BR112019009798A2

BR112019009798A2 - método e kit para detectar vírus da hepatite c em uma amostra de fluido biológico secada, e, método para selecionar um paciente apresentando sintomas de hepatite.

Info

Publication number: BR112019009798A2
Application number: BR112019009798A
Authority: BR
Inventors: Rogers Amy; A Leake John; J Clarke Nigel; E Baumann Russel
Original assignee: Quest Diagnostics Invest Llc
Priority date: 2016-11-15
Filing date: 2017-11-13
Publication date: 2019-08-06
Also published as: EP3541960A2; CN110168111A; US20190276904A1; EP3541960A4; US20180136211A1; JP2020511956A; WO2018093721A3; MX2019005682A; WO2018093721A2; JP2022191225A; CA3044031A1

Abstract

a presente descrição prevê métodos rápidos e não invasivos para determinar se um paciente irá se beneficiar de um tratamento com agentes terapêuticos que inibem o vírus da hepatite c (hcv). estes métodos são baseados na detecção de rna de vhc e/ou anticorpos anti-hcv em amostras de fluido biológico secadas de pequeno volume que são coletadas usando um dispositivo de microamostragem. são também providos kits para uso na prática dos métodos.

Description

MÉTODO E KIT PARA DETECTAR VÍRUS DA HEPATITE C EM UMA AMOSTRA DE FLUIDO BIOLÓGICO SECADA, E, MÉTODO PARA SELECIONAR UM PACIENTE APRESENTANDO SINTOMAS DE HEPATITE

CAMPO TÉCNICO [001] A presente descrição fornece métodos para determinar se um paciente irá se beneficiar do tratamento com agentes terapêuticos que inibem o vírus da hepatite C (HCV). Esses métodos são baseados na detecção de RNA de HCV e/ou anticorpos anti-HCV em amostras de fluido biológico seco de pequeno volume que são coletadas usando um dispositivo de microamostragem. Kits para uso na prática dos métodos são também fornecidos.

FUNDAMENTOS [002] A seguinte descrição dos fundamentos da presente descrição é apresentada simplesmente para auxiliar o leitor a compreender a descrição e não é considerada como descrevendo ou constituindo técnica anterior à presente descrição.

[003] Vírus da hepatite C (HCV) é considerado o principal agente etiológico responsável por 90% a 95% dos casos de hepatite pós-transfusão (Rustgi VK. J Gastroenterol. 42:513-521 (2007), e o agente causador da maioria, se não de todas as hepatites não A, não B, transmitida pelo sangue (NANBH). A presença de anticorpo anti-HCV indica que um indivíduo pode ter sido infectado com HCV e pode ser capaz de transmitir a infecção pelo HCV.

[004] HCV é um vírus de RNA de senso positivo, fita simples, com um genoma de aproximadamente 9.500 nucleotídeos codificando para 3.000 aminoácidos. Como um vírus transmitido pelo sangue, o HCV é transmitido pelo sangue e produtos de sangue. A incidência de infecção por HCV é mais alta em associação com uso excessivo de fármacos intravenosos e, em menor

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 7/77

2/59 escala, com outras exposições percutâneas (Lauer GM & Walker BD, N Engl J Med 345:41-52 (2001)). Segundo a Organização Mundial da Saúde, cerca de 130 a 170 milhões de pessoas são cronicamente infectadas pelo HCV, com mais de 350.000 pessoas morrendo devido a doenças hepáticas relacionadas à hepatite C a cada ano. O Centers for Disease Control estima que 1,8% ou 3,9 milhões de americanos foram infectados com hepatite C - dos quais 2,7 milhões estão infectados cronicamente. Se deixada não tratada, hepatite C pode levar ao câncer de fígado, danos no fígado e, por último, insuficiência hepática.

[005] Assim, existe uma necessidade substancial de métodos mais robustos e sensíveis que possam detectar rapidamente o HCV em pacientes com risco de infecção por hepatite C.

SUMÁRIO [006] A presente descrição fornece métodos para detectar infecção por HCV em pacientes com sinais ou sintomas de hepatite, e em pacientes com risco de infecção por hepatite C. Os métodos da presente tecnologia também podem ser usados para triar a infecção por hepatite C em gestantes de modo a identificar recém-nascidos que estão em alto risco de adquirir HCV durante o período pré-natal.

[007] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para detectar vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico seco compreendendo (a) extrair ácidos ribonucleicos da amostra eluída de fluido biológico seco de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem; (b) transcrever de modo reverso os ácidos ribonucleicos extraídos para gerar uma pluralidade de complexos de hibridização cDNA:RNA; (c) amplificar os complexos de hibridização cDNA:RNA com um par de iniciadores que especificamente hibridiza para o 5’ UTR do genoma de HCV para produzir amplicons de HCV; e (d) detectar HCV na amostra de fluido biológico seco quando os amplicons de HCV produzidos na

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 8/77

3/59 etapa (c) são detectados. Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco é plasma seco, soro seco, ou sangue total seco. O genótipo de HCV presente na amostra de fluido biológico seco pode ser um ou mais genótipos selecionados dentre o grupo que consiste em Genótipo la, Genótipo 1b, Genótipo 2a, Genótipo 2b, Genótipo 2c, Genótipo 2d, Genótipo 3a, Genótipo 3b, Genótipo 3c, Genótipo 3d, Genótipo 3e, Genótipo 3f, Genótipo 4a, Genótipo 4b, Genótipo 4c, Genótipo 4d, Genótipo 4e, Genótipo 4f, Genótipo 4g, Genótipo 4h, Genótipo 4i, Genótipo 4j, Genótipo 5a, e Genótipo 6a. Em certas modalidades, a amostra de fluido biológico seco é isolada de um paciente apresentando sinais ou sintomas de hepatite, ou um paciente em risco de infecção por HCV. Em algumas modalidades, os complexos de hibridização cDNA:RNA são amplificados com Z05 ou Z05D DNA polimerases.

[008] De modo adicional ou alternativo, em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco na ponta absorvente do dispositivo de microamostragem é coletada de um paciente por meio de picada na ponta do dedo. Em certas modalidades, o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®. Eluição da amostra de fluido biológico seco pode ser realizada por contato da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem com um tampão de lise. Em algumas modalidades, o tampão de lise compreende isotiocianato de guanidina e, opcionalmente, β-mercaptoetanol. De modo adicional ou alternativo, em algumas modalidades, eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada por contato da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem com o tampão de lise durante pelo menos 30 minutos a 37°C. Em algumas modalidades, o volume da amostra do dispositivo de microamostragem não é maior que 30 pL, não maior que 25 pL, não maior que 20 pL, não maior que 15 pL, ou não maior que 10 pL.

[009] Em certas modalidades, o método compreende adicionalmente contatar os complexos de hibridização cDNA:RNA com uma sonda

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 9/77

4/59 detectavelmente rotulada. Em algumas modalidades, o rótulo detectável é um repórter fluorescente selecionado a partir do grupo que consiste em ácido 4acetamido-4’-isotiocianatostilbeno-2,dissulfônico, acridina e derivados (acridina, isotiocianato de acridina), Alexa Fluors (Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647 (Sondas Moleculares)), ácido 5-(2’aminoetil)aminonaftaleno-l-sulfônico (EDANS), 4-amino-N-[3vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 dissulfonato (amarelo Eucifer VS), N-(4anilino-l-naftil)maleimida, antranilamida, BODIPY® R-6G, BOPIPY® 530/550, BODIPY® FE, amarelo brilhante, Cal Fluor Red 610® (CFR610), coumarina e derivados (coumarina, 7-amino-4-metilcoumarina (AMC, Coumarina 120), 7-amino-4-trifluorometilcouluarina (Coumarina 151)), Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, cianosina, 4’,6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), 5’, 5”-dibromopirogalol-sulfonaftaleína (vermelho Bromopirogalol), 7-dietilamino-3-(4’-isotiocianatofenil)-4-metilcoumarina, pentaacetato de dietilenotriamina, ácido 4,4’ -di-isotiocianatodi-hidro-stilbeno-2,2 ’ dissulfônico, ácido 4,4’-di-isotiocianatostilbeno-2,2’-dissulfônico, cloreto de 5-[dimetilamino]naftaleno-l-sulfonila (DNS, cloreto de dansila), ácido 4-(4’dimetilaminofenilazo)benzóico (DAB CYE), 4-dimetilaminofenilazofenil-4 ’ isotiocianato (DABITC), Eclipse^Tm (Epoch Biosciences Inc.), eosina e derivados (eosina, isotiocianato de eosina), eritrosina e derivados (eritrosina B, isotiocianato de eritrosina), etídio, fluoresceína e derivados (5carboxifluoresceina (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceina (DTAF), 2’,7’-dimetoxi-4’5’-dicloro-6-carboxifluoresceina (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), hexacloro-6carboxifluoresceina (HEX), QFITC (XRITC), tetraclorofluoresceína (TET), fluorescamina, IR144, IR1446, fósforos de lantamida, isotiocianato de verde malaquita, 4-metilumbeliferona, orto cresolftaleina, nitrotirosina, pararosanilina, vermelho fenol, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, aloficocianina,

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 10/77

5/59 o-ftaldialdeído, Oregon Verde®, iodeto de propídio, pireno e derivados (pireno, butirato de pireno, sucinimidil 1-butirato de pireno), QSY® 7, QSY® 9, QSY® 21, QSY® 35 (Sondas Moleculares), vermelho reativo 4 (Cibacron® vermelho brilhante 3B-A), rodamina e derivados (6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), lissamina rodamina B cloreto de sulfonila, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina-verde, isotiocianato de rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101, derivado de cloreto de sulfonila de sulforodamina 101 (vermelho texas), N,N,N',N'-tetrametil-6carboxirodamina (TAMRA), tetrametil rodamina, isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC), riboflavina, ácido rosólico, derivados de quelato de térbio, Quasar 670®, e VIC®.

[0010] Em qualquer uma das modalidades acima, a carga viral de HCV na amostra de fluido biológico seco é pelo menos 1-5 lU/mL, pelo menos 5-10 lU/mL, pelo menos 10-15 lU/mL, pelo menos 15-20 lU/mL, pelo menos 20-40 lU/mL, pelo menos 40-60 lU/mL, pelo menos 60-80 lU/mL, pelo menos 80-100 lU/mL, pelo menos 100-150 lU/mL, pelo menos 150-200 lU/mL, pelo menos 200-250 lU/mL, pelo menos 250-300 lU/mL, pelo menos 300-350 lU/mL, pelo menos 350-400 lU/mL, pelo menos 400-500 lU/mL, pelo menos 500-600 lU/mL, pelo menos 600-700 lU/mL, pelo menos 700800 lU/mL, pelo menos 800-850 lU/mL, pelo menos 850 lU/mL, ou pelo menos 900 lU/mL.

[0011] Em outro aspecto, a presente descrição fornece um método para detectar vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico seco compreendendo (a) eluir uma amostra de fluido biológico seco a partir de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem; e (b) detectar HCV na amostra de fluido biológico seco quando um anticorpo antiHCV para pelo menos um antígeno codificado de HCV é detectado na amostra eluída de fluido biológico seco. Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco é plasma seco, soro seco, ou sangue total seco. O

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 11/77

6/59 genótipo de HCV presente na amostra de fluido biológico seco pode ser um ou mais genótipos selecionados dentre o grupo que consiste em Genótipo la, Genótipo 1b, Genótipo 2a, Genótipo 2b, Genótipo 2c, Genótipo 2d, Genótipo 3a, Genótipo 3b, Genótipo 3c, Genótipo 3d, Genótipo 3e, Genótipo 3f, Genótipo 4a, Genótipo 4b, Genótipo 4c, Genótipo 4d, Genótipo 4e, Genótipo 4f, Genótipo 4g, Genótipo 4h, Genótipo 4i, Genótipo 4j, Genótipo 5a, e Genótipo 6a. Em certas modalidades, a amostra de fluido biológico seco é isolada de um paciente apresentando sinais ou sintomas de hepatite, ou um paciente em risco de infecção por HCV. Em algumas modalidades, o pelo menos um antígeno codificado de HCV é selecionado a partir do grupo que consiste em c22-3, c200, e NS5.

[0012] De modo adicional ou alternativo, em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco na ponta absorvente do dispositivo de microamostragem é coletada do paciente por meio de picada na ponta do dedo. Em certas modalidades, o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®. Eluição da amostra de fluido biológico seco pode ser realizada por contato da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem com uma mistura compreendendo solução salina de tampão fosfato e BS A a 0,5%. Em certas modalidades, eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada por contato da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem com a mistura compreendendo solução salina de tampão fosfato e BS A a 0,5% durante pelo menos 2 horas em temperatura ambiente, ou durante a noite a 28°C. Em algumas modalidades, o volume da amostra do dispositivo de microamostragem não é maior que 30 μΕ, não maior que 25 μΕ, não maior que 20 μΕ, não maior que 15 μΕ, ou não maior que 10 μΕ.

[0013] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para selecionar um paciente apresentando sintomas de hepatite para tratamento com um agente terapêutico que inibe a infecção por HCV compreendendo (a) eluir uma amostra de sangue seco sob condições que resultam na liberação de

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 12/77

7/59 ácidos ribonucleicos de células de sangue, em que a amostra de sangue seco é coletada do paciente com um dispositivo de microamostragem; (b) isolar ácidos ribonucleicos da amostra eluída de sangue seco; (c) transcrever de modo reverso os ácidos ribonucleicos isolados para gerar uma pluralidade de complexos de hibridização cDNA:RNA; (d) amplificar os complexos de hibridização cDNA:RNA com um par de iniciadores que especificamente hibridiza para o 5’ UTR do genoma de HCV para produzir amplicons de HCV fluorescentemente rotulados; (e) detectar os amplicons de HCV fluorescentemente rotulados produzidos na etapa (d); e (f) selecionar o paciente para tratamento com um agente terapêutico que inibe a infecção por HCV, se os amplicons de HCV fluorescentemente rotulados forem detectados.

[0014] De modo adicional ou alternativo, em outro aspecto, a presente descrição fornece um método para selecionar um paciente apresentando sintomas de hepatite para tratamento com um agente terapêutico que inibe a infecção por HCV compreendendo (a) eluir uma amostra de sangue seco com uma solução de tampão compreendendo BS A a 0,5%, em que a amostra de sangue seco é coletada do paciente com um dispositivo de microamostragem; (b) detectar um anticorpo anti-HCV para pelo menos um antígeno codificado de HCV na amostra eluída de sangue seco; e (c) selecionar o paciente para tratamento com um agente terapêutico que inibe a infecção por HCV, se o anticorpo anti-HCV for detectado. Em algumas modalidades, o pelo menos um antígeno codificado de HCV é selecionado a partir do grupo que consiste em c22-3, c200, e NS5. Em algumas modalidades, a solução de tampão compreende adicionalmente solução salina de tampão fosfato.

[0015] Em qualquer uma das modalidades acima, o agente terapêutico que inibe a infecção por HCV é um ou mais agentes selecionados dentre o grupo que consiste em interferon alfacon-1, interferon alfa-2b peguilado e/ou não peguilado, peginterferon alfa-2a, ribavirina, telaprevir, boceprevir,

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 13/77

8/59 sofosbuvir, simeprevir, daclatasvir, velpatasvir, ombitasvir, paritaprevir, ritonavir, dasabuvir, ledipasvir, elbasvir, danoprevir, grazoprevir, GS-7977, βinterferon, γ-interferon, amantadina, e 3TC. Em algumas modalidades, ο dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®. O genótipo de HCV presente na amostra de sangue seco pode ser um ou mais genótipos selecionados dentre o grupo que consiste em Genótipo la, Genótipo 1b, Genótipo 2a, Genótipo 2b, Genótipo 2c, Genótipo 2d, Genótipo 3a, Genótipo 3b, Genótipo 3c, Genótipo 3d, Genótipo 3e, Genótipo 3f, Genótipo 4a, Genótipo 4b, Genótipo 4c, Genótipo 4d, Genótipo 4e, Genótipo 4f, Genótipo 4g, Genótipo 4h, Genótipo 4i, Genótipo 4j, Genótipo 5a, e Genótipo 6a.

[0016] Também são descritos aqui kits para detectar a presença de vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico seco. Em algumas modalidades, os kits compreendem um dispositivo de microamostragem, um tampão de lise, transcriptase reversa e, opcionalmente, um par de iniciadores que especificamente hibridiza para o 5’ UTR do genoma de HCV. Em certas modalidades, os kits compreendem uma sonda detectavelmente rotulada que especificamente hibridiza para o 5’ UTR do genoma de HCV.

[0017] De modo adicional ou alternativo, em algumas modalidades, os kits compreendem um dispositivo de microamostragem, a solução de PBS compreendendo BS A a 0,5%, e um anticorpo secundário detectavelmente rotulado que especificamente se liga a um anticorpo primário anti-HCV. Em certas modalidades, os kits compreendem adicionalmente um substrato sólido compreendendo cavidades revestidas com pelo menos um antígeno codificado de HCV selecionado a partir do grupo que consiste em c22-3, c200, e NS5.

[0018] Em qualquer uma das modalidades acima dos kits da presente tecnologia, o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®.

[0019] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para detectar vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico seco

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 14/77

9/59 compreendendo isolar RNA de HCV da amostra eluída de fluido biológico seco de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem (por exemplo, ponta MITRA®) com um tampão de lise. Em algumas modalidades, o RNA de HCV é detectado usando transcrição reversa e PCR em tempo real. Em certas modalidades, o tampão de lise compreende isotiocianato de guanidina e, opcionalmente, β-mercaptoetanol.

[0020] Em outro aspecto, a presente descrição fornece um método para detectar vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico seco compreendendo isolar um anticorpo anti-HCV da amostra eluída de fluido biológico seco de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem (por exemplo, Ponta MITRA®) com uma solução de tampão compreendendo BS A a 0,5%. Em algumas modalidades, a solução de tampão compreende adicionalmente solução salina de tampão fosfato. Em certas modalidades, o anticorpo anti-HCV se liga a um antígeno de HCV selecionado a partir do grupo que consiste em c22-3, c200, e NS5. O anticorpo anti-HCV pode ser detectado usando teste imunossorvente ligado a enzima (ELISA).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0021] Figura 1 mostra a concordância entre a detecção de RNA de HCV em amostras de sangue seco coletadas em um dispositivo de coleta de ponta MITRA® por meio de picada na ponta do dedo de 12 pacientes e detecção de RNA de HCV em amostras de sangue total dos mesmos pacientes coletadas usando coleta de sangue convencional.

[0022] Figura 2 mostra uma correlação das cargas virais recuperadas entre HCV recuperado de picada na ponta do dedo e HCV recuperado do soro.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0023] A presente descrição fornece métodos para determinar se um paciente irá se beneficiar de tratamento com agentes terapêuticos que inibe

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 15/77

10/59

HCV. Esses métodos são baseados em detectar RNA de HCV e/ou anticorpos anti-HCV em amostras de fluido biológico seco de pequeno volume que são coletadas usando um dispositivo de microamostragem. Kits para uso na prática dos métodos são também fornecidos. Os métodos aqui descritos são capazes de detectar baixas cargas virais em amostras de fluido biológico seco de pequeno volume obtidas com um dispositivo de coleta de ponta MITRA® por meio de picada na ponta do dedo. Além disso, foi determinado que RNA de HCV em amostras de fluido biológico seco eluídas das pontas MITRA® permaneceu estável, mesmo quando eluição foi realizada 1 mês após a coleta por meio de picada na ponta do dedo. Este resultado foi inesperado porque os métodos da presente tecnologia não implicam pré-tratamento das pontas MITRA® com aditivos tais como ureia, sais, quelantes ou inibidores da RNase, de modo a prevenir a degradação do RNA.

Definições [0024] Salvo se definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que o comumente entendido por um versado na técnica à qual a presente tecnologia pertence. Como aqui usado, salvo indicação em contrário, as formas singulares de “um”, “uma” e “o” e “a” incluem a referência no plural. Assim, por exemplo, uma referência a “um oligonucleotídeo” inclui uma pluralidade de moléculas de oligonucleotídeo, e uma referência a “um ácido nucleico” é uma referência a um ou mais ácidos nucleicos.

[0025] Como aqui usado, o termo “cerca de” em referência a um número é geralmente considerado como incluindo números dentro de uma faixa de 1% a 10% em qualquer direção (maior ou menor que) do número, salvo indicação em contrário ou de outra forma evidente do contexto.

[0026] Como aqui usado, a “administração” de um agente terapêutico ou fármaco para um indivíduo inclui qualquer via de introdução ou distribuição a um indivíduo de um composto para desempenhar sua função

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 16/77

11/59 pretendida. Administração pode ser realizada por qualquer via apropriada, incluindo oralmente, intranasalmente, parenteralmente (intravenosamente, intramuscularmente, intraperitoneamente ou subcutaneamente), ou topicamente. Administração inclui auto-administração e a administração por outro.

[0027] Como aqui usado, os termos “amplificar” ou “amplificação” com relação às sequências de ácido nucleico, referem-se a métodos que aumentam a representação de uma população de sequências de ácido nucleico em uma amostra. Cópias de uma sequência de ácido nucleico alvo particular gerada in vitro em uma reação de amplificação são chamadas “amplicons” ou “produtos de amplificação”. Amplificação pode ser exponencial ou linear. Um ácido nucleico alvo pode ser DNA (tal como, por exemplo, DNA genômico e cDNA) ou RNA. Embora os métodos exemplares descritos a seguir se refiram à amplificação usando reação em cadeia de polimerase (PCR), numerosos outros métodos, como métodos isotérmicos, métodos de círculos rolantes, etc., são bem conhecidos do versado da técnica. O versado na técnica compreenderá que estes outros métodos podem ser usados em vez de, ou em junto com métodos de PCR. Ver, por exemplo, Saiki, “Amplification of Genomic DNA' in PCR Protocols, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA 1990, pp 13-20; Wharam, et al., Nucleic Acids Res. 29(11):E54-E54 (2001).

[0028] Os termos “complemento”, “complementar” ou “complementaridade” como usados aqui com referência a polinucleotídeos (isto é, uma sequência de nucleotídeos como um oligonucleotídeo ou um ácido nucleico alvo) referem-se às regras de emparelhamento de bases de Watson/Crick. O complemento de uma sequência de ácido nucleico, como aqui usado, refere-se a um oligonucleotídeo que, quando alinhado com a sequência de ácido nucleico tal que a extremidade 5’ de uma sequência é emparelhada com a extremidade 3’ da outra, está em “associação

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 17/77

12/59 antiparalelo”. Por exemplo, a sequência “5’-A-G-T-3” é complementar à sequência “3’-T-C-A-5”. Algumas bases não comumente encontradas em ácidos nucleicos de ocorrência natural podem ser incluídas nos ácidos nucleicos aqui descritos. Estes incluem, por exemplo, inosina, 7deazaguanina, ácidos nucleicos fechados (LNA) e ácidos nucleicos peptídeos (PNA). Complementaridade não precisa ser perfeita; duplexes estáveis podem conter pares de bases de correspondência incorreta, bases degenerativas ou sem correspondência. Os versados na técnica de tecnologia de ácido nucleico podem determinar empiricamente estabilidade duplex considerando um número de variáveis incluindo, por exemplo, o comprimento do oligonucleotídeo, composição de base e sequência do oligonucleotídeo, força iônica e incidência de pares de bases de correspondência incorreta. Uma sequência de complemento também pode ser uma sequência de RNA complementar à sequência de DNA ou sua sequência complementar, e também pode ser um cDNA.

[0029] O termo “substancialmente complementar” como aqui usado significa que duas sequências hibridizam sob condições de hibridização estringentes. O versado na técnica compreenderá que sequências substancialmente complementares não precisam de hibridizar ao longo de todo o seu comprimento. Em particular, sequências substancialmente complementares podem compreender uma sequência contígua de bases que não hibridizam com uma sequência alvo, posicionada 3’ ou 5’ para uma sequência contígua de bases que hibridizam sob condições de hibridização estringentes com uma sequência alvo.

[0030] Como aqui usado, o termo “detecção” refere-se à determinação da presença de um ácido nucleico alvo do HCV, ou um anticorpo que especificamente liga-se a um antígeno alvo do HCV na amostra. Detecção não requer o método para proporcionar 100% de sensibilidade e/ou 100% de especificidade.

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 18/77

13/59 [0031] Como aqui usado, “resposta virológica precoce (EVR)” significa que uma diminuição de dois log ou maior nos níveis de RNA de HCV ou níveis indetectáveis de RNA de HCV são observados em um paciente após 12 semanas de terapia.

[0032] Como aqui usado, o termo “quantidade eficaz” refere-se a uma quantidade suficiente para alcançar um efeito terapêutico e/ou profilático desejado, por exemplo, uma quantidade que resulte na prevenção de, ou uma diminuição na infecção por HCV, ou um ou mais sintomas associados à infecção pelo HCV. No contexto de aplicações terapêuticas ou profiláticas, a quantidade de um agente terapêutico administrado ao indivíduo dependerá do tipo e severidade da doença e das características do indivíduo, tais como saúde geral, idade, sexo, peso corporal e tolerância a fármacos. Dependerá também do grau, severidade e tipo de doença. O versado na técnica será capaz de determinar dosagens apropriadas dependendo destes e de outros fatores. Como aqui usado, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um fármaco ou agente terapêutico significa níveis em que os efeitos fisiológicos da infecção por HCV são, no mínimo, melhorados. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser dada em uma ou mais administrações.

[0033] Como aqui usado, os termos “extração” ou “isolamento” referem-se a qualquer ação tomada para separar ácidos nucleicos ou proteínas de outro material celular presente na amostra. O termo extração ou isolamento inclui lise mecânica ou química, adição de detergente ou protease, ou precipitação e remoção de outro material celular.

[0034] O termo “fluoróforo”, tal como aqui usado, refere-se a uma molécula que absorve luz em um comprimento de onda determinado (frequência de excitação) e subsequentemente emite luz de um comprimento de onda mais longo (frequência de emissão). O termo “fluoróforo doador”, como aqui usado, significa um fluoróforo que, quando em proximidade íntima de uma porção de extinção, doa ou transfere energia de emissão para o

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 19/77

14/59 extintor. Como resultado da doação de energia para a porção de extinção, o fluoróforo doador emite, ele mesmo, menos luz em uma frequência de emissão particular que ele teria na ausência de uma porção de extinção posicionada bem próxima.

[0035] O termo “hibridizar”, como aqui usado, refere-se a um processo em que dois filamentos de ácido nucleico substancialmente complementares (pelo menos cerca de 65% complementar ao longo de um trecho de pelo menos 14 a 25 nucleotídeos, pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 90% complementar) anelam um ao outro sob condições apropriadamente estringentes para formar um duplex ou heteroduplex através da formação de pontes hidrogênio entre pares de bases complementares. As hibridizações são tipicamente e preferivelmente conduzidas com moléculas de ácido nucleico de comprimento de sonda, preferivelmente de 15-100 nucleotídeos de comprimento, mais preferivelmente 18-50 nucleotídeos de comprimento. Técnicas de hibridização de ácido nucleico são bem conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^a. ed., Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. A hibridização e a potência da hibridização (isto é, a força da associação entre os ácidos nucleicos) é influenciada por tais fatores como o grau de complementaridade entre os ácidos nucleicos, estringência das condições envolvidas e o ponto de fusão térmica (T_m) do híbrido formado. Os versados na técnica entendem como estimar e ajustar a estringência das condições de hibridização de modo que as sequências tendo pelo menos um nível desejado de complementaridade irá hibridizar de forma estável, enquanto aquelas com menor complementaridade não. Para exemplos de condições e parâmetros de hibridização, ver, por exemplo, Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^a. ed., Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.; Ausubel, F. M. Et al. 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N.J. Em algumas modalidades, hibridização

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 20/77

15/59 específica ocorre sob condições de hibridização estringentes. Um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo (por exemplo, uma sonda ou um iniciador) que é específico para um ácido nucleico alvo irá “hibridizar” com o ácido nucleico alvo sob condições apropriadas.

[0036] Como aqui usado, os termos “individual”, “paciente” ou “indivíduo” podem incluir um organismo individual, um vertebrado, um mamífero ou um humano. Em uma modalidade preferida, o indivíduo, paciente ou indivíduo é um humano.

[0037] Como aqui usado, “oligonucleotídeo” refere-se a uma molécula que tem uma sequência de bases de ácido nucleico em uma espinha dorsal constituída principalmente de unidades monoméricas idênticas em intervalos definidos. As bases estão dispostas na espinha dorsal de tal modo que elas podem ligar-se a um ácido nucleico tendo uma sequência de bases que são complementares às bases do oligonucleotídeo. Os oligonucleotídeos mais comuns têm uma espinha dorsal de unidades de fosfato de açúcar. Uma distinção pode ser feita entre oligodesoxirribonucleotídeos que não têm um grupo hidroxila na posição 2’ e oligorribonucleotídeos que têm um grupo hidroxila na posição 2’. Oligonucleotídeos podem também incluir derivados, em que o hidrogênio do grupo hidroxila é substituído por grupos orgânicos, por exemplo, um grupo alila. Oligonucleotídeos que funcionam como iniciadores ou sondas são geralmente pelo menos de cerca de 10-15 nucleotídeos de comprimento ou até cerca de 70, 100, 110, 150 ou 200 nucleotídeos de comprimento e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 15 a 25 nucleotídeos de comprimento. Oligonucleotídeos usados como iniciadores ou sondas para especificamente amplificar ou especificamente detectar um ácido nucleico alvo particular geralmente são capazes de especificamente hibridizar com o ácido nucleico alvo.

[0038] Como aqui usado, o termo “iniciador” refere-se a um oligonucleotídeo, que é capaz de atuar como um ponto de iniciação da síntese

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 21/77

16/59 de sequência de ácido nucleico quando colocado sob condições em que a síntese de um produto de extensão de iniciador que é complementar a um filamento de ácido nucleico alvo é induzida, isto é, na presença de diferentes nucleotídeos trifosfatos e uma polimerase em um tampão apropriado (“tampão” inclui pH, força iônica, co-fatores etc.) e a uma temperatura apropriada. Um ou mais dos nucleotídeos do iniciador podem ser modificados, por exemplo, por adição de um grupo metila, uma porção biotina ou digoxigenina, uma etiqueta fluorescente ou usando nucleotídeos radioativos. Uma sequência de iniciador não precisa refletir a sequência exata do gabarito. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser fixado à extremidade 5 ’ do iniciador, sendo o restante da sequência de iniciador substancialmente complementar ao filamento. O termo iniciador como aqui usado inclui todas as formas de iniciadores que podem ser sintetizados incluindo iniciadores de ácidos nucleicos peptídeos, iniciadores de ácidos nucleicos bloqueados, iniciadores modificados de fosforotioato, iniciadores rotulados, e similares. O termo “iniciador dianteiro”, como aqui usado, significa um iniciador que anela com o filamento anti-senso de DNA de fita dupla (dsDNA). Um “iniciador reverso” anela com a cadeia senso de dsDNA.

[0039] Iniciadores têm tipicamente pelo menos 10, 15, 18, ou 30 nucleotídeos de comprimento ou até cerca de 100, 110, 125, ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, iniciadores têm preferivelmente entre cerca de 15 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento, e mais preferivelmente entre cerca de 25 a cerca de 40 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, iniciadores têm 15 a 35 nucleotídeos de comprimento. Não há comprimento padrão para hibridização ótima ou amplificação de reação em cadeia polimerase. Um comprimento ótimo para uma aplicação particular de iniciadores pode ser prontamente determinado como descrito em H. Erlich, PCR Technology, Principles and Application

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 22/77

17/59 for DNA Amplification, (1989).

[0040] Como aqui usado, o termo “par de iniciadores” refere-se a um par de iniciadores dianteiro e reverso (isto é, um par de iniciadores esquerdo e direito) que podem ser usados juntos para amplificar uma dada região de um ácido nucleico de interesse.

[0041] “Sonda”, como aqui usada, refere-se a ácido nucleico que interage com um ácido nucleico alvo por meio de hibridização. Uma sonda pode ser totalmente complementar a uma sequência de ácido nucleico alvo ou parcialmente complementar. O nível de complementaridade dependerá de muitos fatores baseados, em geral, na função da sonda. Sondas podem ser rotuladas ou não rotuladas, ou modificadas de vários modos, bem conhecidas na técnica. Uma sonda pode especificamente hibridizar para um ácido nucleico alvo. Sondas podem ser DNA, RNA ou um híbrido RNA/DNA. Sondas podem ser oligonucleotídeos, cromossomas artificiais, cromossoma artificial fragmentado, ácido nucleico genômico, ácido nucleico genômico fragmentado, RNA, ácido nucleico recombinante, ácido nucleico recombinante fragmentado, ácido nucleico peptídeo (PNA), ácido nucleico bloqueado, oligômero de heterociclos cíclicos ou conjugados de ácido nucleico. Sondas podem compreender nucleobases modificadas, unidades de açúcar modificadas e ligações intemucleotídeos modificadas. Sondas são tipicamente pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100 nucleotídeos ou mais de comprimento.

[0042] O termo “porção de extinção”, como aqui usado, significa uma molécula que, em estreita proximidade com um fluoróforo doador, absorve a energia de emissão gerada pelo doador e dissipa a energia como calor ou emite luz de comprimento de onda mais longo que o comprimento de onda de emissão do doador. Neste último caso, o extintor é considerado um fluoróforo receptor. A porção de extinção pode atuar por meio de extinção proximal (isto é, colisional) ou por transferência Fõrster ou de energia de ressonância de

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 23/77

18/59 fluorescência (“FRET”). A extinção por FRET é geralmente usada em sondas TaqMan® enquanto a extinção proximal é usada em baliza molecular e sondas do tipo Scorpion ™.

[0043] Como aqui usado, “resposta viral rápida (RVR)” significa que níveis não detectáveis de RNA de HCV são observados em um paciente após 4 semanas de terapia.

[0044] Como aqui usado, o termo “amostra” refere-se a amostras clínicas obtidas de um paciente ou microrganismos isolados. Em modalidades preferidas, a amostra é obtida a partir de uma fonte biológica (isto é, uma “amostra biológica”), tal como o tecido, fluido corporal, ou microrganismos coletados a partir de um indivíduo. As fontes da amostra incluem, mas não estão limitadas a muco, esputo de expectoração (processado ou não), lavagem alveolar brônquica (BAL), lavagem brônquica (BW), sangue, fluidos corporais, líquido cérebro-espinhal (CSF), urina, plasma, soro ou tecido (por exemplo, material de biópsia). Fontes de amostra preferidas incluem sangue total por meio de picada na ponta do dedo.

[0045] O termo “sensibilidade”, como aqui usado em referência aos métodos da presente tecnologia, é uma medida da capacidade de um método para detectar uma variante de sequência pré-selecionada de uma população heterogênea de sequências. Um método tem uma sensibilidade de S% para variantes de F% se, dada uma amostra na qual a variante de sequência préselecionada está presente como pelo menos F% das sequências na amostra, o método pode detectar a sequência pré-selecionada em uma confiança préselecionada de C %, S % do tempo. A título de exemplo, um método tem uma sensibilidade de 90% para variantes de 5% se, dada uma amostra na qual a sequência variante pré-selecionada estiver presente como, pelo menos, 5% das sequências na amostra, o método conseguir detectar a sequência préselecionada a uma confiança pré-selecionada de 99%, 9 de 10 vezes (F=5%; C=99%; S=90%). Sensibilidades exemplares incluem pelo menos 50, 60, 70,

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 24/77

19/59

80, 90, 95, 98, e 99%.

[0046] O termo “específico”, como aqui usado em referência a um iniciador de olionucleotídeo, significa que a sequência de nucleotídeo do iniciador tem pelo menos 12 bases de identidade de sequência com uma porção do ácido nucleico a ser amplificada quando o oligonucleotídeo e o ácido nucleico estão alinhados. Um iniciador de oligonucleotídeo que é específico para um ácido nucleico é um que, sob condições de hibridização ou lavagem estringentes, é capaz de hibridizar com o alvo de interesse e não hibridizar substancialmente com ácidos nucleicos que não são de interesse. Níveis maiores de identidade de sequência são preferidos e incluem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 85-95% e, mais preferivelmente, pelo menos 98% de identidade de sequência. A identidade da sequência pode ser determinada usando um programa de computador comercialmente disponível com uma configuração default padrão que emprega algoritmos bem conhecidos na técnica. Tal como aqui usado, as sequências que têm “identidade de sequência elevada” têm nucleotídeos idênticos em pelo menos cerca de 50% das posições de nucleotídeos alinhadas, preferivelmente pelo menos a cerca de 60% das posições de nucleotídeos alinhadas e, mais preferivelmente, pelo menos em cerca de 75% de posições dos nucleotídeos alinhadas.

[0047] “Especificidade”, como aqui usado, é uma medição da capacidade de um método para distinguir uma variante de sequência préselecionada, que ocorre verdadeiramente, a partir de artefatos de sequenciamento ou outras sequências relacionadas. Esta é a capacidade de evitar detecções de falso positivo. Detecções falsas positivas podem surgir de erros introduzidos na sequência de interesse durante a preparação da amostra, erro de sequenciamento ou sequenciamento inadvertido de sequências intimamente relacionadas, como pseudogenes ou membros de uma família de genes. Um método tem uma especificidade de X % se, quando aplicado a um

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 25/77

20/59 conjunto de amostras de sequências N_totai, em que as sequências Xverdadeiras são verdadeiramente variantes e X_não verdadeiras são não verdadeiramente variantes, o método seleciona pelo menos X % da variante não verdadeira como não variante. Por exemplo, um método tem uma especificidade de 90% se, quando aplicado a um conjunto de amostras de 1.000 sequências, em que 500 sequências são verdadeiramente variantes e 500 são não verdadeiramente variantes, o método seleciona 90% das 500 sequências não verdadeiramente variantes como não variantes. Especificidades exemplares incluem pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, e 99%.

[0048] Como aqui usado, “se liga especificamente” refere-se a molécula (por exemplo, um anticorpo anti-HCV) que reconhece e se liga a outra molécula (por exemplo, um antígeno HCV alvo), mas não reconhece substancialmente e se liga a outras moléculas. Os termos “ligação específica” “especificamente se liga a,” ou é “específico para” uma molécula particular (por exemplo, um antígeno de HCV alvo), como aqui usado, podem ser apresentados, por exemplo, por uma molécula tendo um Kd para a molécula à qual ele se liga de, pelo menos, cerca de 10^-4M, 10^-5M, 10^-6M, 10^-7M, 10“⁸M, 10“⁹M, 10“¹⁰M, 10^-11M, 10¹²M, ou maior.

[0049] O termo “condições de hibridização estringentes”, como aqui usado, refere-se a condições de hibridização pelo menos tão estringentes quanto as seguintes: hibridização em 50% de formamida, 5x SSC, 50 mM NaHiPCfl, pH 6,8, 0,5% SDS, 0,1 mg/mL de DNA de esperma de salmão com sonicação, e 5x solução de Denhart a 42°C durante a noite; lavagem com 2x SSC, 0,1% SDS a 45°C; e lavagem com 0,2x SSC, 0,1% SDS a 45°C. Em outro exemplo, condições de hibridização estringentes não devem permitir a hibridização de dois ácidos nucleicos que diferem em um trecho de 20 nucleotídeos contíguos por mais de duas bases.

[0050] Como aqui usado, “resposta virológica sustentada (SVR)” significa que níveis não detectáveis de RNA de HCV são observados em um

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 26/77

21/59 paciente após 24 semanas após o final de um regime terapêutico.

[0051] Como aqui usado “sistema de detecção de PCR TaqMan®” refere-se a um método para PCR em tempo real. A sonda TaqMan® compreende um fluoróforo doador e um extintor em cada extremidade da sonda e em proximidade próxima suficiente para que a fluorescência do doador seja absorvida pelo extintor. No entanto, quando a sonda hibridiza com o segmento amplificado, a atividade 5’-exonuclease da polimerase Taq cliva a sonda permitindo, assim, que o fluoróforo doador emita fluorescência que pode ser detectada.

[0052] Os termos “ácido nucleico alvo” ou “sequência alvo”, como aqui usados, referem-se a uma sequência de ácidos nucleicos de interesse a ser detectada e/ou quantificada na amostra a ser analisada. Ácido nucleico alvo pode ser composto por segmentos de um cromossoma, um gene completo com ou sem sequência intergênica, segmentos ou porções de um gene com ou sem sequência intergênica ou sequência de ácidos nucleicos cujas sondas ou iniciadores são projetadas. Ácidos nucleicos alvo podem incluir uma sequência(s) de tipo selvagem, uma mutação, deleção, inserção ou duplicação, elementos de repetição em tandem, um gene de interesse, uma região de um gene de interesse ou qualquer região a montante ou a jusante da mesma. Ácidos nucleicos alvo podem representar sequências alternativas ou alelos de um gene particular. Ácidos nucleicos alvo podem ser derivados de DNA genômico, cDNA ou RNA.

HCV [0053] O virion de HCV é um vírus de RNA de fita positiva envelopado na família Flaviviridae com uma sequência genômica de cerca de 9600 bases que codifica uma poliproteína de cerca de 3.010 aminoácidos. Em células infectadas, a poliproteína é clivada em sítios múltiplos por proteases celulares e virais para produzir as proteínas estruturais e não estruturais (NS). Os produtos de proteína de HCV incluem as proteínas estruturais C, El e E2,

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 27/77

22/59 e as proteínas não estruturais NS2, NS3, NS4A e NS4B, e NS5A e NS5B.

[0054] As proteínas não estruturais (“NS”) fornecem a maquinaria catalítica para a replicação viral, como se acredita. No caso de HCV, a geração de proteínas não estruturais maduras (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B) é efetuada por duas proteases virais. A primeira protease cliva na junção NS2-NS3; o segundo é uma serina protease contida na região Nterminal de NS3 (de agora em diante referida como NS3 protease) e serve de mediador de todas as clivagens subsequentes a jusante de NS3, tanto em eis, no sítio de clivagem NS3-NS4A, como em trans, para os restantes sítios NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B.

[0055] A proteína NS4A parece servir a múltiplas funções, atuando como um cofator para a NS3 protease e possivelmente auxiliando na localização de membrana de NS3 e outros componentes da replicase viral. A formação complexa da proteína NS3 com NS4A parece necessária para os eventos de processamento, intensificando a eficácia proteolítica em todos os sítios. A proteína NS3 também apresenta atividades de nucleosídeo trifosfatase e RNA helicase. A proteína c200 é codificada pelas regiões putativas NS3 e NS4 do genoma do HCV.

[0056] NS5B é uma RNA polimerase dependente de RNA que está envolvida na replicação do HCV. A NS5B polimerase do HCV é necessária para a síntese de um RNA de fita dupla a partir de um RNA viral de fita simples que serve como um gabarito no ciclo de replicação de HCV. Portanto, a NS5B polimerase é considerada como sendo um componente essencial no complexo de replicação de HCV. (K. Ishi, et al, Hepatology 29: 1227-1235 (1999); V. Lohmann, et al., Virology 249: 108-118 (1998)). A proteína c22-3 é codificada pela região de núcleo putativa do genoma de HCV.

Dispositivos de microamostragem empregados nos métodos da presente tecnologia [0057] As técnicas convencionais de detecção de manchas de sangue

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 28/77

23/59 seco são acompanhadas por uma série de desvantagens, incluindo um volume impreciso de amostra e dependência de uma viscosidade constante da amostra (isto é, a expectativa de que a amostra se espalhe uniformemente no cartão de amostra). Uma viscosidade constante resulta em diâmetros de manchas de sangue permanecendo constantes quando amostras de volume igual são administradas nos cartões. No entanto, a viscosidade varia significativamente entre amostras de sangue por causa dos diferentes níveis de hematócritos (HCT) ou volume de células embaladas (PCV) no sangue. Amostras com altos níveis de hematócritos formam manchas de menor diâmetro nos papéis para teste do sangue, levando a diferentes concentrações de sangue dentro do diâmetro fixo das manchas amostradas. Acredita-se que os níveis de PCV mostrem uma variância de cerca de 45% nos diâmetros das manchas. Como padrões internos são pulverizados sobre o sangue manchado, isso pode resultar em um erro de 45% na quantificação. Os dispositivos de microamostragem empregados nos métodos aqui descritos conferem várias vantagens, incluindo a coleta de volumes de sangue mais precisa, falta de alinhamento de hematócritos, e a capacidade de ser facilmente automatizada com manipuladores de líquido padrão para processamento laboratorial.

[0058] Adicionalmente, técnicas convencionais de manchas de sangue requerem um volume comparativamente grande de sangue em relação aos dispositivos de microamostragem. Uma mancha de sangue seco geralmente iria requerer 50-75 μΐ por mancha, enquanto um dispositivo de microamostragem pode produzir resultados de aproximadamente 20 μΐ. Foi reconhecido na técnica que manchas de sangue seco apresentam com frequência problemas de variabilidade de desempenho para detectar carga viral em comparação com outros tipos de amostras, como plasma {Pannus et al., Medicine, 95:48(e5475) (2016)), e o volume de uma mancha de sangue seco pode precisar ser significativamente maior para certos tipos de avaliação (por exemplo, densidade óptica) em comparação com outros tipos de amostra,

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 29/77

24/59 como soro (Brandao et al., J. Clin. Virol., 57:98-102 (2013)). De fato, foi verificado que o uso tanto da triagem de mancha de sangue seco quanto de mancha de plasma para detecção de carga viral e falha de tratamento em pacientes com HIV recebendo terapia antirretroviral mostrou que ambas produziram uma alta taxa de falsos positivos (Sawadogo et al., J. Clin. Microbiol., 52(11):3878-83 (2014)).

[0059] O dispositivo de microamostragem utilizável nos métodos da presente tecnologia compreende uma ponta absorvente tendo uma extremidade distai e uma extremidade proximal. A largura da extremidade distai da ponta absorvente é estreita em comparação com a largura da extremidade proximal. A extremidade proximal é fixada a um suporte, enquanto a extremidade distai é configurada para contatar um fluido a ser absorvido, como sangue. O dispositivo de microamostragem permite que amostras de fluidos biológicos, como sangue, sejam facilmente secas, expedidas e, subsequentemente, analisadas. Em certas modalidades, o fluido biológico é sangue da picada na ponta do dedo.

[0060] Ação de absorção capilar puxa o sangue para a ponta absorvente. Uma barreira opcional entre a ponta absorvente e o suporte impede que o sangue passe ou escorra para o suporte. A ponta absorvente é composta de um material que absorve de modo capilar substancialmente o mesmo volume de fluido mesmo quando líquido em excesso está disponível (microamostragem absorvente volumétrica ou VAMS™). O volume da ponta absorvente afeta o volume de líquido absorvido. O tamanho e o formato da ponta absorvente podem ser variados de modo a ajustar o volume de sangue absorvido e a taxa de absorção. Volumes de sangue de cerca de 7-15 μΕ, cerca de 20 μΕ e até cerca de 30 μΕ podem ser aceitáveis. O tempo de amostragem pode ser de cerca de 2 segundos, cerca de 3 segundos, cerca de 5 segundos, ou até cerca de 10 segundos [0061] Em algumas modalidades, o material usado para a ponta

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 30/77

25/59 absorvente é hidrofílico (por exemplo, poliéster). Altemativamente, o material pode inicialmente ser hidrofóbico sendo, subsequentemente, tratado para tomar o mesmo hidrofílico. Matrizes hidrofóbicas podem ser tornadas hidrofílicas por vários métodos conhecidos, tais como tratamento com plasma ou tratamento com tensoativo (por exemplo, Tween-40 ou Tween-80) da matriz. Em algumas modalidades, o tratamento com plasma é usado para tomar hidrofílico um material hidrofóbico, tal como poliolefina, por exemplo, polietileno. Alternativamente, o enxerto de polímeros hidrofílicos na superfície e a funcionalização química de gmpos ativos na superfície com moléculas polares ou hidrofílicas, como açúcares, podem ser usados para obter uma superfície hidrofílica para a ponta absorvente. A modificação covalente também pode ser usada para adicionar gmpos funcionais polares ou hidrofílicos à superfície de ponta absorvente.

[0062] Em algumas modalidades, o dispositivo de microamostragem compreende uma ponta absorvente feita de um material polimérico hidrofílico de tamanho suficiente para absorver um máximo de cerca de 20 pL de sangue em cerca de 2-5 segundos, e tendo um comprimento inferior a cerca de 5 mm (0,2 polegadas) e uma área transversal inferior a cerca de 20 mm² e uma densidade menor que cerca de 4g/cm³. Em algumas modalidades, as pontas absorventes são compostas de polietileno e configuradas para absorver cerca de 1-20 microlitros de sangue, preferivelmente em 1-7 segundos, e mais preferivelmente em cerca de 1-5 segundos. A ponta absorvente pode conter um ou mais dentre sangue seco ou um padrão interno.

[0063] Em certas modalidades, as pontas absorventes têm um volume de cerca de 35 mm³, absorvem cerca de 13-14 microlitros de sangue em cerca de 3 segundos, absorvem 9-10 microlitros de sangue em cerca de 2,5 segundos, e tem um volume de poro de cerca de 38%. Em outras modalidades, as pontas absorventes têm um volume de cerca de 24 microlitros, uma densidade de cerca de 0,6 g/cm³, absorvem cerca de 10

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 31/77

26/59 microlitres de sangue em cerca de 2,5 segundos, e tem um volume de poro de cerca de 40%. Em algumas modalidades, o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®, como descrito em US 2013/0116597, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[0064] A ponta absorvente pode ser conformada com um exterior que se parece com um cone truncado com uma extremidade distai estreita e arredondada. Em algumas modalidades, o suporte tem um poste cilíndrico que se encaixa em um recesso dentro do centro da ponta absorvente e estendendose ao longo do eixo longitudinal da ponta absorvente e suporte. O formato cônica da ponta absorvente ajuda a absorver capilarmente a amostra de modo rápido e uniforme.

[0065] O suporte pode ser adaptado para uso com uma pipeta. Em algumas modalidades, um suporte de formato tubular cônico é preferido, com a ponta absorvente sobre a extremidade estreita do suporte. A extremidade oposta mais larga do suporte pode ser fechada ou aberta e oca, e pode opcionalmente ser configurada para se fixar a uma ponta de pipeta. O suporte pode ter flanges se estendendo para fora que estão dispostos para encontrar estruturas casadas nos suportes, prateleiras de secagem ou equipamentos de teste para ajudar posicionar a ponta absorvente nos locais desejados em tais suportes, prateleiras de secagem e equipamento de teste.

[0066] Em certas modalidades, o suporte pode incluir uma ponta de pipeta ou uma estrutura tubular afilada configurada para se aninhar em uma ponta de pipeta. A ponta absorvente pode ser composta de polietileno, e tanto a ponta absorvente com o suporte são feitos sob condições assépticas, ou são esterilizados terminalmente. A ponta absorvente pode conter anticoagulante seco. Em algumas modalidades, o suporte tem uma pluralidade de nervuras estendendo-se ao longo de um comprimento do suporte. As nervuras podem ter uma altura e comprimento selecionados para impedir a ponta absorvente de contatar as paredes de um recesso em que o suporte e ponta absorvente são

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 32/77

27/59 colocados para expedição, ou para a extração do sangue seco na ponta absorvente.

[0067] Após absorver uma amostra de volume pequeno, a ponta absorvente é, então, seca. Em algumas modalidades, a amostra de sangue de volume pequeno é seca durante pelo menos 10 minutos, pelo menos 20 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 40 minutos, pelo menos 50 minutos, pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 3 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 5 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 16 horas, pelo menos 20 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas, ou pelo menos 96 horas, ou pelo menos 1 semana, ou pelo menos 2 semanas, ou pelo menos 3 semanas, ou pelo menos 4 semanas, ou pelo menos 1 mês em temperatura ambiente ou do local. Em certas modalidades, a amostra de sangue de volume pequeno é seca por cerca de 2-3 horas.

[0068] A secagem pode ser feita em uma prateleira ou suporte apropriado, ou preferivelmente a ponta absorvente e o suporte podem ser transferidos para um recipiente de secagem especial configurado para facilitar a secagem enquanto minimizando o contato entre a ponta absorvente e as paredes do recipiente de secagem ou outras superfícies potencialmente contaminantes. O recipiente de secagem pode ter um dessecante para facilitar a secagem. O recipiente de secagem também pode fornecer uma cobertura de proteção que pode ser vedada para transporte de modo a evitar contaminação. Em algumas modalidades, a cobertura tem uma superfície sobre a qual podem ser escritas indicações impressas para identificar a fonte da amostra de sangue seco e fornecer outras informações relevantes. Em algumas modalidades, as dimensões do recipiente, e as posições relativas dos suportes dentro do recipiente, estarão em conformidade com as especificações da placa SBS Microwell. O dispositivo de microamostragem e o recipiente de secagem podem ser colocados em um saco plástico junto com um dessecante para

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 33/77

28/59 auxiliar a secagem e pode ser expedido deste modo ou enviado após o dessecante ser removido.

[0069] Em algumas modalidades, a extremidade oposta mais larga do suporte é oca e o recipiente tem uma primeira porção com uma porção de projeção de montagem dimensionada para se ajustar e encaixar de modo liberável a extremidade oca do suporte. De modo adicional ou alternativo, o recipiente tem uma segunda porção presa de modo liberável na primeira porção e tem um recesso configurado para encerrar uma parte do suporte para transporte do suporte. O recipiente pode compreender uma pluralidade de aberturas permitindo que o ar tenha acesso à ponta absorvente do dispositivo de microamostragem. Além disso, a primeira porção pode ter um lado com uma abertura de acesso de tamanho suficiente e localizada de modo que as indicações possam ser aplicadas através da abertura e no suporte quando o suporte está na projeção de montagem.

[0070] Após recepção no local de teste, a ponta absorvente pode ser eluída em um volume predeterminado de um tampão apropriado (como aqui descrito), quer manualmente ou por meio de meios automatizados para extrair os ácidos nucleicos ou proteínas de interesse a partir de sangue seco. Técnicas de agitação física, como sonicação ou sob vórtice, do fluido e/ou da ponta absorvente podem acelerar o processo de extração do sangue seco em uma matriz de amostra líquida. Técnicas de separação física como centrifugação, evaporação/reconstituição, concentração, precipitação, extração líquido/ líquido e extração em fase sólida podem ser usadas para simplificar adicionalmente a matriz de amostra para análise adicional.

[0071] Cada recipiente pode incluir uma pluralidade de suportes, em que cada suporte compreende uma ponta absorvente em sua extremidade distai e tem uma extremidade proximal oca. Do mesmo modo, o recipiente tem uma pluralidade de projeções de montagem alongadas, cada uma dimensionada para se ajustar em e engatar de modo liberável as extremidades

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 34/77

29/59 ocas da pluralidade de suportes. A segunda porção do recipiente tem recessos configurados para encerrar, separadamente, cada um dentre a pluralidade de suportes em um compartimento separado dentro do recipiente. Em certas modalidades, cada um dentre a pluralidade de suportes tem uma pluralidade de nervuras que se estendem ao longo de um comprimento do suporte com as nervuras configuradas para evitar a ponta absorvente de contatar as paredes do recipiente. Como desejado, um dessecante pode ser colocado dentro do recipiente para ajudar a secar o sangue na ponta absorvente ou manter secura. Cada suporte pode ter indicações ou sinais visíveis associando o suporte ao recipiente e com pelo menos um outro suporte, como números de série com várias porções do número indicando suportes/pontas absorventes relacionados e o recipiente em que os suportes são expedidos.

PCR em tempo real [0072] Amplificação de ácidos nucleicos alvo (por exemplo, RNA de HCV) pode ser detectada por qualquer um de vários métodos bem conhecidos na técnica, como eletroforese em gel, cromatografia em coluna, hibridização com uma sonda, sequenciamento, análise de curva de fusão ou detecção em “tempo real”.

[0073] Para detecção em tempo real, iniciadores e/ou sondas podem ser rotulados de modo detectável para permitir diferenças em fluorescência quando os iniciadores se tomam incorporados ou quando as sondas são hibridizadas, por exemplo, e amplificados em um instrumento capaz de monitorar a mudança em fluorescência durante a reação. Métodos de detecção em tempo real para a amplificação de ácidos nucleicos são bem conhecidos e incluem, por exemplo, o sistema TaqMan®, o sistema de iniciador Scorpion™ e o uso de corantes intercalantes para ácido nucleico de filamento duplo.

[0074] Em PCR quantitativa em tempo real, o acúmulo do produto de amplificação é medido continuamente em ambas as diluições padrão do DNA alvo e amostras contendo quantidades desconhecidas de DNA alvo. Uma

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 35/77

30/59 curva padrão é construída correlacionando a concentração inicial do gabarito nas amostras padrão com o número de ciclos de PCR™ (Ct) necessários para produzir uma concentração limiar específica do produto. Nas amostras de teste, o acúmulo do produto alvo PCR™ é medido após o mesmo Ct, que permite a interpolação da concentração de DNA alvo da curva padrão.

[0075] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos amplificados são detectados por hibridização com uma sonda específica. Oligonucleotídeos de sonda, complementares a uma porção da sequência alvo amplificada, podem ser usados para detectar fragmentos amplificados. Em algumas modalidades, hibridização pode ser detectada em tempo real. Em uma modalidade alternativa, hibridização não é detectada em tempo real. Ácidos nucleicos amplificados para cada uma das sequências alvo podem ser detectados simultaneamente (isto é, no mesmo vaso de reação tal como PCR multiplex) ou individualmente (isto é, em recipientes de reação separados). Em certas modalidades, ácidos nucleicos alvos múltiplos são detectados simultaneamente, usando duas ou mais sondas de oligonucleotídeos específicas para o gene distintamente marcadas (por exemplo, por meio de diferentes porções detectáveis, como a cor), sendo um que hibridiza para a primeira sequência alvo e a outra que hibridiza para a segunda sequência alvo. [0076] Em algumas modalidades, os diferentes pares de iniciadores são rotulados com diferentes porções detectáveis distinguíveis. Assim, por exemplo, os corantes fluorescentes HEX e FAM podem estar presentes em diferentes pares de iniciadores em PCR multiplex e associados com os amplicons resultantes. Em outras modalidades, o iniciador dianteiro é rotulado com uma porção detectável, enquanto que o iniciador reverso é rotulado com uma porção detectável diferente, por exemplo, corante FAM para um iniciador dianteiro e corante HEX para um iniciador reverso. O uso de diferentes porções detectáveis é utilizável para discriminar entre produtos amplificados que tenham o mesmo comprimento ou muito similares em

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 36/77

31/59 comprimento.

[0077] Para ácidos nucleicos modificados na sequência, o alvo pode ser selecionado independentemente da fita superior ou da fita inferior. Assim, todos os alvos a serem detectados podem compreender fita superior, fita inferior ou uma combinação de alvos da fita superior e da fita inferior.

[0078] Um método geral para PCR em tempo real usa sondas fluorescentes, como sondas TaqMan®, balizas moleculares e sondas de iniciadores Scorpion. PCR em tempo real quantifica a quantidade inicial do gabarito com mais especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade, do que outras formas de PCR quantitativo, que detectam a quantidade de produto final amplificado. PCR em tempo real não detecta o tamanho do amplicon. As sondas empregadas em tecnologias Scorpion™ e TaqMan® são baseadas no princípio de extinção de fluorescência e envolvem um fluoróforo doador e uma porção de extinção.

[0079] PCR em tempo real é realizada usando qualquer instrumento apropriado capaz de detectar o acúmulo do produto de amplificação por PCR. Mais comumente, o instrumento é capaz de detectar a fluorescência de um ou mais rótulos fluorescentes. Por exemplo, detecção em tempo real no instrumento (por exemplo, um detector de sequência ABI Real Time PCR System 7500) monitora a fluorescência e calcula a medida do sinal repórter, ou valor de Rn, durante cada ciclo de PCR. O ciclo de limiar, ou valor Ct, é o ciclo no qual a fluorescência intersecciona o valor de limiar. O valor de limiar pode ser determinado pelo software do sistema de detecção de sequência ou manualmente.

[0080] Em algumas modalidades, as sondas empregadas são marcadas de forma detectável e a detecção é obtida pela detecção do rótulo da sonda para cada produto de amplificação. Um extintor pode ser associado adicionalmente com o rótulo detectável que evita a detecção da etiqueta antes da amplificação do alvo da sonda. As sondas TaqMan® são exemplos de tais

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 37/77

32/59 sondas.

[0081] Sondas TaqMan® (Heid et al., Genome Res. 6: 986-994, 1996) usam a atividade de 5’ exonuclease fluorogênica de polimerase Taq para medir a quantidade de sequências alvo em amostras de DNA. Sondas TaqMan® são oligonucleotídeos que contêm um fluoróforo doador geralmente na base 5’ ou próximo da mesma, e a porção de extinção tipicamente na ou próximo da base 3’. A porção de extinção pode ser um corante como TAMRA ou pode ser uma molécula não fluorescente como ácido 4-(4-dimetilamino fenilazo) benzóico (DABCYL). Ver Tyagi et al., 16 Nature Biotechnology 49-53 (1998). Quando irradiado, o doador fluorescente excitado transfere energia para a porção de extinção próxima por FRET em vez de fluorescência. Assim, a proximidade íntima do doador e do extintor evita a emissão de fluorescência do doador enquanto a sonda está intacta.

[0082] Sondas TaqMan® são projetadas para se anelar a uma região interna de um produto PCR. Quando a polimerase replica um gabarito no qual uma sonda TaqMan® é ligada, sua atividade de exonuclease 5’ cliva a sonda. Isto termina a atividade do extintor (sem FRET) e o fluoróforo doador começa a emitir fluorescência que aumenta em cada ciclo proporcional à taxa de clivagem da sonda. O acúmulo do produto de PCR é detectado monitorando o aumento da fluorescência do corante repórter. Se o extintor é um fluoróforo receptor, então o acúmulo do produto de PCR pode ser detectado monitorando a diminuição na fluorescência do fluoróforo receptor.

[0083] Em certas modalidades, PCR em tempo real é realizada usando um sistema de detecção de iniciador-sonda bifuncional (por exemplo, os iniciadores Scorpion ™). Com iniciadores Scorpion, a iniciação específica da sequência e a detecção do produto de PCR é obtida usando uma única molécula. O iniciador Scorpion mantém uma configuração “haste-alça” no estado não hibridizado. O fluoróforo está fixado à extremidade 5’ e é extinto por uma porção acoplada à extremidade 3’, apesar de que, em certas

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 38/77

33/59 modalidades, este arranjo pode ser comutado. A porção 3’ da haste e/ou alça também contém sequência que é complementar ao produto de extensão do iniciador e está ligada à extremidade 5’ de um iniciador específico por meio de um monômero não amplificável. Após extensão da porção iniciadora, a sequência sonda específica é capaz de se ligar ao seu complemento dentro do amplicon estendido, abrindo assim a alça do grampo-de-cabelo. Isso impede que a fluorescência seja extinta e um sinal é observado. Um alvo específico é amplificado pelo iniciador reverso e a porção de iniciador do iniciador Scorpion®, resultando em um produto de extensão. E gerado um sinal fluorescente devido à separação do fluoróforo do extintor resultante da ligação do elemento sonda do iniciador Scorpion® ao produto de extensão.

[0084] Em algumas modalidades, as sondas empregadas nos métodos descritos compreendem ou consistem em sequências de DNA rotuladas com fluorescência curta, projetadas para detectar seções da sequência de DNA com uma variação genética, como as descritas em French et al., Mol Cell Probes, 5(6):363-74 (2001), incorporado por referência aqui na sua totalidade. HyBeacons® são um exemplo desse tipo de sonda.

[0085] Em algumas modalidades do método, pelo menos um iniciador de cada par de iniciadores ou pelo menos uma sonda na reação de amplificação compreende uma porção detectável. Alternativamente, a porção detectável pode estar em uma sonda que está fixada ao iniciador, como com uma sonda de iniciador. Em algumas modalidades, a porção ou rótulo detectável é um fluoróforo. Unidades fluorescentes apropriadas incluem, mas não estão limitados aos seguintes fluoróforos: ácido 4-acetamido-4’isotiocianatostilbeno-2,2’ dissulfônico, acridina e derivados (acridina, isotiocianato de acridina), Alexa Fluors (Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647 (Sondas Moleculares)), ácido 5-(2’aminoetil)aminonaftaleno-l-sulfônico (EDANS), 4-amino-N-[3Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 39/77

34/59 vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 dissulfonato (amarelo Lucifer VS), N-(4anilino-l-naftil)maleimida, antranilamida, BODIPY® R-6G, BOPIPY® 530/550, BODIPY® FL, amarelo brilhante, Cal Fluor Red 610® (CFR610), coumarina e derivados (coumarina, 7-amino-4-metilcoumarina (AMC, Coumarina 120), 7-amino-4-trifluorometilcouluarina (Coumarina 151)), Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, cianosina, 4’,6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), 5’, 5”-dibromopirogalol-sulfonaftaleína (vermelho Bromopirogalol), 7-dietilamino-3-(4’-isotiocianatofenil)-4-metilcoumarina, pentaacetato de dietilenotriamina, ácido 4,4’ -di-isotiocianatodi-hidro-stilbeno-2,2 ’ dissulfônico, ácido 4,4’-di-isotiocianatostilbeno-2,2’-dissulfônico, cloreto de 5-[dimetilamino] naftaleno-l-sulfonila (DNS, cloreto de dansila), ácido 4-(4’dimetilaminofenilazo)benzóico (DAB CYL), 4-dimetilaminofenilazofenil-4 ’ isotiocianato (DABITC), Eclipse T_m (Epoch Biosciences Inc.), eosina e derivados (eosina, isotiocianato de eosina), eritrosina e derivados (eritrosina B, isotiocianato de eritrosina), etídio, fluoresceína e derivados (5carboxifluoresceina (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il) aminofluoresceina (DTAF), 2’,7’-dimetoxi-4’5’-dicloro-6-carboxifluoresceina (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), hexacloro-6carboxifluoresceina (HEX), QFITC (XRITC), tetraclorofluoresceína (TET), fluorescamina, IR144, IR1446, fósforos de lantamida, isotiocianato de verde malaquita, 4-metilumbeliferona, orto cresolftaleina, nitrotirosina, pararosanilina, vermelho fenol, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, aloficocianina, o-ftaldialdeido, Oregon Verde®, iodeto de propídio, pireno e derivados (pireno, butirato de pireno, sucinimidil 1-butirato de pireno), QSY® 7, QSY® 9, QSY® 21, QSY® 35 (Sondas Moleculares), vermelho reativo 4 (Cibacron® vermelho brilhante 3B-A), rodamina e derivados (6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), lissamina rodamina B cloreto de sulfonila, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina-verde, isotiocianato de rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101, derivado de cloreto de

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 40/77

35/59 sulfonila de sulforodamina 101 (vermelho texas), N,N,N',N'-tetrametil-6carboxirodamina (TAMRA), tetrametil rodamina, isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC), riboflavina, ácido rosólico, derivados de quelato de térbio, Quasar 670®, e VIC®.

[0086] Os extintores apropriados são selecionados com base no espectro de fluorescência do fluoróforo particular. Os extintores utilizáveis incluem, por exemplo, os extintores Black Hole™ BHQ-1, BHQ 2, e BHQ-3 (Biosearch Technologies, Inc.), e a série ATTO de extintores (ATTO 540Q, ATTO 580Q, e ATTO 612Q; Atto-Tec GmbH).

Métodos alternativos de detecção de ácidos nucleicos alvo [0087] Altemativamente, a detecção dos ácidos nucleicos alvo (por exemplo, RNA de HCV) pode ocorrer medindo o ponto final da reação. Na detecção do ponto final, o(s) produto(s) amplificado(s) pode(m) ser detectado(s) em primeiro lugar pela separação do tamanho dos amplicons e, então, detectando os amplicons separados por tamanho. A separação de amplicons de tamanhos diferentes pode ser realizada por eletroforese em gel, cromatografia em coluna, eletroforese capilar ou outros métodos de separação conhecidos na técnica.

[0088] O rótulo detectável pode ser incorporado em, associado com ou conjugado a um ácido nucleico. O rótulo detectável pode ser fixado por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estereoquímico em potencial ou impacto sobre outras propriedades úteis ou desejadas. Ver, por exemplo, Mansfield, 9 Mol. Cell. Probes 145-156 (1995). Rótulos detectáveis podem ser incorporados em ácidos nucleicos por meios covalentes ou não covalentes, por exemplo, por transcrição, como através de rotulação aleatória de iniciador, usando polimerase Klenow, ou tradução nick, ou amplificação, ou equivalente, tal como é conhecido na técnica. Por exemplo, uma base de nucleotídeo é conjugada com uma porção detectável, tal como um corante fluorescente e, então, incorporada em ácidos nucleicos

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 41/77

36/59 durante a síntese ou amplificação de ácidos nucleicos.

[0089] Exemplos de outras etiquetas úteis que auxiliam na detecção de ácidos nucleicos alvo incluem radioisótopos (por exemplo, ³²P, ³⁵S, ³H, ¹⁴C, ¹²⁵1,¹³¹I), reagentes densos em elétrons (por exemplo, ouro), enzimas (por exemplo, peroxidase de raiz-forte, beta-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), rótulos colorimétricos (por exemplo, ouro coloidal), rótulos magnéticos (por exemplo, Dynabeads ™), biotina, dioxigenina ou haptenos e proteínas para as quais antissoros ou anticorpos monoclonais estão disponíveis. Outros rótulos incluem ligantes ou oligonucleotídeos capazes de formar um complexo com o receptor correspondente ou complemento de oligonucleotídeo, respectivamente. O rótulo pode ser diretamente incorporado no ácido nucleico a ser detectado, ou pode ser fixado a uma sonda (por exemplo, um oligonucleotídeo) ou anticorpo que hibridiza ou se liga ao ácido nucleico a ser detectado.

[0090] Em outras modalidades, análogos fluorescentes de nucleotídeos podem ser usados para marcar os ácidos nucleicos, ver, por exemplo, Jameson, Methods. Enzymol. 278: 363-390 (1997); Zhu, Nucl. Acids Res. 22: 3418-3422 (1994). Patentes US 5.652.099 e 6.268.132 também descrevem análogos de nucleosídeos para incorporação nos ácidos nucleicos, por exemplo, DNA e/ou RNA, ou oligonucleotídeos, por meio de qualquer síntese enzimática ou química para produzir oligonucleotídeos fluorescentes. Patente US 5.135.717 descreve reagentes ftalocianina e tetrabenztriazaporfirina para uso como rótulos fluorescentes.

[0091] Em algumas modalidades, sondas rotuladas de forma detectável podem ser usadas em testes de hibridização incluindo, mas não limitados a Northern blots, Southern blot, microarray, dot ou slot blots, e testes de hibridização in situ tais como hibridização fluorescente in situ (FISH) para detectar uma sequência de ácido nucleico alvo dentro de uma amostra biológica. Certas formas de realização podem empregar métodos de

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 42/77

37/59 hibridização para medir a expressão de um produto de gene de polinucleotídeo, como mRNA. Métodos para a realização de testes de hibridização de polinucleotídeos foram bem desenvolvidos na técnica. Os procedimentos e condições do teste de hibridização variam em função da aplicação e são selecionados de acordo com os métodos gerais de ligação conhecidos, incluindo os mencionados em: Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a. ed. Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Berger e Kimmel Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., San Diego, Calif, 1987); Young e Davis, PNAS. 80: 1194(1983).

Testes de detecção de HCV da presente tecnologia [0092] Métodos aqui previstos são para detectar vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico seco compreendendo isolar RNA de HCV da amostra eluída de fluido biológico seco de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem (por exemplo, ponta MITRA®) com um tampão de lise. Em algumas modalidades, o RNA de HCV é detectado usando transcrição reversa e PCR em tempo real. Em certas modalidades, o tampão de lise compreende isotiocianato de guanidina e, opcionalmente, βmercaptoetanol.

[0093] Também são descritos aqui métodos para detectar vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico seco compreendendo isolar um anticorpo anti-HCV da amostra eluída de fluido biológico seco de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem (por exemplo, ponta MITRA®) com uma solução de tampão compreendendo BSA a 0,5%. Em algumas modalidades, a solução de tampão compreende adicionalmente solução salina de tampão fosfato. Em certas modalidades, o anticorpo antiHCV se liga a um antígeno de HCV selecionado a partir do grupo que consiste em c22-3, c200, e NS5. O anticorpo anti-HCV pode ser detectado usando teste imunossorvente ligado a enzima (ELISA).

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 43/77

38/59 [0094] Em um aspecto, a presente tecnologia fornece um método para detectar vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico seco compreendendo (a) extrair ácidos ribonucleicos da amostra eluída de fluido biológico seco de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem; (b) transcrever de modo reverso os ácidos ribonucleicos extraídos para gerar uma pluralidade de complexos de hibridização cDNA:RNA; (c) amplificar os complexos de hibridização cDNA:RNA com um par de iniciadores que especificamente hibridiza para 5’ UTR do genoma de HCV para produzir amplicons de HCV; e (d) detectar HCV na amostra de fluido biológico seco quando amplicons de HCV produzidos na etapa (c) são detectados. Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco é plasma seco, soro seco, ou sangue total seco. O genótipo de HCV presente na amostra de fluido biológico seco pode ser um ou mais genótipos selecionados dentre o grupo que consiste em Genótipo la, Genótipo 1b, Genótipo 2a, Genótipo 2b, Genótipo 2c, Genótipo 2d, Genótipo 3a, Genótipo 3b, Genótipo 3c, Genótipo 3d, Genótipo 3e, Genótipo 3f, Genótipo 4a, Genótipo 4b, Genótipo 4c, Genótipo 4d, Genótipo 4e, Genótipo 4f, Genótipo 4g, Genótipo 4h, Genótipo 4i, Genótipo 4j, Genótipo 5a, e Genótipo 6a. Em certas modalidades, a amostra de fluido biológico seco é isolada de um paciente apresentando sinais ou sintomas de hepatite, ou um paciente em risco de infecção por HCV. Em algumas modalidades, os complexos de hibridização cDNA:RNA são amplificados com Z05 ou Z05D DNA polimerases.

[0095] De modo adicional ou alternativo, em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco na ponta absorvente do dispositivo de microamostragem é coletada do paciente por meio de picada na ponta do dedo. Em certas modalidades, o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®. Eluição da amostra de fluido biológico seco pode ser realizada por contato da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem com um tampão de lise. Em algumas modalidades, o tampão de lise compreende

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 44/77

39/59 isotiocianato de guanidina e, opcionalmente, β-mercaptoetanol. De modo adicional ou alternativo, em algumas modalidades, eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada por contato da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem com o tampão de lise durante pelo menos 30 minutos a 37°C. Em algumas modalidades, o volume da amostra do dispositivo de microamostragem não é maior que 30 pL, não maior que 25 pL, não maior que 20 pL, não maior que 15 pL, ou não maior que 10 pL. Adicionalmente, foi determinado que RNA de HCV em amostras de fluido biológico seco eluído das pontas MITRA® permaneceu estável, mesmo quando a eluição foi realizada 1 mês após a coleta por meio de picada na ponta do dedo. Este resultado foi inesperado porque os métodos da presente tecnologia não implicam pré-tratamento das pontas MITRA® com aditivos como ureia, sais, quelantes ou inibidores de RNase, de modo a prevenir a degradação do RNA.

[0096] Em certas modalidades, o método compreende adicionalmente contatar os complexos de hibridização cDNA:RNA com uma sonda detectavelmente rotulada. Em algumas modalidades, o rótulo detectável é um repórter fluorescente selecionado a partir do grupo que consiste em ácido 4acetamido-4’-isotiocianatostilbeno-2,dissulfônico, acridina e derivados (acridina, isotiocianato de acridina), Alexa Fluors (Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647 (Sondas Moleculares)), ácido 5-(2’aminoetil)aminonaftaíeno-l-suífônico (EDANS), 4-amino-N-[3vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 dissulfonato (amarelo Lucifer VS), N-(4anilino-l-naftil)maleimida, antranilamida, BODIPY® R-6G, BOPIPY® 530/550, BODIPY® FL, amarelo brilhante, Cal Fluor Red 610® (CFR610), coumarina e derivados (coumarina, 7-amino-4-metilcoumarina (AMC, Coumarina 120), 7-amino-4-trifluorometilcouluarina (Coumarina 151)), Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, cianosina, 4’,6-diaminidino-2-fenilindol

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 45/77

40/59 (DAPI), 5’, 5”-dibromopirogalol-sulfonaftaleína (vermelho Bromopirogalol), 7-dietilamino-3-(4’-isotiocianatofenil)-4-metilcoumarina, pentaacetato de dietilenotriamina, ácido 4,4’ -di-isotiocianatodi-hidro-stilbeno-2,2 ’ dissulfônico, ácido 4,4’-di-isotiocianatostilbeno-2,2’-dissulfônico, cloreto de 5-[dimetilamino]naftaleno-l-sulfonila (DNS, cloreto de dansila), ácido 4-(4’dimetilaminofenilazo)benzóico (DAB CYL), 4-dimetilaminofenilazofenil-4 ’ isotiocianato (DABITC), Eclipse T_m (Epoch Biosciences Inc.), eosina e derivados (eosina, isotiocianato de eosina), eritrosina e derivados (eritrosina B, isotiocianato de eritrosina), etídio, fluoresceína e derivados (5carboxifluoresceina (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceina (DTAF), 2’,7’-dimetoxi-4’5’-dicloro-6-carboxifluoresceina (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), hexacloro-6carboxifluoresceina (HEX), QFITC (XRITC), tetraclorofluoresceína (TET), fluorescamina, IR144, IR1446, fósforos de lantamida, isotiocianato de verde malaquita, 4-metilumbeliferona, orto cresolftaleina, nitrotirosina, pararosanilina, vermelho fenol, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, aloficocianina, o-ftaldialdeido, Oregon Verde®, iodeto de propidio, pireno e derivados (pireno, butirato de pireno, sucinimidil 1-butirato de pireno), QSY® 7, QSY® 9, QSY® 21, QSY® 35 (Sondas Moleculares), vermelho reativo 4 (Cibacron® vermelho brilhante 3B-A), rodamina e derivados (6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), lissamina rodamina B cloreto de sulfonila, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina-verde, isotiocianato de rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101, derivado de cloreto de sulfonila de sulforodamina 101 (vermelho texas), N,N,N',N'-tetrametil-6carboxirodamina (TAMRA), tetrametil rodamina, isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC), riboflavina, ácido rosólico, derivados de quelato de térbio, Quasar 670®, e VIC®.

[0097] Em qualquer uma das modalidades acima, a carga viral de HCV na amostra de fluido biológico seco é pelo menos 1-5 lU/mL, pelo

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 46/77

41/59 menos 5-10 lU/mL, pelo menos 10-15 lU/mL, pelo menos 15-20 lU/mL, pelo menos 20-40 lU/mL, pelo menos 40-60 lU/mL, pelo menos 60-80 lU/mL, pelo menos 80-100 lU/mL, pelo menos 100-150 lU/mL, pelo menos 150-200 lU/mL, pelo menos 200-250 lU/mL, pelo menos 250-300 lU/mL, pelo menos 300-350 lU/mL, pelo menos 350-400 lU/mL, pelo menos 400-500 lU/mL, pelo menos 500-600 lU/mL, pelo menos 600-700 lU/mL, pelo menos 700800 lU/mL, pelo menos 800-850 lU/mL, pelo menos 850 lU/mL, ou pelo menos 900 lU/mL.

[0098] Em outro aspecto, a presente descrição fornece um método para detectar vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico seco compreendendo (a) eluir uma amostra de fluido biológico seco a partir de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem; e (b) detectar HCV na amostra de fluido biológico seco quando um anticorpo antiHCV para pelo menos um antígeno codificado de HCV é detectado na amostra eluída de fluido biológico seco. Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco é plasma, soro ou sangue total. O genótipo de HCV presente na amostra de fluido biológico seco pode ser um ou mais genótipos selecionados dentre o grupo que consiste em Genótipo la, Genótipo 1b, Genótipo 2a, Genótipo 2b, Genótipo 2c, Genótipo 2d, Genótipo 3a, Genótipo 3b, Genótipo 3c, Genótipo 3d, Genótipo 3e, Genótipo 3f, Genótipo 4a, Genótipo 4b, Genótipo 4c, Genótipo 4d, Genótipo 4e, Genótipo 4f, Genótipo 4g, Genótipo 4h, Genótipo 4i, Genótipo 4j, Genótipo 5a, e Genótipo 6a. Em certas modalidades, a amostra de fluido biológico seco é isolada de um paciente apresentando sinais ou sintomas de hepatite, ou um paciente em risco de infecção por HCV. Em algumas modalidades, o pelo menos um antígeno codificado de HCV é selecionado a partir do grupo que consiste em c22-3, c200, eNS5.

[0099] De modo adicional ou alternativo, em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco na ponta absorvente do dispositivo de

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 47/77

42/59 microamostragem é coletada do paciente por meio de picada na ponta do dedo. Em certas modalidades, o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®. Eluição da amostra de fluido biológico seco pode ser realizada por contato da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem com uma mistura compreendendo solução salina de tampão fosfato e BS A a 0,5%. Em certas modalidades, eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada por contato da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem com a mistura compreendendo solução salina de tampão fosfato e BS A a 0,5% durante pelo menos 2 horas em temperatura ambiente, ou durante a noite a 28°C. Em algumas modalidades, o volume da amostra do dispositivo de microamostragem não é maior que 30 pL, não maior que 25 pL, não maior que 20 pL, não maior que 15 pL, ou não maior que 10 pL.

[00100] Embora deva ser entendido que, para os fins dos métodos descritos, a amostra de fluido biológico pode compreender plasma, soro ou sangue total, os versados na técnica saberão que, em alguns casos, um tipo de amostra pode ser preferido em relação a outro. Por exemplo, amostras de sangue total hemolisadas em bruto podem causar interferências em imunotestes que poderíam comprometer os resultados do teste (Schiettecatta et al., Interferences in Immunoassays in Advances in Immunoassay Technology, (Norman H.L. Chiu ed. 2012). Assim, ao realizar certos imunotestes, plasma ou soro podem ser preferidos ao sangue total. No entanto, como mostrado nos resultados na Tabela 3 abaixo, as amostras de sangue total são estáveis mesmo após o armazenamento em temperatura ambiente quando a amostra foi coletada usando um dispositivo de microamostragem.

Tratamento para infecção por HCV [00101] São aqui descritos métodos para determinar se um paciente irá se beneficiar de tratamento com agentes terapêuticos que inibem HCV.

[00102] Exemplos de agentes terapêuticos que inibem HCV incluem

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 48/77

43/59 interferon alfacon-1, interferon peguilado e/ou não peguilado alfa-2b, peginterferon alfa-2a, ribavirina, telaprevir, boceprevir, sofosbuvir, simeprevir, daclatasvir, velpatasvir, ombitasvir, paritaprevir, ritonavir, dasabuvir, ledipasvir, elbasvir, danoprevir, grazoprevir, GS-7977, βinterferon, γ-interferon, amantadina, 3TC (também conhecido como enantiômero (-) do análogo nucleosídeo citosina-l,3-oxatiolano), e inibidores que alvo-direcionam o ciclo de vida do HCV, incluindo, mas não limitados a, helicase, polimerase, metaloprotease ou sítio de entrada do ribossoma interno (IRES).

[00103] Exemplos de inibidores que alvo-direcionam o ciclo de vida do HCV incluem carboxamidas substituídas por heterocíclicos (descritas na Patente US 5.633.388.) que interferem com a atividade helicase da proteína NS3; a fenantrenoquinona relatada em Chu et al., Tet. Lett. 7229-7232 (1996), que inibe a NS3 protease de HCV in vitro', análogos de morfolinilcarbonilbenzoil-peptídeo (WO 1995/33764); análogos de peptídeos baseados em substrato NS5A/5B (WO 1998/17679); derivados de tiazolidina (BrownDriver et al., Antiviral Research 30(1), A23 (1996)) que inibem a protease de HCV; e outros inibidores de peptídeos da NS3 protease de HCV (Steinkuhler et al., Biochemistry 37:8899-8905 (1998); Ingallinella et al., Biochemistry 37:8906-8914 (1998)).

[00104] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para selecionar um paciente com sintomas de hepatite para tratamento com pelo menos um agente terapêutico que inibe a infecção por HCV compreendendo (a) eluir uma amostra de sangue seco sob condições que resultam na liberação de ácidos ribonucleicos de células de sangue, em que a amostra de sangue seco é coletada do paciente com um dispositivo de microamostragem; (b) isolar ácidos ribonucleicos da amostra eluída de sangue seco; (c) transcrever de modo reverso os ácidos ribonucleicos isolados para gerar uma pluralidade de complexos de hibridização cDNA:RNA; (d) amplificar os complexos de

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 49/77

44/59 hibridização cDNA:RNA com um par de iniciadores que especificamente hibridiza para o 5’ UTR do genoma de HCV para produzir amplicons de HCV fluorescentemente rotulados; (e) detectar os amplicons de HCV fluorescentemente rotulados produzidos na etapa (d); e (f) selecionar o paciente para tratamento com um agente terapêutico que inibe a infecção por HCV, se os amplicons de HCV fluorescentemente rotulados forem detectados.

[00105] De modo adicional ou alternativo, em um aspecto, a presente descrição fornece um método para selecionar um paciente apresentando sintomas de hepatite para tratamento com um agente terapêutico que inibe a infecção por HCV compreendendo (a) eluir uma amostra de sangue seco com uma solução de tampão compreendendo BS A a 0,5%, em que a amostra de sangue seco é coletada do paciente com um dispositivo de microamostragem; (b) detectar um anticorpo anti-HCV para pelo menos um antígeno codificado de HCV na amostra eluída de sangue seco; e (c) selecionar o paciente para tratamento com um agente terapêutico que inibe a infecção por HCV, se o anticorpo anti-HCV for detectado. Em algumas modalidades, o pelo menos um antígeno codificado de HCV é selecionado a partir do grupo que consiste em c22-3, c200, e NS5. Em algumas modalidades, a solução de tampão compreende adicionalmente solução salina de tampão fosfato.

[00106] Em qualquer uma das modalidades acima, o agente terapêutico que inibe a infecção por HCV é um ou mais agentes selecionados dentre o grupo que consiste em interferon alfacon-1, interferon peguilado e/ou não peguilado alfa-2b, peginterferon alfa-2a, ribavirina, telaprevir, boceprevir, sofosbuvir, simeprevir, daclatasvir, velpatasvir, ombitasvir, paritaprevir, ritonavir, dasabuvir, ledipasvir, elbasvir, danoprevir, grazoprevir, GS-7977, βinterferon, γ-interferon, amantadina, 3TC, e inibidores que alvo -direcionam o ciclo de vida do HCV. Em qualquer uma das modalidades acima, o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®.

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 50/77

45/59 [00107] Em certas modalidades, o HCV na amostra de sangue seco tem pelo menos um Genótipo selecionado a partir do grupo que consiste em Genótipo la, Genótipo 1b, Genótipo 2a, Genótipo 2b, Genótipo 2c, Genótipo 2d, Genótipo 3a, Genótipo 3b, Genótipo 3c, Genótipo 3d, Genótipo 3e, Genótipo 3f, Genótipo 4a, Genótipo 4b, Genótipo 4c, Genótipo 4d, Genótipo 4e, Genótipo 4f, Genótipo 4g, Genótipo 4h, Genótipo 4i, Genótipo 4j, Genótipo 5 a, e Genótipo 6a.

[00108] Sintomas da hepatite incluem, mas não se limitam a sintomas similares aos da gripe, dores articulares e musculares, erupção cutânea leve, perda de apetite, dor abdominal, urina escura, fezes de cor cinza, icterícia, doença hepática crônica, crioglobulinemia, dor e sensibilidade na área do fígado, febre, perda de peso, depressão e fadiga. Os pacientes com risco de contrair HCV incluem aqueles expostos a sangue infeccioso ou produtos de sangue, receptores de transfusão sanguínea, receptores de transplantes de órgãos anteriores a 1992, pacientes com HIV, pacientes de hemodiálise de longo prazo, indivíduos com histórico de atividade sexual sem proteção, indivíduos com tatuagens e piercings corporais, pacientes apresentando sinais ou sintomas de doença hepática, usuários de drogas ilícitas e pacientes com mães infectadas pelo HCV.

[00109] A quantificação de RNA de HCV para medir as cargas virais de linha de base e para monitoramento do tratamento tem sido bem estabelecida na demonstração da eficácia da resposta antiviral a alguns regimes terapêuticos de combinação (McHutchison JG et al., N Engl J Med 339:1485-1492 (1998); Davis GL et al., NEngl JMed 339:1493-1499 (1998); Manns MP et al., Lancet 358:958-965 (2001); Fried MW et al., NEngl J Med 347:975-982 (2002); Hadziyannis SJ et al., Ann Intern Med 140:346-355 (2004)). As diretrizes atuais para a gestão e tratamento de HCV recomendam testes quantitativos para RNA de HCV antes do início da terapia antiviral, durante a terapia (terapia guiada por resposta) e geralmente 12 a 24 semanas

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 51/77

46/59 após o término do tratamento. A falha em obter resposta virológica precoce (EVR) tem um alto valor de previsão negativa para alcançar uma resposta virológica sustentada (SVR) e é considerada quando determinando se uma terapia particular deve ser terminada para um paciente. Uma resposta viral rápida (RVR) tem um alto valor de previsão positiva para SVR.

[00110] A presente descrição fornece métodos para avaliar a eficácia de um regime terapêutico em um paciente apresentando sinais ou sintomas de HCV, ou em um paciente em risco de infecção por HCV monitorando de modo recorrente os níveis de RNA de HCV ou anticorpos anti-HCV em amostras de fluido biológico seco (por exemplo, sangue) coletadas do paciente com um dispositivo de microamostragem (por exemplo, por meio de picada na ponta do dedo). Em algumas modalidades, o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®.

[00111] Em um aspecto, a presente descrição fornece métodos para avaliar a eficácia de um regime terapêutico para HCV na infecção pelo HCV em um paciente compreendendo (a) eluir uma primeira amostra de sangue seco sob condições que resultam na liberação de ácidos ribonucleicos das células de sangue, em que a primeira amostra de sangue seco é coletada do paciente com um dispositivo de microamostragem antes de administrar o regime terapêutico do HCV para o paciente; (b) detectar RNA de HCV na primeira amostra eluída de sangue seco por meio de transcrição reversa e PCR em tempo real; (c) eluir uma segunda amostra de sangue seco sob condições que resultam na liberação de ácidos ribonucleicos das células de sangue, em que a segunda amostra de sangue seco é coletada do paciente com um dispositivo de microamostragem após a administração do regime terapêutico de HCV para o paciente; e (d) detectar RNA de HCV na segunda amostra eluída de sangue seco por meio de transcrição reversa e PCR em tempo real, em que o regime terapêutico do HCV é identificado como tendo um efeito terapêutico na infecção pelo HCV se os níveis de RNA de HCV na segunda

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 52/77

47/59 amostra de sangue seco após a administração do regime terapêutico do HCV forem reduzidos em comparação com os níveis de RNA de HCV observados na etapa (b). Em certas modalidades, o paciente pode apresentar uma resposta virológica precoce (EVR), resposta viral rápida (RVR), e/ou resposta virológica sustentada (SVR).

[00112] De modo adicional ou alternativo, a presente descrição fornece métodos para avaliar a eficácia de um regime terapêutico para HCV na infecção pelo HCV em um paciente compreendendo (a) eluir uma primeira amostra de sangue seco com uma solução de tampão compreendendo BSA a 0,5%, em que a primeira amostra de sangue seco é coletada do paciente com um dispositivo de microamostragem antes de administrar o regime terapêutico do HCV ao paciente; (b) detectar pelo menos um anticorpo anti-HCV para pelo menos um antígeno codificado de HCV na primeira amostra eluída de sangue seco; (c) eluir uma segunda amostra de sangue seco com uma solução de tampão compreendendo BSA a 0,5%, em que a segunda amostra de sangue seco é coletada do paciente com um dispositivo de microamostragem após a administração do regime terapêutico do HCV ao paciente; (d) detectar pelo menos um anticorpo anti-HCV para pelo menos um antígeno codificado de HCV na segunda amostra eluída de sangue seco, em que o regime terapêutico do HCV é identificado como tendo um efeito terapêutico na infecção pelo HCV se os níveis de anticorpos anti-HCV na segunda amostra de sangue seco após a administração do regime terapêutico do HCV forem reduzidos em comparação com os níveis de anticorpos anti-HCV observados na etapa (b). Em algumas modalidades, a solução de tampão compreende adicionalmente solução salina de tampão fosfato.

[00113] Em qualquer uma das modalidades acima, o regime terapêutico de HCV compreende um ou mais inibidores de HCV aqui descritos e/ou outros inibidores de HCV conhecidos na técnica.

Kits

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 53/77

48/59 [00114] Também são descritos aqui kits para detectar a presença de vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico seco. Em algumas modalidades, os kits compreendem um dispositivo de microamostragem, um tampão de lise, transcriptase reversa e, opcionalmente, um par de iniciadores que especificamente hibridiza para 5’ UTR do genoma de HCV. Em certas modalidades, os kits compreendem uma sonda detectavelmente rotulada que especificamente hibridiza para o 5’ UTR do genoma de HCV.

[00115] De modo adicional ou alternativo, em algumas modalidades, os kits compreendem um dispositivo de microamostragem, solução de PBS compreendendo BS A a 0,5%, e um anticorpo secundário detectavelmente rotulado que especificamente se liga a um anticorpo primário anti-HCV. Em certas modalidades, os kits compreendem adicionalmente um substrato sólido compreendendo cavidades revestidas com pelo menos um antígeno codificado de HCV selecionado a partir do grupo que consiste em c22-3, c200, e NS5.

[00116] Em qualquer uma das modalidades acima dos kits da presente tecnologia, o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®.

[00117] Em algumas modalidades, os kits compreendem um par de iniciadores que é capaz de especificamente hibridizar para o 5’ UTR do genoma de HCV. De modo adicional ou alternativo, em algumas modalidades, os kits fornecem uma sonda de ácido nucleico detectavelmente rotulada que especificamente hibridiza para uma sequência localizada dentro da região que é amplificada pelo par de iniciadores.

[00118] Em algumas modalidades, os kits podem incluir uma pluralidade de dispositivos de microamostragem, cada um tendo um suporte oco na extremidade proximal e uma ponta absorvente na extremidade distai. A ponta absorvente compreende um material polimérico hidrofílico configurado para absorver 30 microlitros ou menos de sangue em aproximadamente 10 segundos ou menos. O kit também inclui um recipiente

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 54/77

49/59 com uma pluralidade de compartimentos. Cada compartimento é configurado para encaixar de modo liberável um dispositivo de microamostragem. O recipiente está configurado para evitar que as pontas absorventes do dispositivos de microamostragem encostem no compartimento em que o dispositivo de microamostragem está colocado.

[00119] De modo adicional ou alternativo, em certas modalidades, os kits podem incluir uma pluralidade de aberturas de acesso com cada abertura associada a um compartimento individual. Cada abertura está localizada para permitir a impressão sobre o suporte de um dispositivo de microamostragem presente dentro do compartimento com o qual a abertura está associada. Em certas modalidades, o suporte de um dispositivo de microamostragem tem uma pluralidade de nervuras se estendendo ao longo de um comprimento do suporte com as nervuras configuradas para evitar que a ponta absorvente contate as paredes do recipiente. O recipiente tem, preferivelmente, duas partes configuradas para formar compartimentos de formato tubular. O recipiente pode ter uma primeira parte com uma pluralidade de saliências alongadas de montagem, estendendo-se cada ao longo de uma porção de um compartimento diferente. A extremidade oca do suporte do dispositivo de microamostragem encaixa-se na saliência de montagem para prender, de modo liberável, o suporte sobre a saliência de montagem.

[00120] Em algumas modalidades, o kit compreende meio líquido contendo a, pelo menos, uma sonda de ácido nucleico específica de alvo em uma concentração de 250 nM ou menor. Com esse kit, as sondas são fornecidas na quantidade requerida para realizar reações de detecção multiplex confiáveis de acordo com a presente tecnologia.

[00121] Em algumas modalidades, os kits compreendem adicionalmente tampões, enzimas tendo atividade polimerase, enzimas tendo atividade polimerase e carecendo de atividade 5’—> 3’ exonuclease ou ambas as atividades 5’—>3’ e 3’—>5’ de exonuclease, cofatores de enzimas, como

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 55/77

50/59 magnésio ou manganês, sais, nucleotídeos de extensão de cadeia, como trifosfatos de desoxinucleosídeo (dNTPs), dNTPs modificados, dNTPs resistentes a nuclease ou dNTPs rotulados, necessários para realizar um teste ou reação, como amplificação e/ou detecção de sequências de ácidos nucleicos alvo correspondentes ao HCV.

[00122] Em uma modalidade, os kits da presente tecnologia compreendem adicionalmente uma sequência de ácido nucleico de controle positivo (por exemplo, moléculas de RNA tipo HCV Quantitation Standard (QS), como as usadas no Teste COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV) e uma sequência de ácido nucleico de controle negativo para assegurar a integridade do teste durante ciclos experimentais. De modo adicional ou alternativo, em algumas modalidades, os kits da presente tecnologia compreendem adicionalmente uma amostra biológica de controle positivo anti-HCV e uma amostra biológica de controle negativo anti-HCV. O kit pode também compreender instruções de uso, software para análise automatizada, recipientes, embalagens, tais como embalagens destinadas à venda comercial e similares.

[00123] O kit pode compreender adicionalmente um ou mais dentre: tampões e/ou reagentes de lavagem, tampões e/ou reagentes de hibridização, tampões e/ou reagentes de rotulação e meios de detecção. Os tampões e/ou reagentes são geralmente otimizados para a técnica particular de amplificação/detecção para a qual o kit é destinado. Os protocolos para usar estes tampões e reagentes para realizar diferentes etapas do procedimento também podem ser incluídos no kit.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Detecção de HCV com pontas MITRA® [00124] Métodos para detectar RNA de HCV. Um total de 79 pacientes humanos foram incluídos no estudo. Retiradas de plasma ou soro convencionais tendo um volume de pelo menos 1 mL foram obtidos de cada

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 56/77

51/59 indivíduo. Além disso, 20 pL de sangue foi coletado de cada indivíduo com um dispositivo de coleta de ponta MITRA® por meio de picada na ponta do dedo. As pontas absorventes dos dispositivos de coleta de ponta MITRA® foram então colocadas em tampão RLT a 0,7 mL (Qiagen Inc., Valencia, CA) durante pelo menos 30 minutos a 37°C com agitação a 800 rpm para eluir as amostras de sangue seco. Tampão RLT é um tampão de lise compreendendo uma alta concentração de isotiocianato de guanidina, e foi usado para lisar células e tecidos antes do isolamento do RNA. As pontas absorventes foram subsequentemente removidas do tampão de RLT e 0,65 mL de cada amostra eluída de sangue seco foi transferido para tubos de entrada de amostras para teste no instrumento COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®. Preparação de amostras, transcrição reversa e amplificação por PCR para cada amostra (ponta MITRA® e amostras retiradas de sangue convencionais) foram realizados na plataforma COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® de acordo com as instruções do fabricante.

[00125] Brevemente, as partículas virais de HCV, se presentes na amostra, foram lisadas por incubação em temperatura elevada com tampão de ligação/lise caotrópica com protease para liberar ácidos nucleicos e proteger o RNA de HCV liberado de RNases. Protease e um número conhecido de moléculas de RNA Padrão de Quantificação (QS) de HCV foram introduzidos em cada amostra junto com o reagente de lise e partículas de vidro magnético. Subsequentemente, a mistura foi incubada e o RNA de HCV (se presente) e RNA QS de HCV se ligam à superfície das partículas de vidro magnéticas. Substâncias não ligadas, como sais, proteínas e outras impurezas celulares, foram removidas lavando as partículas de vidro magnético. Depois de separar as partículas de vidro magnético e completar as etapas de lavagem, os ácidos nucleicos adsorvidos foram eluídos a uma temperatura elevada com uma solução aquosa. Cada amostra processada, contendo as partículas magnéticas de vidro, bem como RNA de HCV e QS RNA de HCV liberados, foi

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 57/77

52/59 adicionada na mistura de amplificação e transferida para o analisador COBAS® TaqMan®.

[00126] O teste COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV usa transcrição reversa de RNA de HCV para DNA complementar (cDNA) e amplificação por PCR de cDNA usando iniciadores que definem uma sequência dentro da região altamente conservada da região não traduzida 5’ do genoma de HCV e sondas rotuladas detectavelmente que também hibridizam com a sequência definida pelo par de iniciadores. A sequência de nucleotídeo dos iniciadores foi otimizada para dar amplificação comparável de Genótipos 1 a 6 de HCV. A reação de transcrição reversa e amplificação por PCR foi realizada com uma mistura otimizada de polimerases de DNA Z05 e Z05D termoestáveis, que têm, ambas, atividade de transcriptase reversa e DNA polimerase na presença de manganês (Mn²⁺) e sob condições de tampão apropriados.

[00127] As amostras processadas foram adicionadas à mistura de amplificação em tubos de amplificação (tubos-K) onde ocorreram tanto a transcrição reversa quanto à amplificação por PCR. A mistura de reação foi aquecida para permitir que o andamento de um iniciador a jusante especificamente no RNA alvo de HCV e QS RNA de HCV. Após a transcrição reversa do RNA alvo de HCV e do QS RNA de HCV, a mistura de reação foi aquecida para desnaturar o híbrido RNA:cDNA e expor as sequências de alvo do iniciador específico. Após resfriar a mistura de reação, os iniciadores ligados ao DNA de HCV alvo e às polimerases de DNA termoestáveis (Z05 e Z05D) na presença de Mn²⁺ e excesso de trifosfatos de desoxinucleotídeos (dNTP), estenderam os iniciadores andados ao longo do gabarito alvo para produzir amplicons de DNA de fita dupla. O número necessário de ciclos foi pré-programado no Analisador COBAS® TaqMan® ou analisador COBAS® TaqMan® 48.

[00128] Métodos para detectar anticorpos anti-HCV. Um total de 242

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 58/77

53/59 indivíduos humanos foi alistado no estudo. Retiradas de sangue convencionais tendo um volume de pelo menos 1 mL foram obtidas de cada indivíduo. Além disso, 20 pL de sangue foram coletados de cada indivíduo com um dispositivo de coleta de ponta MITRA® por meio de picada na ponta do dedo. As pontas absorventes dos dispositivos de coleta de ponta MITRA® foram então colocadas em 0,35 mL PBS/ BSA a 0,5% durante a noite a 2-8°C para eluir as amostras de sangue seco. As pontas absorventes foram subsequentemente removidas do tampão e cada amostra eluída de sangue seco foi colocada no sistema imunodiagnóstico VITROS ECi/ECiQ (Ortho-Clinical Diagnostics, U.K.) para testes. Dez amostras simuladas de picada na ponta do dedo foram usadas como controles negativos. Imunotestes para cada amostra (ponta MITRA® e amostras retiradas de sangue convencionais) foram realizadas no sistema imunodiagnóstico VITROS ECi/ECiQ, de acordo com as instruções do fabricante.

[00129] Brevemente, as amostras foram transferidas para cavidades revestidas com antígenos recombinantes HCV c22-3, c200 e NS5, permitindo que um anticorpo de HCV (se presente) na amostra se ligue especificamente a um ou mais dos antígenos recombinantes de HCV. Amostra não ligada foi removida por etapas de lavagem. As amostras foram então incubadas com conjugado de anticorpo rotulado com peroxidase de raiz-forte (HRP) (IgG anti-humano monoclonal de camundongo), que se liga a qualquer IgG humana capturada na cavidade. O conjugado não ligado foi removido por etapas de lavagem. Um reagente contendo substratos luminogênicos (um derivado de luminol e um sal de perácido) e um agente de transferência de elétrons, foi adicionado para as cavidades e o conjugado HRP ligado foi medido por uma reação luminescente. A quantidade de conjugado HRP ligado foi indicativa do nível de anti-HCV presente na amostra. Resultados foram calculados como a razão de um sinal normalizado em relação ao valor de corte (sinal/corte, s/c). Uma razão <0,90 é considerada um resultado negativo,

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 59/77

54/59 uma razão >1,00 é um resultado positivo, e uma razão entre 0,9 a 0,99 é considerada equivocada.

[00130] Resultados. Tanto a Tabela 1 como a Figura 1 mostram uma amostragem de dados de 32 dos 79 indivíduos, o que demonstra uma concordância completa entre detecção de RNA de HCV em amostras de sangue seco coletadas em um dispositivo de coleta de ponta MITRA® por meio de picada na ponta do dedo de pacientes e detecção de RNA de HCV em amostras de sangue total dos mesmos pacientes coletadas com coleta de sangue convencional (R² = 0,98). Tabela 1 também demonstra que os métodos de detecção de HCV da presente tecnologia são capazes de detectar de forma confiável cargas virais pelo menos tão baixas quanto 126 UI/mL em amostras de sangue seco de volume pequeno, obtidas com um dispositivo de coleta de ponta MITRA® por meio de picada na ponta do dedo. Estes resultados são notáveis, dado que se espera que a sensibilidade e precisão do teste diminuam com a redução do volume da amostra. Ver Chen et al., Clin. Chem. 53:1962-1965 (2007). Estudos anteriores relataram que a quantificação de RNA de HCV em amostras de sangue total capilar de punção no dedo de 1 Ομί é apropriada para monitorar cargas virais de >900 lU/mL. Bruns et al., J. Clin. Microbiol. 47(10): 3231-3240 (2009). Figura 2 mostra uma correlação das cargas virais recuperadas entre HCV recuperado na picada na ponta do dedo e HCV recuperado de soro.

[00131] Tabela 2 mostra uma amostragem de dados de 45 dos 242 indivíduos, o que demonstra a concordância entre a detecção de anticorpo anti-HCV em amostras de sangue seco coletadas em um dispositivo de coleta de ponta MITRA® por meio de picada na ponta do dedo e detecção de anticorpo anti-HCV nas amostras de sangue total dos mesmos pacientes coletadas usando retiradas de sangue convencionais.

[00132] Tabela 3 mostra que as amostras coletadas em um dispositivo de coleta de ponta MITRA® também são inesperadamente estáveis ao longo

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 60/77

55/59 do tempo em temperatura ambiente (18-24°C), independentemente de se o fluido coletado era soro/plasma ou sangue total. Este é um benefício técnico valioso porque amostras biológicas geralmente não são estáveis quando armazenadas em temperatura ambiente por longos períodos de tempo. O presente resultado mostra que, mesmo após dois meses de armazenamento em temperatura ambiente, as amostras ainda são capazes de dar resultados precisos e reproduzíveis.

Tabela 1: Detecção de RNA de HCV

ID de Amostra de Plasma	Concentração de Amostra de Plasma	ID da amostra de picada na ponta do dedo	Concentração de amostra de picada de dedo (sangue total)
lU/mL	Log lU/mL	lU/mL	Log lU/mL
1	ND	NEG	1	ND	NEG
2	ND	NEG	2	ND	NEG
3	ND	NEG	3	ND	NEG
4	ND	NEG	4	ND	NEG
5	<15	<1,18	5	ND	NEG
6	<15	<1,18	6	ND	NEG
7	15,9	1,20	7	ND	NEG
8	20	1,30	8	ND	NEG
9	30	1,47	9	ND	NEG
10	119	2,08	10	<15	<1,18
11	858	2,93	11	<15	<1,18
12	1,160	3,06	12	ND	NEG
13	2,228	3,35	13	<15	<1,18
14	6,740	3,83	14	185	2,27
15	8,980	3,95	15	126	2,10
16	16,500	4,22	16	137	2,14
17	48,900	4,69	17	238	2,38
18	69,100	4,84	18	246	2,39
19	97,000	4,99	19	1,420	3,15
20	137,000	5,14	20	741	2,87
21	141,000	5,15	21	545	2,74
22	144,000	5,16	22	472	2,67
23	222,000	5,35	23	2,510	3,40
24	300,000	5,48	24	2,400	3,38
25	317,000	5,50	25	1,130	3,05
26	327,000	5,51	26	2,010	3,30
27	359,000	5,56	27	1,560	3,19
28	369,000	5,57	28	2,970	3,47
29	397,000	5,60	29	873	2,94
30	731,000	5,86	30	5,220	3,72
31	1,000,000	6,00	31	3,610	3,56
32	2,170,000	6,34	32	5,860	3,77

Tabela 2: Detecção de anticorpos anti-HCV

ID de Amostra de Plasma	Anticorpo de HCV no plasma	ID da amostra de picada no dedo	Anticorpo HCV na picada no dedo (WB)
Resultado	Interpretação	Resultado	Interpretação

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 61/77

56/59

1	27,6	Reativo	1	17,3	Reativo
2	0,06	Negativo	2	1,41	Reativo
0,05	Negativo	0,69	Negativo
3	24,5	Reativo	3	7,51	Reativo
4	23,5	Reativo	4	13,4	Reativo
5	23,6	Reativo	5	3,58	Reativo
6	27,4	Reativo	6	18,9	Reativo
7	23,0	Reativo	7	2,77	Reativo
8	24,5	Reativo	8	14,8	Reativo
9	19,3	Reativo	9	2,12	Reativo
19,9	Reativo	2,03	Reativo
10	18,3	Reativo	10	15,6	Reativo
11	19,3	Reativo	11	12,0	Reativo
12	21,9	Reativo	12	8,0	Reativo
13	0,03	Não Reativo	13	0,33	Negativo
14	0,06	Não Reativo	14	1,11	Reativo
15	0,37	Não Reativo	15	0,87	Negativo
0,86	Negativo
16	3,27	Reativo	16	0,44	Negativo
17	13,0	Reativo	17	1,27	Reativo
18	15,1	Reativo	18	1,10	Reativo
19	17,2	Reativo	19	7,63	Reativo
20	18,3	Reativo	20	14,4	Reativo
21	18,7	Reativo	21	1,10	Reativo
22	18,8	Reativo	22	0,67	Negativo
0,71	Negativo
23	19,1	Reativo	23	9,06	Reativo
24	19,3	Reativo	24	1,52	Reativo
25	19,3	Reativo	25	10,6	Reativo
26	20,1	Reativo	26	23,8	Reativo
27	20,2	Reativo	27	1,10	Reativo
28	20,3	Reativo	28	6,81	Reativo
29	20,4	Reativo	29	0,81	Negativo
1,41	Reativo
30	21,2	Reativo	30	5,46	Reativo
31	21,3	Reativo	31	1,88	Reativo
32	21,4	Reativo	32	2,10	Reativo
33	21,7	Reativo	33	1,73	Reativo
34	21,7	Reativo	34	27,3	Reativo
35	21,8	Reativo	35	1,37	Reativo
36	21,9	Reativo	36	5,0	Reativo
37	22,4	Reativo	37	1,15	Reativo
38	22,6	Reativo	38	10,2	Reativo
39	23,0	Reativo	39	2,09	Reativo
40	23,5	Reativo	40	10,5	Reativo
41	23,6	Reativo	41	2,02	Reativo
42	24,5	Reativo	42	6,59	Reativo
43	24,5	Reativo	43	13,9	Reativo
44	27,4	Reativo	44	19,8	Reativo
45	27,6	Reativo	45	18,3	Reativo
Plasma Negativo	0,08	Negativo	PBS/ BSAa0,5%	0,00	Negativo
0,06	Negativo	0,00	Negativo

Tabela 3: Estabilidade do anticorpo anti-HCV e detecção ao longo do tempo

ID amos tra picada	Data retirada	Plasma/Soro HCV Ab	Data coleta Mitra Dispositivo testado	PICADA NO DEDO (WB) HCV Ab
Resultado	Interpretaç ão	Resultado	Interpretação
1	21/09/2016	18,7	Reativo	13/10/2016	1,10	Reativo

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 62/77

57/59

				13/12/2016	1,41	Reativo
2	27/09/2016	30,3	Reativo	13/10/2016	17,9	Reativo
13/12/2016	13,1	Reativo
3	03/10/2016	32,5	Reativo	13/10/2016	24,9	Reativo
13/12/2016	21,6	Reativo
4	05/10/2016	30,3	Reativo	13/10/2016	14,6	Reativo
13/12/2016	10,2	Reativo
5	10/10/2016	29	Reativo	13/10/2016	16,3	Reativo
13/12/2016	12,4	Reativo
6	10/10/2016	27,1	Reativo	13/10/2016	16,2	Reativo
13/12/2016	14,3	Reativo
7	11/10/2016	26,8	Reativo	03/11/2016	11,0	Reativo
03/01/2017	8,68	Reativo
8	13/10/2016	18,8	Reativo	03/11/2016	0,67	Não Reativo
03/01/2017	1,03	Reativo
9	18/10/2016	13	Reativo	03/11/2016	1,27	Reativo
03/01/2017	1,09	Reativo
10	19/04/2016	21,7	Reativo	03/11/2016	1,73	Reativo
03/01/2017	1,80	Reativo
11	25/10/2016	20,3	Reativo	03/11/2016	6,81	Reativo
03/01/2017	5,20	Reativo
12	31/10/2016	15,1	Reativo	03/11/2016	1,10	Reativo
03/01/2017	1,14	Reativo

[00133] Estes resultados demonstram que os métodos da presente tecnologia são capazes de detectar RNA de HCV e/ou anticorpos anti-HCV em uma amostra de fluido biológico seco de pequeno volume, que é coletada com um dispositivo de microamostragem (por exemplo, ponta MITRA®). Os métodos aqui descritos produziram resultados consistentes com os observados com métodos de detecção de HCV, empregando retiradas de sangue convencionais.

EQUIVALENTES [00134] A presente tecnologia não deve ser limitada em termos das modalidades particulares descritas neste pedido, que se destinam como ilustrações únicas de aspectos individuais da presente tecnologia. Muitas modificações e variações da presente tecnologia atual podem ser feitas sem sair de seu espírito e escopo, como será evidente para os versados na técnica. Métodos e aparelhos funcionalmente equivalentes no escopo da presente tecnologia, além dos aqui enumerados, serão evidentes para os versados na técnica a partir das descrições precedentes. Tais modificações e variações devem estar dentro do escopo da presente tecnologia. Deve ser entendido que essa presente tecnologia não está limitada a métodos, reagentes, composições

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 63/77

58/59 de compostos ou sistemas biológicos particulares, os quais podem, como evidente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a ser limitativa.

[00135] Os termos “compreendendo”, “incluindo”, “contendo”, etc. devem ser lidos de forma ampliada e sem limitação. Além disso, os termos e expressões aqui empregados foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não se nota intenção, no uso de tais termos e expressões, de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou partes das mesmas, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da descrição reivindicada.

[00136] Além disso, quando as características ou aspectos da descrição são descritos em termos de grupos Markush, os versados na técnica reconhecerão que a descrição é também assim descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.

[00137] Como será entendido por um versado na técnica, para quaisquer e todos os fins, particularmente em termos de apresentar uma descrição por escrito, todas as faixas descritas aqui também englobam qualquer uma e todas as possíveis subfaixas e combinações de subfaixas dos mesmos. Qualquer faixa listada pode ser facilmente reconhecida como descrevendo suficientemente e permitindo que a mesma faixa seja dividida em pelo menos metades, terços, quartos, quintos, décimos, iguais, etc. Como um exemplo não limitative, cada faixa discutida aqui pode ser facilmente dividida em um terço menor, terço médio e terço maior, etc. Como também será entendido por um versado na técnica, todas as expressões como “até”, “pelo menos”, “maior que”, “menor que” e similares, incluem o número recitado e referem-se a faixas que podem ser subsequentemente divididas em subfaixas como discutido acima. Finalmente, como será entendido por um versado na técnica, uma faixa inclui cada membro individual. Assim, por

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 64/77

59/59 exemplo, um grupo tendo 1-3 células refere-se a grupos tendo 1, 2 ou 3 células. Similarmente, um grupo tendo 1 a 5 células refere-se a grupos tendo 1, 2, 3, 4 ou 5 células e assim por diante.

[00138] Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios e publicações mencionados ou citados aqui são incorporados por referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, na medida em que não sejam inconsistentes com os ensinamentos explícitos deste relatório descritivo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para detectar vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico secada, caracterizado pelo fato de que compreende (a) extrair ácidos ribonucleicos a partir de uma amostra de fluido biológico secada eluída de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem;

(b) transcrever de modo reverso os ácidos ribonucleicos extraídos para gerar uma pluralidade de complexos de hibridização cDNA:RNA;

(c) amplificar os complexos de hibridização cDNA:RNA com um par de iniciadores que especificamente hibridiza para o 5’ UTR do genoma de HCV para produzir amplicons de HCV; e (d) detectar HCV na amostra de fluido biológico secada quando os amplicons de HCV produzidos na etapa (c) são detectados.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o HCV na amostra de fluido biológico secada tem pelo menos um genótipo selecionado a partir do grupo que consiste em Genótipo la, Genótipo 1b, Genótipo 2a, Genótipo 2b, Genótipo 2c, Genótipo 2d, Genótipo 3a, Genótipo 3b, Genótipo 3c, Genótipo 3d, Genótipo 3e, Genótipo 3f, Genótipo 4a, Genótipo 4b, Genótipo 4c, Genótipo 4d, Genótipo 4e, Genótipo 4f, Genótipo 4g, Genótipo 4h, Genótipo 4i, Genótipo 4j, Genótipo 5a, e Genótipo 6a.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido biológico secada é plasma secado, soro secado, ou sangue total secado.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido biológico secada na ponta absorvente do dispositivo de microamostragem é coletada do paciente

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 66/77

2/9 por meio de picada na ponta do dedo.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que eluição da amostra de fluido biológico secada é realizada por contato da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem com um tampão de lise.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o tampão de lise compreende isotiocianato de guanidina, e opcionalmente β-mercaptoetanol.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

6, caracterizado pelo fato de que eluição da amostra de fluido biológico secada é realizada por contato da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem com o tampão de lise durante pelo menos 30 minutos a 37°C.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

7, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

8, caracterizado pelo fato de que o volume da amostra do dispositivo de microamostragem é não mais que 30 pL, não mais que 25 pL, não mais que 20 pL, não mais que 15 pL, ou não mais que 10 pL.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido biológico secada é isolada de um paciente apresentando sinais ou sintomas de hepatite, ou um paciente em risco de infecção por HCV.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a carga viral do HCV na amostra de fluido biológico secada é pelo menos 1-5 lU/mL, pelo menos 5-10 IU/mL, pelo menos 10-15 IU/mL, pelo menos 15-20 IU/mL, pelo menos 20-40 IU/mL, pelo menos 40-60 IU/mL, pelo menos 60-80 IU/mL, pelo menos 80-

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 67/77

3/9

100 IU/mL, pelo menos 100-150 IU/mL, pelo menos 150-200 lU/mL, pelo menos 200-250 IU/mL, pelo menos 250-300 IU/mL, pelo menos 300-350 IU/mL, pelo menos 350-400 IU/mL, pelo menos 400-500 IU/mL, pelo menos 500-600 IU/mL, pelo menos 600-700 IU/mL, pelo menos 700-800 IU/mL, pelo menos 800-850 IU/mL, pelo menos 850 IU/mL, ou pelo menos 900 IU/mL.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 all, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o contato da complexos de hibridização cDNA:RNA com uma sonda detectavelmente rotulada.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o rótulo detectável é um repórter fluorescente selecionado a partir do grupo que consiste em ácido 4-acetamido-4’-isotiocianatostilbeno2,dissulfônico, acridina e derivados (acridina, isotiocianato de acridina), Alexa Fluors (Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647 (Sondas moleculares)), ácido 5-(2’-aminoetil)aminonaftaleno-l-sulfônico (EDANS), 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 dissulfonato (amarelo Lucifer VS), N-(4-anilino-l-naftil)maleimida, antranilamida, BODIPY® R-6G, BOPIPY® 530/550, BODIPY® FL, amarelo brilhante, Cal Fluor Red 610® (CFR610), coumarina e derivados (coumarina, 7-amino-4metilcoumarina (AMC, Coumarina 120), 7-amino-4-trifluorometilcouluarina (Coumarina 151)), Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, cianosina, 4',6diaminidino-2-fenilindol (D API), 5', 5-dibromopirogalol-sulfoneftaleína (vermelho Bromopirogalol), 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4metilcoumarina, penta-acetato de dietilenotriamina, ácido 4,4’-diisotiocianatodi-hidro-stilbeno-2,2’-dissulfônico, ácido 4,4’-diisotiocianatostilbeno-2,2’-dissulfônico, cloreto de 5-[dimetilamino]naftaleno1-sulfonila (DNS, cloreto de dansila), ácido 4-(4’Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 68/77

4/9 dimetilaminofenilazo)benzóico (DAB CYL), 4-dimetilaminofenilazofenil-4'isotiocianato (DABITC), Eclipse ™ (Epoch Biosciences Inc.), eosina e derivados (eosina, isotiocianato de eosina), eritrosina e derivados (eritrosina B, isotiocianato de eritrosina), etídio, fluoresceína e derivados (5carboxifluoresceina (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceina (DTAF), 2',7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceina (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), hexacloro-6carboxifluoresceina (HEX), QFITC (XRITC), tetraclorofluoresceína (TET), fluorescamina, IR144, IR1446, fósforos de lantamida, isotiocianato de verde malaquita, 4-metilumbeliferona, orto cresolftaleina, nitrotirosina, pararosanilina, vermelho fenol, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, aloficocianina, o-ftaldialdeido, Oregon Green®, iodeto de propídio, pireno e derivados (pireno, butirato de pireno, sucinimidil 1-butirato de pireno), QSY® 7, QSY® 9, QSY® 21, QSY® 35 (Sondas moleculares), vermelho reativo 4 (Cibacron® vermelho brilhante 3B-A), rodamina e derivados (6-carboxi-Xrodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), lissamina rodamina B cloreto de sulfonila, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina verde, isotiocianato de rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101, derivado de cloreto de sulfonila de sulforodamina 101 (vermelho texas), Ν,Ν,Ν',Ν'tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), tetrametil rodamina, isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC), riboflavina, ácido rosólico, derivados de quelato de térbio, Quasar 670®, e VIC®.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que os complexos de hibridização cDNA:RNA são amplificados com Z05 ou Z05D DNA polimerases.
15. Método para detectar vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico secada, caracterizado pelo fato de que compreende (a) eluir uma amostra de fluido biológico secada de uma ponta

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 69/77

5/9 absorvente de um dispositivo de microamostragem; e (b) detectar HCV na amostra de fluido biológico secada quando um anticorpo anti-HCV para pelo menos um antígeno codificado de HCV é detectado na amostra de fluido biológico secada eluída.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um antígeno codificado de HCV é selecionado a partir do grupo que consiste em c22-3, c200, e NS5.
17. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o HCV na amostra de fluido biológico secada tem pelo menos um Genótipo selecionado a partir do grupo que consiste em Genótipo la, Genótipo 1b, Genótipo 2a, Genótipo 2b, Genótipo 2c, Genótipo 2d, Genótipo 3a, Genótipo 3b, Genótipo 3c, Genótipo 3d, Genótipo 3e, Genótipo 3f, Genótipo 4a, Genótipo 4b, Genótipo 4c, Genótipo 4d, Genótipo 4e, Genótipo 4f, Genótipo 4g, Genótipo 4h, Genótipo 4i, Genótipo 4j, Genótipo 5 a, e Genótipo 6a.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido biológico secada é plasma secado, soro secado, ou sangue total secado.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido biológico secada na ponta absorvente do dispositivo de microamostragem é coletada do paciente por meio de picada na ponta do dedo.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo fato de que eluição da amostra de fluido biológico secada é realizada por contato da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem com uma mistura compreendendo solução salina de tampão fosfato e BSA a 0,5%.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que eluição da amostra de fluido biológico secada é realizada por

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 70/77

6/9 contato da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem com a mistura compreendendo solução salina de tampão fosfato e BS A a 0,5% durante pelo menos 2 horas a temperatura ambiente, ou durante a noite a 2-8 °C.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizado pelo fato de que o volume da amostra do dispositivo de microamostragem é não mais que 30 pL, não mais que 25 pL, não mais que 20 pL, não mais que 15 pL, ou não mais que 10 pL.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 23, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido biológico secada é isolada de um paciente apresentando sinais ou sintomas de hepatite, ou um paciente em risco de infecção por HCV.
25. Kit para detectar a presença de vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico secada, caracterizado pelo fato de que compreende um dispositivo de microamostragem, um tampão de lise, transcriptase reversa, e opcionalmente um par de iniciadores que especificamente hibridiza para o 5 ’ UTR do genoma de HCV.
26. Kit de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma sonda detectavelmente rotulada que especificamente hibridiza para o 5 ’ UTR do genoma de HCV.
27. Kit para detectar a presença de vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico secada, caracterizado pelo fato de que compreende um dispositivo de microamostragem, solução de PBS compreendendo BS A a 0,5%, e um anticorpo secundário detectavelmente rotulado que especificamente se liga a um anticorpo primário anti-HCV.
28. Kit de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 71/77

7/9 fato de que compreende adicionalmente um substrato sólido compreendendo cavidades revestidas com pelo menos um antígeno codificado de HCV selecionado a partir do grupo que consiste em c22-3, c200, e NS5.
29. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®.
30. Método para selecionar um paciente apresentando sintomas de hepatite para tratamento com um agente terapêutico que inibe a infecção por HCV, caracterizado pelo fato de que compreende (a) eluir uma amostra de sangue secada sob condições que resultam na liberação de ácidos ribonucleicos de células de sangue, em que a amostra de sangue secada é coletada do paciente com um dispositivo de microamostragem;

(b) isolar ácidos ribonucleicos a partir da amostra de sangue secada eluída;

(c) transcrever de modo reverso os ácidos ribonucleicos isolados para gerar uma pluralidade de complexos de hibridização cDNA:RNA;

(d) amplificar os complexos de hibridização cDNA:RNA com um par de iniciadores que especificamente hibridiza para o 5’ UTR do genoma de HCV para produzir amplicons fluorescentemente rotulados de HCV;

(e) detectar os amplicons fluorescentemente rotulados de HCV produzidos na etapa (d); e (f) selecionar o paciente para tratamento com um agente terapêutico que inibe a infecção por HCV, se os amplicons fluorescentemente rotulados de HCV são detectados.
31. Método para selecionar um paciente apresentando sintomas de hepatite para tratamento com um agente terapêutico que inibe a

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 72/77

8/9 infecção por HCV, caracterizado pelo fato de compreender (a) eluir uma amostra de sangue secada com uma solução de tampão compreendendo BS A a 0,5%, em que a amostra de sangue secada é coletada do paciente com um dispositivo de microamostragem;

(b) detectar um anticorpo anti-HCV a pelo menos um antígeno codificado de HCV na amostra de sangue secada eluída; e (c) selecionar o paciente para tratamento com um agente terapêutico que inibe a infecção por HCV, se o anticorpo anti-HCV é detectado.
32. Método de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-32, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico que inibe a infecção por HCV é um ou mais agentes selecionados a partir do grupo que consiste em interferon alfacon-1, interferon peguilado e/ou não peguilado alfa-2b, peginterferon alfa-2a, ribavirina, telaprevir, boceprevir, sofosbuvir, simeprevir, daclatasvir, velpatasvir, ombitasvir, paritaprevir, ritonavir, dasabuvir, ledipasvir, elbasvir, danoprevir, grazoprevir, GS-7977, βinterferon, γ-interferon, amantadina, e 3TC.
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-33, caracterizado pelo fato de que o HCV na amostra de sangue secada tem pelo menos um genótipo selecionado a partir do grupo que consiste em Genótipo la, Genótipo 1b, Genótipo 2a, Genótipo 2b, Genótipo 2c, Genótipo 2d, Genótipo 3a, Genótipo 3b, Genótipo 3c, Genótipo 3d, Genótipo 3e, Genótipo 3f, Genótipo 4a, Genótipo 4b, Genótipo 4c, Genótipo 4d, Genótipo 4e, Genótipo 4f, Genótipo 4g, Genótipo 4h, Genótipo 4i, Genótipo 4j, Genótipo 5 a, e Genótipo 6a.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

Petição 870190058587, de 25/06/2019, pág. 73/77

9/9

30-34, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um antígeno codificado de HCV é selecionado a partir do grupo que consiste em c22-3, c200, e NS5.
36. Método para detectar vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico secada, caracterizado pelo fato de que compreende isolar RNA de VHC a partir de uma amostra de fluido biológico secada eluída de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem com um tampão de lise.
37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o RNA de VHC é detectado usando PCR de transcrição reversa e tempo real.
38. Método de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizado pelo fato de que o tampão de lise compreende isotiocianato de guanidina, e opcionalmente β-mercaptoetanol.
39. Método para detectar vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra de fluido biológico secada, caracterizado pelo fato de que compreende isolar um anticorpo anti-HCV a partir de uma amostra de fluido biológico secada eluída de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem com uma solução de tampão compreendendo BS A a 0,5%.
40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a solução de tampão compreende solução salina de tampão fosfato.
41. Método de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-HCV é detectado usando ELISA.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-HCV se liga a um antígeno de HCV selecionado a partir do grupo que consiste em c22-3, c200, eNS5.