FI120912B - Alukkeita ja koettimia CMV:n nukleiinihapon monistamiseksi ja havaitsemiseksi - Google Patents
Alukkeita ja koettimia CMV:n nukleiinihapon monistamiseksi ja havaitsemiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI120912B FI120912B FI961678A FI961678A FI120912B FI 120912 B FI120912 B FI 120912B FI 961678 A FI961678 A FI 961678A FI 961678 A FI961678 A FI 961678A FI 120912 B FI120912 B FI 120912B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- sequence
- nucleic acid
- primer
- mrna
- amplification
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Alukkeita ja koettimia CMV:n nukleiinihapon monistamiseksi ja havaitsemiseksi
Keksintö koskee oligonukleotideja, joita voidaan 5 käyttää alukkeina ja koettimina ihmisen sytomegaloviruksen (HCMV) mRNA:n havaitsemiseksi. Lisäksi siitä saadaan käyttöön menetelmä HCMV:n aiheuttaman taudin diagnosoimiseksi.
Ihmisen sytomegalovirus on kaikkialla esiintyvä herpes-tyyppinen virus, jonka kaksijuosteinen DNA-genomi 10 on noin 240 000 nukleotidin pituinen ja joka infektoi 40 -80 % ihmisistä ennen puberteettia. Kaikille herpes-viruksille yhteinen merkittävä piirre on se, että ne jäävät infektion jälkeen elimistöön koko eliniäksi ja se, että ne kykenevät aiheuttamaan uuden infektion aktivoiduttuaan 15 uudelleen [Stevens, J.G., Microbiol. Rev. 53 (1989) 318 -332]. Myös HCMV jää latentiksi primaari-infektion jälkeen, joka tapahtuu usein kliinisiä oireita aiheuttamatta. Immu-nokompetentissa isännässä jopa uusiva infektio on useimmissa tapauksissa oireeton tai aiheuttaa vain lievän tau-20 din. Kongenitaalisesti infektoituneilla vastasyntyneillä ja immuunivajavuustilaisilla potilailla, kuten allograftin saaneilla potilailla [Meyers, J.D., et ai., J. Infect. Dis. 153 (1986) 478 - 488] tai AIDS-potilailla [Drew, W.L., J. Infect. Dis. 158 (1988) 449 - 456; Drew, W.L., 25 Clin. Infect. Dis 14 (1992) 608 - 615], joilla immuunijärjestelmän ja latentin viruksen välinen hienojakoinen tasapaino on häiriintynyt, saattaa HCMV aiheuttaa vakavan ja toisinaan hengenvaarallisen taudin, kuten retiniitin, jonkin ruuansulatuskanavan häiriön tai enkefaliitin (Drew, 30 1992). Antiviraalisten lääkeaineiden, kuten gansikloviirin ja foskarnetin, antaminen varhaisessa vaiheessa saattaa vaikuttaa edullisesti potilaan ennusteeseen [Jahn, G. et ai., Intervirology 35 (1993) 60 - 72; Schmidt, G.M., et ai., N. Engl. J. Med. 324 (1991) 1005 - 1011]. Tästä syys-35 tä on varhaisessa vaiheessa tehtävällä ja herkällä diag- 2 noosilla erittäin suuri merkitys silloin, kun kliinisesti tehokasta antiviraalista hoitoa on saatavilla.
CMV-infektion markkerina voidaan käyttää CMV:lle spesifisiä vasta-aineita, erityisesti IgM-vasta-aineita, 5 mutta niiden avulla ei ole juurikaan mahdollista erottaa toisistaan latenttia ja aktiivista infektiota. Useimmilla nykyisin virusten havaitsemiseen käytetyillä menetelmillä ei pystytä yksiselitteisesti ennustamaan muuttuuko yksittäinen infektio oireiseksi. Serologiset menetelmät ovat 10 lisäksi epäsuoria ja niiden herkkyys on usein huono. CMV-viremian yhteydessä virusviljelyllä on diagnostisesti edellistä suurempi merkitys. Vaikka vaikuttaa siltä, että aktiivinen CMV-infektio saadaan osoitettua verisoluista tehtävällä CMV-viljelyllä, niin tällä menetelmällä diag-15 noosia ei saada nopeasti ja sen suorittaminen on teknisesti vaikeaa. Virusviljelyllä ei myöskään ole välttämättä vastaavuutta HCMV-tautiin. Joillakin immuunisuppressoi-duilla potilailla ei välttämättä ole luotettavaa vastaavuutta periferaalisen veren leukosyyteistä tehdyn virus-20 eristyksen ja kliinisten oireiden esiintymisen välillä [Delgado, R., et ai., J. Clin. Microbiol. 30 (1992) 1876 -1878]. Virusta irtoaa usein myös virtsateiden ja nielun limakalvolta ilman kliinisiä tai joissakin elimissä havaittavia oireita. Vaikka HCMV-DNA:n monistus perifeerisen 25 veren leukosyyteistä polymeraasiketjureaktiolla (PCR) onkin erittäin herkkä menetelmä CMV-viremian havaitsemiseksi, niin sitä ei myöskään voida käyttää kliinisiä oireita aiheuttavan HCMV-infektion markkerina. Koska entsymaatti-nen monistus on hyvin herkkä, niin HCMV-DNA:ta on voitu 30 toisinaan havaita perifeerisen veren leukosyyteistä ilman HCMVrhen liittyvää tautia. Tällä menetelmällä voidaan havaita latentin viruksen genomeja tai potilas saattaa jäädä HCMV-DNA-positiiviseksi pitkäksi aikaa taudin parannuttua [Jahn, G., et ai., 1993; Zipeto, D., et ai., J. Clin. Mic-35 robiol. 30 (1992) 527 - 530; Delgado, et ai., 1992].
3 Tällä hetkellä akuutin oireisen HCMV-infektion var-haisdiagnostiikassa käytettävä ensisijainen menetelmä on antigenemiamääritys, joka perustuu pp65-rakenneproteiinin immunologiseen havaitsemiseen spesifisillä vasta-aineilla 5 [Storch, G.A., et ai., J. Clin. Microbiol. 32 (1994) 997 -1003; Gerna, G. et ai., J. Infect. Dis. 164 (1991) 488 - 498; Gerna, G., et ai., J. Clin. Microbiol. 30 (1992) 1232 - 1237]. Tätä menetelmää käytettäessä huolenaiheena on kuitenkin sen herkkyys. pp65-positiivisten solujen lukumää-10 rä voi infektion varhaisvaiheessa olla erittäin pieni. pp65-antigeenin stabiliteetti vaikutti sitä ilmentävissä soluissa olevan lisäksi rajallinen [Chou, S., Curr. Opin. Infect. Dis. 5 (1991) 427 - 432] ja koska menetelmässä käytettiin proteiinin eri epitooppeja tunnistavien yhdistetty-15 jen anti-pp65-vasta-aineiden sijaan monoklonaalisia vasta-aineita, niin tämä saattaa heikentää sen herkkyyttä.
Koska viruksen replikaatioon tarvitaan mRNA-molekyylien transkriptiota, niin on tutkittu HCMV-mRNA:n havaitsemisen käyttöä aktiivisen CMV-infektion markkerina 20 [Bitsch, A., et ai., J. Infect. Dis. 167 (1993) 740 - 743].
Viime aikoina HCMV-infektioita on tutkittu tran-skriptiotasolla RNA-monistusta käyttäen [Bitsch, A., et ai., 1993; Meyer, T., et ai., Mol. Cell Probes. 8 (1994) 261 - 271; Gerna, G., et ai., J. Clin. Microbiol. 30 (1993) 25 1232 - 1237; Gerna, G., et ai., J. Clin. Microbiol., 30 (1992) 1232 - 1237]. Alukepari myöhäisgeenin (LA) nukle iinihapon havaitsemiseksi sytomegaloviruksen DNA:sta kuvataan julkaisussa EP 586 011. Virusantigeenien havaitsemisen tavoin pitäisi viruksen replikaation yhteydessä ilmentynei-30 den viruksen transkriptiotuotteiden analyysillä saada oireiset infektiot periaatteessa diagnosoitua luotettavasti. Tekniikan tasoa on edelleen kuvattu julkaisussa EP 329 822 ja W093/132227.
Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön sellainen mene-35 telmä, joka soveltuu kliinisiä oireita aiheuttavan CMV-taudin havaitsemiseksi ja joka perustuu HCMV:n myöhäisten 4 mRNA-sekvenssien havaitsemiseen, sekä nukleiinihapposek-venssejä, joita voidaan käyttää mainitussa menetelmässä.
Myöhäisten mRNA-molekyylien transkriptioon tarvitaan viruksen replikoitumista ja tästä syystä ne saattavat 5 olla spesifisiä aktiiviselle infektiolle.
Tätä keksintöä käyttämällä on havaittu, että HCMV:n tietyn myöhäisvaiheen mRNA:n havaitseminen on yhteydessä HCMV-taudin kliinisten oireiden ilmaantumiseen. Keksinnöstä saadaan käyttöön sellainen menetelmä HCMV-taudin diag-10 nosoimiseksi, jonka tunnusomaisena piirteenä on se, että mainittua tautia kantavaksi epäillyn henkilön verinäytteestä havaitaan mRNA:ta, joka koodaa ihmisen sytomegalo-viruksen myöhäistä rakenneproteiinia, ja mainittu menetelmä sisältää vaiheet, jotka ovat: 15 - monistetaan mainitussa mRNA:ssa oleva kohdesek- venssi käyttäen alukeparia, joka kykenee spesifisesti reagoimaan mainitun kohdesekvenssin ja sopivien monistukseen käytettävien reagenssien kanssa, - saatetaan vaihtoehtoisesti monistettua nukleiini-20 happoa sisältävä näyte reagoimaan sellaisen leimalla varustetun nukleiinihappokoettimen kanssa, jonka sekvenssi on komplementaarinen monistetun sekvenssin osan suhteen ja - havaitaan monistetun sekvenssin ja koettimen välille muodostuneet hybridit.
25 Kun tutkittiin tiettyjen myöhäisen mRNA:n esiinty misen tai niiden puuttumisen korrelaatiota kliiniseen statukseen, havaittiin huomiota herättävä yhteys näiden myöhäisten mRNA-molekyylien esiintymisen ja mahdollisesti CMV:hen liittyvien kliinisten oireiden välillä.
30 CMV-mRNA:n havaitsemisen herkkyys ja luotettavuus on suurelta osin riippuvainen valitusta alukkeesta, koska CMV-kantojen välistä sekvenssien variaatiota esiintyy mahdollisesti genomin kaikilla alueilla. Ihannetapauksessa alukkeen valinnan tulisi perustua siihen, että ehdokkaina 35 olevissa alukesekvensseissä esiintyvä kantojen välinen 5 vaihtelu sekä alukekohtien yhteensopimattomuuden seurausvaikutukset tunnetaan [Chou, S., J. of Clin. Microbiol. (1992) 2307 - 2310].
Tämän perusteella on olemassa tarve saada käyttöön 5 sopivia oligonukleotideja, mukaan luettuna nukleiinihappo-sekvenssit, joita voidaan käyttää alukkeina ja hybridisaa-tiokoettimina kaikkien CMV-kantojen varianttien monistuksessa ja sen jälkeen niiden havaitsemisessa.
Tämä keksintö liittyy tietyn myöhäisen HCMV-mRNA:n 10 havaitsemiseen ja siitä saadaan käyttöön sopivia alukkeita ja koettimia tämän mRNA:n monistamiseksi ja sen jälkeen sen havaitsemiseksi. Tämän keksinnön mukaisten alukkeiden ja koettimien sitoutumiskohdat sijaitsevat matriksin pp67-vaippaproteiinia koodaavassa geenisekvenssissä (UL65 ), jo-15 ka ilmentyy CMV-infektion myöhäisvaiheessa.
Termi "oligonukleotidi" tarkoittaa tässä keksinnössä molekyyliä, kuten alukkeita tai koettimia, joka koostuu kahdesta tai useammasta deoksiribonukleotidista tai ribo-nukleotidista.
20 Termi "aluke" tarkoittaa tässä keksinnössä joko luonnossa (esimerkiksi restriktiofragmenttina) esiintyvää tai synteettisesti valmistettua oligonukleotidia, joka kykenee toimimaan sellaisen alukkeen pidennystuotteen synteesin aloituskohtana, joka on komplementaarinen nukleii-25 nihappojuosteeen (mallisekvenssin tai kohdesekvenssin) suhteen sopiviin olosuhteisiin (esimerkiksi puskuri, suolapitoisuus, lämpötila ja pH) vietynä nukleotidien tai nukleiinihappojen polymerointiin tarkoitetun aineen, kuten DNA:sta riippuvaisen tai RNA:sta riippuvaisen polymeraa-30 sin, läsnä ollessa. Alukkeen täytyy olla riittävän pitkä toimiakseen alukkeena pidennystuotteiden synteesissä poly-merointiaineen läsnä ollessa. Tyypillinen aluke sisältää vähintään noin 10 nukleotidin mittaisen sekvenssin, joka on olennaisesti komplementaarinen (P1) tai homologinen 35 (P2) kohdesekvenssin suhteen, mutta hieman pidemmät aluk- 6 keet ovat edullisia. Alukkeet sisältävät tavallisesti noin 15 - 26 nukleotidia, mutta voidaan käyttää myös tätä pidempiä, jopa 35 nukleotidin mittaisia alukkeita.
Alukesarja koostuu tavallisesti vähintään kahdesta 5 alukkeesta, toisesta "vastasuuntaisesta" alukkeesta ja toisesta "myötäsuuntaisesta" alukkeesta, joiden molempien perusteella monistettava sekvenssi (sekvenssi, joka monistetaan mainittuja alukkeita käyttäen) määräytyy.
Vastasuuntainen aluke (P1) sisältää aina sekvens-10 sin, joka on olennaisesti komplementaarinen sen kohdesek-venssin suhteen, johon aluke voi pariutua. Myötäsuuntainen aluke (P2) sisältää sekvenssin, joka on olennaisesti homologinen kohdesekvenssin suhteen.
Aluke voi vaihtoehtoisesti sisältää myös promootto-15 risekvenssin. Termi "promoottorisekvenssi" tarkoittaa sellaista nukleiinihapposekvenssin aluetta, jonka RNA-polyme-raasi spesifisesti tunnistaa ja johon se sitoutuu käynnistäen transkriptiotapahtuman, jonka tuloksena muodostuu RNA-transkriptiotuotetta. Periaatteessa voidaan käyttää 20 mitä tahansa promoottorisekvenssiä, jolle on olemassa tunnettu ja saatavilla oleva polymeraasi, joka kykenee tunnistamaan aloitussekvenssin. Tunnettuja ja käyttökelpoisia promoottoreita ovat tiettyjen bakteriofagi-RNA-polymeraa-sien, kuten bakteriofagien T3, T7 tai SP6, tunnistamat 25 promoottorit.
On selvää, että tämän keksinnön mukaisista sekvensseistä koostuva nukleiinihappoaluke voi sisältää sellaisen määrän pieniä nukleiinihappodeleetioita, -additioita ja/ tai -substituutioita, että tällaiset muutokset eivät vai-30 kuta merkittävässä määrin haitallisesti saantoon tai saa tuun tuotteeseen.
Tällä alalla tunnetaan monia erilaisia menetelmiä nukleiinihappojen monistamiseksi. Yksi esimerkki DNA-koh-desegmentin monistukseen käytettävästä menetelmästä on 35 niinsanottu "polymeraasiketjureaktio" (PCR). PCR-menetel- ; 7 mässä tietyn kohdesegmentin kappalemäärää lisääntyy eksponentiaalisesti jokaisen syklin aikana. Kussakin syklissä DNA-aluke pariutuu kaksijuosteisen kohde-DNA-sekvenssin kunkin juosteen 3'-puolelle. Alukkeet pidennetään DNA-po-5 lymeraasilla useiden erilaisten mononukleotidien läsnä ollessa. Pidennystuotteet muutetaan yksijuosteisiksi lämpö-denaturoimalla ja kukin juoste pystyy toimimaan seuraavassa syklissä mallijuosteena alukkeen pariutumisessa ja sen jälkeen tapahtuvassa pidennyksessä. PCR-menetelmä on ku-10 vattu julkaisussa Saiki, et ai., Science 230 (1985) 135, sekä EP-patenttijulkaisuissa nro EP 200 362 ja EP 201 184.
Toinen menetelmä nukleiinihapon monistamiseksi on niin sanottu transkriptioon perustuva monistusjärjestelmä (TAS). TAS:ssä käytetään RNA-transkriptiotuotteen valmis-15 tusvaihetta, joka alkaa DNA:sta, joka on syntetisoitu siten, että se sisältää segmentin kohdesekvenssistä sekä promoottorin, minkä tarkoituksena on mahdollistaa transkriptio, joka alkaa kohteen sekvenssin suhteen komplementaarisen sekvenssin sisältävästä RNA-segmentistä. On mah-20 dollista suorittaa useita syklejä, koska transkriptiovai-heessa valmistettu RNA voi toimia mallina sellaisen samalla tavalla transkriboitavan DNA:n valmistuksessa, joka vuorostaan voidaan transkriboida siten, että saadaan lisää RNA:ta. TAS-menetelmä on kuvattu WO-patenttihakemusjulkai-25 sussa nro W0 88/10 315.
Vielä yksi menetelmä nukleiinihapon monistamiseksi on nukleiinihapposekvenssiin perustuva monistusmenetelmä ("NASBA"), joka on kuvattu EP-patenttijulkaisussa nro 329 822. TAS:n tavoin NASBA:ssa on RNA-transkriptiotuot-30 teen valmistusvaihe, jossa käytetään T7:n RNA-polymeraasia transkriboimaan useita kappaleita RNA:ta kaksijuosteisesta DNA-mallista, joka sisältää T7:n promoottorisekvenssin.
Havaitsemiskoettimena käytetty oligonukleotidisek-venssi voidaan varustaa leimalla käyttäen havaittavaa ryh-35 mää. Tällä alalla tunnetaan monia ryhmiä, jotka soveltuvat 8 käytettäväksi leimalla varustamiseen. Mainittu ryhmä voi olla esimerkiksi joko radioaktiivinen yhdiste, havaittava entsyymi [esimerkiksi piparjuuriperoksidaasi (HRP)] tai mikä tahansa ryhmä, joka pystyy saamaan aikaan havaittavan 5 signaalin, kuten kolorimetrisen, fluoresoivan, kemilumi-nesoivan tai elektrokemiluminesoivan signaalin.
pp67-geenisekvenssin kyseessä ollessa esiintyy CMV:n AD169- ja Towne-kannoissa kantojen välistä vaihtelua. Tästä syystä tälle kohteelle valittiin kaksi alukepa-10 ria, CMV-pp67-l ja CMV-pp67-4 (taulukko 1), joista kumpikin oli peräisin samalta geenialueelta mutta kumpikin perustui eri laboratoriokantaan. Esimerkkinä pp67:n mRNA:n havaitsemiseen käytetyistä oligonukleotideista ovat pituudeltaan 10 - 35 nukleotidin mittaiset oligonukleotidit, 15 jotka sisältävät vähintään 10 nukleotidin mittaisen fragmentin sekvensseistä, jotka ovat: 5'-GGGTCGATTCAGACTGA-3' 5'-GGGTCGATTCGAGACCGA-3' tai 51-GACCTGATATCCCTCCATATA-3'.
20 Tämän keksinnön mukaiseen edulliseen alukesarjaan kuuluvat seuraavat oiigonukleotidisekvenssit: 5'-aattctaatacgactcactatagggagaGGGTCGATTCAGACTGA-3' tai 5'-aattctaatacgactcactatagggagaGGGTCGATTCGAGACCGA-3' sekvenssiin 5'-GACCTGATATCCCTCCATATA-3' yhdistettynä.
25 Sekvensseissä on esitetty T7:n promoottorisekvens si, mutta sen tilalla voidaan käyttää mitä tahansa muuta sopivaa promoottorisekvenssiä.
Koetin, jota voidaan käyttää tätä alukesarjaa käyttäen muodostetun monistustuotteen havaitsemiseen, voi ol-30 la oiigonukleotidi, joka sisältää olennaisesti sekvenssin 5'-GGATTCGGACTTTCCGTTCGA-3'.
Mainitun sekvenssin sisältävät koettimet kuuluvat myös tämän keksinnön piiriin.
Edullinen menetelmä RNA:n monistamiseksi (tämän 35 keksinnön mukaisella menetelmällä) on NASBA-menetelmä tai 9 jokin toinen transkriptioon perustuva monistusmenetelmä. Tämä monistusmenetelmä koostuu spesifisen RNA-alueen monistuksesta alukkeen ohjamana in vitro -olosuhteissa [Kievits, et ai., 1991; Compton J., Nature 350 (1991) 91 -5 92] .
Jos viruksen transkriptiotuotteiden havaitsemiseen käytetään RT-PCR:ää, niin on tarpeen erotella toisistaan mRNA- ja DNA-peräiset PCR-tuotteet. Silmukoituneiden transkriptiotuotteiden, kuten IEA-mRNA:n, kohdalla voidaan 10 käyttää eksoni-intronirakennetta. Myöhäisiä rakennepro- teiineja koodaavat mRNA-molekyylit ovat kuitenkin lähes yksinomaan silmukoitumattomien transkriptiotuotteiden koodaamia. Ennen RT(käänteistranskriptaasi)-PCR:ää voidaan käyttää DNaasikäsittelyä [Bitsch, A., et ai., J. Infect. 15 Dis. 167 (1993) 740 - 743, Meyer, T., et ai., Mol. Cell Probes. 8 (1994) 261 - 271] mutta toisinaan sillä ei saada poistettua kontaminoivaa DNA:ta riittävässä määrin (Bitsch, A., et ai., 1993).
Toisin kuin RT-PCR:ssä, ei NASBA:ssa, joka perus-20 tuu T7-RNA-polymeraasin aikaansaamaan RNA-transkriptioon (Kievits, et ai., 1991, Compton, 1991), tarvitase erottaa RNA- ja DNA-peräisiä monistustuotteita toisistaan, koska menetelmän ensisijaisena kohteena käytetään pelkästään RNA:ta. NASBA mahdollistaa RNA-kohteiden spesifisen mo-25 nistamisen jopa DNA-taustaa sisältävistä näytteistä. Tämä menetelmä on edullinen erityisesti silmukoitumattomien kohteiden, kuten lähes kaikkien myöhäisten HCMV-geenien transkriptiotuotteiden, kyseessä ollessa, koska siinä ei tarvitse käyttää DNaasi-käsittelyä, joka toisinaan saattaa 30 olla tehoton (Bitsch, A., et ai., 1993).
Tätä menetelmää käytettiin CMV-transkriptiotuottei-den analysoitiin elinsiirteen vastaanottajilta ja HIV-in-fektion saaneilta potilailta otetuista kokoverinäytteistä.
Tähän keksintöön kuuluvat myös testipakkaukset, 35 jotka on tarkoitettu CMV:n havaitsemiseen kliinisistä 10 näytteistä. Tämän keksinnön mukainen testipakkaus voi sisältää sarjan tämän keksinnön mukaisia alukkeita ja tämän keksinnön mukaisen koettimen. Tällainen testipakkaus voi sisältää lisäksi sopivia monistuksessa käytettäviä rea-5 gensseja, kuten DNA- ja RNA-polymeraaseja ja mononukleo-tideja. Tämän keksinnön mukaisen menetelmän yhteydessä käytettävät testipakkaukset voivat sisältää tämän keksinnön mukaisia alukkeita ja koetinta pp67-mRNA:n monistamiseksi ja sen jälkeen sen havaitsemiseksi.
10 Seuraava esimerkki on esimerkkinä tästä keksinnös tä.
Esimerkit
Esimerkki 1: CMV:n DNA:n ja mRNA:n analysointi kliinisistä näytteistä 15 Materiaalit ja menetelmät
Kliiniset näytteet
Esivarhaista antigeeniä (IEA, immediate early antigen) tai CMV-infektion myöhäisvaiheessa ilmentyvää mat-riksin vaippaproteiinia pp67 koodaavien mRNA-molekyylien 20 esiintyminen määritettiin näytteistä, jotka oli otettu potilailta, jotka olivat kliinisesti vaarassa saada CMV-in-fektion.
Otettiin 35 verinäytettä immuunivajavuustilaisista potilaista, joista 22 oli sydän-, maksa- tai munuaissiir-25 teen vastaanottajia, kahdeksan AIDS-potilasta, kaksi leukemiapotilasta, yksi myelodysplastista syndroomaa sairastava potilas, yksi primaarista Epstein-Barrin viruksen aiheuttamaa mononukleoosia sairastava potilas ja yksi potilas, jolla oli Kaposin sarkooma. Etyleenidiamiinitetra-30 etikkahappo (EDTA) -antikoagulanttikäsitellyt verinäytteet, jotka oli toimitettu näytteenoton jälkeen laboratorioon vietäviksi, yhdistettiin niiden omaan tilavuuteen nähden yhdeksänkertaiseen tilavuuteen hajotuspuskuria [50 mM Tris-suolahappo (pH 6,4); 20 mM EDTA; 1,3 % (w/v) 11
Triton X-100; 5,25 M guanidiniumtiosyanaatti] ja varastoitiin -70 °C:ssa siihen asti, kunnes ne otettiin käyttöön.
Nukleiinihappojen eristäminen
Kokonaisnukleiinihappo eristettiin antikoagulantil-5 la käsitellyistä verinäytteistä hajottamalla solut guani-diniumtiosyanaatilla ja adsorboimalla nukleiinihapot sili-kapartikkeleihin [Boom, et ai., J. of Clin Microbiol. 28 (1990) 495 - 503] .
Hajotuspuskuriliuoksessa olevat kokoverinäytteet 10 sulatettiin ja kustakin näytteestä siirrettiin Eppendorf-putkeen 1 ml (tämä vastaa 100 μΐ kokoverta). Seokseen lisättiin sitten 70 μΐ suolahapolla aktivoituja piidioksidi-partikkeleita [0,1 M suolahappoon valmistettu koon mukaan valikoitu suspensio, joka sisälsi 1 mg/ml partikkeleita 15 (Sigma); tätä on käsitelty julkaisussa Boom, et ai., 1990] ja suspensiota inkuboitiin huoneenlämmössä 10 minuutin ajan tasaisesti sekoittaen. Silikaan sitoutunut nukleiinihappo sentrifugoitiin putken pohjalle. Napiksi sentrifu-goidut silikapartikkelit pestiin kaksi kertaa 1 ml:11a 20 GuSCN-pesupuskuriliuosta [50 mM Tris-suolahappoa (pH 6,4); 5,25 M guanidiniumtiosyanaattia], ja sen jälkeen kaksi kertaa 1 ml:11a 70-%:ista etanolia ja kerran 1 ml:11a asetonia. Suspensio sentrifugoitiin lyhyesti kunkin pesuvai-heen jälkeen ja silikanappi suspendoitiin uudelleen seu-25 raavaan pesuliuokseen perusteellisesti sekoittamalla. Ase tonin poistamisen jälkeen silikapartikkelit kuivattiin in-kuboimalla 56 °C:ssa lämpöblokissa 10 minuutin ajan. Nukleiinihappo eluoitiin silikapartikkeleista inkuboimalla niitä 100 pl:ssa tislattua vettä 56 °C:ssa 10 minuutin 30 ajan. Lopuksi silikapartikkelit sentrifugoitiin koeputkien pohjalle ja supernatantti pipetoitiin huolellisesti uusiin reaktiokoeputkiin ja varottiin, ettei yhtään silikaa joutunut uusiin koeputkiin. Uutetut nukleiinihapponäytteet varastoitiin -70 °C:ssa siihen asti, kunnes ne otettiin 35 käyttöön.
12
Uutetun RNA:n eheys ja sen määrä varmistettiin näistä eristetyistä näytteistä ennen CMV-mRNA:n havaitsemista.
Tätä tarkoitusta varten näytteistä määritettiin 5 sellaisen Ul-snRNP-spesifisen A-proteiinin (U1A) mRNA:n esiintyminen [Sillekens, P.T.G., et ai., EMBO J. 6 (1987) 3841 - 3848], joka on suhteellisen pienikokoinen voimakkaasti esiintyvä lähetti-RNA, joka transkriboituu solun taloutta ylläpitävästä geenistä. Northern-blottauksella 10 saatiin selville, että monistettavissa olevaa U1A mRNA:ta esiintyi selvästi kaikissa näytteissä (koetuloksia ei ole esitetty).
Alukkeet ja koettimet
Taulukossa 1 on esitetty alukkeiden ja spesifiseen 15 havaitsemiseen käytettyjen koettimien sekvenssit ja niiden polariteetti.
Kaikki oligonukleotidialukkeet ja -koettimet synte-toitiin PCR-MATE 391 DNA-syntetisointilaitteella (Applied Biosystems) biokemiallisella fosforamidiittimenetelmällä.
20 ELGA-havaitsemisessa käytetyt oligonukleotidit (esitetty jäljempänä) syntetoitiin siten, että niiden 5'-päähän tuli sitoutumiskohta (Aminolink 2; Applied Biosystems), johon tämän jälkeen voidaan liittää piparjuuriperoksidaasi (HRP).
25 Monistusalukkeet puhdistettiin elektroforeettisesti erottamalla puhdistamattomat oligonukleotidiliuokset slab-geelissä, joka oli valmistettu 20-%:isesta polyakryyliami-dista ja 7 M ureasta, ja täysimittainen oligonukleotidi eluoitiin sitten sitä vastaavasta geelivyöhykkeestä. Kun j
30 alukkeet oli ensin eluoitu geelileikkeistä ja konsentroitu J
saostamalla etanolilla, niin ne liuotettiin sitten Milli-Q-veteen ja konsentraatiot määritettiin määrittämällä A(260 nm).
Havaitsemiskoettimet konjugoitiin HRP:hen (Boehrin-35 ger) kytkemällä entsyymi oligonukleotidissa olevaan amino- 13 sidokseen käyttäen SDPD- (Pharmacia) ja EMCS- (Fluka) sil-loitusreagensseja. Sitoutumaton HRP poistettiin Qiagen Tip-100 -kolonnissa. HRP-leimalla varustetut oligonukleo-tidit puhdistettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla 5 ja HRP-oligonukleotidit eluoitiin sitten geelileikkeistä inkuboimalla yön yli vedessä. HRPrhen konjugoituneen oli-gonukleotidin määrä laskettiin määritettyjen A(260 nm) ja A(400 nm) -arvojen perusteella. Liuoksia varastoitiin -70 °C:ssa.
10 NASBA-moni stus RNA-monistukset tehtiin NASBA:aa käyttäen, koska tällä monistusmenetelmällä pystytään spesifisesti monistamaan RNA:ta DNA:n läsnä ollessa. Nämä monistusreaktiot tehtiin tavanomaista NASBA:n suoritusvaiheita käyttäen: 15 Monistusreaktion valmisteluvaiheessa reaktiokoe- putkeen lisättiin 10 μΐ 2,5 x reaktiopuskuriliuosta [100 mM Tris-suolahappo (pH 8,5); 30 mM magnesiumkloridi;
105 mM kaliumkloridi; 12,5 mM ditiotreitoli; 2,5 mM kutakin dNTP:tä; 5 nM ATP, CTP ja UTP; 3,75 mM GTP; 1,25 mM
20 ITP] sekä 6,25 μΐ 4 x alukeseosta [0,8 μΜ kutakin aluket-ta, 60-%:inen dimetyylisulfoksidi], 5 μΐ nukleiinihappo- liuosta ja 1,75 μΐ tislattua vettä. Tätä seosta kuumennettiin 65 °C:ssa 5 minuutin ajan ja tämän jälkeen koeputket vietiin 41 °C:seen. Reaktioseokseen lisättiin 2 μΐ entsyy-25 miseosta [40 yksikköä T7:n RNA-polymeraasia; 8 yksikköä AMV-käänteiskopiointientsyymiä; 0,1 yksikköä RNaasi H:ta, 1,25 pg/μΐ BSA:ta] ja koeputkea ravisteltiin varovasti taputtelemalla. Reaktioseosta inkuboitiin 41 °C:ssa 1 90 minuutin ajan ja reaktio lopetettiin panemalla seos 30 -20 °C:een.
Polymeraasiketj ureaktio HCMV-mRNA-molekyylejä vastaavien geenien havaitsemiseen käytettiin PCR-monistusta [tämä suoritettiin olennaisilta osiltaan julkaisussa Saiki, et ai. (1985) kuva-35 tulla tavalla].
14
Malli-DNA:ksi lisättiin 5 μΐ nukleiinihappoliuos-ta yhteensä 20 plraan monistusreaktioseosta, joka sisälsi tarkoituksenmukaisen alukeparin (15 pmol kumpaakin), deok-siribonukleosiditrifosfaatteja (200 μΜ kutakin; Pharma-5 cia), 2 μΐ 10 x PCR-puskuria (Perkin-Elmer) ja 1,25 yksikköä Taq-polymeraasia. Reaktioseosten pinnalle lisättiin haihtumisen estämiseksi 100 μΐ mineraaliöljyä. Monistus-reaktio tehtiin DNA-lämpösyklilaitteessa (Perkin-Elmer), jossa suoritettiin 40 sykliä, joihin kuului denaturoin-10 ti 94 °C:ssa 1 minuutin ajan, alukkeiden pariutuminen 60 °C;ssa 1 minuutin ajan, ketjun pidennys 72 °C;ssa 2 minuutin ajan ja viimeinen pidennysvaihe 72 °C:ssa 10 minuutin ajan.
PCR-monistettujen tuotteiden Southern-blottaus-15 määritys
Monistettu DNA siirrettiin 2,0-%:isesta pronarose-geelistä (Hispanagar, S.A.) nailonkalvolle (Zeta-probe, BioRad, USA) vakuumiblottaamalla 2 x SCC:ssä [1 x SCC sisältää 150 mM natriumkloridia; 15 M natriumsitraattia] 20 2 tunnin ajan. Kalvoja esi-inkuboitiin ensin 50 °C:ssa hybridisaatioliuoksessa [0,5 M natriumfosfaatti (pH 7,2); 7 % natriumdodekyylisulfaatti] 30 minuutin ajan ja niihin lisättiin sitten sellainen määrä 32P-leimalla varustettua oligonukleotidikoetinta, että sen lopulliseksi kon-25 sentraatioksi saatiin noin 105 cpm/ml. Hybridisaatio tehtiin yön yli 50 °C:ssa 0,3 x SCC:ssä, jota oli täydennetty 0,1 %:isella SDS:llä. Autoradiografia tehtiin useiden tuntien aikana -70 °C:ssa käyttäen Kodak Royal X-omat -filmiä ja vahvistinlevyjä.
30 NASBA:lla monistettujen tuotteiden analysointi (ELGÄ) NASBA-tuotteiden analysoimiseen käytettiin nestemäisissä olosuhteissa suoritettavaan hybridisaatioon perustuvaa ei-radioaktiivista entsyymivälitteistä geelimää-35 ritystä (ELGA, enzyme-linked gel assay).
15
Monistustuotteen hybridisointi spesifiseen HRP-lei-malla varustettuun oligonukleotidikoettimeen tehtiin yhdistämällä 2 μΐ monistusreaktioseosta 1 pl:aan 5 x SCC:tä, 1 plraan konsentroitua täyttöpuskuriliuosta [25 % (v/v) 5 glyserolia, 10 mM natriumfosfaattipuskuriliuosta (pH 7,0); 0,05 % bromifenolisinistä; 0,01 % ksyleenisyanolia] ja 1 pl:aan HRP-leimalla varustettua oligonukleotidiliuosta, joka sisälsi noin 1010 molekyyliä mikrolitrassa, minkä jälkeen seosta inkuboitiin 45 °C:ssa 15 minuutin ajan. Hybri-10 disaation jälkeen puolet reaktioseoksesta lisättiin suoraan 7-%:iseen polyakryyliamidigeeliin, jota oli täydennetty 0,04-%:isella (w/v) dekstraanisulfaatilla. Kun sitoutuneet ja sitoutumattomat HRP-leimalla varustetut oli-gonukleotidit oli erotettu elektroforeesilla, niin koetin 15 visualisoitiin geelissä värjäämällä suoraan 50 ml:11a substraattiliuosta [125 pg 3,3',5,5'-tetrametyylibentsi-diiniä millilitraa kohti; 0,003 % vetyperoksidia; 100 mM natriumsitraattipuskuriliuosta (pH 5,2)] noin 10 minuutin ajan huoneenlämmössä. Lopuksi geeli kiinnitettiin inkuboi-20 maila 50-%:isessa (v/v) metanoliliuoksessa yön yli ja kuivattiin ilmassa.
Tulokset
Alukkeet ja herkkyys Näiden alukeparien avulla NASBArssa saavutettavis-25 sa olevan analyysiherkkyyden määrittämiseksi arvioitiin in vitro -olosuhteissa muodostetusta CMV-RNA:sta valmistettua standardilaimennossarjaa. RNA-templaattia, jonka konsent-raatio tunnettiin, muodostettiin in vitro -olosuhteissa CMV AD 169 EcoRl-fragmentin kloonatusta alafragmentista 30 [Schrier, R.D., et ai., Science 230 (1985) 1048 - 1051] IEArta varten ja pp67-geenin sisältävä CMV-klooni pp67:ää varten. In vitro -olosuhteissa muodostetusta RNA:sta valmistettiin standardilaimennossarja.
CMV-IEA (E4) -alukesarjan herkkyyden havaittiin 35 toistetuissa määrityksissä olevan NASBA-reaktiossa vähin- 16 tään 100 molekyyliä in vitro -olosuhteissa muodostettua RNA:ta. CMV-IEA (E2/E3) -alukeparin avulla saatiin herkkyydeksi samalla tavoin 100 molekyyliä.
pp67-alukeparien tehokkuutta alukkeena arvioitiin 5 käyttäen in vitro -olosuhteissa muodostettua RNA:ta, joka oli transkriboitu CMV AD 169:n pp67-geenin kloonatusta fragmentista. AD169:stä peräisin olevan CMV-pp67-4-aluke-parin osalta NASBArssa käytetyt olosuhteet pystyttiin optimoimaan siten, että alukeparin herkkyys oli 100 molekyy-10 liä in vitro -olosuhteissa muodostettua RNA:ta. Kuten Townen kannan sekvenssiin perustuvan CMV-pp67-l:n myötä-suuntaisen alukeen yhteensopimattomien kohtien perusteella voitiin odottaa, tällä alukeparilla CVM-AD169:stä peräsin olevasta pp67-RNA:sta ei saatu muodostumaan lainkaan mo-15 nistustuotetta.
Sen selvittämiseksi pystytäänkö näillä aluke-sarjoilla tunnistamaan in vitro -olosuhteissa muodostetun RNA:n lisäksi myös aitoja viruksen mRNA-molekyylejä, uutettiin CMV AD169:llä infektoiduista fibroblastisoluista 20 kokonaisnukleiinihapot ja ne monistettiin NASBA:11a. Kai killa alukesarjoilla saatiin Northern-blottauksessa esille hybridisaatiosignaaleja, jotka vastaavat CMV:lie spesifisestä RNArsta peräisin olevia monistustuotteita. Northern-blottausmääritys tehtiin tuonnempana esitetyllä tavalla. 25 NASBA-alukeparien alin havaitsemisraja PCRrssä käy tettynä oli noin 50 - 100 genomiekvivalenttia sellaisista yhdistelmäplasmideista kymmenkertaisia laimennoksia käyttäen valmistetun laimennossarjan perusteella, joita käytettiin IEA-RNA:n tai pp67-RNA:n transkriptioon in vitro 30 -olosuhteissa.
HCMV:n mRNA:n ja DNA:n havaitseminen Koska sisäinen UlA-mRNA-kontrolli oli kaikissa näytteissä positiivinen, niin koko 35 näytteen sarja analysoitiin uudelleen IEA-geenin ja sitä vastaavan mRNA:n 35 havaitsemiseksi. PCR-monistuksen jälkeen 18 näytettä oli 17 positiivisia CMV-DNA:n suhteen, kun käytettiin IEA-geeni-alukkeita (taulukko 2). Näistä kahdeksastatoista näytteestä kahdesta (OT28 ja OT34, taulukko 22) ei pp67-geeni-alukkeilla tehdyllä PCR-monistuksella kuitenkaan pystytty 5 havaitsemaan CMV-DNA:ta. Tämä osoittaa, että siitä huolimatta, että pp67:n havaitsemiseen oli käytetty jo kahta alukeparia, niin silti kahdesta näytteestä saatiin väärä negatiivinen tulos CMV-DNA:n suhteen. Tämä johtuu todennäköisimmin kliinisissä kannoissa esiintyvästä sekvenssien 10 variaatiosta tässä osassa HCMV:n genomia, koska IEA-geeni-kohteen ja pp67-geenikohteen havaitsemiseen tarkoitettujen alukesarjojen herkkyydet olivat yhtä hyviä.
Kun näytteet analysoitiin IEA-mRNA:n suhteen NASBA-monistuksella käyttäen samoja alukepareja kuin DNA:n ha-15 vaitsemisessa PCR:llä, niin olennaisesti kaikki näytteet, jotka olivat positiivisia PCR:ssa, olivat positiivisia myös NASBA:ssa. Näin ollen yhtä potilasnäytettä lukuun ottamatta kaikista CMV-IEA-DNA:n suhteen positiivisista näytteistä pystyttiin havaitsemaan myös samaa alkuperää 20 oleva mRNA.
pp67-nRNA:n analysoinnista NASBA:11a saatiin huomattavasti edellisestä poikkeava tulos.
Toisin kuin IEA:ta, jonka osalta yhtä näytettä lukuun ottamatta kaikki DNA-positiiviset näytteet olivat 25 myös IEA-mRNA-positiivisia, kyettiin pp67-mRNA:ta havait semaan ainoastaan osasta CMV-DNA-positiivista potilaista (taulukko 2). Taulukossa 3 on esitetty yhteenvetona IEA-kohteen ja pp67-kohteen mRNA:n ja DNA:n havaitsemista koskevat koetulokset. Kun näillä potilailla pp67-mRNA:n 30 esiintyminen tai sen puuttuminen korreloitiin heidän kliiniseen statukseensa, havaittiin huomiota herättävä yhteys pp67-mRNA:n esiintymisen ja mahdollisesti CMV-in-fektioon liittyvien kliinisten oireiden välillä (taulukko 4). Tässä ryhmässä kahdella potilaalla oli elinsiirteen 35 hylkimisoireita, joihin liittyi siirretyn elimen toiminta- 18 häiriö ja kuume. Muiden potilaiden kliinisenä diagnoosina oli gastriitti sydämensiirron jälkeen ja retiniitti mu-nuaissiirteen saanella potilaalla. Retiniittiä havaittiin myös kolmella CMV-pp67-mRNA-positiivisella AIDS-potilaal-5 la, joista kahdella oli myös esofagiitti.
19
•H
CU G
Ti O
G m
O M
M CU
il r- r-
> < CD CD
S H a, a
OM
\—I C\J
p — — 0) O OI en en
g MH
rj CO CO Oi O
jj m m JS mm Φ ro ro υ il M H En ro ro
_ O En I I
Cd 0O rt! C M
n f=C e 0 0 S
O0 0 M □
+j 0 sd u o S
m H H d cd pi S d < 0 o §
S 0 h d d S
•5 eh 0 0 u "1 q d d 0 h 'f? _g 00 eh 0 h
d d fd 0 fd S
td 0 0 d 0 ^ H H 0 0
P 00— — 0 En ~ — S
*>. 0 0 0¾1 0 — — 0 0 CM S
jj EhH O 0 CO O <H rH 0
(TI 0HOO0 0 S
fj 00CE|fE|0OOtOOOp.
11 ro cd m m (SHH 0 M M
.Jh* aa—'^-'aMMetiMM'H
•ro ro ro --1 ro a "" — a >*> a a - a a . a a - ro a- - a- - rv cd a a 0 1 a00 (000+: ω ro ro 1 h ro 1 1 +-> 1 1 t co 00fdrd0fd(drOidid^
Q) fti cti d O (ti Eh O -G Eh O "G
CO 4->4->00+Jfd0OidO'^ IJ OO00O00(ti00” q rorodorodEnodEH11 jj OO00O00000-
ti PPrd(dP00O00K
5 OO00OEh0(ÖEh0° <2 roroafdroa^aaH^ ö aardaaoHooH™ Q OO00O00d00” : B (θΓϋ00(ΟΗ0-ΡΗ0" l -PPEHO+JidCcdCCq
rt* ro ro eh 0 (ti00 ro 0 0 P
3 roroEnd^edO-GdOT
m -H 4->.U0fd-P004J0O'G 1
Gi tn OU00U00O00S :
Sen 4J00fd-l->00-l->00S S
s G +j+j,<0.|JOdG0dro i • CU (ti(ti00(tifd0(tiid0- i
Id> (ti cti Eh d (ti00 (ti00 ζ i n ,y i i i i i i i i i i 2 ! CU - IM 0000000000" ! rt | '! u g W \—I C\] e—le—le—le—le—I i
, * * * * 1 . ’ * . -P
£ 1 e—I e—I CN i—I C\| ' ' rH C\] <-1 :Q
οι —i ’ · · · i ·>, )
Jj g i a a r? e
M o a td od K
a “ g 3d _H I
•PaC C" Γ~ 0 Γ- 0 Γ" g 33 G ddddLOLOCDLOLDLDG! pa MMMMaaaaaag 34 o i—il—il—il—i a a a a a a ^
ia i i i i i i i i i i C
a -H -h SSSSSSSSSSg :
QOT 0000000000 S
u " — ° Ή sr <h sr tj •HM 1 i n O n ^ 0 a g i rM iti fd 0 LD g 1 34 a m a a g i p a) n a a d ; i—l a i i 1 o ro a S S S rl £ d 0 0 0 eh 20
H
m ti
pH
(0 9
G
• o
C
Z
0
IS
VO
o.
Oi υ c «i G (¾ ^
^ H C
i 1 03
Mfl ΚΩ C v ^ s OiZ + + + + ++ + + M Oi'-' I + I + I 1 I I I — — + I — I I I I + I + υ < 9 § > 1^-<D £ tt i-H VO C ' ' ' ' ' ' O ftp + + ++ + + + + + + +
OiM" I + I + I ·— — I I + + + I + I v— | 1 + 1 + m
Ui H <
<d S
£ Oi rt t ε g
>1 I U
:2 < rt ^ G W |Z + + + + + + + + + + H'-- I + I — I + + I I+ + +I + I + I 1 + 1 + «Ö m
Ui
H I
Ui C
H Z
G Q
H I Ci
H CO
r-|ft3Öi + + + + + + + + +
Hw I + I + I+ +I I+ + +I + I + I 1 + 1 + • 9
(M
O
G HCNICO^vOtSCnOi-ICMOO^OISCOCnOiHCNCO·^
'j O OOOOOOOHtHrHi-HrHt-HTHiHiHC^CN<NCSCSI
3 HEhE-<&<E-)EhEhEhE-iEhEhE-<E-<E-<EhE-iE-<EhE-iEhE-<Eh g 2 ooooooooooooooooooooo E-< 21 g
Oi ^ e < 1 m in ω VO <
Oj 2 + + + i a— l+llll+l+lllllll ; <
2 I
Q i I -· IN p: vo c. ^ aa + + + + + a >4 I++I I++I + I I I I I I — << 2 -> K rt e cc I u.
< rt W2+++ + + +0
H s_. I + + I + + + I + | | | | | | + U
Φ e g
G <D
. C G G
< CD -H
£5 G G >
Q <D ·Η -H
i K _ _ 03 > -H
W P-i +++ + +++ + 1J Ή t{
Hw i + + i —- + + i + — i i i i i —- j^-pcra
afl -H 0) O
G co g a
CO O -H
to a > o h -h x •H CO -H x -μ > +> -h
CO^vOtNCOOVr-itMOO^LOVOINCOCftO O £ί -H CD
o NNNtsNNncocownconnn^ atotno; μ E-tE-<E-fE-iE-<E-iE-iE-iE-iE->E-iE-*E-i|r<E-<E-> O > Ο ~ 2 ΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟ £ + & + 2 + +--- 22
Taulukko 3 DNA-pos/ DNA-pos/ DNA-neg/ CMV-kohde HNA-pos RNA-neg RNA-neg_ 5 IEA (n=35) 17 1 17 pp67 (n=35) 9 7 19 * Kaksi näytettä negatiivisia pp67-DNA:n ja -mRNA:n suhteen ja samalla positiivisia IEA-DNA:n ja mRNA:n suhteen.
10 * Monet CMV-positiiviset näytteet eivät sisällä havaittavia määriä pp67-mRNA:ta.
15 Taulukko 4: Korrelaatio HCMV-pp67-mRNA:n ja kliinisen statuksen välillä A. pp67 DNÄ-pos/RNA-pos potilaat 20 Potilas_ Kliininen status_____
Sydämensiirto Siirteen hyijintä, kuume, bronkiaali- karsinooma.
Munuaisensiirto Immunosytooma
Munuaisensiirto Retiniitti, kuume 25 Munuaisensiirto Siirteen hyijintä, kuume
AIDS
AIDS Retiniitti, lobulaarinen hepatiitti AIDS Retiniitti, esofagiitti
Sydämensiirto Retiniitti, esofagiitti 30 AIDS Gastriitti
Epilepsia 23 B. pp67 DNA-pos/RNA-neg potilaat
Prvhi 1 as_ K1 i i m~ npn qj-al-iig_ AIDS Kaposin sarkooma, cryptococcus-menin- giitti
5 AIDS
Munuaisensiirto
Munuaisensiirto
Sydämensiirto
Sydämensiirto sekundaarinen EBV-infektio, immunosy- tooma 10 Sydämensiirto C. pp67 DNA-pos/RNA-neg potilaat K1 i i ni npn status_
Pnti1 as_ 15 Leukemia
Maksansiirto Kohonneet maksaentsyymit
Sydämensiirto Siirteen hyijintä
Sydämensiirto Siirteen hyijintä
Sydämensiirto 20 AIDS Lobaaripneumonia, kandida-infektio, akuutti myelooinen leukemia, vasku-liitti
Sydämensiirto Primaarinen EBV-mononukleoosi
Munuaisensiirto
AIDS
Sydämensiirto Siirteen hyijintä
25 AIDS
Munuaisensiirto Tuberkuloosi, myelodysplastinen syndrooma
Sydämensiirto Sydänkohtaus
Sydämensiirto Rintalastan infektio, Staphylococcus aureus
Sydämensiirto 30 Sydämensiirto 24
Sekvenssilista (1) GENERAL INFORMATION: | (i) APPLICANT: (A) NAME: Akzo Nobel N.V.
(B) STREET: Velperweg 76 (C) CITY: Arnhem (E) COUNTRY: The Netherlands
(F) POSTAL CODE (ZIP): 6824 BM
(ii) TITLE OF INVENTION: Primers and probes for the detection of CMV nucleic acid.
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 12 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (vi) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: EP 94202360.7 (B) FILING DATE: 18-AUG-1994 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 48 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1: AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACT TGCTCACATC ATGCAGCT 48 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 48 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: unknown 25
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2: I
AATTOTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACT TGGTCACATT ATAGAGTT 48 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3: TGAGCCTTTC GAGGAGATGA A 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4: AGGATAAGCG- GGAGATGTGG AT 22 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 46 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
26 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5: AM1 TCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGAGG GTCGATTCGA GACCGA 46 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 18 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6: GGGTCGATTC GAGACCGA 18 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7: GACCTGATAT CCCTCCATAT A 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs j (B) TYPE:'nucleic acid j (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: unknown ]
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8: GGATTCGGAC TTTCCGTTCG A 21 27 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 45 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9: AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGAGG GTCGATTCAG ACTGA 4 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 17 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10: GGGTCGATTC AGACTGA’ 17 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ] (A) LENGTH: 21 base pairs 1
(B) TYPE: nucleic acid I
(C) STRANDEDNESS: single ] (D) TOPOLOGY: unknown (ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA ' (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 11: GACCTGATAT CCCTCCATAT A 21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12: I
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: j 28 (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12: GGATTCGGAC TTTCCGTTCG A 21
Claims (10)
1. Menetelmä oireisen CMV-taudin diagnosoimiseksi, tunnettu siitä, että ihmisen sytomegaloviruksen myö- 5 häisvaiheen rakenneproteiinia pp67 koodaavan mRNA:n esiintyminen havaitaan in vitro verinäytteestä, joka on otettu yksilöltä, jonka epäillään kantavan mainittua tautia, ja mainittu menetelmä käsittää vaiheet, joissa: - monistetaan mainitussa mKNA:ssa oleva kohdese- 10 kvenssi käyttäen mainitun kohdesekvenssin kanssa spesifisesti reagoimaan kykenevää alukeparia sekä sopivia monistukseen tarkoitettuja reagensseja, jolloin mainittu aluke-pari on suunniteltu soveltumaan kantojen väliseen vaihteluun , 15. saatetaan näyte, joka mahdollisesti sisältää mo nistettua nukleiinihappoa, reagoimaan sellaisen leimalla varustetun nukleiinihappokoettimen kanssa, jonka sekvenssi on komplementaarinen monistetun kohdesekvenssin osan suhteen, 20. havaitaan monistetun kohdesekvenssin ja koettimen välille muodostuneet hybridit.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mRNA monistetaan käyttäen transkriptioon perustuvaa monistusmenetelmää.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että mainittu monistusmenetelmä on NASBA.
4. Oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se vastaa osaa HCMV-pp67:ää koodaavasta nukleiinihapposekvens-sistä, ja mainittu oligonukleotidi on pituudeltaan 10 - 30 35 nukleotidia ja sisältää vähintään 10 nukleotidinmittai- sen fragmentin sekvenssistä, joka on 5'-GGGTCGATTCGAGACCGA-3', 5'-GGGTCGATTCAGACTGA-3' 5'-GACCTGATATCCCTCCATATA-3' 35 tai jokin sen komplementaarinen sekvenssi.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se on kytketty promoottorisekvens-siin.
6. Alukesarja, tunnettu siitä, että se on tar-5 koitettu HCMV-pp67:n sekvenssissä sijaitsevan kohdesekvens- sin monistamiseen, joka sarja sisältää yhden alukkeen, joka koostuu nukleiinihapposekvenssistä: 5'-GGGTCGATTCGAGACCGA-3', kytkettynä promoottorisekvens-siin, ja toisen alukkeen, joka koostuu nukleiinihapposek- 10 venssistä 5'-GACCTGATATCCCTCCATATA-31.
7. Alukesarja, tunnettu siitä, että se on tarkoitettu HCMV-pp67:n sekvenssissä sijaitsevan kohdesekvens-sin monistamiseen, joka sarja sisältää yhden alukkeen, joka koostuu nukleiinihapposekvenssistä 5'-GGGTCGATTCAGACTGA-3', 15 kytkettynä promoottorisekvenssiin, ja toisen alukkeen, joka koostuu nukleiinihapposekvenssistä 5 ' -GACCTGATATCCCTCCATATA-3 ' .
8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 4 mukaisen oligonukleotidin käyttö alukkeena patenttivaatimuksen 1 mu- 20 kaisessa menetelmässä.
9. Havaittavalla leimalla varustetun oligonukleotidin, joka koostuu sekvenssistä 5'-GGATTCGGACTTTCCGTTCGA-3', käyttö koettimena patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä.
10. Testipakkaus HCMV-taudin diagnosoimiseksi, tun nettu siitä, että se sisältää: - yhden tai useamman sarjan patenttivaatimuksen 6 ja/tai 7 mukaisia alukkeita, - havaittavalla leimalla varustetun oligonukleoti- 30 din, joka sisältää nukleiinihapposekvenssin, joka on komp lementaarinen vähintään osalle monistettua, mainitun alu-kesarjan perusteella määräytyvää nukleiinihapposekvenssiä.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94202360 | 1994-08-18 | ||
| EP94202360 | 1994-08-18 | ||
| EP9503295 | 1995-08-18 | ||
| PCT/EP1995/003295 WO1996006191A2 (en) | 1994-08-18 | 1995-08-18 | Primers and probes for the amplification and detection of cmv nucleic acid |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI961678A0 FI961678A0 (fi) | 1996-04-17 |
| FI961678A FI961678A (fi) | 1996-04-17 |
| FI120912B true FI120912B (fi) | 2010-04-30 |
Family
ID=8217105
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI961678A FI120912B (fi) | 1994-08-18 | 1996-04-17 | Alukkeita ja koettimia CMV:n nukleiinihapon monistamiseksi ja havaitsemiseksi |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0729518B1 (fi) |
| JP (1) | JPH09504182A (fi) |
| KR (1) | KR100399715B1 (fi) |
| AT (1) | ATE209691T1 (fi) |
| AU (1) | AU707317B2 (fi) |
| CA (1) | CA2172142C (fi) |
| DE (1) | DE69524199T2 (fi) |
| DK (1) | DK0729518T3 (fi) |
| ES (1) | ES2169146T3 (fi) |
| FI (1) | FI120912B (fi) |
| PT (1) | PT729518E (fi) |
| WO (1) | WO1996006191A2 (fi) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA981491B (en) * | 1997-02-28 | 1998-08-20 | Akzo Nobel Nv | Oligonucleotides that can be used in the amplification and detection of cmv nucleic acid |
| ES2275336T3 (es) | 1998-01-23 | 2007-06-01 | Biomerieux B.V. | Arnm del ef-tu para determinar la viabilidad de bacterias. |
| EP1211323A1 (en) * | 2000-12-04 | 2002-06-05 | Amsterdam Support Diagnostics B.V. | Tests based on nucleic acids of endosymbiont cellular organelles |
| CA2364294C (en) | 2000-12-04 | 2013-04-02 | Primagen B.V. | Testing endosymbiont cellular organelles and compounds identifiable therewith |
| CA2820067C (en) | 2011-01-12 | 2019-08-20 | Abbott Molecular Inc. | Materials and method for detecting cytomegalovirus (cmv) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1340807C (en) * | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
| CA2124796A1 (en) * | 1991-12-23 | 1993-07-08 | Chiron Diagnostics Corporation | Cmv probes for use in solution phase sandwich hybridization assays |
| EP0586011A2 (en) * | 1992-08-28 | 1994-03-09 | Eastman Kodak Company | Methods for production and amplification of nucleic acids |
-
1995
- 1995-08-18 AT AT95929892T patent/ATE209691T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-08-18 KR KR1019960701958A patent/KR100399715B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-08-18 PT PT95929892T patent/PT729518E/pt unknown
- 1995-08-18 ES ES95929892T patent/ES2169146T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-18 DE DE69524199T patent/DE69524199T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-18 DK DK95929892T patent/DK0729518T3/da active
- 1995-08-18 JP JP8507784A patent/JPH09504182A/ja active Pending
- 1995-08-18 CA CA002172142A patent/CA2172142C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-18 WO PCT/EP1995/003295 patent/WO1996006191A2/en active IP Right Grant
- 1995-08-18 AU AU33469/95A patent/AU707317B2/en not_active Expired
- 1995-08-18 EP EP95929892A patent/EP0729518B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-04-17 FI FI961678A patent/FI120912B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09504182A (ja) | 1997-04-28 |
| CA2172142A1 (en) | 1996-02-29 |
| EP0729518A1 (en) | 1996-09-04 |
| AU707317B2 (en) | 1999-07-08 |
| AU3346995A (en) | 1996-03-14 |
| KR960705062A (ko) | 1996-10-09 |
| CA2172142C (en) | 2010-01-12 |
| KR100399715B1 (ko) | 2003-12-18 |
| PT729518E (pt) | 2002-05-31 |
| EP0729518B1 (en) | 2001-11-28 |
| DE69524199D1 (de) | 2002-01-10 |
| DK0729518T3 (da) | 2002-03-18 |
| WO1996006191A3 (en) | 1996-03-14 |
| FI961678A0 (fi) | 1996-04-17 |
| FI961678A (fi) | 1996-04-17 |
| ES2169146T3 (es) | 2002-07-01 |
| WO1996006191A2 (en) | 1996-02-29 |
| ATE209691T1 (de) | 2001-12-15 |
| DE69524199T2 (de) | 2002-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ali et al. | Simultaneous detection of multiple viruses based on chemiluminescence and magnetic separation | |
| JP2005511030A (ja) | 核酸の増幅方法 | |
| CA2246238A1 (en) | A method for the amplification and detection of a nucleic acid fragment of interest | |
| CA2422956A1 (en) | Compositions and methods for detecting human immunodeficiency virus 2 (hiv-2) | |
| Lunel et al. | Comparative study of conventional and novel strategies for the detection of hepatitis C virus RNA in serum: amplicor, branched-DNA, NASBA and in-house PCR | |
| US6333150B1 (en) | Isothermal transcription based assay for the detection and genotyping of dengue virus | |
| PL209415B1 (pl) | Mieszanina starterów do amplifikacji, jej zastosowanie, sposób wykrywania genotypów HPV i zestaw odczynników do wykrywania i typowania HPV | |
| US6306602B1 (en) | Oligonucleotides that can be used in the amplification and detection of CMV nucleic acid | |
| US5876937A (en) | Method for determining the integrity of nucleic acid | |
| US20100216117A1 (en) | Oligonucleotides, use, method of detection and kit for diagnosing the presence of the chikungunya virus e1 gene | |
| FI120912B (fi) | Alukkeita ja koettimia CMV:n nukleiinihapon monistamiseksi ja havaitsemiseksi | |
| US10053742B2 (en) | Compositions and methods for detecting HEV nucleic acid | |
| US7074561B2 (en) | Isothermal amplification based assay for the detection and quantitation of alpha-fetoprotein mRNA | |
| CA2281793C (en) | Oligonucleotides that can be used in the amplification and detection of cmv nucleuc acid | |
| USH1825H (en) | Isothermal transcription based assay for the detection of HTLV I and HTLV II RNA | |
| JP5164850B2 (ja) | インフルエンザａウイルスのｈ５及びｎ１遺伝子の存在を診断するためのオリゴヌクレオチド、その使用、検出方法及びキット | |
| US20240110252A1 (en) | Compositions and Kits for Rapid Detection of SARS-CoV-2 and Methods of Production and Use Thereof | |
| Loens et al. | Nucleic acid sequence-based amplification | |
| KR20230022540A (ko) | A형 간염바이러스의 검출 및 정량 방법 | |
| JPH04311400A (ja) | ヒトサイトメガロウイルス検出用プローブ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 120912 Country of ref document: FI |
|
| MA | Patent expired |