレオチドのストレッチにわたり、少なくとも約65%相補
的な、少なくとも約75%、または少なくとも約90%相補的な)核酸鎖が適切にストリ
ンジェントな条件下で互いにアニールして、相補的塩基対間の水素結合の形成を介して二
重鎖またはヘテロ二重鎖を形成するプロセスを指す。ハイブリダイゼーションは、典型的
には、さらに好ましくは、プローブの長さの核酸分子、好ましくは15~100ヌクレオ
チドの長さ、より好ましくは18~50ヌクレオチドの長さの核酸分子を用いて実行され
る。核酸ハイブリダイゼーション技術は当技術分野において周知である。例えば、Sam
brook,et al.,1989,Molecular Cloning:A La
boratory Manual,Second Edition,Cold Spri
ng Harbor Press,Plainview,N.Y.を参照されたい。ハイ
ブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度(すなわち、核酸間の会合の強
度)は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、および形成された
ハイブリッドの熱融点(Tm)のような要因の影響を受ける。当業者は、少なくとも所望
のレベルの相補性を有する配列が、安定してハイブリダイズするが、より低い相補性を有
するものはハイブリダイズしないようなハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシ
ーをどのように推測し調整するかを理解している。ハイブリダイゼーション条件およびパ
ラメーターの例については、例えば、Sambrook,et al.,1989,Mo
lecular Cloning:A Laboratory Manual,Seco
nd Edition,Cold Spring Harbor Press,Plai
nview,N.Y.;Ausubel,F.M.et al.1994,Curren
t Protocols in Molecular Biology,John Wi
ley & Sons,Secaucus,N.J.を参照されたい。一部の実施形態に
おいて、特異的なハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下で起こる。標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド(例
えば、プローブまたはプライマー)は、好適な条件下で標的核酸に「ハイブリダイズする
」ことになる。
、脊椎動物、哺乳動物、またはヒトであり得る。好ましい実施形態において、個体、患者
または対象は、ヒトである。
単量体単位で構成される骨格上に核酸塩基の配列を有する分子を指す。塩基は、それらが
オリゴヌクレオチドの塩基に相補的な塩基配列を有する核酸と結合できるような様式で骨
格上に配置される。最も一般的なオリゴヌクレオチドは、糖リン酸単位の骨格を有する。
2’位にヒドロキシル基を有さないオリゴデオキシリボヌクレオチドと、2’位にヒドロ
キシル基を有するオリゴリボヌクレオチドとは、区別することができる。またオリゴヌク
レオチドは、ヒドロキシル基の水素が有機基、例えばアリル基で置き換えられた誘導体を
包含する場合もある。プライマーまたはプローブとして機能するオリゴヌクレオチドは、
一般的に、少なくとも約10~15ヌクレオチドの長さ、または最大約70、100、1
10、150または200ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約15から2
5ヌクレオチドの長さである。特定の標的核酸を特異的に増幅したり、または特異的に検
出したりするためのプライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、
一般的に、標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。
の伸長生成物の合成が誘導される条件下、すなわち、適切な緩衝液(「緩衝液」は、pH
、イオン強度、補因子などを包含する)および好適な温度で、異なるヌクレオチド三リン
酸およびポリメラーゼの存在下に配置された場合、核酸配列合成の開始点として作用する
ことができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーのヌクレオチドの1つまたは複数は
、例えばメチル基、ビオチンもしくはジゴキシゲニン部分、蛍光性タグの付加によって、
または放射性ヌクレオチドを使用することによって修飾されていてもよい。プライマー配
列は、必ずしもテンプレートの正確な配列を反映していなくてもよい。例えば、非相補的
ヌクレオチド断片が、プライマーの5’末端に付着されており、プライマー配列の残りが
、鎖に実質的に相補的であってもよい。本明細書で使用されるプライマーという用語は、
合成することができるプライマーの全ての形態、例えばペプチド核酸プライマー、ロック
ド核酸プライマー、ホスホロチオエートで修飾されたプライマー、標識されたプライマー
などを包含する。用語「フォワードプライマー」は、本明細書で使用される場合、二本鎖
DNA(dsDNA)のアンチセンス鎖にアニールするプライマーを意味する。「リバー
スプライマー」は、dsDNAのセンス鎖にアニールする。
長さ、または最大約100、110、125、または200ヌクレオチドの長さである。
一部の実施形態において、プライマーは、好ましくは約15から約60ヌクレオチドの間
の長さであり、最も好ましくは約25から約40ヌクレオチドの間の長さである。一部の
実施形態において、プライマーは、15から35ヌクレオチドの長さである。最適なハイ
ブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応増幅にとって標準的な長さはない。特定
のプライマーの適用にとって最適な長さは、H.Erlich,PCR Technol
ogy,PRINCIPLES AND APPLICATION FOR DNA A
MPLIFICATION,(1989)に記載される方式で容易に決定することができ
る。
するのに一緒に使用できるフォワードプライマーとリバースプライマーとの対(すなわち
、左側のプライマーと右側のプライマーとの対)を指す。
酸と相互作用する核酸を指す。プローブは、標的核酸配列に完全に相補的であってもよい
し、または部分的に相補的であってもよい。相補性のレベルは、一般的にプローブの機能
に基づく多くの要因によって決まる。プローブは、標識されていてもよいし、もしくは非
標識でもよく、または当技術分野において周知の様々な方法のいずれかで修飾されていて
もよい。プローブは、標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。プローブは
、DNA、RNAまたはRNA/DNAハイブリッドであり得る。プローブは、オリゴヌ
クレオチド、人工染色体、断片化した人工染色体、ゲノム核酸、断片化したゲノム核酸、
RNA、組換え核酸、断片化した組換え核酸、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸、
環状の複素環のオリゴマー、または核酸のコンジュゲートであり得る。プローブは、修飾
された核酸塩基、修飾された糖部分、および修飾されたインターヌクレオチド結合を含ん
でいてもよい。プローブは、典型的には、少なくとも約10、15、20、25、30、
35、40、50、60、75、100ヌクレオチドの長さであるか、またはそれより長
い。
接すると、ドナーによって生成した放出エネルギーを吸収し、エネルギーを熱として放散
させるか、またはドナーの発光波長より長い波長の光を放出するかのいずれかである分子
を意味する。後者の場合、クエンチャーは、アクセプターフルオロフォアであるとみなさ
れる。消光部分は、近位の(すなわち衝突)消光を介して、またはフォースターまたは蛍
光共鳴エネルギー移動(「FRET」)によって作用し得る。FRETによる消光は、一
般的に、TaqMan(登録商標)プローブで使用されるが、近位の消光は、分子ビーコ
ンおよびScorpion(商標)タイプのプローブで使用される。
る場合、4週間の療法後に、患者において検出不可能なレベルのHCV RNAが観察さ
れることを意味する。
られた臨床サンプルを指す。好ましい実施形態において、サンプルは、対象から収集され
る組織、体液、または微生物などの生物学的な源から得られる(すなわち、「生体サンプ
ル」)。サンプル源としては、これらに限定されないが、粘液、痰(処理済みまたは未処
理)、気管支肺胞洗浄液(BAL)、気管支洗浄液(BW)、血液、体液、髄液(CSF
)、尿、血漿、血清、または組織(例えば、生検材料)が挙げられる。好ましいサンプル
源としては、指先穿刺による全血が挙げられる。
列のヘテロジニアスな集団中で予め選択された配列バリアントを検出する方法の能力の尺
度である。予め選択された配列バリアントがサンプル中の配列の少なくともF%として存
在するサンプルと仮定して、方法が、予め選択されたC%の信頼性、時間のS%で予め選
択された配列を検出することができる場合、その方法は、F%のバリアントに対してS%
の感度を有する。一例として、予め選択されたバリアント配列がサンプル中の配列の少な
くとも5%として存在するサンプルと仮定して、方法が、予め選択された99%の信頼性
、10回のうち9回(F=5%;C=99%;S=90%)で予め選択された配列を検出
することができる場合、その方法は、5%のバリアントに対して90%の感度を有する。
例示的な感度としては、少なくとも50、60、70、80、90、95、98、および
99%が挙げられる。
される場合、オリゴヌクレオチドと核酸とを並べたときに、プライマーのヌクレオチド配
列が、増幅しようとする核酸の一部と少なくとも12塩基の配列同一性を有することを意
味する。核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、ストリンジェントなハイブリ
ダイゼーションまたは洗浄条件下で、目的の標的にハイブリダイズできるが、目的ではな
い核酸に実質的にハイブリダイズしないものである。より高いレベルの配列同一性が好ま
しく、例えば少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90
%、少なくとも85~95%であり、より好ましくは、少なくとも98%の配列同一性で
ある。配列同一性は、市販のコンピュータープログラムを、当技術分野において周知のア
ルゴリズムを採用するデフォルト設定で使用して決定することができる。「高い配列同一
性」を有する配列は、本明細書で使用される場合、並べられたヌクレオチド位置の少なく
とも約50%、好ましくは並べられたヌクレオチド位置の少なくとも約60%、より好ま
しくは並べられたヌクレオチド位置の少なくとも約75%に、同一なヌクレオチドを有す
る。
ントを、シーケンシングアーティファクトまたは他の密接に関連した配列から区別する方
法の能力の尺度である。これは、偽陽性検出を回避する能力である。偽陽性検出は、サン
プル調製中に目的の配列に導入されたエラー、シーケンシングのエラー、または偽遺伝子
もしくは遺伝子ファミリーのメンバーのような密接に関連した配列の不注意なシーケンシ
ングに起因する可能性がある。XTrue種の配列が実際にバリアントであり、XNot
true種が実際にバリアントではない、NTotal種の配列のサンプルセットに適
用されたとき、方法が、実際にバリアントではないものの少なくともX%をバリアントで
はないとして選択する場合、その方法は、X%の特異性を有する。例えば、500種の配
列が実際にバリアントであり、500種が実際にバリアントではない、1,000種の配
列のサンプルセットに適用されたとき、方法が、500種の実際にバリアント配列ではな
いものの90%をバリアントではないとして選択する場合、その方法は、90%の特異性
を有する。例示的な特異性としては、少なくとも50、60、70、80、90、95、
98、および99%が挙げられる。
抗原)を認識しそれと結合するが、他の分子を実質的に認識したりそれと結合したりしな
い分子(例えば、抗HCV抗体)を指す。特定の分子(例えば、標的HCV抗原)への「
特異的な結合」、それに「特異的に結合する」、またはそれに「特異的な」という用語は
、本明細書で使用される場合、例えば、分子が、それに結合する分子に関して、少なくと
も約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10
-10M、10-11M、10-12Mの、またはそれより大きいKdを有することによ
って示すことができる。
合、以下:50%ホルムアミド、5×SSC、50mMのNaH2PO4、pH6.8、
0.5%SDS、0.1mg/mLの超音波破砕したサケ精子DNA、および5×デンハ
ルト溶液中での、42℃で一晩のハイブリダイゼーション;2×SSC、0.1%SDS
を用いた、45℃での洗浄;および0.2×SSC、0.1%SDSを用いた、45℃で
の洗浄と、少なくとも同程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を指す。
別の例において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、20個の隣接する
ヌクレオチドのストレッチにわたり2つより多くの塩基が異なる、2つの核酸のハイブリ
ダイゼーションを許容しないはずである。
〕(SVR)」は、治療レジメンの終了から24週間の後に、患者において検出不可能な
レベルのHCV RNAが観察されることを意味する。
アルタイムPCRのための方法を指す。TaqMan(登録商標)プローブは、プローブ
のどちらかの末端に、ドナーの蛍光がクエンチャーによって吸収されるように十分互いに
近接してドナーおよびクエンチャーフルオロフォアを含む。しかしながら、プローブが増
幅したセグメントにハイブリダイズする場合、Taqポリメラーゼの5’-エキソヌクレ
アーゼ活性は、プローブを切断し、それによってドナーフルオロフォアが検出可能な蛍光
を放出することを可能にする。
るサンプル中の、検出および/または定量化しようとする目的の核酸配列を指す。標的核
酸は、染色体のセグメント、遺伝子間配列を有するまたは有さない完全な遺伝子、遺伝子
間配列を有するまたは有さない遺伝子のセグメントもしくは一部、またはプローブまたは
プライマーが設計される核酸の配列で構成されていてもよい。標的核酸としては、野生型
配列、変異、欠失、挿入もしくは重複、タンデムリピートエレメント、目的の遺伝子、目
的の遺伝子の領域、またはそれらのあらゆる上流もしくは下流の領域を挙げることができ
る。標的核酸は、特定の遺伝子の代替配列または対立遺伝子を表す場合もある。標的核酸
は、ゲノムDNA、cDNA、またはRNAから誘導されたものでもよい。
HCVビリオンは、約3,010アミノ酸のポリタンパク質をコードする約9600塩
基のゲノム配列を有するフラビウイルス科に属するエンベローププラス鎖RNAウイルス
である。感染細胞において、ポリタンパク質は、細胞およびウイルスのプロテアーゼによ
って複数の部位で切断されて、構造および非構造(NS)タンパク質を産生する。HCV
のタンパク質生成物としては、構造タンパク質C、E1、およびE2、ならびに非構造タ
ンパク質NS2、NS3、NS4AおよびNS4B、ならびにNS5AおよびNS5Bが
挙げられる。
れる。HCVのケースにおいて、成熟非構造タンパク質(NS2、NS3、NS4A、N
S4B、NS5A、およびNS5B)の生成は、2つのウイルスプロテアーゼによって実
行される。第1のプロテアーゼは、NS2-NS3ジャンクションで切断を行い、第2の
プロテアーゼは、NS3のN末端領域内に含有されるセリンプロテアーゼ(以降、NS3
プロテアーゼと称される)であり、それに続く全てのNS3下流の切断を媒介し、どちら
もNS3-NS4A切断部位ではシス、残りのNS4A-NS4B、NS4B-NS5A
、NS5A-NS5B部位ではトランスの形態である。
して作用し、場合によってはNS3および他のウイルスレプリカーゼ要素の膜局在化を補
助する。NS3タンパク質とNS4Aとの複合体形成は、あらゆる場所でタンパク質分解
効率を強化するプロセシング事象に必要のようである。またNS3タンパク質は、ヌクレ
オシドトリホスファターゼおよびRNAヘリカーゼ活性も呈する。c200タンパク質は
、HCVゲノムの推定のNS3およびNS4領域によってコードされる。
NS5Bポリメラーゼは、HCVの複製サイクルにおけるテンプレートとして役立つ一本
鎖ウイルスRNAからの二本鎖RNAの合成に必要である。それゆえに、NS5Bポリメ
ラーゼは、HCV複製複合体における必須の要素とみなされる。(K.Ishi,et
al,Hepatology 29:1227-1235(1999);V.Lohma
nn,et al.,Virology 249:108-118(1998))。c2
2-3タンパク質は、HCVゲノムの推定のコア領域によってコードされる。
従来の乾燥血液のスポット技術は、不正確なサンプル体積や、一定のサンプル粘度への
依存(すなわち、サンプルがサンプルカード上に均一に塗り広げられるという見込み)な
どの多数の欠点が付随する。カード上に等しい体積サンプルが投与される場合、粘度が一
定であれば、血液スポットの直径は一定のままになる。しかしながら、粘度は、血液中の
ヘマトクリット(HCT)またはパック細胞容積(PCV)レベルが異なるために、血液
サンプル間で顕著に変動する。高いヘマトクリットレベルを有するサンプルは、血液スポ
ット紙上により小さい直径のスポットを形成することから、サンプリングしたスポットの
固定した直径内に異なる濃度の血液をもたらす。PCVレベルは、スポット直径において
約45%の変動を示すと考えられる。内部標準はスポットされた血液上に噴霧されるため
、これは、定量化において45%のエラーを引き起こす可能性がある。本明細書で開示さ
れた方法で採用されるマイクロサンプリングデバイスは、より正確な血液体積を回収でき
ること、ヘマトクリットの偏りがないこと、および実験室での処理のために標準的な液体
を取り扱う者でも簡単に自動化できる能力などの数々の利点を付与する。
て比較的大量の血液を必要とする。乾燥血液スポットは、一般的に、スポット1つ当たり
50~75μlを必要とするが、マイクロサンプリングデバイスは、およそ20μlから
結果を得ることができる。乾燥血液スポットはしばしば、ウイルス負荷量を検出する場合
、血漿などの他のサンプルタイプと比較して性能が一定しない問題を有すること(Pan
nus et al.,Medicine,95:48(e5475)(2016))、
さらに、特定のタイプの評価(例えば、光学密度)の場合、乾燥血液スポットの体積を、
血清などの他のサンプルタイプと比較して著しく多くする必要性がある場合があること(
Brandao et al.,J.Clin.Virol.,57:98-102(2
013))が当技術分野において認識されている。実際に、抗レトロウイルス剤療法を受
けているHIV患者においてウイルス負荷量および処置の失敗を検出するための乾燥血液
スポットと血漿スポットの両方のスクリーニングを使用したところ、どちらも高い割合の
偽陽性を生じたことが見出された(Sawadogo et al.,J.Clin.M
icrobiol.,52(11):3878-83(2014))。
位端を有する吸収性チップを含む。吸収性チップの遠位端の幅は、近位端の幅と比較して
狭い。近位端は、ホルダーに取り付けられ、それに対して遠位端は、血液などの吸収させ
ようとする流体と接触するように設計される。マイクロサンプリングデバイスは、血液な
どの生体液サンプルを、容易に乾燥させ、輸送し、次いで後で分析することを可能にする
。特定の実施形態において、生体液は、指先穿刺による血液である。
の間に任意選択の障壁があってもよく、それにより血液がホルダーに通過したりまたは吸
い上げられたりすることを防ぐ。吸収性チップは、過量の流体が利用可能であっても、実
質的に同じ体積の流体を吸い上げる材料で構成される(容量測定式の吸収性マイクロサン
プリングまたはVAMS(商標))。吸収性チップの体積は、吸収された流体の体積に影
響を与える。吸収性チップのサイズおよび形状は、吸収される血液の体積および吸収の速
度を調整するために、変更することができる。約7~15μL、約20μL、さらには最
大約30μLもの血液体積を受け入れることができる。サンプリング時間は、約2秒、約
3秒、約5秒、または最大約10秒であり得る。
ポリエステル)。代替として、材料は、最初のうちは疎水性であってもよく、その後、そ
れを親水性になるように処理してもよい。疎水性マトリックスは、様々な公知の方法、例
えばマトリックスのプラズマ処理または界面活性剤処理(例えば、Tween-40また
はTween-80)によって親水性にすることができる。一部の実施形態において、プ
ラズマ処理は、ポリオレフィン、例えばポリエチレンなどの疎水性材料を親水性にするの
に使用される。代替として、表面への親水性ポリマーのグラフト化、および糖などの極性
または親水性分子での表面上の活性基の化学的官能化が、吸収性チップのために親水性表
面を達成するのに使用することができる。また共有結合による改変も、吸収性チップの表
面に極性または親水性官能基を付加するのに使用することができる。
μLの血液を吸収するのに十分なサイズを有し、約5mm(0.2インチ)未満の長さ、
および約20mm2未満の断面積、および約4g/cc未満の密度を有する、親水性のポ
リマー性材料で作製された吸収性チップを含む。一部の実施形態において、吸収性チップ
は、ポリエチレンで構成され、好ましくは1~7秒以内、より好ましくは約1~5秒以内
に約1~20マイクロリットルの血液を吸収するように設計される。吸収性チップは、乾
燥血液、または内部標準の1つまたは複数を含有していてもよい。
3~14マイクロリットルの血液を吸収し、約2.5秒で9~10マイクロリットルの血
液を吸収し、約38%の細孔容積を有する。他の実施形態において、吸収性チップは、約
24マイクロリットルの体積、約0.6g/ccの密度を有し、約2.5秒で約10マイ
クロリットルの血液を吸収し、約40%の細孔容積を有する。一部の実施形態において、
マイクロサンプリングデバイスは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるUS
2013/0116597に記載されるようなMITRA(登録商標)チップである。
の実施形態において、ホルダーは、吸収性チップの中心内部の凹部にはまり、吸収性チッ
プとホルダーの縦軸に沿って伸びる円筒状の柱を有する。吸収性チップの円錐型の形状は
、サンプルを迅速かつ均一に吸い上げることを助ける。
管状の円錐型の形状のホルダーが好ましく、吸収性チップは、ホルダーの狭い末端上にあ
る。ホルダーのより幅広な逆の末端は、閉じていてもよいし、または開いていて中空であ
ってもよく、任意選択で、ピペットチップに取り付けられるように設計されていてもよい
。ホルダーは、外側に伸長するフランジを有していてもよく、このようなフランジは、ホ
ルダー、乾燥棚または試験器具中の合わせ構造を突き合わせて、このようなホルダー、乾
燥棚および試験器具中の所望の位置に吸収性チップを位置決めするのを助けるように配置
される。
子になるように設計された先細の管状構造を包含していてもよい。吸収性チップは、ポリ
エチレンで構成されていてもよく、吸収性チップとホルダーはどちらも、無菌条件下で作
製されるか、または最後に滅菌される。吸収性チップは、乾燥抗凝血剤を含有していても
よい。一部の実施形態において、ホルダーは、ホルダーの長さに沿って伸長する複数のリ
ブを有する。リブは、輸送のために、または吸収性チップ中の乾燥血液の抽出のために、
吸収性チップが、ホルダーおよび吸収性チップが設置されている凹部の壁と接触すること
を防ぐように選択された高さおよび長さを有していてもよい。
少量の血液サンプルは、少なくとも10分、少なくとも20分、少なくとも30分、少な
くとも40分、少なくとも50分、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3
時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも8時間、少
なくとも12時間、少なくとも16時間、少なくとも20時間、少なくとも24時間、少
なくとも48時間、少なくとも72時間、または少なくとも96時間、または少なくとも
1週間、または少なくとも2週間、または少なくとも3週間、または少なくとも4週間、
または少なくとも1カ月、周囲温度または室温で乾燥させる。特定の実施形態において、
少量の血液サンプルは、約2~3時間乾燥させる。
プおよびホルダーは、吸収性チップと乾燥容器の壁または他の可能性のある汚染物質表面
との接触を最小化しながら、乾燥を促進するように設計された特殊な乾燥容器に移しても
よい。乾燥容器は、乾燥を促進するために、乾燥剤を有していてもよい。また乾燥容器は
、汚染を防ぐために、運送のために密封できる保護カバーを備えていてもよい。一部の実
施形態において、カバーは、表面を有し、その上に、乾燥血液サンプルの源を識別し、他
の関連情報を提供するために、印刷された表示が記載されていてもよい。一部の実施形態
において、容器の寸法、および容器内のホルダーの相対的な位置は、SBS Micro
wellのプレートの仕様に従うものとする。マイクロサンプリングデバイスおよび乾燥
容器は、乾燥を助けるために乾燥剤と共にプラスチックバッグ中に入れてもよく、さらに
、この様式で輸送されるか、または乾燥剤を除去した後に輸送されるかのいずれでもよい
。
ルダーの中空の末端にはまり、取り外し可能にかみ合う大きさの、据え付けの突出部分を
有する第1の部分を有する。加えて、または代替として、容器は、第1の部分に取り外し
可能に留められた第2の部分を有し、さらに、ホルダーの運送のために、ホルダーの一部
を内包するように設計された凹部を有する。容器は、空気をマイクロサンプリングデバイ
スの吸収性チップと接触させる複数の開口部を含んでいてもよい。さらに、第1の部分は
、その中にアクセスポートを有する面を有していてもよく、このような面は、ポート全体
に、さらにホルダーが据え付けの突出部上にある場合はホルダー上に表示を適用できるよ
うに、十分なサイズを有し、そのように配置される。
ずれかで、予め決定された体積の好適な緩衝液(本明細書に記載されるように)中で溶出
させて、乾燥血液から目的の核酸またはタンパク質を抽出することができる。流体および
/または吸収性チップの物理的なかき混ぜ技術、例えば超音波破砕またはボルテックス混
合は、乾燥血液から液体サンプルマトリックスへの抽出プロセスを促進することができる
。さらなる分析のためのサンプルマトリックスをさらに簡易化にするために、物理的な分
離技術、例えば遠心分離、蒸発/再溶解、濃縮、沈殿、液体/液体抽出、および固相抽出
を使用することができる。
に吸収性チップを含み、中空の近位端を有する。容器は同様に、それぞれ複数のホルダー
の中空の末端にはまり、取り外し可能にかみ合う大きさの、複数の細長い据え付けの突出
部を有する。容器の第2の部分は、容器内の別々の囲いの中に、複数のホルダーのそれぞ
れを別々に内包するように設計された凹部を有する。特定の実施形態において、複数のホ
ルダーのそれぞれは、ホルダーの長さに沿って伸長する複数のリブを有し、リブは、吸収
性チップが容器の壁と接触することを防ぐように設計されている。要求に応じて、吸収性
チップ中の血液の乾燥または乾燥の維持を助けるために、容器の内部に乾燥剤が入れられ
ていてもよい。各ホルダーは、シリアルナンバーなどの、ホルダーを容器や少なくとも1
つの他のホルダーと関連付ける可視的な表示を有していてもよく、シリアルナンバーの様
々な部分は、関連するホルダー/吸収性チップおよびその中にホルダーを輸送する容器を
示す。
標的核酸(例えば、HCV RNA)の増幅は、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフ
ィー、プローブを用いるハイブリダイゼーション、シーケンシング、融解曲線分析、また
は「リアルタイム」検出などの、当技術分野において周知の多数の方法のいずれかによっ
て検出することができる。
ーが取り込まれた状態になるか、またはプローブがハイブリダイズして、反応中に蛍光の
変化をモニターすることが可能な機器で増幅されると、蛍光の差が生じるように検出可能
に標識されていてもよい。核酸増幅のためのリアルタイム検出方法は周知であり、そのよ
うなものとしては、例えば、TaqMan(登録商標)システム、Scorpion(商
標)プライマーシステムおよび二本鎖核酸のためのインターカレート色素の使用が挙げら
れる。
量の標的DNAを含有するサンプルの両方において連続的に測定される。標準曲線は、標
準サンプル中の最初のテンプレート濃度を、生成物の具体的な閾値濃度を産生するのに必
要なPCR(商標)サイクルの数(Ct)と相関させることによって構築される。試験サ
ンプルにおいて、target PCR(商標)生成物の蓄積を、同じCtの後に測定す
ることにより、標準曲線からの標的DNA濃度の補間が可能になる。
ーションによって検出される。増幅した標的配列の一部に相補的なプローブオリゴヌクレ
オチドを使用して、増幅した断片を検出することができる。一部の実施形態において、ハ
イブリダイゼーションは、リアルタイムで検出してもよい。代替の実施形態において、ハ
イブリダイゼーションは、リアルタイムで検出されない。標的配列のそれぞれにつき増幅
した核酸は、同時に(すなわち、マルチプレックスPCRなどの同じ反応容器中で)また
は個々に(すなわち、別々の反応容器で)検出してもよい。特定の実施形態において、複
数の標的核酸が、2つ以上の区別可能に標識された(例えば、色などの異なる検出可能な
部分を介して)遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用して同時に検出され、
このようなプローブの一方は、第1の標的配列にハイブリダイズし、他方は、第2の標的
配列にハイブリダイズする。
標識される。したがって、マルチプレックスPCRにおいて、例えばHEXおよびFAM
蛍光色素が異なるプライマー対に存在し、得られたアンプリコンと会合される。他の実施
形態において、フォワードプライマーは、1つの検出可能な部分で標識され、一方でリバ
ースプライマーは、異なる検出可能な部分で標識され、例えば、フォワードプライマーは
FAM色素で、リバースプライマーはHEX色素で標識される。異なる検出可能な部分の
使用は、同じ長さを有するかまたは長さが非常に類似している増幅生成物を識別するのに
有用である。
い。したがって、検出しようとする全ての標的は、上の鎖、下の鎖、または上の鎖および
下の鎖の標的の組合せを含んでいてもよい。
(登録商標)プローブ、分子ビーコン、およびScorpionプライマー-プローブを
使用する。リアルタイムPCRは、最終的な増幅した生成物の量を検出する他の形態の定
量PCRより高い特異性、感度および再現性で、テンプレートの最初の量を定量化する。
リアルタイムPCRは、アンプリコンのサイズを検出しない。Scorpion(商標)
およびTaqMan(登録商標)技術で採用されるプローブは、蛍光消光の原理に基づい
ており、ドナーフルオロフォアおよび消光部分を含む。
な機器を使用して実行される。このような機器は、最も一般的には、1つまたは複数の蛍
光標識からの蛍光を検出することが可能である。例えば、このような機器(例えば、AB
I Real-Time PCR System 7500(登録商標)配列検出器)で
のリアルタイム検出は、蛍光をモニターし、各PCRサイクル中にレポーターシグナルの
測定値またはRn値を計算する。閾値サイクル、またはCt値は、蛍光が閾値と交差する
サイクルである。閾値は、配列検出システムソフトウェアで決定してもよいし、または手
動で決定してもよい。
幅生成物につきプローブ標識を検出することによって達成される。クエンチャーは、プロ
ーブの標的が増幅される前に標識が検出されることを防ぐ検出可能な標識とさらに会合し
ていてもよい。TaqMan(登録商標)プローブは、このようなプローブの例である。
.6:986-994,1996)は、Taqポリメラーゼの蛍光を発生させる5’エキ
ソヌクレアーゼ活性を使用して、DNAサンプル中の標的配列の量を測定する。TaqM
an(登録商標)プローブは、通常5’塩基またはその近くにあるドナーフルオロフォア
と、典型的には3’塩基またはその近くにある消光部分とを含有するオリゴヌクレオチド
である。クエンチャー部分は、TAMRAなどの色素であってもよいし、または4-(4
-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)などの非蛍光分子であっても
よい。Tyagi et al.,16 Nature Biotechnology
49-53(1998)を参照されたい。照射されると、励起された蛍光性のドナーは、
蛍光を発するのではなく、FRETによってエネルギーをすぐ近くの消光部分に移動させ
る。したがって、ドナーとクエンチャーとが近接すると、ドナー蛍光の放出が防がれ、同
時にプローブは無傷のままとなる。
設計される。ポリメラーゼが、TaqMan(登録商標)プローブが結合しているテンプ
レートを複製すると、その5’エキソヌクレアーゼ活性によってプローブが切断される。
それによりクエンチャー(FRETではない)の活性を終わらせ、ドナーフルオロフォア
は蛍光を放出し始め、この蛍光はプローブ切断の速度に比例して各サイクルで増加する。
PCR生成物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の増加をモニターすることによって検出さ
れる。クエンチャーがアクセプターフルオロフォアである場合、PCR生成物の蓄積は、
アクセプターフルオロフォアの蛍光の減少をモニターすることによって検出することがで
きる。
システム(例えば、Scorpion(商標)プライマー)を使用して実行される。Sc
orpionプライマーでは、配列特異的なプライミングおよびPCR生成物の検出は、
単一分子を使用して達成される。Scorpionプライマーは、ハイブリダイズしてい
ない状況でステム-ループ立体配置を維持する。フルオロフォアは5’末端に付着し、3
’末端とカップリングした部分によって消光されるが、特定の実施形態において、この配
置は交換されていてもよい。またステムおよび/またはループの3’部分は、プライマー
の伸長生成物に相補的な配列も含有し、増幅不可能な単量体を介して特異的なプライマー
の5’末端に連結される。プライマー部分の伸長後、特異的なプローブ配列は、伸長した
アンプリコン内でその相補物に結合することができ、そのようにしてヘアピンループを開
くことができる。それによって蛍光が消光されることを防ぎ、シグナルが観察される。特
異的な標的は、リバースプライマーおよびScorpion(商標)プライマーのプライ
マー部分によって増幅され、結果として伸長生成物が生じる。蛍光シグナルは、Scor
pion(商標)プライマーのプローブエレメントが伸長生成物に結合することによって
起こる、クエンチャーからのフルオロフォアの分離によって生成する。
するDNA配列のセクションを検出するように設計された、短い蛍光標識したDNA配列
を含むかまたはそれからなり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる
French et al.,Mol Cell Probes,5(6):363-7
4(2001)で開示されたものなどである。HyBeacons(登録商標)は、この
タイプのプローブの例である。
のプライマーまたは少なくとも1つのプローブは、検出可能な部分を含む。代替として、
検出可能な部分は、プライマーに付着した、例えばプライマー-プローブの形態でプロー
ブ上にあってもよい。一部の実施形態において、検出可能な部分または標識は、フルオロ
フォアである。好適な蛍光性の部分としては、これらに限定されないが、以下のフルオロ
フォア:4-アセトアミド-4’-イソチオシアナトスチルベン-2,2’ジスルホン酸
、アクリジンおよび誘導体(アクリジン、アクリジンイソチオシアネート)、Alexa
Fluor(Alexa Fluor(登録商標)350、Alexa Fluor(
登録商標)488、Alexa Fluor(登録商標)546、Alexa Fluo
r(登録商標)555、Alexa Fluor(登録商標)568、Alexa Fl
uor(登録商標)594、Alexa Fluor(登録商標)647(Molecu
lar Probes))、5-(2’-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホ
ン酸(EDANS)、4-アミノ-N-[3-ビニルスルホニル)フェニル]ナフタルイ
ミド-3,5ジスルホネート(ルシファーイエローVS)、N-(4-アニリノ-1-ナ
フチル)マレイミド、アントラニルアミド、BODIPY(登録商標)R-6G、BOP
IPY(登録商標)530/550、BODIPY(登録商標)FL、ブリリアントイエ
ロー、Cal Fluor Red 610(登録商標)(CFR610)、クマリンお
よび誘導体(クマリン、7-アミノ-4-メチルクマリン(AMC、クマリン120)、
7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン(クマリン151))、Cy2(登録商標
)、Cy3(登録商標)、Cy3.5(登録商標)、Cy5(登録商標)、Cy5.5(
登録商標)、シアノシン、4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)
、5’,5”-ジブロモピロガロール-スルホンフタレイン(ブロモピロガロールレッド
)、7-ジエチルアミノ-3-(4’-イソチオシアナトフェニル)-4-メチルクマリ
ン、ジエチレントリアミン五酢酸、4,4’-ジイソチオシアナトジヒドロ-スチルベン
-2,2’-ジスルホン酸、4,4’-ジイソチオシアナトスチルベン-2,2’-ジス
ルホン酸、5-[ジメチルアミノ]ナフタレン-1-スルホニルクロリド(DNS、ダン
シルクロリド)、4-(4’-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)
、4-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-4’-イソチオシアネート(DABITC
)、Eclipse(商標)(Epoch Biosciences Inc.)、エオ
シンおよび誘導体(エオシン、エオシンイソチオシアネート)、エリスロシンおよび誘導
体(エリスロシンB、エリスロシンイソチオシアネート)、エチジウム、フルオレセイン
および誘導体(5-カルボキシフルオレセイン(FAM)、5-(4,6-ジクロロトリ
アジン-2-イル)アミノフルオレセイン(DTAF)、2’,7’-ジメトキシ-4’
5’-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(JOE)、フルオレセイン、フルオレ
セインイソチオシアネート(FITC)、ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレセイン
(HEX)、QFITC(XRITC)、テトラクロロフルオレセイン(TET)、フル
オレサミン、IR144、IR1446、ランタニド系蛍光体、マラカイトグリーンイソ
チオシアネート、4-メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチ
ロシン、パラローズアニリン、フェノールレッド、B-フィコエリトリン、R-フィコエ
リトリン、アロフィコシアニン、o-フタルジアルデヒド、Oregon Green(
登録商標)、ヨウ化プロピジウム、ピレンおよび誘導体(ピレン、ピレンブチレート、ス
クシンイミジル1-ピレンブチレート)、QSY(登録商標)7、QSY(登録商標)9
、QSY(登録商標)21、QSY(登録商標)35(Molecular Probe
s)、リアクティブレッド4(Cibacron(登録商標)ブリリアントレッド3B-
A)、ローダミンおよび誘導体(6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、6-カル
ボキシローダミン(R6G)、リサミンローダミンBスルホニルクロリド、ローダミン(
Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミングリーン、ローダミンXイソ
チオシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スルホローダミン10
1の塩化スルホニル誘導体(テキサスレッド)、N,N,N’,N’-テトラメチル-6
-カルボキシローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダ
ミンイソチオシアネート(TRITC)、リボフラビン、ロゾール酸、テルビウムキレー
ト誘導体、Quasar 670(登録商標)、ならびにVIC(登録商標)が挙げられ
る。
有用なクエンチャーとしては、例えば、Black Hole(商標)クエンチャーBH
Q-1、BHQ2、およびBHQ-3(Biosearch Technologies
,Inc.)、ならびにATTO-シリーズのクエンチャー(ATTO540Q、ATT
O580Q、およびATTO612Q;Atto-Tec GmbH)が挙げられる。
代替として、標的核酸(例えば、HCV RNA)の検出は、反応のエンドポイントを
測定することによって行うことができる。エンドポイント検出において、アンプリコンは
、最初にアンプリコンをサイズ分離し、次いでサイズ分離したアンプリコンを検出するこ
とによって検出することができる。異なるサイズのアンプリコンの分離は、ゲル電気泳動
、カラムクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、または当技術分野において公知の
他の分離方法によって達成することができる。
または核酸とコンジュゲートしていてもよい。検出可能な標識は、起こり得る立体障害ま
たは他の有用なまたは所望の特性への影響を低減するために、様々な長さのスペーサーア
ームによって付着させてもよい。例えば、Mansfield,9 Mol.Cell.
Probes 145-156(1995)を参照されたい。検出可能な標識は、共有結
合または非共有結合の手段によって、例えば転写によって、例えば、クレノーポリメラー
ゼを使用するランダムプライマーでの標識付け、またはニックトランスレーション、また
は増幅、またはそれに匹敵する当技術分野において公知のものによって、核酸に取り込む
ことができる。例えば、ヌクレオチド塩基は、蛍光色素などの検出可能な部分にコンジュ
ゲートされ、次いで核酸の合成または増幅中に核酸に取り込まれる。
、35S、3H、14C、125I、131I)、電子高密度の試薬(例えば、金)、酵
素(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、ルシフ
ェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、比色標識(例えば、コロイド金)、磁気標識(例
えば、Dynabeads(商標))、ビオチン、ジゴキシゲニン〔dioxigenin〕、また
はハプテン、および抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質が挙げられ
る。他の標識としては、それぞれ対応する受容体またはオリゴヌクレオチド相補物と複合
体を形成することが可能なリガンドまたはオリゴヌクレオチドが挙げられる。標識は、検
出しようとする核酸に直接的に取り込んでもよいし、または検出しようとする核酸にハイ
ブリダイズまたは結合するプローブ(例えば、オリゴヌクレオチド)または抗体に付着さ
せてもよい。
ることができる。例えば、Jameson,Methods.Enzymol.278:
363-390(1997);Zhu,Nucl.AcidsRes.22:3418-
3422(1994)を参照されたい。また米国特許第5,652,099号および6,
268,132号も、蛍光性のオリゴヌクレオチドを産生するために、酵素による合成ま
たは化学合成のいずれかを介して、核酸、例えばDNAおよび/もしくはRNA、または
オリゴヌクレオチドに取り込ませるためのヌクレオシド類似体を記載している。米国特許
第5,135,717号は、蛍光標識として使用するためのフタロシアニンおよびテトラ
ベンゾトリアザポルフィリン試薬を記載している。
酸配列を検出するために、ハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、これらに限定され
ないが、ノーザンブロット、サザンブロット、マイクロアレイ、ドットまたはスロットブ
ロットなど、およびインサイチュハイブリダイゼーションアッセイ、例えば蛍光インサイ
チュハイブリダイゼーション(FISH)で使用することができる。特定の実施形態は、
mRNAなどのポリヌクレオチド遺伝子産物の発現を測定するために、ハイブリダイゼー
ション方法を採用することができる。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ
を実行するための方法は、当技術分野において十分な開発が進んでいる。ハイブリダイゼ
ーションアッセイの手順および条件は、用途に応じて様々であり、Maniatis e
t al.Molecular Cloning:A Laboratory Manu
al(2nd Ed.Cold Spring Harbor,N.Y.,1989);
Berger and Kimmel Methods in Enzymology,
Vol.152,Guide to Molecular Cloning Techn
iques(Academic Press,Inc.,San Diego,Cali
f,1987);Young and Davis,PNAS.80:1194(198
3)で述べられているものなどの公知の一般的な結合方法に従って選択される。
乾燥生体液サンプルにおけるC型肝炎ウイルス(HCV)を検出するための方法であっ
て、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ(例えば、MITRA(登録商標)チ
ップ)から溶解緩衝液を用いて溶出させた乾燥生体液サンプルから、HCV RNAを単
離することを含む、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態において、HCV R
NAは、逆転写およびリアルタイムPCRを使用して検出される。特定の実施形態におい
て、溶解緩衝液は、グアニジンイソチオシアネート、および任意選択でβ-メルカプトエ
タノールを含む。
て、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ(例えば、MITRA(登録商標)チ
ップ)から0.5%BSAを含む緩衝溶液を用いて溶出させた乾燥生体液サンプルから、
抗HCV抗体を単離することを含む、方法も本明細書で開示される。一部の実施形態にお
いて、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水をさらに含む。特定の実施形態において、抗HCV
抗体は、c22-3、c200、およびNS5からなる群から選択されるHCV抗原に結
合する。抗HCV抗体は、酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)を使用して検出しても
よい。
CV)を検出するための方法であって、(a)マイクロサンプリングデバイスの吸収性チ
ップから溶出させた乾燥生体液サンプルから、リボ核酸を抽出すること;(b)抽出され
たリボ核酸を逆転写して、複数のcDNA:RNAハイブリダイゼーション複合体を生成
すること;(c)cDNA:RNAハイブリダイゼーション複合体を、HCVゲノムの5
’UTRに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて増幅して、HCVアンプリ
コンを産生すること;および(d)工程(c)で産生されたHCVアンプリコンが検出さ
れる場合、乾燥生体液サンプルにおけるHCVを検出することを含む、方法を提供する。
一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血
である。乾燥生体液サンプル中に存在するHCVの遺伝子型は、遺伝子型1a、遺伝子型
1b、遺伝子型2a、遺伝子型2b、遺伝子型2c、遺伝子型2d、遺伝子型3a、遺伝
子型3b、遺伝子型3c、遺伝子型3d、遺伝子型3e、遺伝子型3f、遺伝子型4a、
遺伝子型4b、遺伝子型4c、遺伝子型4d、遺伝子型4e、遺伝子型4f、遺伝子型4
g、遺伝子型4h、遺伝子型4i、遺伝子型4j、遺伝子型5a、および遺伝子型6aか
らなる群から選択される1つまたは複数の遺伝子型であり得る。特定の実施形態において
、乾燥生体液サンプルは、肝炎の徴候または症状を示す患者、またはHCV感染のリスク
がある患者から単離される。一部の実施形態において、cDNA:RNAハイブリダイゼ
ーション複合体は、Z05またはZ05D DNAポリメラーゼを用いて増幅される。
の吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルは、指先穿刺を介して患者から収集される。特定
の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、MITRA(登録商標)チップ
である。乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを
溶解緩衝液と接触させることによって実行することができる。一部の実施形態において、
溶解緩衝液は、グアニジンイソチオシアネート、および任意選択でβ-メルカプトエタノ
ールを含む。加えて、または代替として、一部の実施形態において、乾燥生体液サンプル
の溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、溶解緩衝液と、37℃で少
なくとも30分接触させることによって実行される。一部の実施形態において、マイクロ
サンプリングデバイスのサンプル体積は、30μL以下、25μL以下、20μL以下、
15μL以下、または10μL以下である。さらに、MITRA(登録商標)チップから
溶出させた乾燥生体液サンプル中のHCV RNAは、指先穿刺を介した収集から1カ月
後に溶出を実行した場合でも、安定なままであったことが決定された。本発明の技術の方
法は、RNA分解を予防するように、MITRA(登録商標)チップを、尿素、塩、キレ
ート化剤、またはRNアーゼ阻害剤などの添加剤で事前処置することを必要としないため
、この結果は予想外であった。
を、検出可能に標識されたプローブと接触させることをさらに含む。一部の実施形態にお
いて、検出可能な標識は、4-アセトアミド-4’-イソチオシアナトスチルベン-2,
2’ジスルホン酸、アクリジンおよび誘導体(アクリジン、アクリジンイソチオシアネー
ト)、Alexa Fluor(Alexa Fluor(登録商標)350、Alex
a Fluor(登録商標)488、Alexa Fluor(登録商標)546、Al
exa Fluor(登録商標)555、Alexa Fluor(登録商標)568、
Alexa Fluor(登録商標)594、Alexa Fluor(登録商標)64
7(Molecular Probes))、5-(2’-アミノエチル)アミノナフタ
レン-1-スルホン酸(EDANS)、4-アミノ-N-[3-ビニルスルホニル)フェ
ニル]ナフタルイミド-3,5ジスルホネート(ルシファーイエローVS)、N-(4-
アニリノ-1-ナフチル)マレイミド、アントラニルアミド、BODIPY(登録商標)
R-6G、BOPIPY(登録商標)530/550、BODIPY(登録商標)FL、
ブリリアントイエロー、Cal Fluor Red 610(登録商標)(CFR61
0)、クマリンおよび誘導体(クマリン、7-アミノ-4-メチルクマリン(AMC、ク
マリン120)、7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン(クマリン151))、
Cy2(登録商標)、Cy3(登録商標)、Cy3.5(登録商標)、Cy5(登録商標
)、Cy5.5(登録商標)、シアノシン、4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインド
ール(DAPI)、5’,5”-ジブロモピロガロール-スルホンフタレイン(ブロモピ
ロガロールレッド)、7-ジエチルアミノ-3-(4’-イソチオシアナトフェニル)-
4-メチルクマリン、ジエチレントリアミン五酢酸、4,4’-ジイソチオシアナトジヒ
ドロ-スチルベン-2,2’-ジスルホン酸、4,4’-ジイソチオシアナトスチルベン
-2,2’-ジスルホン酸、5-[ジメチルアミノ]ナフタレン-1-スルホニルクロリ
ド(DNS、ダンシルクロリド)、4-(4’-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸
(DABCYL)、4-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-4’-イソチオシアネー
ト(DABITC)、Eclipse(商標)(Epoch Biosciences
Inc.)、エオシンおよび誘導体(エオシン、エオシンイソチオシアネート)、エリス
ロシンおよび誘導体(エリスロシンB、エリスロシンイソチオシアネート)、エチジウム
、フルオレセインおよび誘導体(5-カルボキシフルオレセイン(FAM)、5-(4,
6-ジクロロトリアジン-2-イル)アミノフルオレセイン(DTAF)、2’,7’-
ジメトキシ-4’5’-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(JOE)、フルオレ
セイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ヘキサクロロ-6-カルボキ
シフルオレセイン(HEX)、QFITC(XRITC)、テトラクロロフルオレセイン
(TET)、フルオレサミン、IR144、IR1446、ランタニド系蛍光体、マラカ
イトグリーンイソチオシアネート、4-メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタ
レイン、ニトロチロシン、パラローズアニリン、フェノールレッド、B-フィコエリトリ
ン、R-フィコエリトリン、アロフィコシアニン、o-フタルジアルデヒド、Orego
n Green(登録商標)、ヨウ化プロピジウム、ピレンおよび誘導体(ピレン、ピレ
ンブチレート、スクシンイミジル1-ピレンブチレート)、QSY(登録商標)7、QS
Y(登録商標)9、QSY(登録商標)21、QSY(登録商標)35(Molecul
ar Probes)、リアクティブレッド4(Cibacron(登録商標)ブリリア
ントレッド3B-A)、ローダミンおよび誘導体(6-カルボキシ-X-ローダミン(R
OX)、6-カルボキシローダミン(R6G)、リサミンローダミンBスルホニルクロリ
ド、ローダミン(Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミングリーン、
ローダミンXイソチオシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スル
ホローダミン101の塩化スルホニル誘導体(テキサスレッド)、N,N,N’,N’-
テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミン、テ
トラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、リボフラビン、ロゾール酸、
テルビウムキレート誘導体、Quasar 670(登録商標)、ならびにVIC(登録
商標)からなる群から選択される蛍光性レポーターである。
、少なくとも1~5IU/mL、少なくとも5~10IU/mL、少なくとも10~15
IU/mL、少なくとも15~20IU/mL、少なくとも20~40IU/mL、少な
くとも40~60IU/mL、少なくとも60~80IU/mL、少なくとも80~10
0IU/mL、少なくとも100~150IU/mL、少なくとも150~200IU/
mL、少なくとも200~250IU/mL、少なくとも250~300IU/mL、少
なくとも300~350IU/mL、少なくとも350~400IU/mL、少なくとも
400~500IU/mL、少なくとも500~600IU/mL、少なくとも600~
700IU/mL、少なくとも700~800IU/mL、少なくとも800~850I
U/mL、少なくとも850IU/mL、または少なくとも900IU/mLである。
HCV)を検出するための方法であって、(a)マイクロサンプリングデバイスの吸収性
チップから、乾燥生体液サンプルを溶出させること;および(b)溶出させた乾燥生体液
サンプル中で、少なくとも1つのHCVがコードする抗原に対する抗HCV抗体が検出さ
れる場合、乾燥生体液サンプルにおけるHCVを検出することを含む、方法を提供する。
一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、血漿、血清、または全血である。乾燥
生体液サンプル中に存在するHCVの遺伝子型は、遺伝子型1a、遺伝子型1b、遺伝子
型2a、遺伝子型2b、遺伝子型2c、遺伝子型2d、遺伝子型3a、遺伝子型3b、遺
伝子型3c、遺伝子型3d、遺伝子型3e、遺伝子型3f、遺伝子型4a、遺伝子型4b
、遺伝子型4c、遺伝子型4d、遺伝子型4e、遺伝子型4f、遺伝子型4g、遺伝子型
4h、遺伝子型4i、遺伝子型4j、遺伝子型5a、および遺伝子型6aからなる群から
選択される1つまたは複数の遺伝子型であり得る。特定の実施形態において、乾燥生体液
サンプルは、肝炎の徴候または症状を示す患者、またはHCV感染のリスクがある患者か
ら単離される。一部の実施形態において、少なくとも1つのHCVがコードする抗原は、
c22-3、c200、およびNS5からなる群から選択される。
の吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルは、指先穿刺を介して患者から収集される。特定
の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、MITRA(登録商標)チップ
である。乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを
、リン酸緩衝食塩水および0.5%BSAを含む混合物と接触させることによって実行す
ることができる。特定の実施形態において、乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサン
プリングデバイスの吸収性チップを、リン酸緩衝食塩水および0.5%BSAを含む混合
物と、室温で少なくとも2時間、または2~8℃で一晩接触させることによって実行され
る。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスのサンプル体積は、30μ
L以下、25μL以下、20μL以下、15μL以下、または10μL以下である。
てもよいことが理解されるべきであるが、当業者であれば、一部の場合において、あるサ
ンプルのタイプが他のものより好ましい場合があることを認識しているであろう。例えば
、著しく溶血した全血サンプルは、イムノアッセイにおいてアッセイの結果の信頼を損な
う可能性がある干渉の原因となる可能性がある(Schiettecatta et a
l.,Interferences in Immunoassays in ADVA
NCES IN IMMUNOASSAY TECHNOLOGY,(Norman H
.L.Chiu ed.2012)。したがって、特定のイムノアッセイを実行する場合
、血漿または血清が全血より好ましい場合がある。しかしながら、以下の表3の結果で示
されるように、全血サンプルは、マイクロサンプリングデバイスを使用してサンプルを収
集した場合、室温での長期貯蔵後でさえも安定である。
患者が、HCVを阻害する治療剤での処置によって利益を得るかどうかを決定するため
の方法が本明細書で開示される。
よび/または非ペグ化インターフェロンアルファ-2b、ペグインターフェロンアルファ
-2a、リバビリン、テラプレビル、ボセプレビル、ソホスブビル、シメプレビル、ダク
ラタスビル、ベルパタスビル、オムビタスビル、パリタプレビル、リトナビル、ダサブビ
ル、レジパスビル、エルバスビル、ダノプレビル、グラゾプレビル、GS-7977、β
-インターフェロン、γ-インターフェロン、アマンタジン、3TC(ヌクレオシド類似
体であるシトシン-1,3-オキサチオランの(-)エナンチオマーとしても公知である
)、およびHCVの生活環を標的化する阻害剤、例えば、これらに限定されないが、ヘリ
カーゼ、ポリメラーゼ、メタロプロテアーゼまたは内部リボソーム侵入部位(IRES)
などが挙げられる。
に干渉する複素環式の置換されたカルボキサミド(米国特許第5,633,388号に記
載される);Chu et al.,Tet.Lett.7229-7232(1996
)で報告された、インビトロでHCV NS3プロテアーゼを阻害するフェナントレンキ
ノン;モルホリニルカルボニル-ベンゾイル-ペプチド類似体(WO1995/3376
4);NS5A/5B基質ベースのペプチド類似体(WO1998/17679);HC
Vプロテアーゼを阻害するチアゾリジン誘導体(Brown-Driver et al
.,Antiviral Research 30(1),A23(1996));およ
びHCV NS3プロテアーゼの他のペプチド阻害剤(Steinkuehler et
al.,Biochemistry 37:8899-8905(1998);Ing
allinella et al.,Biochemistry 37:8906-89
14(1998))が挙げられる。
処置のために、肝炎の症状を示す患者を選択するための方法であって、(a)血液細胞か
らのリボ核酸の放出が起こる条件下で、乾燥血液サンプルを溶出させることであって、乾
燥血液サンプルは、マイクロサンプリングデバイスを用いて患者から収集される、溶出さ
せること;(b)溶出させた乾燥血液サンプルから、リボ核酸を単離すること;(c)単
離したリボ核酸を逆転写して、複数のcDNA:RNAハイブリダイゼーション複合体を
生成すること;(d)cDNA:RNAハイブリダイゼーション複合体を、HCVゲノム
の5’UTRに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて増幅して、蛍光標識さ
れたHCVアンプリコンを産生すること;(e)工程(d)で産生された蛍光標識された
HCVアンプリコンを検出すること;および(f)蛍光標識されたHCVアンプリコンが
検出される場合、HCV感染を阻害する治療剤での処置のために患者を選択することを含
む、方法を提供する。
治療剤での処置のために、肝炎の症状を示す患者を選択するための方法であって、(a)
乾燥血液サンプルを、0.5%BSAを含む緩衝溶液を用いて溶出させることであって、
乾燥血液サンプルは、マイクロサンプリングデバイスを用いて患者から収集される、溶出
させること;(b)溶出させた乾燥血液サンプルにおいて、少なくとも1つのHCVがコ
ードする抗原に対する抗HCV抗体を検出すること;および(c)抗HCV抗体が検出さ
れる場合、HCV感染を阻害する治療剤での処置のために患者を選択することを含む、方
法を提供する。一部の実施形態において、少なくとも1つのHCVがコードする抗原は、
c22-3、c200、およびNS5からなる群から選択される。一部の実施形態におい
て、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水をさらに含む。
アルファコン-1、ペグ化および/または非ペグ化インターフェロンアルファ-2b、ペ
グインターフェロンアルファ-2a、リバビリン、テラプレビル、ボセプレビル、ソホス
ブビル、シメプレビル、ダクラタスビル、ベルパタスビル、オムビタスビル、パリタプレ
ビル、リトナビル、ダサブビル、レジパスビル、エルバスビル、ダノプレビル、グラゾプ
レビル、GS-7977、β-インターフェロン、γ-インターフェロン、アマンタジン
、3TC、およびHCVの生活環を標的化する阻害剤からなる群から選択される1種また
は複数の薬剤である。上記実施形態のいずれかにおいて、マイクロサンプリングデバイス
は、MITRA(登録商標)チップである。
b、遺伝子型2a、遺伝子型2b、遺伝子型2c、遺伝子型2d、遺伝子型3a、遺伝子
型3b、遺伝子型3c、遺伝子型3d、遺伝子型3e、遺伝子型3f、遺伝子型4a、遺
伝子型4b、遺伝子型4c、遺伝子型4d、遺伝子型4e、遺伝子型4f、遺伝子型4g
、遺伝子型4h、遺伝子型4i、遺伝子型4j、遺伝子型5a、および遺伝子型6aから
なる群から選択される少なくとも1つの遺伝子型を有する。
筋肉の疼痛、軽度の皮膚の発疹、食欲不振、腹痛、暗色尿、灰色の便、黄疸、慢性肝疾患
、クリオグロブリン血症、肝臓の領域における疼痛および圧痛、発熱、体重の減少、うつ
病、ならびに疲労が挙げられる。HCV感染のリスクがある患者としては、感染を起こす
可能性がある血液または血液製剤に曝露された者、輸血を受けている者、1992年より
前に臓器移植を受けた者、HIV患者、長期にわたる血液透析患者、無防備な性行為の過
去を有する対象、入れ墨やボディピアスを有する個体、肝疾患の徴候または症状を示す患
者、違法薬物の使用者、およびHCVに感染している母親から生まれた患者が挙げられる
。
CV RNAの定量化は、一部の併用療法レジメンに対する抗ウイルス剤応答の効能の実
証において十分に確立されている(McHutchison JG et al.,N
Engl J Med 339:1485-1492(1998);Davis GL
et al.,N Engl J Med 339:1493-1499(1998);
Manns MP et al.,Lancet 358:958-965(2001)
;Fried MW et al.,N Engl J Med 347:975-98
2(2002);Hadziyannis SJ et al.,Ann Intern
Med 140:346-355(2004))。現在のHCVの管理および処置に関
するガイドラインは、抗ウイルス剤療法の開始の前、療法中(応答ガイド療法〔response
guided therapy〕)、および一般的に処置終了後12から24週間、HCV RNAを
定量試験することを推奨している。早期ウイルス陰性化(EVR)達成の失敗は、持続的
ウイルス陰性化(SVR)達成のための高い陰性適中率を有し、患者にとって特定の療法
を終わらせるべきかどうかを決定するときに考慮される。迅速ウイルス陰性化(RVR)
は、SVRに関して高い陽性適中率を有する。
から収集された乾燥生体液サンプル(例えば、血液)中のHCV RNAまたは抗HCV
抗体のレベルを繰り返してモニターすることによって、HCVの徴候または症状を示す患
者、またはHCV感染のリスクがある患者における治療レジメンの効能を評価するための
方法を提供する。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、MITR
A(登録商標)チップである。
ンの効能を評価するための方法であって、(a)血液細胞からのリボ核酸の放出が起こる
条件下で、第1の乾燥血液サンプルを溶出させることであって、第1の乾燥血液サンプル
は、患者にHCV治療レジメンを施す前に、マイクロサンプリングデバイスで患者から収
集される、溶出させること;(b)溶出させた第1の乾燥血液サンプル中のHCV RN
Aを、逆転写およびリアルタイムPCRを介して検出すること;(c)血液細胞からのリ
ボ核酸の放出が起こる条件下で、第2の乾燥血液サンプルを溶出させることであって、第
2の乾燥血液サンプルは、患者にHCV治療レジメンを施した後に、マイクロサンプリン
グデバイスで患者から収集される、溶出させること;および(d)溶出させた第2の乾燥
血液サンプル中のHCV RNAを、逆転写およびリアルタイムPCRを介して検出する
ことを含み、HCV治療レジメンを施した後の第2の乾燥血液サンプル中のHCV RN
Aレベルが、工程(b)で観察されたHCV RNAレベルと比較して低減されている場
合、HCV治療レジメンは、HCV感染に対して治療作用を有すると同定される、方法を
提供する。特定の実施形態において、患者は、早期ウイルス陰性化(EVR)、迅速ウイ
ルス陰性化(RVR)、および/または持続的ウイルス陰性化(SVR)を呈する可能性
がある。
治療レジメンの効能を評価するための方法であって、(a)第1の乾燥血液サンプルを、
0.5%BSAを含む緩衝溶液を用いて溶出させることであって、第1の乾燥血液サンプ
ルは、患者にHCV治療レジメンを施す前に、マイクロサンプリングデバイスで患者から
収集される、溶出させること;(b)溶出させた第1の乾燥血液サンプル中の少なくとも
1種のHCVがコードする抗原に対する少なくとも1種の抗HCV抗体を検出すること;
(c)第2の乾燥血液サンプルを、0.5%BSAを含む緩衝溶液を用いて溶出させるこ
とであって、第2の乾燥血液サンプルは、患者にHCV治療レジメンを施した後に、マイ
クロサンプリングデバイスで患者から収集される、溶出させること;(d)溶出させた第
2の乾燥血液サンプル中の少なくとも1種のHCVがコードする抗原に対する少なくとも
1種の抗HCV抗体を検出することを含み、HCV治療レジメンを施した後の第2の乾燥
血液サンプル中の抗HCV抗体レベルが、工程(b)で観察された抗HCV抗体レベルと
比較して低減されている場合、HCV治療レジメンは、HCV感染に対して治療作用を有
すると同定される、方法を提供する。一部の実施形態において、緩衝溶液は、リン酸緩衝
食塩水をさらに含む。
または複数のHCV阻害剤および/または当技術分野において公知の他のHCV阻害剤を
含む。
乾燥生体液サンプルにおけるC型肝炎ウイルス(HCV)の存在を検出するためのキッ
トも本明細書で開示される。一部の実施形態において、キットは、マイクロサンプリング
デバイス、溶解緩衝液、逆転写酵素、および任意選択でHCVゲノムの5’UTRに特異
的にハイブリダイズするプライマー対を含む。特定の実施形態において、キットは、HC
Vゲノムの5’UTRに特異的にハイブリダイズする検出可能に標識されたプローブを含
む。
グデバイス、0.5%BSAを含むPBS溶液、および抗HCV一次抗体に特異的に結合
する検出可能に標識された二次抗体を含む。特定の実施形態において、キットは、c22
-3、c200、およびNS5からなる群から選択される少なくとも1つのHCVがコー
ドする抗原でコーティングされたウェルを含む固体基層をさらに含む。
イスは、MITRA(登録商標)チップである。
イズすることが可能なプライマー対を含む。加えて、または代替として、一部の実施形態
において、キットは、プライマー対によって増幅される領域内に配置された配列に特異的
にハイブリダイズする、検出可能に標識された核酸プローブを提供する。
吸収性チップを有する複数のマイクロサンプリングデバイスを含んでいてもよい。吸収性
チップは、約10秒以内またはそれ未満で30マイクロリットルまたはそれ未満の血液を
吸収するように設計された親水性のポリマー性材料を含む。キットはまた、複数の区画を
有する容器も包含する。各区画は、マイクロサンプリングデバイスと取り外し可能にかみ
合うように設計されている。容器は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップが、
中にマイクロサンプリングデバイスが設置される区画と隣り合わないように設計されてい
る。
トを包含していてもよく、各ポートは、個々の区画と関連付けられる。各ポートは、ポー
トが関連付けられる区画内に存在するマイクロサンプリングデバイスのホルダー上への印
刷が可能になるように配置される。特定の実施形態において、マイクロサンプリングデバ
イスのホルダーは、ホルダーの長さに沿って伸長する複数のリブを有し、リブは、吸収性
チップが容器の壁と接触することを防ぐように設計されている。容器は、好ましくは、管
状の形態の区画を形成するように設計された2つのパートを有する。容器は、それぞれ異
なる区画の一部に沿って伸長する複数の細長い据え付けの突起を有する第1のパートを有
していてもよい。マイクロサンプリングデバイスのホルダーの中空の末端が据え付けの突
起上にはまると、ホルダーが据え付けの突起上に取り外し可能に固定される。
250nMまたはそれ未満の濃度で含有する液状媒体を含む。このようなキットを用いる
場合、プローブは、本発明の技術に従って信頼できるマルチプレックス検出反応を実行す
るのに必要な量で提供される。
たは検出などのアッセイまたは反応を行うのに必要な、緩衝液、ポリメラーゼ活性を有す
る酵素、ポリメラーゼ活性を有し、5’から3’のエキソヌクレアーゼ活性または5’か
ら3’および3’から5’のエキソヌクレアーゼ活性の両方が欠失した酵素、酵素補因子
、例えばマグネシウムまたはマンガン、塩、鎖伸長ヌクレオチド、例えばデオキシヌクレ
オシド三リン酸(dNTP)、修飾されたdNTP、ヌクレアーゼ耐性dNTPまたは標
識されたdNTPをさらに含む。
量標準(QS)RNA分子、例えばCOBAS(登録商標)AmpliPrep/COB
AS(登録商標)TaqMan(登録商標)HCV試験で使用されるもの)、および実験
処理中のアッセイの完全性を確認するための陰性対照核酸配列をさらに含む。加えて、ま
たは代替として、一部の実施形態において、本発明の技術のキットは、抗HCV陽性対照
生体サンプルおよび抗HCV陰性対照生体サンプルをさらに含む。またキットは、使用説
明書、自動分析のためのソフトウェア、容器、パッケージ、例えば市販を意図したパッケ
ージングなどを含んでいてもよい。
たは試薬、標識付けの緩衝液および/または試薬、ならびに検出手段の1種または複数を
さらに含んでいてもよい。緩衝液および/または試薬は通常、キットが意図される特定の
増幅/検出技術に最適化される。また、手順の様々な工程を実行するためのこれらの緩衝
液および試薬を使用するためのプロトコールがキットに包含されていてもよい。
MITRA(登録商標)チップを用いたHCVの検出
HCV RNAを検出するための方法。合計79人のヒト対象を研究に登録した。各対
象から、少なくとも1mLの体積で従来通り血漿または血清を採取した。さらに、20μ
Lの血液を、MITRA(登録商標)チップ収集デバイスを用いて指先穿刺を介して各対
象から収集した。次いでMITRA(登録商標)チップ収集デバイスの吸収性チップを、
0.7mLのRLT緩衝液(Qiagen Inc.、Valencia、CA)中に3
7℃で少なくとも30分、800rpmで振盪しながら置いて、乾燥血液サンプルを溶出
させた。緩衝液RLTは、高濃度のグアニジンイソチオシアネートを含む溶解緩衝液であ
り、RNA単離前に細胞および組織を溶解させるのに使用される。その後吸収性チップを
RLT緩衝液から取り出し、0.65mLのそれぞれの溶出させた乾燥血液サンプルを、
COBAS(登録商標)AmpliPrep/COBAS(登録商標)TaqMan(登
録商標)機器上での試験のために、サンプルインプットチューブに移した。各サンプル(
MITRA(登録商標)チップおよび従来の血液採取によるサンプル)につき試料調製、
逆転写、およびPCR増幅をCOBAS(登録商標)AmpliPrep/COBAS(
登録商標)TaqMan(登録商標)プラットフォーム上で製造元の説明書に従って行っ
た。
をプロテアーゼおよびカオトロピックな溶解/結合緩衝液と共に高温でインキュベートす
ることにより溶解して、核酸を放出させ、放出されたHCV RNAをRNアーゼから保
護した。プロテアーゼおよび数がわかっているHCV定量標準(QS)RNA分子を、溶
解試薬および磁気ガラス粒子と共に各試料に導入した。その後、混合物をインキュベート
したところ、HCV RNA(存在する場合)およびHCV QS RNAが磁気ガラス
粒子の表面に結合した。未結合の物質、例えば塩、タンパク質および他の細胞性不純物を
、磁気ガラス粒子を洗浄することによって除去した。磁気ガラス粒子を分離し、洗浄工程
を終えた後、吸着した核酸を水溶液を用いて高温で溶出させた。それぞれの処理した試料
は、磁気ガラス粒子に加えて放出されたHCV RNAおよびHCV QS RNAを含
有しており、これを増幅混合物に添加し、COBAS(登録商標)TaqMan(登録商
標)分析器に移した。
登録商標)HCVアッセイは、HCV RNAの相補的DNA(cDNA)への逆転写と
、HCVゲノムの5’-非翻訳領域の高度に保存された領域内の配列を定義するプライマ
ーおよびプライマー対によって定義された配列にもハイブリダイズする検出可能に標識さ
れたプローブを使用したcDNAのPCR増幅とを使用する。プライマーのヌクレオチド
配列は、HCV遺伝子型1~6の同等の増幅が起こるように最適化されている。逆転写お
よびPCR増幅反応を、マンガン(Mn2+)の存在下および適切な緩衝液条件下で、逆
転写酵素活性とDNAポリメラーゼ活性の両方を有する熱安定性のZ05およびZ05D
DNAポリメラーゼの最適化したブレンドを用いて実行した。
写とPCR増幅の両方を行った。反応混合物を加熱して、下流のプライマーを、HCV標
的RNAおよびHCV QS RNAに特異的にアニールさせた。HCV標的RNAおよ
びHCV QS RNAの逆転写後、反応混合物を加熱して、RNA:cDNAハイブリ
ッドを変性させ、特異的なプライマー標的配列を露出させた。反応混合物を冷却すると、
標的HCV DNAにアニールしたプライマーおよび熱安定性のDNAポリメラーゼ(Z
05およびZ05D)は、Mn2+および過量のデオキシヌクレオチド三リン酸(dNT
P)の存在下で、アニールしたプライマーを標的テンプレートに沿って伸長させて、二本
鎖DNAアンプリコンを産生した。必要なサイクル数を、COBAS(登録商標)Taq
Man(登録商標)分析器またはCOBAS(登録商標)TaqMan(登録商標)48
分析器に事前にプログラムした。
象から、少なくとも1mLの体積で従来通り血液採取した。さらに、20μLの血液を、
指先穿刺を介してMITRA(登録商標)チップ収集デバイスで各対象から収集した。次
いでMITRA(登録商標)チップ収集デバイスの吸収性チップを、0.35mLのPB
S/0.5%BSA中に2~8℃で一晩置いて、乾燥血液サンプルを溶出させた。その後
吸収性チップを緩衝液から取り出し、それぞれの溶出させた乾燥血液サンプルを、試験の
ためにVITROS ECi/ECiQ免疫診断システム(Ortho-Clinica
l Diagnostics、U.K.)上に置いた。10個の模擬の指先穿刺サンプル
を陰性対照として使用した。各サンプル(MITRA(登録商標)チップおよび従来の血
液採取によるサンプル)につきイムノアッセイを、VITROS ECi/ECiQ免疫
診断システム上で製造元の説明書に従って行った。
ーティングされたウェルに移し、サンプル中のHCV抗体(存在する場合)をHCV組換
え抗原の1種または複数に特異的に結合させた。未結合のサンプルを洗浄工程によって除
去した。次いでサンプルを、ウェル上に補捉されたいずれかのヒトIgGに結合する、ホ
ースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)で標識した抗体コンジュゲート(マウスモ
ノクローナル抗ヒトIgG)と共にインキュベートした。未結合のコンジュゲートを洗浄
工程によって除去した。発光性基質(ルミノール誘導体および過酸塩)および電子移動剤
を含有する試薬をウェルに添加し、結合したHRPコンジュゲートを発光反応によって測
定した。結合したHRPコンジュゲートの量は、サンプル中に存在する抗HCVのレベル
の指標であった。結果を、カットオフ値に対する正規化したシグナルの比率(シグナル/
カットオフ、s/c)として計算した。<0.90の比率が陰性結果とみなされ、≧1.
00の比率が陽性結果であり、0.9から0.99の間の比率があいまいとみなされる。
ングを提供し、それによれば、患者の指先穿刺を介してMITRA(登録商標)チップ収
集デバイス上に収集された乾燥血液サンプルにおけるHCV RNA検出と、従来の血液
採取を使用して収集された同じ患者からの全血サンプルにおけるHCV RNA検出との
完全な一致が実証される(R2=0.98)。また表1は、本発明の技術のHCV検出方
法は、指先穿刺を介してMITRA(登録商標)チップ収集デバイスで得られた少量の乾
燥血液サンプル中で、少なくとも126IU/mLもの低さでもウイルス負荷量を確実に
検出することが可能であることも実証する。これらの結果は、サンプル体積が少なくなる
につれアッセイの感度および精度が低下することが予測されることを考えれば、驚くべき
ことである。Chen et al.,Clin.Chem.53:1962-1965
(2007)を参照されたい。以前の研究は、10μLの指先穿刺による毛細血管の全血
サンプルにおけるHCV RNA定量が、>900IU/mLのウイルス負荷量をモニタ
ーするのに適切であると報告している。Bruns et al.,J.Clin.Mi
crobiol.47(10):3231-3240(2009)。図2は、指先穿刺か
ら回収されたHCVと、血清から回収されたHCVとの、回収されたウイルス負荷量の相
関を示す。
れば、指先穿刺を介してMITRA(登録商標)チップ収集デバイス上に収集された乾燥
血液サンプルにおける抗HCV抗体検出と、従来の血液採取を使用して収集された同じ患
者からの全血サンプルにおける抗HCV抗体検出との一致が実証される。
なことに、収集された流体が血清/血漿または全血であるかどうかに関係なく、長期にわ
たり室温(18~24℃)で安定でもあることを示す。生体サンプルは通常、室温で長期
間貯蔵される場合、安定ではないため、これは、有用な技術的利益である。本発明の結果
は、室温で2カ月貯蔵した後でさえも、サンプルがそれでもなお正確な再現可能な結果を
提供できることを示す。
ITRA(登録商標)チップ)を用いて収集された少量の乾燥生体液サンプル中のHCV
RNAおよび/または抗HCV抗体を検出することが可能であることを実証する。本明
細書で開示される方法は、従来の血液採取を採用するHCV検出方法で観察された結果と
一致する結果をもたらした。
本発明の技術は、本出願に記載された特定の実施形態の観点で限定されないものとし、
それらは本発明の技術の個々の態様の単なる例示であることが意図される。当業者には明
らかであろうが、本発明の技術の多くの改変およびバリエーションを、その本質および範
囲から逸脱することなく作製することができる。本明細書で列挙されたものに加えて、本
発明の技術の範囲内の機能的に同等な方法および装置が、前述の説明から当業者には明ら
かであろう。このような改変およびバリエーションは、本発明の技術の範囲内に含まれる
ことが意図される。本発明の技術は特定の方法、試薬、化合物の組成または生物系に限定
されず、当然ながら様々であってもよいことが理解されるものとする。また、本明細書に
おいて使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、限定するこ
とを意図しないことも理解されるものとする。
のとする。加えて、本明細書で採用される用語および表現は、限定ではなく説明の用語と
して使用されており、このような用語および発現の使用において、示された、および記載
された特徴またはそれらの一部のあらゆる均等物を排除する意図はないが、特許請求され
た開示の範囲内で様々な改変が可能であることが認識されている。
り本開示は、マーカッシュ群のいずれの個々のメンバーまたはメンバーの下位群の形式で
も記載されることを当業者は認識するであろう。
明の提供に関して、本明細書で開示される全ての範囲はまた、ありとあらゆる可能な部分
範囲およびそれらの部分範囲の組合せも包含する。あらゆる列挙された範囲は、同じ範囲
が、少なくとも等しく2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、10分の1などに分割
されることを十分に記載し、それが可能であるとして、容易に認識することができる。非
限定的な例として、本明細書で論じられたそれぞれの範囲は、下部3分の1、中央3分の
1および上部3分の1などに容易に分割できる。やはり当業者であれば理解するであろう
が、例えば「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などの全ての言
語は、列挙された数値を包含し、上記で論じられたようにそれに続いて部分範囲に分割で
きる範囲を指す。結論として、当業者には理解されるであろうが、範囲は、それぞれ個々
の要素を包含する。したがって、例えば、1~3個の細胞を有する群は、1、2、または
3個の細胞を有する群を指す。同様に、1~5個の細胞を有する群は、1、2、3、4、
または5個の細胞を有する群などを指す。
らが本明細書の明確な教示と矛盾しない程度に、参照により全ての図面および表を含めそ
れら全体が本明細書に組み入れられる。
Claims (42)
- 乾燥生体液サンプルにおけるC型肝炎ウイルス(HCV)を検出するための方法であっ
て、
(a)マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから溶出させた乾燥生体液サンプ
ルから、リボ核酸を抽出すること;
(b)抽出されたリボ核酸を逆転写して、複数のcDNA:RNAハイブリダイゼーシ
ョン複合体を生成すること;
(c)cDNA:RNAハイブリダイゼーション複合体を、HCVゲノムの5’UTR
に特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて増幅して、HCVアンプリコンを産
生すること;および
(d)工程(c)で産生されたHCVアンプリコンが検出される場合、乾燥生体液サン
プルにおけるHCVを検出すること
を含む、方法。 - 乾燥生体液サンプル中のHCVが、遺伝子型1a、遺伝子型1b、遺伝子型2a、遺伝
子型2b、遺伝子型2c、遺伝子型2d、遺伝子型3a、遺伝子型3b、遺伝子型3c、
遺伝子型3d、遺伝子型3e、遺伝子型3f、遺伝子型4a、遺伝子型4b、遺伝子型4
c、遺伝子型4d、遺伝子型4e、遺伝子型4f、遺伝子型4g、遺伝子型4h、遺伝子
型4i、遺伝子型4j、遺伝子型5a、および遺伝子型6aからなる群から選択される少
なくとも1つの遺伝子型を有する、請求項1に記載の方法。 - 乾燥生体液サンプルが、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血である、請求項1または
2に記載の方法。 - マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルが、指先穿刺を
介して患者から収集される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。 - 乾燥生体液サンプルの溶出が、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを溶解緩
衝液と接触させることによって実行される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法
。 - 溶解緩衝液が、グアニジンイソチオシアネート、および任意選択でβ-メルカプトエタ
ノールを含む、請求項5に記載の方法。 - 乾燥生体液サンプルの溶出が、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、溶解
緩衝液と、37℃で少なくとも30分接触させることによって実行される、請求項1から
6のいずれか一項に記載の方法。 - マイクロサンプリングデバイスが、MITRA(登録商標)チップである、請求項1か
ら7のいずれか一項に記載の方法。 - マイクロサンプリングデバイスのサンプル体積が、30μL以下、25μL以下、20
μL以下、15μL以下、または10μL以下である、請求項1から8のいずれか一項に
記載の方法。 - 乾燥生体液サンプルが、肝炎の徴候または症状を示す患者、またはHCV感染のリスク
がある患者から単離される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。 - 乾燥生体液サンプル中のHCVのウイルス負荷量が、少なくとも1~5IU/mL、少
なくとも5~10IU/mL、少なくとも10~15IU/mL、少なくとも15~20
IU/mL、少なくとも20~40IU/mL、少なくとも40~60IU/mL、少な
くとも60~80IU/mL、少なくとも80~100IU/mL、少なくとも100~
150IU/mL、少なくとも150~200IU/mL、少なくとも200~250I
U/mL、少なくとも250~300IU/mL、少なくとも300~350IU/mL
、少なくとも350~400IU/mL、少なくとも400~500IU/mL、少なく
とも500~600IU/mL、少なくとも600~700IU/mL、少なくとも70
0~800IU/mL、少なくとも800~850IU/mL、少なくとも850IU/
mL、または少なくとも900IU/mLである、請求項1から10のいずれか一項に記
載の方法。 - cDNA:RNAハイブリダイゼーション複合体を、検出可能に標識されたプローブと
接触させることをさらに含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。 - 検出可能な標識が、4-アセトアミド-4’-イソチオシアナトスチルベン-2,2’
ジスルホン酸、アクリジンおよび誘導体(アクリジン、アクリジンイソチオシアネート)
、Alexa Fluor(Alexa Fluor(登録商標)350、Alexa
Fluor(登録商標)488、Alexa Fluor(登録商標)546、Alex
a Fluor(登録商標)555、Alexa Fluor(登録商標)568、Al
exa Fluor(登録商標)594、Alexa Fluor(登録商標)647(
Molecular Probes))、5-(2’-アミノエチル)アミノナフタレン
-1-スルホン酸(EDANS)、4-アミノ-N-[3-ビニルスルホニル)フェニル
]ナフタルイミド-3,5ジスルホネート(ルシファーイエローVS)、N-(4-アニ
リノ-1-ナフチル)マレイミド、アントラニルアミド、BODIPY(登録商標)R-
6G、BOPIPY(登録商標)530/550、BODIPY(登録商標)FL、ブリ
リアントイエロー、Cal Fluor Red 610(登録商標)(CFR610)
、クマリンおよび誘導体(クマリン、7-アミノ-4-メチルクマリン(AMC、クマリ
ン120)、7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン(クマリン151))、Cy
2(登録商標)、Cy3(登録商標)、Cy3.5(登録商標)、Cy5(登録商標)、
Cy5.5(登録商標)、シアノシン、4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール
(DAPI)、5’,5”-ジブロモピロガロール-スルホンフタレイン(ブロモピロガ
ロールレッド)、7-ジエチルアミノ-3-(4’-イソチオシアナトフェニル)-4-
メチルクマリン、ジエチレントリアミン五酢酸、4,4’-ジイソチオシアナトジヒドロ
-スチルベン-2,2’-ジスルホン酸、4,4’-ジイソチオシアナトスチルベン-2
,2’-ジスルホン酸、5-[ジメチルアミノ]ナフタレン-1-スルホニルクロリド(
DNS、ダンシルクロリド)、4-(4’-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(D
ABCYL)、4-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-4’-イソチオシアネート(
DABITC)、Eclipse(商標)(Epoch Biosciences In
c.)、エオシンおよび誘導体(エオシン、エオシンイソチオシアネート)、エリスロシ
ンおよび誘導体(エリスロシンB、エリスロシンイソチオシアネート)、エチジウム、フ
ルオレセインおよび誘導体(5-カルボキシフルオレセイン(FAM)、5-(4,6-
ジクロロトリアジン-2-イル)アミノフルオレセイン(DTAF)、2’,7’-ジメ
トキシ-4’5’-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(JOE)、フルオレセイ
ン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ヘキサクロロ-6-カルボキシフ
ルオレセイン(HEX)、QFITC(XRITC)、テトラクロロフルオレセイン(T
ET)、フルオレサミン、IR144、IR1446、ランタニド系蛍光体、マラカイト
グリーンイソチオシアネート、4-メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイ
ン、ニトロチロシン、パラローズアニリン、フェノールレッド、B-フィコエリトリン、
R-フィコエリトリン、アロフィコシアニン、o-フタルジアルデヒド、Oregon
Green(登録商標)、ヨウ化プロピジウム、ピレンおよび誘導体(ピレン、ピレンブ
チレート、スクシンイミジル1-ピレンブチレート)、QSY(登録商標)7、QSY(
登録商標)9、QSY(登録商標)21、QSY(登録商標)35(Molecular
Probes)、リアクティブレッド4(Cibacron(登録商標)ブリリアント
レッド3B-A)、ローダミンおよび誘導体(6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX
)、6-カルボキシローダミン(R6G)、リサミンローダミンBスルホニルクロリド、
ローダミン(Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミングリーン、ロー
ダミンXイソチオシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スルホロ
ーダミン101の塩化スルホニル誘導体(テキサスレッド)、N,N,N’,N’-テト
ラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミン、テトラ
メチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、リボフラビン、ロゾール酸、テル
ビウムキレート誘導体、Quasar 670(登録商標)、ならびにVIC(登録商標
)からなる群から選択される蛍光性レポーターである、請求項12に記載の方法。 - cDNA:RNAハイブリダイゼーション複合体が、Z05またはZ05D DNAポ
リメラーゼを用いて増幅される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。 - 乾燥生体液サンプルにおけるC型肝炎ウイルス(HCV)を検出するための方法であっ
て、
(a)マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから、乾燥生体液サンプルを溶出
させること;および
(b)溶出させた乾燥生体液サンプル中で、少なくとも1つのHCVがコードする抗原
に対する抗HCV抗体が検出される場合、乾燥生体液サンプルにおけるHCVを検出する
こと
を含む、方法。 - 少なくとも1つのHCVがコードする抗原が、c22-3、c200、およびNS5か
らなる群から選択される、請求項15に記載の方法。 - 乾燥生体液サンプル中のHCVが、遺伝子型1a、遺伝子型1b、遺伝子型2a、遺伝
子型2b、遺伝子型2c、遺伝子型2d、遺伝子型3a、遺伝子型3b、遺伝子型3c、
遺伝子型3d、遺伝子型3e、遺伝子型3f、遺伝子型4a、遺伝子型4b、遺伝子型4
c、遺伝子型4d、遺伝子型4e、遺伝子型4f、遺伝子型4g、遺伝子型4h、遺伝子
型4i、遺伝子型4j、遺伝子型5a、および遺伝子型6aからなる群から選択される少
なくとも1つの遺伝子型を有する、請求項15または16に記載の方法。 - 乾燥生体液サンプルが、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血である、請求項15から
17のいずれか一項に記載の方法。 - マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルが、指先穿刺を
介して患者から収集される、請求項15から18のいずれか一項に記載の方法。 - 乾燥生体液サンプルの溶出が、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、リン
酸緩衝食塩水および0.5%BSAを含む混合物と接触させることによって実行される、
請求項15から19のいずれか一項に記載の方法。 - 乾燥生体液サンプルの溶出が、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、リン
酸緩衝食塩水および0.5%BSAを含む混合物と、室温で少なくとも2時間、または2
~8℃で一晩接触させることによって実行される、請求項20に記載の方法。 - マイクロサンプリングデバイスが、MITRA(登録商標)チップである、請求項15
から21のいずれか一項に記載の方法。 - マイクロサンプリングデバイスのサンプル体積が、30μL以下、25μL以下、20
μL以下、15μL以下、または10μL以下である、請求項15から22のいずれか一
項に記載の方法。 - 乾燥生体液サンプルが、肝炎の徴候または症状を示す患者、またはHCV感染のリスク
がある患者から単離される、請求項15から23のいずれか一項に記載の方法。 - 乾燥生体液サンプルにおけるC型肝炎ウイルス(HCV)の存在を検出するためのキッ
トであって、マイクロサンプリングデバイス、溶解緩衝液、逆転写酵素、および任意選択
でHCVゲノムの5’UTRに特異的にハイブリダイズするプライマー対を含む、キット
。 - HCVゲノムの5’UTRに特異的にハイブリダイズする検出可能に標識されたプロー
ブをさらに含む、請求項25に記載のキット。 - 乾燥生体液サンプルにおけるC型肝炎ウイルス(HCV)の存在を検出するためのキッ
トであって、マイクロサンプリングデバイス、0.5%BSAを含むPBS溶液、および
抗HCV一次抗体に特異的に結合する検出可能に標識された二次抗体を含む、キット。 - c22-3、c200、およびNS5からなる群から選択される少なくとも1つのHC
Vがコードする抗原でコーティングされたウェルを含む固体基層をさらに含む、請求項2
7に記載のキット。 - マイクロサンプリングデバイスが、MITRA(登録商標)チップである、請求項25
から28のいずれか一項に記載のキット。 - HCV感染を阻害する治療剤での処置のために、肝炎の症状を示す患者を選択するため
の方法であって、
(a)血液細胞からのリボ核酸の放出が起こる条件下で、乾燥血液サンプルを溶出させ
ることであって、乾燥血液サンプルは、マイクロサンプリングデバイスを用いて患者から
収集される、溶出させること;
(b)溶出させた乾燥血液サンプルから、リボ核酸を単離すること;
(c)単離したリボ核酸を逆転写して、複数のcDNA:RNAハイブリダイゼーショ
ン複合体を生成すること;
(d)cDNA:RNAハイブリダイゼーション複合体を、HCVゲノムの5’UTR
に特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて増幅して、蛍光標識されたHCVア
ンプリコンを産生すること;
(e)工程(d)で産生された蛍光標識されたHCVアンプリコンを検出すること;お
よび
(f)蛍光標識されたHCVアンプリコンが検出される場合、HCV感染を阻害する治
療剤での処置のために患者を選択すること
を含む、方法。 - HCV感染を阻害する治療剤での処置のために、肝炎の症状を示す患者を選択するため
の方法であって、
(a)乾燥血液サンプルを、0.5%BSAを含む緩衝溶液を用いて溶出させることで
あって、乾燥血液サンプルは、マイクロサンプリングデバイスを用いて患者から収集され
る、溶出させること;
(b)溶出させた乾燥血液サンプルにおいて、少なくとも1つのHCVがコードする抗
原に対する抗HCV抗体を検出すること;および
(c)抗HCV抗体が検出される場合、HCV感染を阻害する治療剤での処置のために
患者を選択すること
を含む、方法。 - マイクロサンプリングデバイスが、MITRA(登録商標)チップである、請求項30
または31に記載の方法。 - HCV感染を阻害する治療剤が、インターフェロンアルファコン-1、ペグ化および/
または非ペグ化インターフェロンアルファ-2b、ペグインターフェロンアルファ-2a
、リバビリン、テラプレビル、ボセプレビル、ソホスブビル、シメプレビル、ダクラタス
ビル、ベルパタスビル、オムビタスビル、パリタプレビル、リトナビル、ダサブビル、レ
ジパスビル、エルバスビル、ダノプレビル、グラゾプレビル、GS-7977、β-イン
ターフェロン、γ-インターフェロン、アマンタジン、ならびに3TCからなる群から選
択される1種または複数の薬剤である、請求項30から32のいずれか一項に記載の方法
。 - 乾燥血液サンプル中のHCVが、遺伝子型1a、遺伝子型1b、遺伝子型2a、遺伝子
型2b、遺伝子型2c、遺伝子型2d、遺伝子型3a、遺伝子型3b、遺伝子型3c、遺
伝子型3d、遺伝子型3e、遺伝子型3f、遺伝子型4a、遺伝子型4b、遺伝子型4c
、遺伝子型4d、遺伝子型4e、遺伝子型4f、遺伝子型4g、遺伝子型4h、遺伝子型
4i、遺伝子型4j、遺伝子型5a、および遺伝子型6aからなる群から選択される少な
くとも1つの遺伝子型を有する、請求項30から33のいずれか一項に記載の方法。 - 少なくとも1つのHCVがコードする抗原が、c22-3、c200、およびNS5か
らなる群から選択される、請求項30から34のいずれか一項に記載の方法。 - 乾燥生体液サンプルにおけるC型肝炎ウイルス(HCV)を検出するための方法であっ
て、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから溶解緩衝液を用いて溶出させた乾
燥生体液サンプルから、HCV RNAを単離することを含む、方法。 - HCV RNAが、逆転写およびリアルタイムPCRを使用して検出される、請求項3
6に記載の方法。 - 溶解緩衝液が、グアニジンイソチオシアネート、および任意選択でβ-メルカプトエタ
ノールを含む、請求項36または37に記載の方法。 - 乾燥生体液サンプルにおけるC型肝炎ウイルス(HCV)を検出するための方法であっ
て、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから0.5%BSAを含む緩衝溶液を
用いて溶出させた乾燥生体液サンプルから、抗HCV抗体を単離することを含む、方法。 - 緩衝溶液が、リン酸緩衝食塩水を含む、請求項39に記載の方法。
- 抗HCV抗体が、ELISAを使用して検出される、請求項39または40に記載の方
法。 - 抗HCV抗体が、c22-3、c200、およびNS5からなる群から選択されるHC
V抗原に結合する、請求項39から41のいずれか一項に記載の方法。
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