JPH09504182A - Ｃｍｖ核酸の増幅用及び検出用プライマー及びプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＣＭＶ病の疑いのあるヒトの血液標本中にヒトサイトメガロウイルスの後期構造蛋白質をコードするｍＲＮＡの存在を検出することを特徴とする症状のあるＣＭＶ病の診断方法であって、以下の段階、−標的配列と特異的に反応できるプライマー対と適切な増幅試薬を使用して上記ｍＲＮＡ内の標的配列を増幅すること、−増幅した核酸を含む場合がある標本と増幅した配列の一部に相補的な配列を有する標識核酸プローブを反応させること、−増幅した配列とプローブの間で形成されるハイブリッドを検出すること、を含む方法に関する。本発明は更に、後期ｐｐ６７ＨＣＭＶｍＲＮＡの増幅及び検出用プライマー及びプローブに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＭＶ核酸の増幅用及び検出用プライマー及びプローブ 本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｍＲＮＡの検出におけるプ ライマー及びプローブとして使用できるオリゴヌクレオチドに関する。更に、Ｈ ＣＭＶ疾病の診断方法を提供する。 ヒトサイトメガロウイルスは遍在性のヘルペス型ウイルスであり、約240,000 ヌクレオチドの長さの二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、思春期前のヒトの４０−８０ ％に感染する。全てのヘルペスウイルスに共通の顕著な特徴は、感染後一生持続 し、再活性化後、再感染の原因となり得ることである（Stevens,J.G,．Microbio l.Rev.53，318-332.，1989）。ＨＣＭＶはまた、しばしば臨床的症状無しで起こ る一次感染の後、潜伏状態に入る。多くの場合、再感染でさえ、免疫能力のある 宿主には無症状かほんの軽い疾病しかもたらさない。しかし、先天的に感染した 幼児及び同種移植を受けた患者（Meyers,J.D.，ら、J.Infect.Dis.153,478-488. ,1986）又はエイズ患者（Drew,W.L．J Infect.Dis 158,449-456.,1988: Drew,W. L.Clin.Infect.Dis14,608-615.,1992）などの免疫力の低下した患者に於いては 、免疫シ ステムと潜伏しているウイルスの微妙なバランスが崩れているので、ＨＣＭＶは 網膜炎、胃腸病及び脳炎を含む重篤の、時には生命を脅かす疾病の原因となり得 る（Drew,1992）。ガンシクロビル及びホスカルネット（foscarnet）などの抗ウ イルス薬を初期に投与すると患者の予後に顕著に有益な効果を及ぼし得る（Jahn ,G．ら,Intervirology 35,60-72.,1993；Schmidt,G.M,ら、N.Eng I.J.Med,324,1 005-1011,,1991）。それ故、臨床的に有効な抗ウイルス療法の利用可能性と共に 、早期で感度の高い診断が極めて重要である。 ＣＭＶ特異的抗体は、特にＩｇＭ抗体はＣＭＶ感染の指標として使用できるが 、潜伏期と活動期の感染を区別するときには限られた価値しかない。今日使用さ れる多くのウイルス検出法は、ある感染が症状を示すようになるかの予測を明確 にできるものではない。更に、血清法は間接的でしばしば感度を欠く。ウイルス の培養は、ＣＭＶ血症のより直接的な診断の指標である。血液細胞からのＣＭＶ 培養は活動期のＣＭＶ感染の指標となるように見えるが、その方法では速い診断 ができず、技術的に難しい。更に、ウイルス培養は必ずしもＨＣＭＶ病に対応し ない。末梢白血球からのウイルス単離と臨床的症状の出現の信 頼できる関係は免疫抑制患者には存在しないこともあり得る（Delgado,R.ら、J Clin.Microbiol.30,1876-1878.,1992）。また、尿及び咽頭からウイルスが放出 されることはしばしば臨床的症状が無くとも、また器官にウイルスが含まれるこ とが無くとも起こる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による末梢白血球におけ るＨＣＭＶのＤＮＡの増幅はＣＭＶ血症のための非常に感度の高い技術であるが 、それも臨床的症状のあるＨＣＭＶ感染の指標としては使用できない。酵素増幅 は感度が高いために、時にはＨＣＭＶ関連疾病なしに、ＨＣＭＶのＤＮＡを末梢 白血球中で検出できた。潜伏期のウイルスゲノムはこの技術で検出され得るし、 また患者は病気が治った後も長い期間ＨＣＭＶ−ＤＮＡ陽性のままであり得る（ Jahn,G.ら、1993;Zipeto，D．ら、J Clin.Microbiol,30，527-530.，1992;Delga doら、1992）。 現在、急性で症状のあるＨＣＭＶ感染の早期診断用に選択される方法は、特異 的な抗体を使用する構造蛋白質ｐｐ６５の免疫学的検出に基づいた血液の抗原ア ッセイである（Storch,G.A.，ら、J.Clin.Microbiol.32,997-1003.,1994;Gerna, G．ら、J．Infect.Dis.164,488-498.,1991;Gerna,G.ら、J Clin,Micro biol,30,1232-1237.98,,1992）。しかし、この方法を用いる際の重要な点は、そ の感度である。感染の初期段階でのｐｐ６５陽性細胞の数は、非常に低いことも あり得る。更に、ｐｐ６５を発現している細胞に於いてｐｐ６５抗原の安定性は 限られているように思われる(Chou,S.,Curr .Opin.Infect.Dis.5，427-432.,199 1)。そして感度は、ｐｐ６５の別々のエピトープを認識する抗ｐｐ６５抗体のプ ールよりモノクローナル抗体の適用によって減少し得る。 ウイルスの複製にはｍＲＮＡの転写が必要なので、活性ＣＭＶ感染の指標とし てＨＣＭＶのｍＲＮＡ検出の使用が検討された（Bitsch,A．ら、J Infect,Dis 1 67,740-743，1993）。 最近、ＨＣＭＶ感染がＲＮＡ増幅を使用して転写レベルで検査された(Bitsch, Aら、1993;Meyer,T．ら、Mol.Cell Probes8,261-271.,1994;Gerna,G.ら、J Clin .Micro biol.30，1232-1237,1993,Gerna,G.ら、J Clin.Microbiol.30,1232-1237 .98,1992)。原則として、ウイルス抗原の検出のように、ウイルス複製と連関し て発現されるウイルス転写物の分析で、症状のある感染の信頼性のある診断がで きるはずである。 本発明は、ＨＣＭＶの後期ｍＲＮＡ配列の検出に基づいた臨 床的に症状のあるＣＭＶ病の検出方法及び該方法で使用できる核酸配列を提供す る。 後期ｍＲＮＡの転写にはウイルスの複製が必要なので、活動期の感染に特異的 であり得る。 本発明で、ＨＣＭＶのある種の後期ｍＲＮＡの検出がＨＣＭＶ病の臨床的症状 の出現と連関していることが知見された。上記の病気である疑いのあるヒトの血 液標本中にヒトサイトメガロウイルスの後期構造蛋白質をコードするｍＲＮＡの 存在を検出することを特徴とするＨＣＭＶ病の診断方法を提供する。該方法は、 以下の段階を含む。 −標的配列と特異的に反応できるプライマー対と適切な増幅試薬を使用して上記 ｍＲＮＡ内の標的配列を増幅すること、 −増幅した核酸を含む場合がある標本と増幅した配列の一部に相補的な配列を有 する標識核酸プローブを反応させること、及び −増幅した配列とプローブの間で形成されるハイブリッドを検出すること。 患者に於いて、ある種の後期ｍＲＮＡの有無を患者の臨床的状態と関係づける と、この後期ｍＲＮＡの存在とＣＭＶ関連臨 床症状と思われる症状の間で顕著な関連が観察された。 ＣＭＶのｍＲＮＡの検出の感度と信頼性はプライマーの選択に大きく依存する 。何故ならば、ゲノムの各領域でＣＭＶの株間で配列の変異があり得るからであ る。理想的には、プライマーの選択は、プライマー配列の候補における株間の変 異に関する知識とプライマー部位におけるミスマッチの結果に基づくべきである (Chou S.，J.of Clin,Microblol.,2307-2310,1992)。 それ故、ＣＭＶの全ての変異株の増幅と次の検出のためのプライマーとハイブ リダイゼーションプローブとして使用できる核酸配列を含む適切なオリゴヌクレ オチドの必要性がある。 本発明はある種の後期ＨＣＭＶのｍＲＮＡの検出に関し、このｍＲＮＡの増幅 と次の検出のための適切なプライマーとプローブを提供する。本発明のプライマ ーとプローブの結合部位は、ＣＭＶ感染の後期に発現されるマトリックステグメ ント蛋白質ｐｐ６７をコードする遺伝子配列（ＵＬ６５）に位置する。 本明細書で使用する“オリゴヌクレオチド”という用語は、プライマーとプロ ーブなどの２つ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドからなる 分子を指す。 本明細書で使用する“プライマー”という用語は、ヌクレオ チドとＤＮＡ依存性又はＲＮＡ依存性ポリメラーゼなどの核酸重合用試薬の存在 下、適切な条件下（例えば、緩衝液、塩、温度及びｐＨ）で、核酸鎖（鋳型又は 標的配列）に相補的なプライマー伸長生成物の合成の開始点として作用できる天 然（例えば、制限断片）又は合成のオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは重 合用試薬の存在下で伸長生成物の合成を開始するために十分長くなければならな い。典型的なプライマーは、標的配列に実質的に相補的（Ｐ１）又は相同的（Ｐ ２）配列であり、少なくとも約１０ヌクレオチドの長さを含むが、やや長いプラ イマーが好ましい。通常、プライマーは約１５−２６個のヌクレオチドを含むが 、３５ヌクレオチドまでのより長いプライマーもまた使用できる。 通常１セットのプライマーは、増幅物（プライマーを使用して増幅される配列 ）を規定する一つの“上流”及び一つの“下流”である少なくとも２種のプライ マーからなる。 上流プライマー（Ｐ１）は、それがアニールする標的配列に実質的に相補的で ある配列を必ず含む。下流プライマー（Ｐ２）は標的配列に実質的に相同的であ る配列を含む。 プライマーは、所望によりプロモーター配列をも含み得る。 “プロモーター配列”という用語は、認識した配列に結合し、ＲＮＡ転写物を産 生する転写過程を開始するＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される核酸 配列の一領域と定義される。原則的に、開始配列を認識できる公知で入手可能な ポリメラーゼが存在する任意のプロモーター配列を使用でき得る。公知で有用な プロモーターは、バクテリオファージＴ３、Ｔ７又はＳＰ６などのある種のバク テリオファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるものである。 本発明の配列からなる核酸プライマーは核酸塩基の重要でない欠失、付加及び ／又は置換を含み得るが、その程度はそのような変更により、得られる収率又は 生成物に重大な負の影響が出ない程度のものであることが理解される。 核酸を増幅する様々な技術が当業界で公知である。ＤＮＡ標的断片の増幅のた めの技術の一例はいわゆる“ポリメラーゼ連鎖反応”（ＰＣＲ）である。ＰＣＲ 技術により、所定の標的断片のコピー数はサイクル数とともに指数的に増加する 。各サイクルでＤＮＡプライマーは、二本鎖ＤＮＡ−標的配列の各鎖の３’端に アニールする。プライマーは、種々のモノヌクレオチドの存在下にＤＮＡポリメ ラーゼにより伸長する。伸長した生 成物は熱変性により一本鎖にされ、各鎖は、次のサイクルで、プライマーアニー リングと次の伸長のための鋳型として作用できる。ＰＣＲ法は、Saikiら、Scien ce 230,135,1985及び欧州特許第200362号明細書と欧州特許第201184号明細書に 記述されている。 核酸増幅のためのもう一つの技術は、いわゆる転写をベースとした増幅システ ム（ＴＡＳ）である。ＴＡＳでは、標的配列断片とプロモーターを含むように合 成されたＤＮＡからのＲＮＡ転写物産生段階を使用し、標的断片に相補的な配列 によりＲＮＡ断片からの転写を可能なものとする。転写段階で産生されたＲＮＡ は、同様に転写可能なＤＮＡ産生のための鋳型として作用でき、変わってＤＮＡ は更なるＲＮＡを産生するように転写され得るので、多数回のサイクルが行える 。ＴＡＳ法は、国際公開第88/10315号明細書に記載されている。 更に、核酸増幅のためのもう一つの方法は、欧州特許第329822号明細書に記述 されている核酸配列をベースとした増幅法（“ＮＡＳＢＡ”）である。ＴＡＳの ように、ＮＡＳＢＡは、Ｔ７プロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡ鋳型からのＲ ＮＡの多数のコピーを転写するＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用する ＲＮＡ転写物生成段階を含む。 検出プローブとして使用されるオリゴヌクレオチド配列は、検出可能な残基で 標識され得る。種々の標識残基は当業界で公知である。該残基は、例えば放射活 性化合物、検出可能な酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ ））又は比色定量、蛍光、化学発光又は電気化学発光信号などの検出可能な信号 を発生できる任意の他の残基であり得る。 ｐｐ６７遺伝子配列では、ＣＭＶ ＡＤ１６９とＴｏｗｎｅの間で株間の変異 が存在する。それ故、この標的では、２種のプライマー対、ＣＭＶ−ｐｐ６７− １とＣＭＶ−ｐｐ６７−４（表１）が選ばれた。どちらも遺伝子の同一の領域由 来であるが、各々は別の実験室株に基づいている。ｐｐ６７ｍＲＮＡの検出用オ リゴヌクレオチドの例は、下記からなる群から選択される配列の少なくとも１０ ヌクレオチドの断片を含む１０−３５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド である。 本発明の好ましいプライマーセットは次のオリゴヌクレオチド配列を含む。 以下のものと組み合わせてである。 Ｔ７プロモーター配列を示すが、任意の他の適切なプロモーター配列と置き換 えることができる。 プライマーセットを使用して産生される増幅物の検出に使用できるプローブは 、次の配列から本質的になるオリゴヌクレオチドを含むことができる。 上記配列を含むプローブもまた、本発明の一部である。 ＲＮＡ増幅のために（本発明の方法によるように）、ＮＡＳＢＡ技術又は他の 転写をベースにした増幅技術は好ましい技術 である。この増幅方法は、ある特定のＲＮＡ領域のin vitroのプライマー先導の 増幅からなる（Kievitsら、1991; Compton J.，Nature 350,91−92，1991）。 ウイルス転写物の検出のためにＲＴ−ＰＣＲを使用するならば、ｍＲＮＡ−及 びＤＮＡ−由来のＰＣＲ生成物の区別が必要である。ＩＥＡ ｍＲＮＡのように 、スプライスされた転写物の場合、エキソン−イントロン構造を使用できる。し かし、後期構造蛋白質をコードするｍＲＮＡは、スプライスされない転写物によ りほとんどコードされる。ＲＴ−ＰＣＲに先立ちＤＮＡｓｅ処理を使用できる（ Bitsch,A，ら、J Infec.Dis 167,740-743.,1993; Meyer,T．ら、Mol.Cell Probe s.8，261-271.,1994）が、時々夾雑しているＤＮＡを十分に取り除き損なう(Bit sch,A.ら、1993)。 ＲＴ−ＰＣＲに対して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写に基づいた ＮＡＳＢＡ（Kievitsら、1991; Compton，1991）は、その主な標的としてＲＮＡ のみを使用するので、ＲＮＡ−とＤＮＡ−由来増幅生成物の区別をする必要がな い。ＮＡＳＢＡは、ＤＮＡがバックグラウンドに存在する場合においてさえＲＮ Ａ標的の特異的増幅を可能とする。特に、ほとん ど全ての後期ＨＣＭＶ遺伝子転写物のようにスプライスされない標的の場合、時 には効果的でないＤＮＡｓｅ処理をしないですむために、この方法は有利である （Bitsch,A.ら、1993）。 この方法は、移植された患者とＨＩＶ感染患者からの全血標本におけるＣＭＶ 転写物の分析のために使用された。 臨床標本中のＣＭＶ検出用のテストキットもまた、本発明の一部である。本発 明のテストキットは、本発明のプライマーの１セットと本発明のプローブを含み 得る。このようなテストキットはさらに、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡポリメラーゼ 及びモノヌクレオチドなどの適切な増幅試薬を含み得る。本発明の方法で使用で きるテストキットは、ｐｐ６７ｍＲＮＡの増幅と次の検出のための本発明のプラ イマーとプローブを含み得る。 本発明を更に以下の実施例で説明する。実施例 実施例１：臨床標本におけるＣＭＶのＤＮＡとｍＲＮＡの分析材料と方法 臨床標本 臨床的にＣＭＶ感染のおそれのある患者から得た標本を、即時型抗原（ＩＥＡ ）又はＣＭＶ感染後期に発現されるマトリッ クステグメント蛋白質ｐｐ６７をコードするｍＲＮＡの存在を検出するために分 析した。 心臓、肝臓、腎臓移植患者２２人、エイズ患者８人、白血病患者２人、脊髄形 成異常症候群の患者１人、一次Epstein Barrウイルス単核細胞症の患者１人及び カポシ肉腫の患者１人を含む免疫低下患者から３５の血液標本を得た。提供され 次いで実験室で受け取ったエチレンジアミノテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）抗凝固血液 標本を、９倍量の溶解緩衝液［50mM トリス−塩酸(pH6,4); 20mMEDTA; 1.3%(W/ V)トライトンX-100; 5.25Mグアニジニウムチオシアネート］と混合し、使用する まで−７０℃で保存した。 核酸の単離 抗凝固剤処理の血液標本から、グアニジニウムチオシアネートによる細胞溶解 とシリカ粒子への核酸の吸着を使用して全核酸を単離した（Boomら、J.of Clin. Mic robiol.28,495-503,1990）。 溶解緩衝液中の全血標本を融解し、各標本から１ｍｌ（100μｌの全血に相当 ）をエッペンドルフチューブに移した。次に、塩酸で活性化した二酸化ケイ素粒 子（0.1M塩酸中の1mg/mlの サイズを揃えた懸濁液(Sigma); Boomら、1990を参照）の７０μｌを加え、懸濁 液を規則的な振蕩をしながら室温で１０分間インキュベートした。シリカに結合 した核酸を遠心で沈殿させた。ペレットになったシリカ粒子を１ｍｌのＧｕＳＣ Ｎ洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．４）；５．２５Ｍグアニジニウ ムチオシアネート）で２度洗浄し、次に１ｍｌの７０％エタノールで２度の洗浄 段階、１ｍｌのアセトンでの１度の洗浄段階を行った。各洗浄段階後、懸濁液を 簡単に遠心し、シリカのペレットを徹底的に混合して次の洗浄液に再懸濁した。 アセトン除去後、シリカ粒子を１０分間ヒーティングブロックで５６℃でインキ ュベートして乾燥した。核酸をシリカ粒子から、１００μｌの蒸留水で５６℃で １０分間インキュベートして溶出させた。最後に、シリカ粒子を再び遠心し、シ リカの持ち込みを避けながら、上清を注意深く新しい反応チューブにピペットで 入れた。抽出した核酸標本を使用するまで−７０℃で保存した。 これらの分離物におけるＣＭＶのｍＲＮＡの検出の前に、抽出ＲＮＡの完全さ と量を確認した。 それ故、標本を、Ｕ１ｓｎＲＮＰ−特異的Ａ蛋白質（Ｕ１Ａ） ｍＲＮＡ(Sillekens,P.T.G.,ら、EMBO J．6,3841-3848.,1987)の存在を確認する ために分析した。このｍＲＮＡは比較的少ないメッセンジャーであり、細胞のハ ウスキーピング遺伝子から転写される。ノーザンブロット分析により示されるよ うに、増幅できるＵ１ＡのｍＲＮＡの存在が全ての標本で明白であった（データ は示さない）。 プライマー及びプローブ 特異的検出のために使用されるプライマーとプローブの配列と極性を表１に示 す。 全てのオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを、ホスホルアミダイト生 化学を使用してＰＣＲ−ＭＡＴＥ ３９１ＤＮＡ合成機(Applied Biosystems)上 で合成した。ＥＬＧＡ検出のためのオリゴヌクレオチド（下記参照）を、次のセ イヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の結合のために、５’−アミノリンク （Aminolink 2; Applied Biosystems）を用いて合成した。 増幅プライマーを精製するために、２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素スラ ブゲル上で粗オリゴヌクレオチド溶液を電気泳動で分離し、次に、対応するゲル のバンドから完全な長さの オリゴヌクレオチドを溶出した。ゲルスライスから溶出し、エタノール沈殿で濃 縮した後、プライマーをＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶かし、濃度をＯＤ（２６０ｎｍ） 測定により決定した。 検出用プローブをＨＲＰ（Boehringer）に結合させるために、架橋結合試薬Ｓ ＤＰＤ（Pharmacia）とＥＭＣＳ（Fluka）を使用してオリゴヌクレオチドのアミ ノリンクに酵素を結合させた。未結合のＨＲＰをＱｉａｇｅｎ Ｔｉｐ−１００ カラム(Qiagen)で取り除いた。ＨＲＰ−標識オリゴヌクレオチドを精製するため に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後水中での一晩のインキュベーシ ョンによりゲルスライスからＨＲＰ−結合オリゴヌクレオチドを溶出した。ＨＲ Ｐ−結合オリゴヌクレオチドの量をＯＤ（２６０ｎｍ）とＯＤ（４００ｎｍ）測 定から計算した。溶液を−７０℃で保存した。 ＮＡＳＢＡ増幅 ＲＮＡ増幅を、ＮＡＳＢＡを使用して行った。何故ならば、この増幅技術は、 ＤＮＡのバックグラウンドのある中でＲＮＡを特異的に増幅できるからである。 これらの増幅反応を標準ＮＡＳＢＡプロトコルを使用して行った。 増幅反応を始めるために、１０μｌの２．５×反応緩衝液 （100mMトリス−塩酸（ｐＨ８．５）；３０ｍＭ塩化マグネシウム；１０５ｍＭ 塩化カリウム；１２．５ｍＭジチオトレイトール；２．５ｍＭの各ｄＮＴＰ；５ ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ；３．７５ｍＭＧＴＰ；１．２５ｍＭのＩＴＰ ）を、６．２５μｌの４×プライマーミックス（０．８μＭの各プライマー；６ ０％のジメチルスルホキシド）、５μｌの核酸溶液及び１．７５μｌの蒸留水と 共に反応チューブに加えた。この混合物を６５℃で５分間加熱し、その後チュー ブを４１℃にした。２μｌの酵素混合物（４０ユニットのＴ７ＲＮＡポリメラー ゼ；８ユニットのＡＭＶ逆転写酵素；０．１ユニットのＲｎａｓｅＨ；１．２５ μｇ／μｌのＢＳＡ）を加え、チューブの内容物を軽く叩いて混合した。４１℃ で９０分間インキュベートして反応を進め、それを−２０℃にして反応を止めた 。 ポリメラーゼ連鎖反応 ＨＣＭＶのｍＲＮＡの対応する遺伝子を検出するために、ＰＣＲ増幅を使用し た（本質的に、Saikiら、1985に記載されたように行った）。 鋳型ＤＮＡとして、５μｌの核酸溶液を、適切なプライマー対（各１５ｐｍｏ ｌ）、デオキシリボヌクレオシド三リン酸 （各２００μＭ；Pharmacia）、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Perkin-Elmer） 、及び１．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼを含む合計２０μｌの増幅用反応 混合物に加えた。蒸発を防ぐために、反応物の上に１００μｌの鉱物油を重層し た。ＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin-Elmer）で９４℃で１分の変性、６０℃ で１分のプライマーアニーリング、７２℃で２分の鎖伸長、及び７２℃で１０分 の最終の断片伸長からなるサイクルの合計４０サイクルで、増幅を行った。 ＰＣＲ増幅生成物のサザンブロット解析 ２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０ｍＭの塩化ナトリウム；１５ｍＭのクエン酸 ナトリウムである）中で２時間の真空ブロッティングにより、増幅ＤＮＡを２． ０％のpronaroseゲル(Hispanagar,S.A.)からナイロン膜(Zeta-probe;BioRad，US A)に転移させた。５０℃でハイブリダイゼーション溶液（０．５Ｍのリン酸ナト リウム（ｐＨ７．２）；７％のドデシル硫酸ナトリウム）中で３０分間、膜をプ レインキュベートし、次に最終濃度約１０⁵ｃｐｍ／ｍｌで３２Ｐ標識オリゴヌ クレオチドプローブを添加した。ハイブリダイゼーションを、一晩５０℃で行っ た。次の洗浄を、０．１％のＳＤＳを補充した０．３× ＳＳＣ中、５０℃で行った。オートラジオグラフィーを、数時間，−７０℃でKo dak Royal X-omatフィルム及び増感スクリーンを用いて行った。 ＮＡＳＢＡ−増幅生成物の分析（ＥＬＧＡ） ＮＡＳＢＡ生成物の分析のために、液体ハイブリダイゼーションに基づいた非 放射活性の酵素結合ゲルアッセイ（ＥＬＧＡ）を使用した。 増幅生成物と特異的ＨＲＰ標識オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイ ゼーションを実施するために、２μｌの増幅反応物と、１μｌの５×ＳＳＣ、１ μｌの濃縮負荷(load ing)緩衝液（２５％（ｖ／ｖ）グリセロール；１０ｍＭの リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；０．０５％のブロムフェノールブルー ；０．０１％のキシレンシアノール）、及び１μｌ当たり約１０¹⁰分子を含むＨ ＲＰ−標識オリゴヌクレオチド溶液の１μｌを混合させ、続いて４５℃で１５分 間インキュベーションした。ハイブリダイゼーション後、反応混合物の半分を、 ０．０４％（ｗ／ｖ）の硫酸デキストランを補充した７％のポリアクリルアミド ゲルに直接載せた。結合及び未結合のＨＲＰ−標識オリゴヌクレオチドを電気泳 動で分離した後、５０ｍｌの基質溶液（１２５μｇ／ｍｌの３，３′，５，５′ −テトラ メチルベンジジン；０．００３％の過酸化水素；１００ｍＭのクエン酸ナトリウ ム緩衝液（ｐＨ５．２））を用いて約１０分間、室温で直接染色を行い、プロー ブをゲル中で可視化した。最後に、５０％（ｖ／ｖ）のメタノール溶液で一晩イ ンキュベーションをしてゲルを固定し、空気乾燥をした。 結果 プライマー及び感度 プラィマー対を用いてＮＡＳＢＡで達成できる分析感度を決定するために、in vi troで産生されたＣＭＶのＲＮＡの標準希釈系列を評価した。ＩＥＡのため のＣＭＶＡＤ １６９ＥｃｏＲＩ断片Ｊ（Schrier,R.D.,ら、Science 230,1048- 1051,,1985）のクローンされたサブフラグメントとｐｐ６７のためのｐｐ６７遺 伝子を含むＣＭＶクローンから、既知の濃度のＲＮＡ鋳型をin vitroで産生させ た。標準希釈系列を、in vitroで産生されたＲＮＡから調製した。 ＣＭＶ−ＩＥＡ（Ｅ４）プライマーセットの感度は、ＮＡＳＢＡ反応に提供し たin vitro産生ＲＮＡの少なくとも１００分子であることが再現性よく知見され た。ＣＭＶ−ＩＥＡ（Ｅ２／Ｅ３）プライマー対では、１００分子の匹敵しうる 感度が 達成できた。 ｐｐ６７プライマー対のプライマー性能を、ＣＭＶ ＡＤ１６９のｐｐ６７遺 伝子のクローン断片から転写されたinvvitro産生ＲＮＡで評価した。ＡＤ１６９ に由来するＣＭＶ−ｐｐ６７−４プライマー対の場合、ＮＡＳＢＡ条件を、この プライマー対の感度がin vitro産生ＲＮＡの１００分子になるように最適化でき た。Ｔｏｗｎｅ株の配列に基づくＣＭＶ−ｐｐ６７−１の下流プライマーのミス マッチから予期できるように、このプライマー対ではＣＭＶ ＡＤ１６９−由来 ｐｐ６７ＲＮＡから増幅生成物を産生できなかった。 in vitro産生ＲＮＡに加えて、真のウイルスｍＲＮＡもこれらのプライマーセ ットで同定できるかどうかを確立するために、ＣＭＶ ＡＤ １６９で感染され た繊維芽細胞から全核酸を抽出し、ＮＡＳＢＡで増幅した。全てのプライマーセ ットは、ノーザンブロット上にＣＭＶ特異的ＲＮＡ由来増幅生成物に対応するハ イブリダイゼーション信号を示した。ノーザンブロット分析は以下に記述するよ うに行った。 ＩＥＡ ＲＮＡ又はｐｐ６７ＲＮＡのin vitro転写に使用した組換えプラスミ ドの１０倍希釈系列に基づいて，ＰＣＲで使 用したとき、ＮＡＳＢＡプライマー対の検出下限は約５０−１００ゲノム相当物 であった。 ＨＣＭＶのｍＲＮＡ及びＤＮＡの検出 Ｕ１ＡのｍＲＮＡの内部対照が全てのサンプルで陽性であったので、ＩＥＡ遺 伝子とそれに対応するｍＲＮＡの存在を、３５体の標本の全シリーズについて更 に分析した。ＰＣＲ増幅を行うと、ＩＥＡ遺伝子のプライマーを使用するとき、 １８の標本でＣＭＶ−ＤＮＡが陽性であった（表２）。しかし、ｐｐ６７遺伝子 プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うと、これらの１８の標本のうち２つでＣＭ Ｖ−ＤＮＡを検出できなかった（ＯＴ２８及び０Ｔ３４、表２）。これは、既に ２つのプライマー対をｐｐ６７遺伝子のために使用したという事実にもかかわら ず、未だ２つの標本がＣＭＶ−ＤＮＡに対し偽陰性であったということを示す。 最も考えられるのは、これは、ＨＣＭＶゲノムのこの部分での臨床株の間の配列 の変異によるということである。何故ならば、ＩＥＡ遺伝子標的とｐｐ６７遺伝 子標的のためのプライマーセットの感度は同程度であるからである。 ＰＣＲによるＤＮＡ検出のために使用されたものと同じプライマー対を用いて ＮＡＳＢＡ増幅によるＩＥＡのｍＲＮＡに関 して標本を分析したところ、ＰＣＲで陽性であったほぼ全ての標本がまたＮＡＳ ＢＡでも陽性であることが知見された。それ故、ＣＭＶ−ＩＥＡのＤＮＡに関し 陽性であった全ての標本の内、唯一の患者標本の例外はあるが、同族のｍＲＮＡ も同様に検出できた。 ＮＡＳＢＡによるｐｐ６７のｍＲＮＡの分析によると、驚くほど結果が異なっ ていた。 唯一の標本を例外として、全てのＤＮＡ陽性標本がＩＥＡ−ｍＲＮＡでも同様 に陽性であったＩＥＡと対照的に、ｐｐ６７ｍＲＮＡは、ＣＭＶ−ＤＮＡ陽性患 者のサブセットでのみ検出できた（表２）。ＩＥＡ標的とｐｐ６７標的のｍＲＮ ＡとＤＮＡ検出のデータを表３に要約してある。これらの患者でのｐｐ６７ｍＲ ＮＡの存否をかれらの臨床状態と関連づけると、ｐｐ６７のｍＲＮＡの存在とＣ ＭＶ関連の可能性がある臨床症状の間の著しい関連が観察された（表４）。この 群の２人の患者は、移植臓器機能不全と発熱を伴った移植拒絶の症状を示した。 他の患者の臨床診断は心臓移植後の胃炎であり、腎臓移植受容者の網膜炎であっ た。更に、網膜炎はまた、３人のＣＭＶ−ｐｐ６７ｍＲＮＡ陽性エイズ患者でも 観察され、その内２人はまた食道炎に罹っていた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＣＭＶ病の疑いのあるヒトの血液標本中にヒトサイトメガロウイルスの後 期構造蛋白質をコードするｍＲＮＡの存在を検出することを特徴とする症状のあ るＣＭＶ病の診断方法であって、以下の段階、 −標的配列と特異的に反応できるプライマー対と適切な増幅試薬を使用して上記 ｍＲＮＡ内の標的配列を増幅すること、 −増幅した核酸を含む場合がある標本と増幅した配列の一部に相補的な配列を有 する標識核酸プローブを反応させること、 −増幅した配列とプローブの間で形成されるハイブリッドを検出すること、 を含む方法。 ２． 上記ｍＲＮＡがｐｐ６７のｍＲＮＡである請求項１に記載の方法。 ３． 転写をベースとした増幅技術を使用して、ｍＲＮＡを増幅する請求項１又 は２に記載の方法。 ４． 上記増幅技術がＮＡＳＢＡである請求項３に記載の方法。 ５． ＨＣＭＶのｐｐ６７をコードする核酸配列の一部に対応 するオリゴヌクレオチドであって、１０−３５ヌクレオチドの長さであり、以下 の配列からなる群から選択される配列の少なくとも１０ヌクレオチドの断片を含 むオリゴヌクレオチド。 ６． プロモーター配列に結合した請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。 ７． ＨＣＭＶのｐｐ６７配列内に位置する標的配列の増幅用プライマーセット であって、 以下の核酸配列から本質的になる１つのプライマーと 以下の核酸配列から本質的になる第２のプライマー を含むプライマーセツト。 ８． ＨＣＭＶのｐｐ６７配列内に位置する標的配列の増幅用プライマーセット であって、 以下の核酸配列から本質的になる１つのプライマーと 以下の核酸配列から本質的になる第２のプライマー を含むプライマーセット。 ９． 請求項２の方法におけるプライマーとしての、請求項５に記載のオリゴヌ クレオチドのいずれかの使用。 １０． 請求項２の方法におけるプローブとしての、検出可能な標識で標識され た以下の配列から本質的になるオリゴヌクレオチドの使用。 １１． 請求項７及び／又は８に記載の、プライマーの１つ又は複数のセット、 及び プライマーの上記セットにより規定される増幅した核酸配列の少なくとも一部に 実質的に相補的な核酸配列を含む、検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオ チド、 を含むＨＣＭＶ病の診断用テストキット。