SK742003A3 - Novel peptides as NS3-serine protease inhibitors of hepatitis C virus - Google Patents

Description

Peptidové zlúčeniny, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových proteázových inhibítorov vírusu hepatitídy C (HCV); ďalej sa týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich jeden alebo viac takýchto inhibítorov ako aj spôsobov ich prípravy a použitia uvedených inhibítorov na liečenie porúch spojených s HCV proteázou a príbuzných ochorení. Vynález bližšie opisuje peptidové zlúčeniny ako inhibítory NS3/NS4a serínovej proteázy vírusu hepatitídy C (HCV).

Doterajší stav techniky

Vírus hepatitídy C (HCV) je (+)-sense jednovláknový RNA vírus, ktorý je považovaný za hlavného pôvodcu nie A alebo B hepatitídy (non-A, non-B hepatitis; NANBH), najmä s krvou spojenej NANBH (blood-associated NANBH, BB-NANBH) (pozri prihlášku medzinárodného patentu WO 89/04 669 a prihlášku európskeho patentu EP 381 216). NANBH treba odlišovať od ostatných typov vírusmi vyvolaných ochorení pečene ako je hepatitída spôsobená vírusom A (HAV), vírusom hepatitídy B (HBV), vírusom hepatidíty delta (HDV), cytomegalovírusom (CMV) a Epsteinovým-Barrovým vírusom (EBV), ako aj od ďalších foriem chorôb pečene ako je alkoholizmus a primárne žlčová cirhóza.

HCV proteáza potrebná na polypeptidovú stavbu a vírusovú replikáciu bola identifikovaná, klonovaná a exprimovaná iba nedávno (pozri napríklad patent USA 5 712 145). Tento približne 3000 aminokyselinový proteín obsahuje, od aminozakončenia po karboxylové zakončenie, nukleokapsidový proteín (C), obalové proteíny (E1 a E2) a niekoľko neštrukturálnyCh proteínov (NS1, 2, 3, 4a, 5a a 5b). NS3 je približne 68 kDa proteín, kódovaný približne 1 893 genómami HCV a má dve hlavné domény: (a) doménu serínovej proteázy pozostávajúcej z približne 200 Nterminálnych aminokyselín; a (b) RNA-závislú ATPázovú doménu v C-zakončení proteínu. NS3 proteáza sa pre podobnosti v proteínovej sekvencií, v celkovej trojrozmernej stavbe a v mechanizme katalýzy považuje za člena chymotrypsínovej

-2skupiny. Ďalšie chemotrypsínu podobné enzýmy sú elastáza, faktor Xa, trombín, trypsín, plazmín, urokináza, tPA a PSA. HCV NS3 proteáza je dôležitá v proteolýze polypeptidu (polyproteínu) na spojoch NS3/NS4a, NS4a/NS4b/ NS4b/NS5a a NS5a/NS5b a preto je významná aj pre vznik vírusových proteínov počas replikácie. Tým je HCV NS3 serínová proteáza zaujímavým cieľom protivírusovej chemoterapie.

Zistilo sa, že NS4a, približne 6 kDa polypeptid, je kofaktorom serínovej proteázovej aktivity NS3. Autoštiepenie NS3/NS4a spoja účinkom NS3/NS4a serínovej proteázy nastáva intramolekulovo (to znamená cis), kým v iných miestach nastáva štiepenie intermolekulovo (to znamená trans).

Analýza prirodzených miest štiepenia pre HCV ozrejmila, že na spojoch NS4a/NS4b, NS4b/NS5a a NS5a/NS5b je prítomný cysteín v P1 a serín v ΡΓ a že tieto zvyšky sú na uvedených spojoch prísne konzervované. Spoj NS3/NS4a obsahuje treonín v P1 a serín v Pľ. Táto substitúcia Cys -> Thr v NS3/NS4a sa považuje za splnenie požiadavky v prospech cis pred trans pochodmi v tomto spoji. Pozri napríklad: Pizzi a ďalší, Proc. Natl. Ac. Sci (USA) 91, 888 až 892 (1994); Failla a ďalší, Folding & Design 1., 35 až 42 (1996). Miesto štiepenia NS3/NS4a je tiež viac tolerantné k mutagenéze ako iné miesta. Pozri napríklad: Kollykhalov a ďalší, J. Virol. 68, 7525 až 7533 (1994). Zistilo sa tiež, že pre účinné štiepenie sú potrebné kyselinové zvyšky v oblasti v smere od miesta štiepenia. Pozri napríklad: Komoda a ďalší, J. Virol. 68, 7351 až 7357 (1994).

Inhibítory HCV proteázy, ktoré boli v literatúre doteraz opísané zahŕňajú antioxidanty (pozri prihlášku medzinárodného patentu WO 98/14 181), niektoré peptidy a peptidové analógy (pozri prihlášku medzinárodného patentu WO 98/17 679; Landro a ďalší, Biochem. 36, 9340 až 9348 (1997); Ingallinella a ďalší Biochem. 37, 8906 až 8914 (1998); Llinás-Brunet a ďalší, Bioorg. Med. Chem. Lett. 8, 1713 až 1718 (1998)), inhibítory založené na 70-amínokyselinovom polypeptide egline c (Martin a ďalší, Biochem. 37, 11459 až 11468 (1998)), afinitne selektované inhibítory z ľudského pankreatického sekrečného trypsínového inhibítora (hPSTIC3) a MBip (Dimasi a ďalší, J. Virol. 71, 7461 až 7469 (1997)), cV_HE2 (kamelizovaná protilátka variabilnej domény) (Martin a ďalší, Protein Eng. 10, 607 až 614 (1997)), a a1-antichymotrypsín (ACT) (Elzouki a ďalší, J. Hepat. 27, 42 až

-328 (1997)). Nedávno bol opísaný ribozým, navrhnutý na selektívne ničenie RNA vírusu hepatitídy C (pozri BioWorld Today, 9(217), 4 (10. november 1998)).

Odkazuje sa tiež na PCT WO 98/17 679, zverejnený 30. apríla 1998 (Vertex Pharmaceuticals Incorporated); WO 98/22 496, zverejnený 28. mája 1998 (F. Hoffmann-La Roche AG); a WO 99/07 734, zverejnený 18. februára 1999 (Boehringer Ingelheim Canada Ltd.).

Účasť HCV sa preukázala v ciľhóze pečene a pri vyvolaní hepatocelulárneho karoinómu. Prognózy pacientov trpiacich infekciou HCV sú v súčasnosti zlé. Infekcia HCV je ťažšie liečiteľná ako iné formy hepatitídy pre chýbajúcu imunitu alebo remisie, súvisiacich s HCV. Podľa súčasných údajov sa zaznamenáva menej ako 50 % prežití po 4 rokoch po diagnostikovaní cirhózy. Pacienti diagnostikovaní s lokalizovaným resektabilným hepatocelulárnym karcinómom vykazujú po piatich rokoch mieru prežitia 10 až 30 %; pričom pacienti s neresektabilným hepatocelulárnym karcinómom vykazujú po piatich rokoch prežitie v menej ako 1 % prípadov.

Marchetti A. a ďalší, Synlett S1, 1000 až 1002 (1999) opísali syntézu bicyklických analógov inhibítora HCV NS3 proteáz. Zverejnená zlúčenina má vzorec:

AcHN'

ΌΗ

COOH

Han W. a ďalší, (Han W. a ďalší: Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 10. 711 až 713 (2000)) opísali prípravu niektorých a-ketoamidov, α-ketoesterov a adiketónov, obsahujúcich alylové a etylové funkčné skupiny.

Odkazuje sa tiež na WO 00/09 558 (prihlasovateľ Boehringer Ingelheim Limited; zverejnené 24. februára 2000), ktorým sa zverejňujú peptidové deriváty vzorca:

ktorého jednotlivé štruktúrne prvky sú určené v uvedenom patente. Jeden z predstaviteľov tejto skupiny zlúčenín je

Odkazuje sa tiež na WO 00/09 543 (prihlasovateľ: Boehriger Ingelheim

Limited, zverejnené 24. februára 2000), v ktorom sa zverejňujú peptidové deriváty vzorca:

-5R³ / A¹

. predstaviteľov tejto skupiny zlúčenín je

Súčasné terapie hepatitídy C zahŕňajú interferónovú(a) (INF_a) terapiu a kombinovanú terapiu s ribavirínom a interferónom. Pozri napríklad: Beremguer a ďalší, Proc. Asoc. Am, Physicians 110(2). 98 až 112 (1998). Tieto terapie sa ale vyznačujú nízkou mierou udržateľnej odozvy a častými vedľajšími účinkami. Pozri napríklad Hoofnagle a ďalší, N. Engl. J. Med. 336, 336 až 347 (1997). Proti infekcii HCV nie je v súčasnosti dostupná nijaká vakcína.

-6Závislé a patentové prihlášky a prihlášky v konaní, por. číslo 09/825,399, podaná 3.4.2001, por. číslo 09/836,636, podaná 17.4.2001, por. číslo 09/909,077, podaná 19.4.2001, por. číslo 09/909,062, podaná 19.7.2001, por. číslo 09/908,955, podaná 19.7.2001 a por. číslo 09/909,164, podaná 19.7.2001, opisujú rôzne druhy peptidov ako inhibítory NS-3 serínovej proteázy vírusu hepatitídy C.

Jestvuje tak potreba nových postupov a liečby infekcie HCV. Podstatou tohto vynálezu je preto poskytnúť zlúčeniny užitočné na liečenie alebo prevenciu alebo zlepšenie jedného alebo viacerých symptómov hepatitídy C.

Vynález sa ďalej týka spôsobov liečby alebo prevencie alebo zlepšenia jedného alebo viacerých symptómov hepatitídy C.

Vynález sa ešte ďalej týka spôsobov modulácie aktivity serínových proteáz, najmä HCV NS3/NS4a serínovej proteázy s použitím zlúčenín podľa tohto vynálezu.

Vynález sa ešte ďalej týka spôsobov modulácie - ovplyvnenia stavby HCV polypeptidu s použitím zlúčenín podľa tohto vynálezu.

Podstata vynálezu

V mnohých uskutočneniach sa vynález týka novej skupiny inhibitorov HCV proteázy, farmaceutických prostriedkov obsahujúcich jednu alebo viac zlúčenín podľa vynálezu; ďalej sa týka spôsobov prípravy farmaceutických prostriedkov obsahujúcich jednu alebo viac uvedených zlúčenín; ďalej sa týka použitia zlúčenín podľa vynálezu na výrobu lieku na liečenie, prevenciu alebo zlepšenie jedného alebo viacerých syptómov hepatitídy C. Vynález sa ďalej týka spôsobov modulácie interakcie HCV polypeptidu s HCV proteázou. Medzi uvedenými zlúčeninami sú výhodné tie zlúčeniny, ktoré inhibujú aktivitu HCV NS3/NS4a serínovej proteázy. Táto prihláška opisuje peptidové zlúčeniny, obsahujúce aminokyselinové usporiadanie od P3 až po P2’.

Podstatou vynálezu sú peptidové zlúčeniny všeobecného vzorca I

R (I)

-Ί v ktorom

G, J a Y sú vzájomne nezávisle od seba vybrané zo skupín: H, alkyl, alkyl-aryl, heteroalkyl, heteroaryl, aryl-heteroaryl, alkyl-heteroaryl, cykfoalkyl, alkyloxy, alkylaryloxy, aryloxy, heteroaryloxy, heterocykloalkyloxy, cykloalkyloxy, alkylamino, arylamino, alkylarylamino, arylamino, heteroarylamino, cykloalkylamino alebo heterocykloalkylamino s podmienkou, že Y môže byť voliteľne substituované substituentami X¹¹ alebo X¹²;

X¹¹ je skupina alkyl, alkenyl, alkinyl, cykloalkyl, cykloalkyl-alkyl, heterocyklyl, heterocyklylalkyl, aryl, alkylaryl, arylalkyl, heteroaryl, alkylheteroaryl alebo heteroarylalkyl, s podmienkou že X¹¹ môže byť ďalej voliteľne substituované s X¹²;

X¹² je skupina hydroxy, alkoxy, aryloxy, tio, alkyltio, aryltio, amino, alkylamino, arylamino, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, alkylsulfónamido, arylsulfónamido, karboxy, karbalkoxy, karboxamido, alkoxykarbonylamino, alkoxykarbonyloxy, alkylureido, arylureido, halogén, kyano, alebo nitro, s podmienkou, že uvedené alkylové skupiny, skupiny alkoxy a arylové skupiny môžu byť voliteľne ďalej substituované skupinami vybranými z X¹²;

R¹ je COR⁵ alebo B(OR)2, pričom R⁵ je H, OH, OR⁸, NR⁹R¹⁰, CF3, C₂F₅, C3F7. CF₂R⁶, R⁶ alebo COR⁷, pričom R⁷ je H, OH, OR⁸, CHR⁹R¹⁰ alebo NR⁹R¹⁰, kde R⁶, R⁸, R⁹ a R¹⁰ sú vzájomne nezávisle vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa H, alkyl, aryl, heteroalkyl, heteroaryl, cykloalkyl, arylalkyl, heteroarylalkyl, CH(R¹')COOR¹¹, CH(R¹’)CONR¹²R¹³, CH(R^1,)CONHCH(R²')COOR¹¹, CH(R¹’)CONHCH(R²')CONR¹²R¹³, CH(R¹')CONHCH(R²')R’, CH(R¹’)CONHCH(R²)CONHCH(R³')COOR¹¹, CH(R¹')CONHCH(R²')CONHCH(R³')CONR¹²R¹³, CH(R¹’)CONHCH(-R²')CONHCH(R³')CONHCH(R⁴')COOR¹¹, CH(R¹')CONHCH(R²')CONHCH(R³')CONHCH(R⁴')CONR¹²R¹³, CH(R^1,)CONHCH(R²')CONHCH(R³')CONHCH(R⁴')CONHCH(R^5,)COOR¹¹ a CH(R¹)CONHCH(R²’)CONHCH(R³')CONHCH(R⁴’)CONHCH(R⁵')CONR¹²R¹³, kde R¹', R²', R³, R⁴, R⁵, R¹¹, R¹², R¹³ a R' sú vzájomne nezávisle vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa H, alkyl, aryl, heteroalkyl, heteroaryl, cykloalkyl, alkylaryl, alkylheteroaryl, arylalkyl a heteroaralkyl;

Z je vybrané z O, N alebo CH;

-8W môže byť prítomné alebo neprítomné; ak je W prítomné, je vybrané z C=O, C=S alebo SO2; a

R, R², R³ a R⁴ sú vzájomne nezávisle vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa H, C1-C10alkyl, C₂-Cio-alkenyl, C₃-C8-cykloalkyl, C₃-C8-heterocykloalkyl, alkoxy, aryloxy, alkyltio, aryltio, amino, amido, ester, karboxylovú kyselinu, karbamát, močovinu, ketón, aldehyd, kyano, nitro, atómy kyslíka, dusíka, síry a fosforu (pričom uvedené atómy sú v počte 0 až 6); (cykloalkyl)alkyl a (heterocykloalkyl)alkyl, pričom uvedený cykloalkyl je tvorený 3 až 8 atómami uhlíka a žiadnym alebo až šiestimi atómami kyslíka, dusíka síry alebo fosforu a uvedený alkyl má jeden až šesť atómov uhlíka; aryl, heteroaryl; alkylaryl; a alkylheteroaryl;

pričom uvedené skupiny alkyl, heteroalkyl, alkenyl, heteroalkenyl, aryl, heteroaryl, cykloalkyl a heterocykloalkyl môžu byť voliteľne substituované, pričom výraz substituované sa týka voliteľnej a chemicky vhodnej substitúcie jednou alebo viacerými skupinami vybranými zo skupiny, ktorá zahŕňa alkyl, alkenyl, alkinyl, aryl, aralkyl, cykloalkyl, heterocyklyl, halogén, hydroxy, tio, alkoxy, aryloxy, alkyltio, aryltio, amino, amido, ester, karboxyl, karbamát, močovinu, ketón, aldehyd, kyano, nitro, sulfónamid, sulfoxid, sulfón, sulfonylmočovinu, hydrazid a hydroxamát.

Medzi hore určenými rôznymi skupinami všeobecného vzorca I sú pre jednotlivé substituenty výhodné nasledujúce skupiny:

výhodná definícia pre R¹ je COR⁵, pričom R⁵ je H, OH, COOR⁸ alebo CONR⁹R¹⁰, kde R⁸, R⁹ a R¹⁰ sú určené hore. Výhodná skupina pre R¹ je COCONR⁹R¹⁰, kde R⁹ je H a R¹⁰ je H, CH(R¹')COOR¹¹, CH(R¹’)GONR¹²R¹³, CH(R¹')CONHCH(R²')COOR¹¹, CH(R¹')CONHCH(R²’)CONR¹²R¹³ alebo CH(R¹')CONHCH(R²')(R'). Medzi uvedenými sú pre R¹⁰ výhodné CH(R¹')CONHCH(R²')COOR¹¹, CH(R^r)CONHCH(R²')CONR¹²R¹³, CH(R¹ )CONHCH(R²)(R'), kde R¹ je H alebo alkyl, heteroalkyl a R² je fenyl, substituovaný fenyl, heteroatómom substituovaný fenyl, tiofenyl, cykloalkyl, piperidyl a pyridyl. Výhodnejšie skupiny sú: pre R¹' vodík a pre R¹¹ vodík alebo tercbutyl; R’je hydroxymetyl; a

R²'je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

·**** .aaa. «ΑΑΑΡ ώ * ó Ď ¹ ΐ v ktorých

U¹ a U² môžu byť rovnaké alebo rôzne a sú vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa H, F, CH₂COOH, CH₂COOMe, CH2CONH2, CH₂CONHMe, CH₂CONMe₂, azido, amino, hydroxy, substituovanú skupinu amino, substituovanú skupinu hydroxy;

U³ a U⁴ môžu byť rovnaké alebo rôzne a sú O alebo S;

U⁵ je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa alkylsulfonyl, aryl, sulfonyl, heteroalkylsulfonyl, heteroarylsulfonyl, alkylkarbonyl, arylkarbonyl, heteroalkylkarbonyl, heteroarylkarbonyl, alkoxykarbonyl, aryloxykarbonyl, heteroaryloxykarbonyl, alkylaminokarbonyl, arylaminokarbonyl, heteroarylaminokarbonyl alebo ich kombinácie; a

NR¹²R¹³ je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

NH₂, NHMe, N(Me)OMe, NMe₂,

	E	Me L-Me IN^Me
ΗΝ^Χ/θΠ ΗΝχΧγ'°Η Me	Me
		Me
Ό	0 0	OjS

kde U⁶ je H, OH alebo CH₂OH.

-10Výhodné skupiny pre R² sú:

Výhodné skupiny pre R³ sú:

--- ^_vvvw· --- ---ch_3xI ch_3xI h₃T^SCH3 K₃ľ^{s cooa} pričom R³¹ je OH alebo O-alkyl.

R³ môže naviac byť:

pričom Y¹⁹ je vybrané z nasledujúcich skupín:

OOH

R³ môže ešte ďalej znamenať:

¥ ý20

pričom Y²⁰ je vybrané z nasledujúcich skupín:

H₃

NHAc

Najvýhodnejšie skupiny pre R³ sú:

Skupina Z-C-R³ vo všeobecnom vzorci I, pričom R⁴ nie je prítomné, môže ďalej znamenať nasledujúce skupiny:

Niektoré ďalšie výhodné skupiny sú: pre Z je to N, pre R⁴ je to H a pre W je to

C=O alebo SO2. Výhodné skupiny pre Y sú:

Me

Me0₂c^;XxzzOx| •Me '°Í

v ktorých:

Y¹¹ je vybrané z H, COOH, COOEt, OMe, Ph, OPh, NHMe, NHAc, NHPh, CH(ME)₂, 1 -triazolyl, 1-imidazolyl a NHCH2COOH;

Y¹² je vybrané z H, COOH, COOMe, OMe, F, Cl alebo Br.

Y môže tiež znamenať:

y'MLa γ13 pričom

Y¹³ je vybrané z nasledujúcich skupín:

a Y¹⁴ je vybrané zo skupín MeSO2, Ac, Boe, i-Boc, Cbz alebo Alloc. Ďalšie výhodné štruktúry pre Y sú:

CHĺ'Vy

1-2

CH3

Hoocy

pričom

Y¹⁵ a Y¹⁶ môžu byť rovnaké alebo rozdielne a sú nezávisle od seba vybrané zo skupín alkyl, aryl, heteroalkyl alebo heteroaryl.

-16Ešte ďalšie významy Y sú:

pričom

Y¹⁷ je CF₃, NO_2i CONH₂, OH, COOCH3, OCH₃, OC₆H₅, C₆H₅, COC_&H₅, NH₂ alebo COOH;

Y¹⁸ je COOCH3, NO₂, N(CH₃)₂, F, OCH_3i CH₂COOH, COOH, SO₂NH₂ alebo NHCOCH3.

Výhodné skupiny pre J sú:

ChbOOC-X^V BnOOC'-Xx-V HOOC-^V

ch₃

Výhodné skupiny pre G sú:

ο

Pokiaľ sa neuvádza inak, všetky uvedené technické a vedecké výrazy majú rovnaký význam ako im bežne rozumie odborník skúsený v oblasti techniky, ktorej sa týka tento vynález. Tak napríklad:

výraz alkyl (vrátane alkylovej časti skupiny alkoxy) sa týka jednoväzbovej skupiny odvodenej od nerozvetveného alebo rozvetveného reťazca nasýteného uhľovodíka odstránením jedného atómu vodíka, pričom uvedená skupina má 1 až 8 atómov uhlíka, výhodne od 1 do 6 atómov uhlíka;

výraz aryl znamená karbocyklickú skupinu, ktorá má 6 až 14 atómov uhlíka a ktorá má najmenej jeden benzenoidný kruh, pričom všetky substituovateľné aromatické uhlíkové atómy karbocyklickej skupiny sa považujú ako možné body pre spájanie. Výhodné arylové skupiny zahŕňajú fenylovú skupinu, 1-naftylovú skupinu, 2-naftylovú a indanylovú skupinu a najmä fenylovú a substituovanú fenylovú skupinu;

výraz aralkyl znamená skupinu obsahujúcu arylovú skupinu viazanú cez nižší alkyl;

výraz alkylaryl znamená skupinu obsahujúcu nižší alkyl viazaný cez arylovú skupinu;

výraz cykloalkyl znamená nasýtený karbocyklický kruh, ktorý má od 3 do 8 atómov uhlíka, výhodne 5 alebo 6 atómov uhlíka, výhodne substituovaný;

výraz heterocyklický znamená popri heteroarylových skupinách určených nižšie, nasýtené a nenasýtené cyklické organické skupiny, ktoré majú najmenej jeden atóm O, S a/alebo N, prerušujúci karbocyklickú štruktúru kruhu, pričom uvedené skupiny pozostávajú z jedného alebo dvoch kondenzovaných kruhov a každý kruh má 5, 6 alebo 7 členov a má alebo nemusí mať dvojité väzby s

-20nedostatkom delokalizovaných π elektrónov; uvedené kruhové štruktúry majú 2 až 8, výhodne 3 až 6 uhlíkových atómov, napríklad 2- alebo 3-piperidinyl, 2- alebo 3piperazinyl, 2- alebo 3-morfolinyl, alebo 2- alebo 3-tiomorfolinyl;

výraz halogén znamená fluór, chlór, bróm a jód;

výraz heteroaryl znamená cyklickú organickú skupinu, ktorá má najmenej jeden atóm O, S a/alebo N, prerušujúci karbocyklickú štruktúru kruhu a ktorá má dostatočný počet delokalizovaných π elektrónov aby mal kruh aromatický charakter, s aromatickou heterocyklylovou skupinou s 2 až 14, výhodne s 4 až 5 uhlíkovými atómami, napríklad skupiny 2-, 3- alebo 4-pyridyl, 2- alebo 3-furyl, 2- alebo 3-tienyl, 2-, 4- alebo 5-tiazolyl, 2- alebo 4-imidazolyl, 2-, 4- alebo 5-pyrimidinyl, 2-pyrazinyl alebo 3- alebo 4-pyridazinyl a podobné. Výhodné heteroarylové skupiny sú 2-, 3- a 4-pyridylové skupiny; uvedené heteroarylové skupiny môžu byť voliteľne substituované. Pokiaľ sa neuvádza jednotlivo inak, výraz substituovaný alebo nesubstituovaný alebo voliteľne substituovaný sa ďalej týka skupiny, ktorá je voliteľne a chemicky vhodne substituovaná niektorou skupinou z R¹² alebo R¹³.

Vynález ďalej zahŕňa tautoméry, rotaméry, enantioméry a iné optické izoméry zlúčenín vzorca I ako aj ich farmaceutický prípustné soli, solváty a deriváty.

Vynález ďalej zahŕňa farmaceutické prostriedky obsahujúce ako účinnú zložku zlúčeninu všeobecného vzorca I (alebo jej soľ, solvát alebo izoméry) spolu s farmaceutický prípustným nosičom alebo excipientom.

Vynález ďalej zahŕňa spôsoby prípravy zlúčenín všeobecného vzorca I, ďalej spôsoby liečby ochorení ako sú napríklad HCV a príbuzné poruchy. Uvedené spôsoby liečby zahŕňajú podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny vzorca I alebo farmaceutických prostriedkov, ktoré zlúčeninu vzorca I obsahujú, pacientovi, ktorý trpí uvedenou chorobou alebo chorobami.

Vynález ďalej zahŕňa použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I na výrobu lieku na liečenie HCV a príbuzných porúch.

V jednom uskutočnení tento vynález poskytuje zlúčeniny všeobecného vzorca I ako inhibítory HCV proteázy, najmä HCV NS3/NS4a serínovej proteázy, alebo ich farmaceutický prípustné deriváty, ako sú určené hore.

-21 Predstavitelia zlúčenín podľa vynálezu, ktoré majú vynikajúci inhibičný účinok na HCV proteázy, sa uvádzajú v nasledujúcej Tab. 1 spolu s ich účinnosťami (rozsahy hodnôt K* v nanomoloch, nM).

Tabuľka 1

Zlúčeniny a výsledky analýz HCV proteáz

Zlúčenina z príkladu č.	Rozsah K *
1	C
2	B
3	C
4	C
5	B
6	C
7	C
8	C
9	C
10	C
11	A
12	C
13	B
14	C
15	B
16	A
17	B
18	A
19	-
20	C
21	B
22	C

23	C
24	B
25	A
26	C
27	C
28	B
29	C
30	B
31	C
32	B
33	C
34	B
35	C
36	C
37	C
38	B
39	C
40	C
41	B
42	C
43	A
44	C
45	C
47	C
48	B
49	A
50	C
51	B
52	B
53	B
54	B

55	C
56	B
57	B
58	C
59	B
60	C
61	C
62	A
63	C
64	B
65	C
66	B
67	C
68	B
69	B
70	B
71	B
72	B
73	A
74	B
75	B
76	B
77	C
78	B
79	C
80	B
81	B
82	C
83	C
84	C
85	C

86	C
87	B
88	B
89	C
90	B
91	B
92	C
93	C
94	B
95	B
96	A
97	A
98	A
99	B
100	B
101	B
102	B
103	C
104	C
105	B
106	A
107	C
108	B
109	B
110	A
111	B
112	B
113	A
114	A
115	G
116	B

117	B
118	B
119	B
120	A
121	B
122	A
123.	C
124	B
125	A
126	A
127	A
128	B
129	C
130	A
131	C
132	B
133	B

Rozsahy K* analýz HCV:

Skupina A = 0 až 100 nM; B = 101 až 1000 nM; C > 1000 nM.

V ďalšom sa uvádzajú niektoré typy zlúčenín podľa vynálezu a spôsoby syntézy rôznych typov zlúčenín všeobecného vzorca I podľa vynálezu; zlúčeniny sa potom schematicky opisujú a následne sa uvádzajú názorné Príklady.

R = Benzyl

Χ = ΟΗ

Χ = ΝΗ₂

X = NMeOMe

X = NMe₂

X = O-Bu X = OH

o

X = H, Y = tBu; X = tBu, Y = H

OH

X = O’Butyl

X = OH

zz

X = 0‘Butyl

X = OH

X = NMe₂

R = Me

X = H, Y = COOH X = COOH, Y = H

Uvedené zlúčeniny podľa vynálezu môžu v závislosti od ich štruktúry vytvárať farmaceutický prípustné soli s organickými alebo anorganickými kyselinami, alebo s anorganickými alebo organickými zásadami. Príklady kyselín vhodných na vytváranie solí zahŕňajú kyselinu chlorovodíkovú, kyselinu sírovú, kyselinu fosforečnú, kyselinu octovú, kyselinu citrónovú, kyselinu malónovú, kyseliny salicylovú, kyselinu jablčnú, kyselinu fumárovú, kyselinu jantárovú, kyselinu askorbovú, kyselinu maleínovú, kyselinu metánsulfónovú a ďalšie minerálne a karboxylové kyseliny, známe odborníkom v danej oblasti. Na vytváranie solí so zásadami sú vhodné zásady napríklad hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid amónny, tetraalkylamóniumhydroxid a podobné.

V inom uskutočnení vynález zahŕňa farmaceutické prostriedky obsahujúce ako účinnú zložku peptidy podľa tohto vynálezu. Uvedené farmaceutické prostriedky ďalej zahŕňajú farmaceutický prípustné nosičové riedidlo, excipient alebo nosič (spoločne tu označované ako nosičové materiály, nosiče). Uvedené farmaceutické

-32prostriedky sú na základe HCV inhibičného účinku využiteľné v liečbe hepatitídy C a príbuzných ochorení.

V ešte inom uskutočnení vynález zahŕňa spôsoby prípravy farmaceutických prostriedkov obsahujúcich ako účinné zložky zlúčeniny podľa tohto vynálezu. V uvedených farmaceutických prostriedkoch a v spôsoboch podľa tohto vynálezu sa účinné látky budú typicky podávať zmiešané s vhodným nosičovým materiálom, vhodne vybraným s ohľadom na predpokladaný spôsob podávania, napríklad ako perorálne tablety, kapsuly (plnené tuhou formuláciou, polotuhou formuláciou alebo tekutou formuláciou), prášky na prípravu prostriedku, perorálne gély, elixíry, dispergovateľné granuláty, sirupy, suspenzie a podobné, v súlade s bežnou farmaceutickou praxou. Napríklad, na perorálne podávanie vo forme tabliet alebo kapsúl sa účinná liečivá zložka môže kombinovať s niektorým perorálnym netoxickým, farmaceutický prípustným inertným nosičom ako je laktóza, škrob, sacharóza, celulózy, stearan horečnatý, fosforečnan divápenatý, síran vápenatý, mastenec, manitol, etanol (tekuté formy) a podobné. Ak sa vyžaduje alebo je potrebné do zmesi možno ďalej zabudovať vhodné spojivá, mastivá, látky podporujúce rozpad a farbivá. Prášky a tablety môžu obsahovať od približne 5 do približne 95 % zmesi podľa tohto vynálezu. Vhodné spojivá zahŕňajú škrob, želatínu, prírodné cukry, kukuričné sladidlá, prírodné a syntetické gumy ako je akácia, ďalej alginát sodný, karboxymetylcelulózu, polyetylénglykol a vosky. Medzi lubrikačnými látkami možno na použitie v dávkových formách prostriedkov spomenúť kyselinu boritú, benzoát sodný, octan sodný, chlorid sodný a podobné. Látky podporujúce rozpad zahŕňajú napríklad škrob, metylcelulózu, guárovu gumu a podobné.

Keď je to účelné, uvedené prostriedky môžu zahŕňať tiež sladidlá, chuťové a vonné látky a konzervačné látky. Niektoré hore použité výrazy, najmä látky podporujúce rozpad, riedidlá, mastivá, spojivá a podobné sa podrobnejšie rozoberajú v ďalšom texte.

Prostriedky podľa tohto vynálezu možno naviac formulovať s dlhodobým alebo s riadeným uvoľňovaním, čím sa zabezpečuje riadená rýchlosť uvoľňovania jednej alebo viacerých zložiek alebo účinných látok s cieľom optimalizácie terapeutických účinkov, napríklad inhibičného účinku na HCV a podobné. Vhodné dávkové formy s riadeným uvoľňovaním zahŕňajú vrstvové tablety, pozostávajúce z

-33vrstiev s rôznou rýchlosťou rozpadu, alebo účinné zložky impregnované polymérnymi základmi - matricami na riadené uvoľňovanie a tvarované do formy tabliet alebo kapsúl obsahujúcich uvedené impregnované alebo enkapsulované pórovité polymérne základy.

Tekuté formy prípravkov zahŕňajú roztoky, suspenzie a emulzie. Ako príklad možno spomenúť vodu alebo vodné-propylénglykolové roztoky na parenterálne injekcie, alebo prísady sladidiel a upokojujúcich prostriedkov do perorálnych roztokov, suspenzií a emulzií. Tekuté formy prípravkov môžu tiež zahŕňať roztoky na intranazálne podávanie.

Vhodné aerosólové prípravky na inhaláciu zahŕňajú roztoky a tuhé prípravky v práškovej forme, ktoré môžu byť kombináciou s farmaceutický prípustným nosičom ako je inertný stlačený plyn, napríklad dusík.

Pri príprave čapíkov sa najprv roztopí vosk s nízkou teplotou topenia ako je zmes gylceridov mastných kyselín, napríklad kakaové maslo; účinná látka sa potom miešaním alebo mixovaním homogénne disperguje v roztopenom základe. Roztopená homogénna zmes, sa potom odlieva do foriem bežných veľkostí, nechá sa vychladnúť a stuhnúť.

Vynález zahŕňa tuhé prípravky, ktoré sú určené na premenu (krátko pred použitím) na tekutú formu prípravkov na perorálne alebo parenterálne podávanie. Tieto tekuté formy farmaceutických prostriedkov zahŕňajú roztoky, suspenzie a emulzie.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu možno podávať tiež transdermálne. Transdermálne prostriedky môžu mať formu krémov, pleťových vôd, aerosólov a/alebo emulzií a môžu byť zabudované do transdermálnej náplasti so základom alebo môžu mať zásobníkovú formu ako je na tento účel v odbore bežné.

Je výhodné, ak sa zlúčeniny podľa tohto vynálezu podávajú perorálne, intravenózne alebo subkutánne.

Farmaceutické prostriedky sú výhodne vo forme jednotkových dávok. V týchto formách sú prostriedky rozdelené do vhodne veľkých jednotkových dávok, obsahujúcich príslušné množstvá účinných látok, napríklad účinné množstvo na dosiahnutie vyžadovaného účelu.

-34Množstvo účinnej látky podľa tohto vynálezu v jednotkovej dávke prostriedku môže byť vo všeobecnosti rôzne a nastavené od približne 1,0 mg do približne 1000 mg, výhodne od približne 1,0 do približne 950 mg, výhodnejšie od 1,0 do 500 mg a typicky od 1 do približne 250 mg podľa jednotlivých použití prostriedku. Bežne používaná dávka bude rôzna podľa pacientovho veku, pohlavia, hmotnosti a úpomosti liečeného stavu. Tieto techniky sú odborníkom známe.

Všeobecne, perorálnu dávku, ktorá obsahuje účinné zložky možno človekovi podávať 1 alebo 2 razy za deň. Množstvo a frekvencia podávania sa bude upravovať podľa rozhodnutia ošetrujúceho lekára. Všeobecne odporúčaný denný dávkový režim perorálneho podávania môže byť v rozmedzí od približne 1,0 mg do približne 1000 mg za deň v jednej alebo v delených dávkach.

Niektoré použité výrazy sa opisujú ďalej:

výraz kapsula sa týka osobitého zásobníka alebo obalu, vyrobeného z metylcelulózy, polyvinylalkoholu alebo z denaturovaných želatín alebo škrobu tak, aby zásobník alebo obal pojal alebo uchovával prostriedky obsahujúce účinné zložky. Kapsuly s tvrdým obalom sa typicky vyrobia zo zmesí želatínových gélov s vysokou pevnosťou, vyrobených z kostí a z bravčovej kože. Samotná kapsula môže obsahovať malé množstvá farbív, opalizujúcich látok, plastifikátorov a konzervačných látok;

výraz tableta sa týka lisovanej alebo tvarovanej tuhej dávkovej formy, obsahujúcej účinné zložky s vhodným riedidlom. Tabletu možno pripraviť lisovaním zmesí alebo granulátov, získaných mokrou granuláciou, suchou granuláciou alebo stlačením;

výraz perorálny gél sa týka účinných látok dipergovaných alebo solubilizovaných v hydrofilnej polotuhej matrici;

výraz prášok na prípravu tekutého prostriedku sa týka práškových zmesí obsahujúcich účinné zložky a vhodné riedidlá, ktoré možno dispergovať vo vode alebo šťavách;

výraz riedidlo sa týka látok, ktoré zvyčajne tvoria väčšinu prostriedku alebo dávkovej formy. Vhodné riedidlá zahŕňajú cukry ako je laktóza, sacharóza, manitol a sorbitol; pšeničné, kukuričné, ryžové a zemiakové škroby; celulózy ako je mikrokryštalická celulóza. Podiel riedidla v farmaceutickom prostriedku môže byť v

-35rozmedzí od približne 10 do približne 90 % vzťahované na celkovú hmotnosť prostriedku, výhodne od približne 25 do približne 75 %, výhodnejšie od približne 30 do približne 60 % hmotnostných, ešte výhodnejšie od približne 12 do približne 60 %;

výraz látka podporujúca rozpad sa týka materiálov pridaných do farmaceutického prostriedku aby sa ľahšie rozpadal a uvoľňoval liečivo. Vhodnou látkou podporujúcou rozpad sú napríklad škroby, v studenej vode rozpustné modifikované škroby ako je sodná soľ karboxymetylškrobu; prírodné a syntetické gumy ako je akácia, karaya, guar, tragant a agar; deriváty celulózy ako je metylcelulóza a sodná soľ karboxymetylcelulózy; mikrokryštalická celulóza a zosieťované mikrokryštalické celulózy ako je sodná soľ zosieťovanej karboxymetylcelulózy; algináty ako je kyselina alginová a alginát sodný; íly ako sú bentonity; a šumivé zmesi. Množstvo látky podporujúcej rozpad v farmaceutickom prostriedku môže byť v rozmedzi od približne 2 do približne 15 % vzhľadom na celkovú hmotnosť prostriedku, výhodnejšie od približne 4 do 10 % hmotnostných;

výraz spojivo sa týka látok, ktoré viažu alebo lepia prášky spolu; pri vytváraní granulátu sú potom prášky kohézne; spojivá potom v formulácii slúžia ako adhezíva. Spojivá zvyšujú kohézne sily už v zriedenom stave alebo po napúčaní. Vhodné spojivá zahŕňajú cukry ako je sacharóza; pšeničné, kukuričné, ryžové a zemiakové škroby; prírodné gumy ako je akácia, želatína a tragant, deriváty z chalúh ako je kyselina alginová, alginát sodný a alginát amónnovápenatý; celulózové materiály ako je metylcelulóza a sodná soľ karboxymetylcelulózy a hydroxypropylcelulóza; polyvinylpyrolidón; anorganické látky ako je kremičitan hlinitohorečnatý. Množstvo spojiva v prostriedku môže byť v rozmedzi od približne 2 do približne 20 % vzhľadom na celkovú hmotnosť prostriedku, výhodnejšie od 3 do 10 % hmotnostných a ešte výhodnejšie od približne 3 do približne 6 % hmotnostných;

výraz mastivo (lubrikačná látka) sa týka látok pridaných do dávkovej formy aby sa vylisovaná tableta alebo granulát a podobné uvoľnili z formy, alebo aby sa znížilo trenie alebo oter. Vhodné lubrikačné látky zahŕňajú stearany kovov ako je stearan horečnatý, stearan vápenatý alebo stearan draselný; kyselina steárová;

-36vosky s vysokou teplotou topenia; a vo vode rozpustné lubrikačné látky ako je chlorid sodný, benzoan sodný, octan sodný, olean sodný, polyetylénglykoly a d'lleucín. Lubrikačné látky sa zvyčajne pridávajú v poslednom kroku pred lisovaním pretože musia byť prítomné na povrchoch granulátu a medzi granulátom a stenami tabletovacieho lisu. Množstvo lubrikačnej látky v farmaceutickom prostriedku môže byť v rozmedzí od približne 0,2 do približne 5 % (vzťahované na celkovú hmotnosť prostriedku), výhodne od približne 0,5 do približne 2 %, ešte výhodnejšie od 0,3 do 1,5 % hmotnostného;

výraz klzná látka znamená materiál, ktorým sa predchádza zhlukovaniu a ktorým sa zlepšujú tokové vlastnosti granulátov tak, že tok granulátu je plynulý a stále rovnaký. Vhodné klzné látky zahŕňajú oxid kremičitý a mastenec. Množstvo klznej látky v farmaceutickom prostriedku môže byť v rozmedzí približne od 0,1 % do 5 % hmotnostných vzhľadom na celkovú hmotnosť prostriedku, výhodne od 0,5 do približne 2 % hmotnostných;

výraz farbivá znamená pomocné látky, ktoré spôsobujú sfarbenie farmaceutického prostriedku. Tieto pomocné látky zahŕňajú farbivá na potravinárske účely alebo farbivá na potravinárske účely adsorbované na vhodnom adsorbente ako je íl alebo oxid hlinitý. Množstvo farbiva sa môže meniť v rozmedzí približne od 0,1 do 5 % hmotnostných (vzhľadom na celkovú hmotnosť prostriedku), výhodne od 0,1 do 1 % hmotnostného;

výraz biologická dostupnosť sa týka rýchlosti a rozsahu v akom sa účinná liečivá zložka alebo terapeutická skupina absorbuje v systémovom obehu z podávanej dávkovej formy v porovnaní so štandardnou látkou alebo kontrolným pokusom.

Bežné spôsoby prípravy tabliet sú známe. Tieto spôsoby zahŕňajú suché spôsoby prípravy ako je priame lisovanie a lisovanie granulátu, pripraveného zhutnením, alebo mokré spôsoby, alebo iné špeciálne postupy. Známe sú aj bežné spôsoby na prípravu ostatných foriem na podávanie ako sú kapsuly, čapíky a podobné formy.

V inom uskutočnení sa tento vynález týka použitia hore uvedených farmaceutických prostriedkov na liečbu chorôb ako je napríklad hepatitída C a príbuzných ochorení. Spôsob použitia zahŕňa podávanie terapeuticky účinného

-37množstva farmaceutického prostriedku podľa tohto vynálezu pacientovi, ktorý má takú chorobu alebo choroby a potrebuje uvedenú liečbu.

V ešte inom uskutočnení možno zlúčeniny podľa tohto vynálezu použiť u ľudí na liečbu HCV v monoterapeutickom móde alebo v kombinovanom terapeutickom móde ako je napríklad kombinácia s protivírusovými látkami, napríklad s ribavirínom a/alebo interferónom ako je α-interferón a podobné.

Už bolo uvedené, že vynález zahŕňa tiež tautoméry, rotaméry, enantioméry a ďalšie stereoizoméry uvedených zlúčenín. Tak odborník v tejto oblasti uvíta, že zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu jestvovať vo vhodných izomérnych formách. Všetky také formy sa považujú za zahrnuté v rozsahu tohto vynálezu.

Ďalšie uskutočnenie tohto vynálezu zahŕňa spôsob prípravy zlúčenín, opísaných týmto vynálezom. Uvedené zlúčeniny možno pripraviť niekoľkými spôsobmi, známymi v odbore. V nasledujúcich reakčných schémach sa uvádzajú príklady typických spôsobov prípravy. Je zrejmé, že nasledujúce príklady reakčných schém, ktoré opisujú prípravu niekoľkých predstaviteľov zlúčenín podľa tohto vynálezu, možno vhodnou náhradou prírodných a/alebo neprírodných aminokyselín zmeniť a tak získať vyžadované substituované zlúčeniny. Takéto zmeny sa považujú za zahrnuté v rozsahu tohto vynálezu.

V opise schém sa používajú nasledujúce skratky.

THF: tetrahydrofurán;

DMF: Λ/,/V-dimetylŤormamid;

EtOAc: octan etylnatý;

AcOH: kyselina octová;

HOOBt: 3-hydroxy-1,2,3-benzotriazín-4(3/-/)-ón;

EDCI: hydrochlorid 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu;

DEC: hydrochlorid 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu;

NMM: N-metylmorfolín;

ADDP: 1,ľ-(azodikarboyl)dipiperidín;

DEAD: dietylazodikarboxylát;

MeOH: metanol;

EtOH: etanol;

-38Et₂O: dietyléter;

DMSO: dimetylsulfoxid;

HOBt: /V-hydroxybenzotriazol;

PyBrOP: hexafluórfosfát bróm-ŕr/s-pyrolidínofosfónia ;

Bn: benzyl;

Bzl: benzyl;

Et: etyl;

Ph: fenyl;

iBoc: izobutoxykarbonyl;

iPr: izopropyl;

‘Bu alebo Bu^l: terc-butyl;

Boe: ŕerc-butyloxykarbonyl;

Cbz: benzyloxykarbonyl;

Cp: cyklopentyldienyl;

Ts: p-toluénsulfonyl;

Me: metyl;

THP: tetrahydropyranyl;

Chg: cyklohexylglycín.

Všeobecné schémy prípravy

Nasledujúce Schémy znázorňujú spôsoby syntéz medziproduktových stavebných blokov.

Schéma 1

HCI-HzN-Phg-OBu*

OH h

BocHNTO^N^COOH

EDCI NMM

HOOBt (1-1)

BocHN

CI₂CHCO₂H DMSO

DCC , 4N HCI

COOBu dioxán I min w

HCI OH H ⁰ i^{h Η2Ν}Ύ^Υ^Ν [j COOBu' | ° (1.4)

Schéma 2

COOBu* | 4N HCI dioxán 7 min

Ph ^COOBu*

HCI-H₂N-Phg-NMe₂

4N HCI

CONMe₂ dioxán I h j

CI₂CHCO₂H DMSO DCC v

HCI

H₂N

CONMe₂

Schéma 3

CONMe₂

I 4N HCI dioxán 7 min

HCI O

MeSO₂H₂C

Boc-Chg-OH+ _UK1A_z.OBzl MeHN η 3-1 HCI S

3.2

HOOBL EĎCI

NMM

MeSO₂H₂C

Boc-Chg-N'^rf'⁰⁸²' Me II O

3.3

-40Schéma 4

CH₂SO₂Me

HOOBt EDCI NMM COOBu*

MeSO₂H₂C

Boc-Chg-N^

Me

COOBt?

MeSO₂H₂C H OH H O

Boc-Chg-N^^vV ’

MeJ J J

I e ,, J Ph n^nAíoobu*

3.5

I 4NHCI dioxán ’ 7 min

MeSO₂H₂C h OH H j? fh H-Chg_;N/v^NTSr^N^NA Me q J o H

4.1 'COOBu' -¾¾¾—. NaHCO₃ H₂O

MeSO₂H₂C Iboc-Chg-N^ Me

MeSO₂H₂C h lboc-Chg-N'\x'^N Meg

Ph

A

COOBu*

Dess-Martínov jodistan

Ph

N^COOBu*

TFA MeSO₂H₂C H í? H j? J* ^lbOC‘^Ch8MeY^N71í'^N Η^Λ°^ΟΟΗ ' 4.4

MeSO₂H₂C _H O h S Pť

4.5

e₂NH HOOBt EDCI, NMM

-41 Príklady uskutočnenia vynálezu

I) Príprava medziproduktov

Príprava 1

Reakčný krok A: Zlúčenina (1.09)

Do roztoku zlúčeniny (1.08) (3,00 g, 12,0 mmolov; Harbesson S. L., Abelleira

S. M., Akiyama A., Barret R., Carôll R. M. a ďalší, J. Med. Chem. 37(18), 2918 až 2929 (1994)) v DMF (15 ml) a CH2CI2 (15 ml) sa za miešania pri -20 ’C pridal HOOBt (1,97 g, 12,0 mmolov), /V-metylmorfolín (4,0 ml, 36,0 mmolov) a EDCI (2,79 g, 14,5 mmólu) a reakčná zmes sa miešala 10 minút, nasledovalo pridanie HCIH2N-Gly-OBn (2,56 g, 13,0 mmolov). Výsledný roztok sa 2 hodiny miešal pri -20 °C, uložil sa cez noc v mrazničke a potom sa skoncentroval do sucha. Zvyšok sa zriedil EtOAc (150 ml), roztok sa dva razy premyl nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, vodou, 5%-nou kyselinou fosforečnou, roztokom soli a sušil nad bezvodým síranom sodným. Potom sa filtroval a skoncentroval do sucha, čím sa získala zlúčenina (1.09) (4,5 g, 94 % teoretického výťažku).

ĽRMS m/z MH⁺= 395,1.

Reakčný krok B: Zlúčenina (1.1)

(1.09) (1.1)

-42Roztok zlúčeniny (1.09) (7,00 g, 17,8 mmolov) v absolútnom etanole (300 ml) sa miešal pri teplote miestnosti v atmosfére vodíka v prítomnosti Pd-C (300 mg, 10%-né). Postup reakcie sa monitoroval pomocou TLC. Po dvoch hodinách sa zmes filtrovala vrstvou celitu a roztok sa potom skoncentroval vo vákuu, čím sa získala zlúčenina (1.1) (5,40 g, kvantitatívny výťažok).

LRMS m/z MH⁺= 305,1.

Príprava 2

Reakčný krok A: Zlúčenina (1.3)

BocH

OH (1.1)

Ph ’COOBií ·>- BocH oh h ? »^h

(1.2) (1-3)

- Zmes zlúčeniny (1.1) z-Prípravy 1, reakčného kroku B, (1 ekvivalent), zlúčeniny (1.2) (Novabiochem, číslo 04-12-5147) (1,03 ekvivalentu), HOOBt (1,03 ekvivalentu), /V-metylmorfolínu (2,2 ekvivalentu) a dimetylformamidu (70 ml.g'¹) sa miešala pri -20 °C. Pridal sa EDCI (1,04 ekvivalentu) a reakčná zmes sa miešala ešte 48 hodín. Reakčná zmes sa potom naliala do 5%-ného vodného roztoku KH2PO4 a extrahovala octanom etylnatým (2 x). Spojené organické podiely sa premyli chladným 5%-ným roztokom KH2PO4, potom roztokom soli a organická vrstva sa sušila nad bezvodým síranom horečnatým. Zmes sa filtrovala, potom odparila a filtrát sa sušil vo vákuu, zvyšok sa rozotieral so zmesou EÍ2O a hexánu, znova filtroval a získala sa tak v nadpise uvedená zlúčenina (1.3) (86 % teoretického výťažku), C25H39N3O7 (493,60), hmotnostné spektrum (FAB) M+1 = 494,3.

Reakčný krok B: Zlúčenina (1.4)

Ph

(1.3) (1.4)

-43Zlúčenina (1.3) z Prípravy 2, kroku A, (3,0 g) sa zmiešala s roztokom HCI (chci ~ 4 rnol.dm'³ v díoxáne, 36 ml) a reakčná zmes sa miešala 7 minút pri teplote miestnosti. Zmes sa potom naliala do 1,5 litra chladného hexánu (5 °C), nechala stať pol hodiny pri 0 °C. Zmes sa v suchej atmosfére filtrovala s použitím podtlaku a oddelený tuhý podiel sa ďalej sušil, čím sa získala v nadpise uvedená zlúčenina (1.4) (2,3 g, 88% teoretického výťažku); C20H31N3O5.HCI.

¹H NMR (DMSO-de/NaOD): δ 7,38 (m, 5H), 5,25 (m, 1H), 4,3 - 4,1 (m, 1H), 3,8 (m, 2H), 3,4 - 3,3 (m, prekrytý HDO), 1,7 až 1,1 (m, 4H), 1,35 (s, 9H), 0,83 (m, 3H).

Príprava 3

Zlúčenina (1.5)

Zlúčenina (1.3) z Prípravy 2, kroku A, sa spracovala v podstate tým istým spôsobom ako sa uvádza v ďalej uvedenej Príprave 7, kroku A, čím sa získala zlúčenina (1.5).

Príprava 4

Zlúčenina (1.6)

H ° Ph

H (1-6)

Zlúčenina (1.5) z Prípravy 3 sa spracovala v podstate tým istým spôsobom ako sa uvádza v Príprave 2, kroku B, čím sa získala zlúčenina (1.6).

-44Príprava 5

Reakčný krok A: Zlúčenina (2.09)

(2.08)

(2.09)

Do roztoku hydrochloridu dimetylamínu (1,61 g, 19,7 mmolov), N-Boc-fenylglycínu, zlúčeniny (2.08) (4,50 g, 17,9 mmolov, Bachem Co., číslo 2225), HOOBt (3,07 g, 18,8 mmolov) a EDCI (4,12 g, 21,5 mmolov) v bezvodom DMF (200 ml) a CH₂CI₂ (150 ml) pri -20 °C sa pridal NMM (5,90 ml, 53,7 mmolov). Po 30 minútovom miešaní pri uvedenej teplote sa reakčná zmes uchovávala cez noc v mrazničke (18 hodín). Reakčná zmes sa potom nechala zohriať na teplotu miestnosti a pridali sa EtOAc (450 ml), roztok soli (100 ml) a 5%-ná H3PO4 (100 ml). Po oddelení vrstiev sa organická vrstva premyla 5%-nou kyselinou fosforečnou (100 ml), nasýteným vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (2 x 150 ml), vodou (150 ml) a roztokom soli (150 ml), sušila (bezvodý síran horečnatý), filtrovala a skoncentrovala vo vákuu, čím sa získala zlúčenina (2.09) vo forme bielej tuhej látky, ktorá sa bez čistenia použila v ďalšej reakcii.

Reakčný krok B: Zlúčenina (2.1)

(2.09)

(2.1)

Zlúčenina (2.09) z Prípravy 6, kroku A, (4,70 g, surový produkt) sa rozpustila v zriedenej HCI (c_Hci = 4 mol.dm'³, 240 mmolov) a výsledný roztok sa miešal pri teplote miestnosti. Priebeh reakcie sa sledoval TLC. Po 4 hodinách sa roztok

-45skoncentroval vo vákuu, čím sa získala zlúčenina (2.1) vo forme bielej tuhej látky, ktorá sa použila bez čistenia v ďalšom reakčnom kroku.

ĽRMS m/z MH⁺= 179,0.

Príprava 6

Reakčný krok A: Zlúčenina (2.2)

CONMe₂ (2.1)

V podstate rovnakým spôsobom, aký sa uvádza v Príprave 2, kroku A, s výnimkou náhrady hydrochloridu ŕerc-butylesteru fenylglycínu hydrochloridom N,Ndimetylamidfenylglycínu sa pripravila zlúčenina (2.0). Hmotnostné spektrum (FAB) M+1 =465,3.

Reakčný krok B: Zlúčenina (2.3)

Zlúčenina (2.2) (1,85 g) sa nechala hodinu reagovať s kyselinou chlorovodíkovou (chci = 4 mol.dm'³, v dioxáne, 50 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa potom odparila vo vákuu na vodnom kúpeli s teplotou 20 °C, zvyšok sa rozotieral v izopropyléteri, filtroval a sušil, čim sa získala zlúčenina (2.3) (1,57 g, 98% teoretického výťažku);

C₁₈H₂8N4O4.HCI, hmotnostné spektrum (FAB) M+1 = 365,3.

-46Príprava 7

Reakčný krok A: Zlúčenina (2.4)

CONMe₂

Roztok zlúčeniny (2.2) z Prípravy 5, kroku A, (2,0 g) v dichlórmetáne (60 ml) sa spracoval s dimetylsulfoxidom (3,0 ml) a kyselinou 2,2-dichlóroctovou (0,70 ml). Zmes sa za miešania ochladila na 5 °C a pridal sa roztok dicyklohexylkarbodiimidu v dichlórmetáne (c = 4 mol.dm’³, 8,5 ml). Potom sa chladiaci kúpeľ odložil a zmes sa miešala 22 hodín. Potom sa pridal 2-propanol (0,5 ml) a zmes sa miešala ďalšiu hodinu. Zmes sa filtrovala a premyla ľadom vychladeným roztokom NaOH (CNaOH = 0,1 mol.dm’³,50 mP, potom ľadom vychladeným roztokom HCI (chci = 0,1 mol.dm’³, 50 ml), 5%-ným vodným roztokom dihydrogenfosforečnanu draselného a nakoniec roztokom soli. Organická vrstva sa sušila nad bezvodým síranom horéčnatým a filtrovala. Filtrát sa odparil a chromatografoval na silikagéli s použitím octanu etylnatého ako elučným činidlom, čím sa získala zlúčenina (2.3) (1,87 g, 94% teoretického výťažku); C23H34N4O6, hmotnostné spektrum (FAB) M+1 = 463,3.

Reakčný krok B: Zlúčenina (2.5)

CONMe₂

Zlúčenina (2.5) sa pripravila v podstate rovnakým spôsobom, aký sa uvádza v Príprave 2, reakčnom kroku B.

-47 Príprava 8

Reakčný krok A: Zlúčenina (3.3)

Krok A1: Zlúčenina (3.02)

Me-S

Me-N

Boe

COOH

Me-S

Me-N

I

Boe

COOBzl (3-01) (3.02)

Do roztoku zlúčeniny 3.01 (4,6 g, pripravenej z A/-Boc-S-metylcysteínu, Bachem Biosciences Inc. postupom uvedeným Bogerom J., Org. Chem., 53(3), 487 (1988)) v DMF (150 ml) sa pridal Cs₂CO₃ (6,1 g) a potom benzylbromid (2,3 ml); zmes sa 4 hodiny miešala pri teplote miestnosti, potom sa skoncentrovala vo vákuu, a zvyšok sa rozmiešal v octane etylnatom (200 ml). Zmes sa potom premyla vodným 5%-ným roztokom dihydrogenfosforečnanu draselného, potom roztokom soli a organická vrstva sa sušila nad bezvodým síranom horečnatým. Po filtrácii sa filtrát odparil, čím sa získal produkt (3.02) (6,2 g); [a] d = -33,7°(c = 1,3, CHCI₃).

Krok A2: Zlúčenina 3.03

Me-S

COOBzl (3.02)

O₂

COOBzl

Spôsobom, ktorý opísal Larsson (Larsson U. a ďalší, Acta Chem. Scan.

48(6), 517 až 522 (1994)) sa roztok oxónu® (16,4 g, Aldrich Chemical Co.) vo vode (90 mí) pomaly pri 0 °C pridal do roztoku zlúčeniny (3.02) (6,1 g) v MeOH (150 ml).

Zmes sa 4 hodiny miešala pri teplote miestnosti, potom skoncentrovala na 1/2 objemu v rotačnej odparke, pridala sa studená voda (100 ml) a zmes sa extrahovala octanom etylnatým. Extrakt sa premyl roztokom soli a sušil nad bezvodým síranom

-48horečnatým. Zmes sa filtrovala, filtrát sa odparil a získal sa produkt (3.03) (5,9 g); [oc]_D = -26,3°(c = 0,9, CHCIa).

Krok A3: Zlúčenina 3.2

O₂

Me-N COOBzl i

Boe (3.03)

O₂

COOBzl (3.2)

Produkt (3.03) z prechádzajúceho kroku sa zmiešal s roztokom HCI v dioxáne (chci = 4 mol.dm'³) (0,5 hodiny) a získal sa produkt (3.2); C^HnNOíS.HCI (307,79); hmotnostné spektrum (FAB) M+1 = 272,0.

Príprava zlúčeniny (3.3)

Boc-Chg-OH +

MeSC^C

MeHI'/y⁰⁸²' HCI ⁰ ______ MeSQzHjC

BocrChg-MY⁰⁶²¹

IVte »_o (3-Ό (3.2) (3.3)

Zlúčenina (3.2) (hydrochlorid sulfónbenzylesteru S-metylcysteínu) a zlúčenina (3.1) (/V-Boc-cyklohexylglycín) sa nechali reagovať v podstate rovnakým spôsobom aký sa uvádza v Príprave 2, kroku A. Získala sa zlúčenina (3.3) C25H38N2O7S (510,64).

Reakčný krok B: Zlúčenina (3.4)

MeSO₂H₂C

Boc-Chg—N^z^V'^0Bzl Me

CH₂SO₂Me **· Boc-Chg-híV⁰^ Me f.

3.3

3.4

-49Zmes zlúčeniny (3.3) z kroku A hore (0,7 g), 10%-né Pd/C (0,05 g) a EtOHdioxán (100 ml) sa 5 hodín miešala v atmosfére vodíka (0,3 MPa). Potom sa zmes filtrovala a filtrát sa odparil do sucha vo vákuu, čím sa získala zlúčenina (3.4) (0,56 g, 97 % teoretického výťažku); C₁₈H₃2N2O₇S (420,52), hmotnostné spektrum (FAB) M+1 =421,2.

Reakčný krok C: Zlúčenina (3.5)

(3.4) (1.4) (3.5)

Reakciou zlúčeniny (3.4) z kroku B hore so zlúčeninou (1.4) z Prípravy 2, kroku B, v podstate rovnakým spôsobom aký sa uvádza v Príprave 2, kroku A sa získala zlúčenina (3.5); C₃₈H6iN₅0iiS (795,98); hmotnostné spektrum (FAB) M+1 = 796,3.

Príprava 9

Zlúčenina (4.1)

MeSO₂H₂c

Boc-Chg-N Me

' _>MeSO₂H₂C _H OH H ° ?^h

COOBu' H-Ch_S-N-^JY^NYSr^N'^'N^ACOOBu‘ HCI ^Me O J ° ^H (4.1)

Zlúčenina (3.5) z Prípravy 8, kroku C sa nechala reagovať v podstate rovnakým spôsobom, aký sa uvádza v Príprave 2, kroku B a získala sa zlúčenina (4.1); C33H63N5O9S.HCI (732,33).

-50Príprava 10 Zlúčenina (4.2)

Meac^c H fn H 1° f¹ M3SCW H f*⁴ H ? jh (4.1) (4.2)

Roztok zlúčeniny (4.1) z Prípravy 9 (0,7 g), dimetylformamidu (15 ml) a diizopropyletylamínu (0,38 ml) sa pri 5 °C zmiešal s izobutylesterom kyseliny chlórmravčej (0,15 ml). Chladiaci kúpeľ sa potom odložil a reakčná zmes sa 6 hodín miešala, naliala do 5%-ného vodného roztoku dihydrogenfosforečnanu draselného (100 ml) a extrahovala octanom etylnatým (2 x 100 ml). Po premytí spojených organických vrstiev chladným vodným roztokom uhličitanu draselného, potom 5%ným roztokom dihydrogenfosforečnanu draselného a po sušení organickej vrstvy nad bezvodým síranom horečnatým sa zmes filtrovala a filtrát sa odparil vo vákuu, zvyšok sa rozotieral s Et₂O-hexánom a odfiltroval, čím sa získala zlúčenina (4,2).

Príprava 11

Zlúčenina (4.3)

COOBu*

Reakciou zlúčeniny (4.2) v podstate rovnakým spôsobom aký sa opisuje v ďalej uvedenej Príprave 14, kroku H, sa získala zlúčenina (4.3).

Príprava 12

Zlúčenina (4.4)

MeSOjHjC

Iboo-Chg-

COOBu¹ (4.3)

MeSO₂H2C

Iboc-Chg-

co OH (4.4)

-51 Zlúčenina (4.3) z Prípravy 11 (asi 0,10 g) sa asi 2 hodiny nechala reagovať s roztokom bezvodej kyseliny trifluóroctovej v dichlórmetáne (1:1, asi 10 ml). Roztok sa potom zriedil xylénom (približne 50 ml) a odparil vo vákuu. Zvyšok sa rozotieral s Et₂O, filtroval, čím sa získala zlúčenina (4.4).

Príprava 13

Zlúčenina (4.5)

N

H

H

CONMe₂

Reakciou zlúčeniny (4.4) z Prípravy 12 s dimetylamínom sa v podstate rovnakým spôsobom aký sa uvádza v Príprave 2, kroku A získala zlúčenina (4.5).

Príprava 14

Reakčný krok A: Zlúčenina (5.2)

(5.01) (5.1) (5.2)

Do roztoku zlúčeniny (5.01) (1,11 g, 7,0 mmolov) v bezvodom DMF (10 ml) a bezvodom CH2CI2 (10 ml) sa za miešania pri teplote 0 °C pridal HOBT (1,19 g, 7,25 mmolov), /V-metylmorfolín (2,3 ml, 21,0 mmolov) a DEC (1,6 g, 8,4 mmolov). Výsledný roztok sa 15 minút miešal pri 0 °C a nasledovalo pridanie H-Val-O-terc-Bu (1,54 g, 7,35 mmolov). Roztok sa cez noc uchovával v mrazničke. Vznikol značný podiel precipitátu a roztok sa skoncentroval do sucha, nasledovala extrakcia octanom etylnatým, nasýteným hydrogenuhličitanom sodným. Spojené organické vrstvy sa potom premyli 5%-ným roztokom kyseliny fosforečnej, vodou, roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a odparili, čim sa získal surový produkt (5.1) (2,4 g, 98 % teoretického výťažku).

-52Roztok surového produktu (získaného hore) v kyseline chlorovodíkovej (c_Hci = 4 mol.dm*³v dioxáne)sa miešal 7 hodín pri teplote miestnosti a skoncentroval sa do sucha, čím sa získala zlúčenina (5.2).

Reakčný krok B: Zlúčenina (5.4)

BOC

(5-4)

Do roztoku zlúčeniny (5.3) (Bach F. L., Jr. a ďalší, J. Amer. Chem. Soc. 77, 6049 (1955)) (17,5 g, 0,086 molu) v 50 % MeOH/50 % H₂O (300 ml) sa za miešania pridal anhydrid Boe (47,0 g, 0,215 molu). pH roztoku sa potom upravilo na hodnotu

9,5 pridávaním 50%-ného roztoku NaOH po kvapkách. Výsledný roztok sa cez noc miešal pri teplote miestnosti, potom sa neutralizoval koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou až sa dosiahlo pH 8 a okyslil kyselinou citrónovou na pH = 2,94. Nasledovala extrakcia do CH2CI2. Spojené organické vrstvy sa sušili nad bezvodým síranom horečnatým a odparením sa získala zlúčenina (5.4) (27,16 g 95 % teoretického výťažku).

Reakčný krok C: Zlúčenina (5.5)

(5.4)

Pri 0 °C sa pripravil roztok tionylchloridu (3,37 ml, 0,046 molu) v DMF (3,59 ml, 0,046 molu); roztok sa zohrial sa na teplotu miestnosti a miešal 35 minút. Potom sa ochladil na 0 °C a pridala sa zlúčenina (5.4) z kroku B hore (15,0 g, 0,045 molu) v CH₃CN (150 ml) a pyridíne (3,73 ml, 0,046 molu). Výsledný roztok sa zahrial na

-53teplotu miestnosti a cez noc miešal. Potom sa roztok nalial do ľadovej vody (700 ml) a tri razy extrahoval octanom etylnatým (150 ml). Spojené organické vrstvy sa premyli roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (5.5) (10,8 g).

Reakčný krok D: Zlúčenina (1.08)

(6.6)

Do roztoku zlúčeniny (6.6) z ďalej uvedenej Prípravy 14, kroku D, (6,5 g, 0,044 molu) v CH2CI2 (130 ml) sa za miešania pridal anhydrid Boe (9,65 g, 0,044 molu) a DMF (50 ml). Výsledný roztok sa miešal cez víkend pri teplote miestnosti a skoncentroval sa do sucha. Pridala sa voda (120 ml) a 50%-ným roztokom NaOH sa upravilo pH roztoku na 10 až 11. Roztok sa potom 2 hodiny miešal, pridal sa ešte anhydrid Boe (1,93 g, 8,8 mmolov) a reakčná zmes sa cez noc miešala pri teplote miestnosti.. Potom sa roztok extrahoval dichlórmetánom a vodná vrstva sa pri 0 °C okyslila na pH = 4 zriedenou kyselinou chlorovodíkovou (chci = 1 mol.dm'³) a potom tri razy extrahovala dichlórmetánom. Spojené organické vrstvy sa premyli roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (1.08) (4,50 g, 41 % teoretického výťažku), (M-ŕerc-butyl+2 = 192).

Reakčný krok E: Zlúčenina (5.7)

(1.08) (5-7)

-54Do roztoku zlúčeniny (1.08) z predchádzajúceho kroku (4,5 g, 0,018 molu) v DMF (22 ml) a dichlórmetáne sa za miešania pridal HOBT (2,7 g, 0,02 molu), Nmetylmorfolín (6 ml, 0,054 molu), DEC (4,17 g, 0,022 molu) a alylglycín.TsOH (6,1 g, 0,02 molu). Výsledný roztok sa cez víkend miešal pri teplote miestnosti a potom sa skoncentroval do sucha. Nasledovala extrakcia octanom etylnatým, nasýteným hydrogenuhličitanom sodným. Spojené organické vrstvy sa premyli 10%-ným vodným roztokom kyseliny fosforečnej, roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným a filtrovali, čím sa získal surový produkt (5,7 g). Roztok tohto surového produktu v HCI (c_Hci = 4 rnol.dm'³ v dioxáne) (50 ml) sa 50 minút miešal pri teplote miestnosti a skoncentroval do sucha, čím sa získala zlúčenina (5.7) (4,79 g, 94 % teoretického výťažku). MS MH⁺ = 245,1.

Reakčný krok F: Zlúčenina (5.8)

(5.8)

Do roztoku zlúčeniny (5.7) z predchádzajúceho kroku E (3,1 g, 0,011 molu) v bezvodom CH2CI2 (55 ml) sa za miešania a po kvapkách v priebehu 13 minút pridával TEA (1,69 mL 0,012 molu) a zlúčenina (5.5) z kroku C (2,83 g, 0,011 molu) v bezvodom CH2CI2 (55 ml). Výsledný roztok sa 1,5 hodiny miešal pri teplote miestnosti. Organická vrstva sa potom premyla nasýteným vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, sušila nad bezvodým síranom sodným a filtrovala, čím sa získala zlúčenina (5.8) (4,67 g, MS MS⁺ = 457,2).

Reakčný krok G: Zlúčenina (5.9)

(5-8) (5-9)

-55Do roztoku zlúčeniny (5.2) z predchádzajúceho kroku A (0,34 g, 1,31 mmol) v CH2CI2 (5 ml) a DMF (5 ml) sa pri 0 °C za miešania pridal HOBT (0,214 g, 1,31 mmólu), /V-metylmorfolín (0,43 ml, 3,9 mmólu) a DEC (0,5 g, 1,09 mmólu). Zmes sa 15 minút miešala pri teplote miestnosti. Potom sa pridala zlúčenina (5.8) z predchádzajúceho kroku F (0,5 g, 1,09 mmólu). Výsledný roztok sa cez noc uložil do mrazničky a potom skoncentroval do sucha. Nasledovala extrakcia octanom etylnatým-vodou. Spojené organické vrstvy sa dva razy premyli nasýteným vodným roztokom hydrogeňuhličitanu sodného, 5%-ným roztokom kyseliny fosforečnej, roztokom soli a sušili nad bezvodým síranom sodným. Filtráciou a skoncentrovaním do sucha sa získala zlúčenina (5.9) (0,65 g, MS MH⁺ = 697,4).

Reakčný krok H: Zlúčenina (5.10)

n

^H o (5.9) (5.10)

Do roztoku zlúčeniny (5.9) z predchádzajúceho kroku G (0,6 g, 0,8 mmólu) v bezvodom CH2CI2 (8 ml) sa za miešania pridalo Dess-Martinovo činidlo (0,732 g, 1,72 mmólu) a reakčná zmes sa hodinu miešala pri teplote miestnosti. Potom sa po kvapkách pridala voda (0,031 ml) a Dess-Martinovo činidlo (0,373 g, 0,86 mmólu) v CH₂CI₂ (12 ml). Výsledný roztok sa 2,5 hodiny miešal pri teplote miestnosti, nasledovalo pridanie roztoku 50 % nasýteného NaHCO3/50 % nasýteného roztoku Na₂S₂O₃ (20 ml) a roztok sa rýchlo miešal 1,5 hodiny pri teplote miestnosti. Potom sa roztok premyl vodou, roztokom soli, sušil nad bezvodým síranom sodným a skoncentroval do sucha, čím sa získala zlúčenina (5.10) (0,588 g, 100%-ný výťažok, MS MH⁺ = 695,2).

Príprava 15

Reakčný krok A: Zlúčenina (6.2)

(6.1)

BOC-Νγ^,Η,

(6-2)

Do roztoku zlúčeniny (6.1) (5,0 g, 19,89 mmolov) v CH2CI2 (20 ml) a DMF (10 ml) sa za miešania pri -20 °C pridal HOBT (3,25 g, 19,89 mmolov) EDCI (4,58 g, 23,87 mmolov) a /V-metylmorfolín (6,56 ml, 59,69 mmolov). Výsledný roztok sa 10 minút miešal pri teplote miestnosti. Potom sa pridal chlorid amónny (1,38 g) a zmes sa cez noc uložila pri 0 °C. Potom sa roztok skoncentroval, extrahoval octanom etylnatým a vodou. Spojené organické vrstvy sa dva razy premyli roztokom hydrogénuhličitanu sodného, kyselinou fosforečnou a roztokom soli. Sušili sa nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha. Surový produkt sa čistil stĺpcovou chromatografiou s použitím 2,5%-ného MeOH v CH2CI2 ako elučným činidlom, čím sa získala zlúčenina (6.2) (1,95 g, MS MH⁺ = 251,1).

Reakčný krok B: Zlúčenina (6.3) boc-n^A_NH2 ^HCl· ^h2ⁿγ^ΝΗ₂

(6.2) (θ·3)

Roztok zlúčeniny (6.2) z kroku A (12,32 g, 49,28 mmolov) v HCI/dioxáne (chci = 4 mol.dm’³ v dioxáne) (270 ml, 43,08 mmolov) sa 2 hodiny miešal pri teplote miestnosti, potom sa skoncentroval do sucha, čím sa získala zlúčenina (6.3) (8,40 g, 100%-ný výťažok).

Reakčný krok C: Zlúčenina (1.8) - alternatívna syntéza

(6.4) (6.5)

-57Do roztoku 1-nitrobutánu (16,5 g, 0,16 molu), monohydrátu kyseliny glyoxálovej (28,1 g, 0,305 molu) v MeOH (122 ml) sa pri 0 až 5 °C po kvapkách v priebehu 2 hodín pridal trietylamín (93 ml, 0,667 molu), roztok sa zahrial na teplotu miestnosti, cez noc miešal a potom skoncentroval do sucha, čím sa získal olejovitý produkt. Olej sa potom zmiešal s vodou a okyslil (na pH = 1) 10%-ným roztokom HCI. Nasledovala extrakcia s EtOAc. Spojené organické vrstvy sa premyli roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (6.5) (28,1 g, 99 % teoretického výťažku).

Reakčný krok D: Zlúčenina (6.6)

(6.6)

z kroku C (240 g, 1,35 molu) v kyseline octovej

Pd/C (37 g). Výsledný roztok sa 3 hodiny

_. Do roztoku zlúčeniny (6.5) (1,25 litra) sa pridalo 10%-né hydrogenoval vodíkom pri 0,41 MPa (59 psi) a potom pri 0,42 MPa (60 psi) cez noc. Kyselina octová sa potom odparila a zvyšok sa tri razy azeotropicky destiloval s toluénom, potom sa rozotieral s MeOH a éterom. Roztok sa potom filtroval a dva razy azeotropicky destiloval s toluénom, čím sa získala zlúčenina (6.6) (131 g, 66 % teoretického výťažku).

Reakčný krok E: Zlúčenina (1.08)

Do roztoku zlúčeniny (6.6) z kroku D (2,0 g, 0,0136 molu) v dioxáne (10 ml) a vode (5 ml) sa za miešania pri 0 °C pridal vodný roztok NaOH (Cnsoh ⁼ 1 mol.dm'³) (4,3 ml, 0,014 molu). Výsledný roztok sa 10 minút miešal a potom sa pridal anhydrid

-58Boc (0,11 g, 0,014 molu) a reakčná zmes sa 15 minút miešala pri 0 °C. Potom sa roztok zohrial na teplotu miestnosti, 45 minút miešal, cez noc sa uložil do mrazničky a potom sa skoncentroval do sucha, čím sa získal surový materiál. Do roztoku tohto surového materiálu v EtOAc a ľadu sa pridal KHSO₄ (3,36 g, a voda (32 ml) a zmes sa 4 až 6 minút miešala. Organická vrstva sa potom oddelila a vodná vrstva sa extrahovala dva razy s EtOAc. Spojené organické vrstvy sa premyli vodou, roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (1.08) (3,0 g, 89,2 % teoretického výťažku).

Reakčný krok F: Zlúčenina (1.09)

(1.08)

Do roztoku zlúčeniny (1,08) z kroku E (3,0 g, 0,012 molu) v DMF (15 ml) a CH₂CI₂ (15 ml) sa za miešania pri -20 °C pridal HOBT (1,97 g, 0,012 molu), /V-metylmorfolín (4,0 ml, 0;036 molu) a EDCI (2,79 g, 0,0145 molu). Výsledný roztok sa miešal 10 minút a potom sa pridal hydrochlorid H-Gly-OBZ (2,56 g, 0,013 molu). Roztok sa 2 hodiny miešal pri -20 °C, cez noc sa uložil do mrazničky. Potom sa skoncentroval do sucha. Zvyšok sa rozpustil v EtOAc, roztok sa dva razy premyl nasýteným roztokom NaHCO3, vodou, 5%-ným roztokom kyseliny fosforečnej, roztokom soli, sušil nad bezvodým síranom sodným, filtroval a skoncentroval do sucha, čím sa získala zlúčenina (1.09) (4,5 g, 94 % teoretického výťažku, MS MH⁺ =

395,1).

Reakčný krok G: Zlúčenina (6.9)

(1.09) (6.9)

-59Roztok zlúčeniny (1.09) z kroku F (4,5 g, 0,0114 molu) v HCI/dioxáne (c_Hci = 4 mol.dnrí v dioxáne) (45 ml) sa 45 minút miešal pri teplote miestnosti, potom sa skoncentroval do sucha, čím sa získala zlúčenina (6.9) (4,5 g, MS MH⁺ = 295,1).

Reakčný krok H: Zlúčenina (6.11)

(6.1) (6.11)

Do roztoku Boc-fenyl-glycínu, zlúčeniny (6.1), (0,398 g, 1,58 mmólu) v CH2CI2 (5 ml) v 100 ml banke s guľatým dnom sa za miešania pri -20 °C pridal HOBT (0,258 g, 1,58 mmólu), EDCI (0,364 g, 1,903 mmólu) a /V-metylmorfoíín (0,523 g, 4,759 mmólu). Zmes sa 5 minút miešala, potom sa pridala zlúčenina (6.9) z kroku G (0,5 g, 1,51 mmólu) a CH₂CI₂ (5 ml). Výsledný roztok sa 10 minút miešal pri -20 °C a uložil sa cez noc v mrazničke. Reakčná zmes sa potom skoncentrovala do sucha, nasledovala extrakcia s EtOAc, nasýteným NaHCO3. Spojené organické vrstvy sa potom premyli 5%-ným roztokom kyseliny fosforečnej, roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (6.11) (0,75 g, 94 % teoretického výťažku, MS MH⁺ = 528,1).

Reakčný krok J: Zlúčenina (6.12)

Roztok zlúčeniny (6.11) z kroku H (0,75 g, 1,423 mmólu) v kyseline chlorovodíkovej (chci = 4 mol.dm'³ v dioxáne, 21 ml) sa 3 hodiny miešal pri teplote

-60miestnosti, potom sa skoncentroval do sucha, čím sa získala zlúčenina (6.12) (0,68 g, 100%-ný výťažok).

Reakčný krok K: Zlúčenina (6.14)

(6-13)

(6.14)

Do roztoku zlúčeniny (6.13) (0,44 g, 1,725 mmólu) v dichlórmetáne (5 ml) a DMF (5 ml) sa za miešania pri -20 °C pridal EDCI (0,39 g, 2,07 mmólu), HOBT (0,18 g, 1,725 mmólu) a /V-metylmorfolín (0,523 ml, 4,76 mmólu). Reakčná zmes sa 5 minút miešala, potom sa pridala zlúčenina (6.12) z kroku J (0,68 g, 1,64 mmólu) v dichlórmetáne (7 ml). Výsledný roztok sa 10 minút miešal pri -20 °C a cez noc bol uložený v mrazničke. Potom sa skoncentroval do sucha, nasledovala extrakcia s EtOAc, nasýteným s NaHCO₃. Spojené organické vrstvy sa potom premyli 5%-ným roztokom kyseliny fosforečnej, roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (6.14) (0,59 g, 54 % teoretického výťažku, MS MH⁺ = 667,3).

Reakčný krok L: Zlúčenina (6.15)

(6.14) (6.15)

Do roztoku zlúčeniny (6.14) z kroku K (0,593 g, 0,89 mmólu) v dichlórmetáne (20 ml) a DMF (5 ml) sa za miešania pridal Dess-Martinov jodistan (0,76 g, 1,784 mmólu). Roztok sa miešal 2 hodiny pri teplote miestnosti, a pridala sa zmes vody a dichlórmetánu. Zmes sa 45 minút miešala, potom sa pridal roztok 50 % nasýteného roztoku NaHCOVSO % nasýteného roztoku Na₂S2O₃ (10 ml); zmes sa miešala

-61 ďalšiu 1,5 hodinu. Potom sa pridal ďalší dichlórmetán a organická vrstva sa premyla roztokom soli, sušila nad bezvodým síranom sodným, filtrovala, skoncentrovala do sucha a čistila stĺpcovou chromatografiou s použitím 2,5%-ného MeOH v dichlórmetáne ako elučným činidlom. Získala sa zlúčenina (6.15) (0,48 g, 82 % teoretického výťažku).

Reakčný krok M: Zlúčenina (6.16)

(6.15) (6.16)

Do roztoku zlúčeniny (6.15) z kroku L (0,16 g, 0,24 mmólu) v absolútnom etanole (10 ml) sa za miešania pridalo Pd/C (40,8 mg). Roztok sa intenzívne miešal a pridala sa 1 kvapka kyseliny octovej. Roztok sa potom miešal 2 hodiny v atmosfére plynného vodíka a následne filtroval vrstvou celitu, čím sa získala zlúčenina (6.16) (0,133 g, 95 % teoretického výťažku, MS MH⁺ = 575,3).

Reakčný krok N: Zlúčenina (6.18)

O BOC-NH U

(6-17)

Do roztoku zlúčeniny (6.17) (0,5 g, 1,59 mmólu) v dichlórmetáne (5 ml) a

DMF (5 ml) sa za miešania pri -20 °C pridal HOBT (0,259 g, 1,59 mmólu), NMM (0,48 g, 4,77 mmólu) a EDCI (0,366 g, 1,91 mmólu). Zmes sa 5 minút miešala a potom sa pridala zlúčenina (6.9) z kroku G (0,5 g, 1,51 mmólu) a dichlórmetán (5 ml). Výsledný roztok sa 10 minút miešal pri -20 °C, uložil sa cez noc do mrazničky, potom sa skoncentroval do sucha. Nasledovala extrakcia s EtOAc, nasýteným

-62NaHCO₃. Spojené organické vrstvy sa potom dva razy premyli 5%-ným roztokom kyseliny fosforečnej, roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (6.18) (0,95 g, MS MH⁺ = 592,1).

Reakčný krok O: Zlúčenina (6.19)

(6.18)

(6.19)

Roztok zlúčeniny (6.18) z kroku N (0,93 g, 1,58 mmolu) v HCI/dioxáne (chci = 4 mol.dm’³, v dioxáne, 26 ml) sa 2 hodiny miešal pri teplote miestnosti, potom sa skoncentroval do sucha, čím sa získala zlúčenina (6.19) (0,96 g, 100%-ný výťažok, MS MH⁺ = 492,1).

Reakčný krok P: Zlúčenina (6.20)

(6.20)

Do chladeného roztoku zlúčeniny (6.13) (0,51 g, 2,02 mmolu) v dichlór metáne (5 ml) a DMF (5 ml) sa za miešania pri -20 °C pridal HOBT (0,33 g, 2,02 mmolu), /V-metylmorfolín (0,61 g, 6,06 mmolu) a EDCI (0,46 g, 2,42 mmolu).

Reakčná zmes sa 5 minút miešala, potom sa pridala zlúčenina (6.19) z kroku O (0,94 g, 1,92 mmolu). Výsledný roztok sa 10 minút miešal pri -20 °C, nechal cez noc v mrazničke, potom skoncentroval do sucha a extrahoval EtOAc, nasýteným NaHCO₃. Spojené organické vrstvy sa premyli 5%-ným roztokom kyseliny

-63fosforečnej, roztokom soli a sušili nad bezvodým síranom sodným. Potom sa skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (6.20) (1,29 g, 87 % teoretického výťažku).

Reakčný krok Q: Zlúčenina (6.21)

(6.20)

Do roztoku zlúčeniny (6.20) z kroku P (1,27 g, 1,74 mmólu) v absolútnom etanole (50 ml) sa pridalo Pd/C (100 mg). Výsledný roztok sa intenzívne miešal a pridali sa 2 kvapky kyseliny octovej. Roztok sa potom hydrogenoval 2 hodiny, filtroval celitom, čím sa získala zlúčenina (6.21) (1,07 g, 96 % teoretického výťažku, MS MH⁺= 641,1).

Reakčný krok R: Zlúčenina (6.22)

(6.21)

Do roztoku zlúčeniny (6.21) z kroku Q (0,25 g, 0,39 mmólu) v dichlórmetáne (5 ml) a DMF (5 ml) sa za miešania pri -25 °C pridal HOBT (0,06 g, 0,39 mmólu), Nmetylmorfolín (0,12 g, 1,17 mmólu), EDCI (0,089 g, 1,17 mmólu); roztok sa 10 minút miešal, potom sa pridala zlúčenina (6.3) z kroku B (0,069 g, 0,37 mmólu). Výsledný roztok sa 15 minút miešal pri -25 °C, uložil sa cez noc do mrazničky, potom sa skoncentroval do sucha. Nasledovala extrakcia EtOAc, nasýteným NaHCO3.

-64Spojené organické vrstvy sa premyli 5%-ným roztokom kyseliny fosforečnej, potom roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (6.22).

Reakčný krok S: Zlúčenina (6.23)

(6-22) (6.23)

Do roztoku zlúčeniny (6.22) z kroku R (0,23 g, 0,302 mmólu) v dichlórmetáne (10 ml) sa za miešania pri -20 °C pridal Dess-Martinov jodistan (0,256 g, 0,60 mmólu). Výsledný roztok sa 2 hodiny miešal pri teplote miestnosti, potom sa pridala zmes vody a dichlórmetánu a celá zmes sa miešala ďalších 45 minút. Do reakčnej zmesi sa potom pridala zmes 50 % nasýteného roztoku NaHCOa/ôO % nasýteného roztoku Na₂S₂O₃ a reakčná zmes sa miešala ďalšiu 1,5 hodinu. Do roztoku sa pridal ďalší dichlórmetán a organická vrstva sa potom premyla roztokom soli, sušila nad bezvodým síranom sodným, filtrovala, skoncentrovala do sucha a čistila stĺpcovou chromatografiou na silikagéli s použitím 1 až 3%-ného roztoku MeOH v dichlórmetáne, čím sa získala zlúčenina (6.23) (0,08 g, 34 % teoretického výťažku, MSMH⁺= 771,2 g).

Príprava 16

Reakčný krok A: Zlúčenina (7.2)

-65Do roztoku zlúčeniny (7.1) (0,476 g, 1,51 mmolu) v dichlórmetáne (60 ml) a DMF (60 ml) sa za miešania a pri -20 °C pridal HOBT (0,246 g, 1,51 mmolu), Nmetylmorfolín (0,458 g, 4,53 mmolu) a EDCI (0,351 g, 1,81 mmolu). Reakčná zmes sa 5 minút miešala, potom sa pridala zlúčenina (6.8) z Prípravy 15, kroku F, (0,5 g, 1,51 mmolu). Výsledný roztok sa 3 hodiny miešal pri -20 °C a uložil sa cez noc do mrazničky. Potom sa skoncentroval do sucha, nasledovala extrakcia EtOAc, nasýteným s NaHCO3. Spojené organické vrstvy sa dva razy premyli 5%-nou kyselinou fosforečnou, vodou a potom roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (7.2) (0,82 g, 94 % teoretického výťažku, MS MH⁺ = 592,1).

Reakčný krok B: Zlúčenina (7.3)

Roztok zlúčeniny (7.2) z kroku A (0,82 g, 1,39 mmolu) v HCI/dioxáne (chci = 4 mol.dm’³, v dioxáne, 20 ml) sa 2 hodiny miešal pri teplote miestnosti, potom sa skoncentroval do sucha, čím sa získala zlúčenina (7.3) (0,84 g, 100%-ný výťažok, MS MH⁺= 492,3).

Reakčný krok C: Zlúčenina (7.4) boc-n^oh ----ô

(6.13) (7.4)

-66Do roztoku zlúčeniny (6.13) (0,36 g, 1,40 mmolu) v dichlórmetáne (60 ml) a DMF (60 ml) sa za miešania a pri -20 °C pridal HOBT (0,228 g, 1,40 mmolu), Nmetylmorfolín (0,425 g, 4,20 mmolu) a EDCI (0,322 g, 1,68 mmolu). Reakčná zmes sa 5 minút miešala, potom sa pridala zlúčenina (7.3) z kroku B (0,84 g, 1,40 mmolu). Výsledný roztok sa 3 hodiny miešal pri -20 °C a uložil sa cez noc do mrazničky. Potom sa skoncentroval do sucha, nasledovala extrakcia EtOAc, nasýteným s NaHCO₃. Spojené organické vrstvy sa premyli 5%-nou kyselinou fosforečnou, vodou a potom roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (7.4) (0,82 g, 57 % teoretického výťažku, MS MH⁺ = 731,3).

Reakčný krok D: Zlúčenina (7.5) (7.5) (7-4)

Do roztoku zlúčeniny (7.4) z kroku C (0,55 g, 0,75 mmolu) v dichlórmetáne (5 ml) sa za miešania pridal Dess-Martinov jodistan (0,64 g, 1,50 mmolu). Výsledný roztok sa 2 hodiny miešal pri teplote miestnosti, potom sa pridala zmes vody a dichlórmetánu a celá zmes sa miešala ďalších 45 minút. Do reakčnej zmesí sa potom pridala zmes 50 % nasýteného roztoku NaHCOs/50 % nasýteného roztoku Na₂S₂O₃ a reakčná zmes sa miešala ďalšiu 1,5 hodinu. Do roztoku sa pridal ďalší dichlórmetán a organická vrstva sa potom premyla roztokom soli, sušila nad bezvodým síranom sodným, filtrovala, skoncentrovala do sucha, čím sa získala zlúčenina (7.5) (0,24 g, 44 % teoretického výťažku, MS MH⁺ = 729,5 g).

Reakčný krok E: Zlúčenina (7.6)

ΟΗ

Do roztoku zlúčeniny (7.5) z kroku D (0,10 g, 0,14 mmólu) v absolútnom etanole (20 ml) sa pridalo Pd/C (20 mg). Výsledný roztok sa intenzívne miešal v 100 ml banke s guľatým dnom. Roztok sa potom hydrogenoval prebublávanim plynným vodíkom cez noc, filtroval cez celit, premyl etanolom a skoncentroval, čim sa získala zlúčenina (7.6) (93 mg, 100 % teoretického výťažku, MS MH* = 639,1).

Príprava 17

A-E

R=Benzyl (8.2) R=H (8.3)

V podstate rovnakým spôsobom, aký sa opisuje v Príprave 16, v krokoch A až E, s výnimkou náhrady zlúčeniny (7.1) zlúčeninou (8.1) v kroku A, sa pripravili zlúčeniny (8.2) a (8.3).

Príprava 18

Reakčný krok A: Zlúčenina (9.2) o

TšOH.NH₂^X

(9.1) (9.2)

Do roztoku (S)-(+)-2-fenyl-glycínu (9.1) (15,0 g, 0,099 molu) v benzéne (350 ml) sa pridal monohydrát kyseliny p-toluénsulfónovej (20,76 g, 0,116 molu) a benzylakohol (30 ml, 0,29 molu). Výsledný roztok sa zahrieval na teplotu varu pod spätným chladičom cez noc; roztok zhustol. Roztok sa potom ochladil na teplotu miestnosti a pridal sa éter. Tuhý podiel sa odfiltroval filtračným lievikom s filtračnou fritou a dva razy premyl éterom. Podiel na filtri sa sušil v ochrannej atmosfére dusíka, čím sa získal tuhý produkt (35,4 g). Produkt sa potom rozpustil v dichlórmetáne a premyl nasýteným vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného. Organická vrstva sa potom sušila nad bezvodým síranom sodným a skoncentrovala do sucha, čím sa získal voľný amín (18,1 g, 75,7 % teoretického výťažku). Voľný amín sa potom rozpustil v éteri a roztok sa prebublával HCI, čím sa vytvorila biela zrazenina. Zrazenina sa filtrovala, premyla éterom a sušila vo vákuu, čím sa získala zlúčenina (9.2) (15,2 g).

Reakčný krok B: Zlúčenina (9.4)

(9.3) (9.4)

Do roztoku Boc-gly-OH (9.3) (11,35 g, 0,0648 molu) v bezvodom dichlórmetáne (100 ml) a bezvodom DMF (100 ml) sa za miešania a pri -20 °C pridal HOBT (10,5 g, 0,065 molu), A/-metylmorfolín (21,3 ml, 0,194 molu) a EDCI (13,6 g, 0,0712 molu). Reakčná zmes sa 10 minút miešala, potom sa pridala zlúčenina (9.2) z predchádzajúceho kroku A (18,0 g, 0,065 molu). Výsledný roztok sa 45 minút miešal pri -20 °C a uložil sa cez noc do mrazničky. Potom sa skoncentroval do sucha, nasledovala extrakcia EtOAc, nasýteným s NaHCO₃. Spojené organické vrstvy sa premyli vodou a potom roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (9.4) (26,48 g, 100 % teoretického výťažku, MS MH⁺ = 399,2).

-69Reakčný krok C: Zlúčenina (9.5)

H 0 ΒοοΗΝ^γΝ^Αο^=Λ °ó	H 0 °ô
(9.4)	(9.5)

Roztok zlúčeniny (9.4) z predchádzajúceho kroku B (26,4 g, 0,065 molu) v HCI/dioxáne (c_Hci = 4 mol.dm'³, v dioxáne, 100 ml) sa hodinu miešal pri teplote miestnosti, potom sa skoncentroval do sucha, čím sa získala zlúčenina (9.5) (22,69 g, 100%-ný výťažok, MS MH⁺ = 299,1).

Reakčný krok D: Zlúčenina (9.6)

(9-6) (1.08)

Do roztoku zlúčeniny (1.08) z Prípravy 15, kroku E, (15,5 g, 0,0627 molu) v dichlórmetáne (150 ml) a DMF (150 ml) sa za miešania a pri -20 °C pridal ΗΌΒΤ (10,22 g, 0,0626 molu), A/-metylmorfolín (20,67 g, 0,188 molu) a EDCI (13,2 g, 0,069 molu). Reakčná zmes sa 10 minút miešala, potom sa pridala zlúčenina (9.5) z predchádzajúceho kroku C (21,0 g, 0,063 molu). Výsledný roztok sa hodinu miešal pri -20 °C a uložil sa cez noc do mrazničky. Potom sa skoncentroval do sucha, nasledovala extrakcia EtOAc, nasýteným s NaHCO3. Spojené organické vrstvy sa premyli vodou, 5%-ným roztokom kyseliny fosforečnej a potom roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (9.6) (30,3 g, 92 % teoretického výťažku, MS MH⁺ = 528,1).

(9.7)

V podstate rovnakým spôsobom, aký sa opisuje v Príprave 18, v kroku C, sa pripravila zlúčenina (9.7) (30,0 g, 100%-ný výťažok, MS MH⁺ = 428,1).

Reakčný krok F: Zlúčenina (9.9)

Do roztoku Boc-His(Z)-OH (9.8) (0,5 g, 1,28 mmólu) v dichlórmetáne (5 ml) a DMF (5 ml) sa za miešania a pri -20 °C pridal HOBT (0,209 g, 1,28 mmólu), Nmetylmorfolín (0,42 ml, 3,85 mmólu) a EDCI (0,27 g, 1,41 mmólu). Reakčná zmes sa 10 minút miešala pri -20 °C, potom sa pridala zlúčenina (9.7) z predchádzajúceho kroku E (0,673 g, 1,28 mmólu). Výsledný roztok sa dve hodiny miešal pri -20 °C a uložil sa cez noc do mrazničky. Potom sa skoncentroval do sucha, nasledovala extrakcia EtOAc, nasýteným s NaHCO₃. Spojené organické vrstvy sa premyli vodou, 5%-ným roztokom kyseliny fosforečnej a potom roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (9.9) (0,858 g, 84 % teoretického výťažku, MS MH⁺ = 799).

V podstate rovnakým spôsobom, aký sa opisuje v Príprave 18, v kroku C sa pripravila zlúčenina (9.11) (0,76 g, 100%-ný výťažok, MS MH⁺ = 699,2).

Reakčný krok H: Zlúčenina (9.12)

(9.11)

Do roztoku /V-Boc-cyklohexylglycínu (0,263 g, 1,026 mmólu) v dichlórmetáne (5 ml) a DMF (5 ml) sa za miešania a pri -20 °C pridal HOBT (0,167 g, 1,026 mmólu), A/-metylmorfolin (0,338 g, 3,078 mmólu) a EDCI (0,216 g, 1,13 mmólu).

Reakčná zmes sa 10 minút miešala pri -20 °C, potom sa pridala zlúčenina (9.11) z predchádzajúceho kroku G (0,754 g, 1,03 mmólu). Výsledný roztok sa hodinu miešal pri -20 °C a uložil sa cez noc do mrazničky. Potom sa skoncentroval do sucha, nasledovala extrakcia EtOAc, nasýteným s NaHCO₃. Spojené organické vrstvy sa premyli vodou, 5%-ným roztokom kyseliny fosforečnej a potom roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (9.12) (0,735 g, MS MH⁺ = 938,4).

-72Reakčný krok I: Zlúčenina (9.12)

Do roztoku zlúčeniny (9.12) z predchádzajúceho kroku H (0,367 g, 0,377 mmólu) v bezvodom dichlórmetáne (10 ml) sa za miešania pridal Dess-Martinov jodistan (0,32 g, 0,75 mmólu). Výsledný roztok sa 2 hodiny miešal pri teplote miestnosti, potom sa pridala zmes vody a dichlórmetánu a celá zmes sa miešala ďalších 45 minút. Do reakčnej zmesi sa potom pridala zmes 50 % nasýteného roztoku NaHCOVSO % nasýteného roztoku Na2S₂C>3 a reakčná zmes sa miešala ďalšiu hodinu. Organická vrstva sa potom premyla vodou, roztokom soli, sušila nad bezvodým síranom sodným, filtrovala, skoncentrovala do sucha, čím sa získal surový produkt (340 mg). Produkt sa potom čistil stĺpcovou chromatografiou na silikagéli s použitím dichlórmetánu a potom 4%-ného MeOH v dichlórmetáne ako elučným činidlom, čím sa získala zlúčenina (9.13) (150 mg, MS MH⁺ = 936,3 g).

Reakčný krok J: Zlúčenina (9.14)

-73Do roztoku zlúčeniny (9.13) z predchádzajúceho kroku I (0,15 g, 1,6 mmólu) v absolútnom etanole (40 ml) sa pridalo 10%-né Pd/C v 50 % H₂O (hmotnostne). Výsledný roztok sa prebublal dusíkom a 45 minút intenzívne miešal v atmosfére vodíka; katalyzátor sa potom odfiltroval celitom, premyl etanolom/CH₂CI₂ a skoncentroval do sucha, čím sa získala zlúčenina (9.14) (0,116 g, MS MH⁺ = 712,2).

Príprava 19

Reakčný krok A: Zlúčenina (10.2)

(10.1)

V 500 ml banke sa pripravila suspenzia L-3-(1-naftyl)alanínu (2,0 g, 9,34 mmolov) v bezvodom EtOH (200 ml). Do roztoku sa potom privádzal bezvodý koncentrovaný HCI (2 ml) až sa tuhý podiel celkom rozpustil. Roztok sa v priebehu 45 minút nechal vychladnúť na teplotu miestnosti a potom sa skoncentroval do sucha. Pridal sa EtOH (50 ml), 10%-né Pd/C (300 mg) a 5%-né Rh/C (300 mg). Reakčná zmes sa vložila do trepačky a hydrogenovala pri tlaku vodíka 0,42 MPa (60 psi). Potom sa zmes filtrovala vrstvou celitu, premyla EtOH a skoncentrovala do sucha, čím sa pripravil surový produkt (2,4 g, MS MH⁺ = 254,2). Tento produkt sa rozpustil v dichlórmetáne a premyl nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Organická vrstva sa skoncentrovala do sucha a čistila stĺpcovou chromatografiou na silikagéli s použitím 5%-ného až 20%-ného EtOAc/CH₂CI₂ ako elučným činidlom, čím sa získala zlúčenina (10.2) (0,65 g).

Reakčný krok B: Zlúčenina (10.3)

(10.3)

Do roztoku /V-Boc-cyklohexylglycínu (0,643 g, 2,5 mmólu) v dichlórmetáne (5 ml) a DMF (5 ml) sa za miešania a pri -20 °C pridal HOBT (0,407 g, 2,5 mmólu), Nmetylmorfolín (0,825 ml, 7,5 mmólu) a EDCI (0,527 g, 2,75 mmólu). Reakčná zmes sa 10 minút miešala pri -20 °C, potom sa pridala zlúčenina (10.2) z predchádzajúceho kroku A a dichlórmetán (3 ml). Výsledný roztok sa uložil sa cez noc do mrazničky. Potom sa skoncentroval do sucha, nasledovala extrakcia EtOAc, nasýteným s NaHCO₃. Spojené organické vrstvy sa premyli vodou, 5%-ným roztokom kyseliny fosforečnej a potom roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čím sa získala zlúčenina (10.3) (1,12 g, 92 % teoretického výťažku).

Reakčný krok C: Zlúčenina (10.4)

(10.3) (10.4)

Do roztoku zlúčeniny (10.3) z predchádzajúceho kroku B (1,1 g, 2,25 mmólu) v MeOH (30 ml) a vode (7,5 ml) sa pridal LiOH (0,283 g, 6,75 mmólu). Výsledný roztok sa cez noc miešal pri teplote miestnosti, potom sa pridal 5%-ný roztok kyseliny fosforečnej. Vytvorila sa zrazenina a roztok sa odparil na odstránení väčšiny MeOH. Pridal sa ďalší CH2CI2 a organická vrstva sa oddelila, sušila nad

-75bezvodým síranom sodným, filtrovala a skoncentrovala do sucha, čím sa získala zlúčenina (10.4) (1,068 g, 100%-ný výťažok, MS MH⁺ = 459,1).

Reakčný krok D: Zlúčenina (10.5) (10.4) (10.5)

Do roztoku zlúčeniny (10.4) z predchádzajúceho kroku C (1,0 g, 2,17 mmólu) v DMF (10 ml) a dichlórmetáne (10 ml) sa za miešania a pri -20 °C pridal HOBT (0,353 g, 2,17 mmólu), /V-metylmorfolín (0,715 ml, 6,51 mmólu) a EDCI (0,457 g, 2,38 mmólu). Reakčná zmes sa 10 minút miešala pri -20 °C, potom sa pridala zlúčenina (9.7) z Prípravy 18, kroku E, (1,13 g, 2,17 mmólu). Výsledný roztok sa 0,5 hodiny miešal pri -20 °C a uložil sa cez noc do mrazničky. Potom sa skoncentroval do sucha, nasledovala extrakcia EtOAc, nasýteným s NaHCO3. Spojené organické vrstvy sa premyli vodou, 5%-ným roztokom kyseliny fosforečnej a potom roztokom soli, sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali do sucha, čim sa získala zlúčenina (10.5) (1,8 g, MS M+Na = 890,4).

Reakčný krok E: Zlúčenina (10.6)

Boe (10.5)

Boc._n.

H (10.6)

Do roztoku zlúčeniny (10.5) z predchádzajúceho kroku D (1,8 g, 2,07 mmólu) v bezvodom dichlórmetáne (40 ml) sa za miešania pridal Dess-Martinov jodistan

-76(1,76 g, 4,15 mmólu). Výsledný roztok sa hodinu miešal pri teplote miestnosti, potom sa po kvapkách v priebehu 1,5 hodiny pridal bezvodý dichlórmetán (40 ml) a voda (0,074 ml) a celá zmes sa miešala ďalšie 2 hodiny. Do reakčnej zmesi sa potom pridala zmes 50 % nasýteného roztoku NaHCO₃/50 % nasýteného roztoku Na2S2O₃ (40 ml) a reakčná zmes sa intenzívne miešala ďalšiu polhodinu. Organická vrstva sa potom oddelila a premyla vodou, skoncentrovala do sucha a potom sa zvyšok čistil stĺpcovou chromatografiou na silikagéli s použitím 2%-ného až 3%ného MeOH v dichlórmetáne ako elučným činidlom, čím sa získala zlúčenina (10.6) (0,95 g, MS MH⁺ = 866,2).

Reakčný krok F: Zlúčenina (10.7)

(10.6) (10.7)

V podstate rovnakým spôsobom aký sa opisuje v Príprave 18, v kroku K, sa pripravila zlúčenina (10.7).

Príklady

Pripravili sa zlúčeniny uvedené v Tab. 2. Na kopuláciu sa použili postupy z Prípravy 1, kroku A, a z Prípravy 2, kroku F; na odstránenie ochranných esterových skupín sa použili postupy z Prípravy 1, kroku B, z Prípravy 1, kroku F, z Prípravy 2, kroku D a z Prípravy 4, kroku J; na odstránenie ochrannej amínovej skupiny sa použili postupy z Prípravy 2, kroku E a z Prípravy 4, kroku J; a na oxidáciu hydroxyamidov na ketoamidy - spolu s α-aminokyselinami hore uvedených Príprav

-77alebo komerčne dostupných α-aminokyselín alebo α-aminokyselín opísaných v literatúre, v potrebných kombináciách - sa použil postup z Prípravy 4, kroku H.

Syntéza v tuhej fáze

Všeobecný postup kopulačných reakcií v tuhej fáze

Syntéza sa uskutočnila v reakčnej nádobke, zhotovenej z polypropylénového zásobníka injekčnej striekačky zakončenej polypropylénovou fritou. Fmoc-chránené aminokyseliny sa kopulovali bežnou technikou reakcií v tuhej fáze. Do každej reakčnej nádobky sa nadávkovalo 100 mg východiskovej Fmoc-Sieberovej živice (približne 0,035 mmolu). Živica sa premyla dva razy, vždy s 2 ml DMF. Ochranná skupina Fmoc sa odstránila 20 minútovým pôsobením 2 ml 20%-ného (objemovo) roztoku piperidínu v DME. Potom sa živica štyri razy premyla vždy po 2 ml DMF. Kopulácia sa uskutočnila v DMF (2 ml) s použitím 0,12 mmolu Fmoc-aminokyseliny, 0,12 mmolu HATU [O-(azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametylurónium, hexafluórfosfát]- a _0,24 mmolu DIPEA (Λ/,/V-diizopropyletylamín). Po 2 hodinovom pretrepávaní sa tekutina z nádobky odviedla a živica sa premyla štyri razy vždy po 2 ml DMF. Kopulačný cyklus sa opakoval s ďalšou Fmoc-aminokyselinou alebo s koncovou skupinou.

Všeobecný postup Dess-Martinovej oxidácie v tuhej fáze

Syntéza sa uskutočnila v reakčnej nádobke, zhotovenej z polypropylénového zásobníka injekčnej striekačky zakončenej polypropylénovou fritou. Na hydroxyzlúčeninu viazanú na živicu (približne 0,035 mmolu) sa 4 hodiny pôsobilo roztokom 0,14 mmolu Dess-Martinovho jodistanu a 0,14 mmolu terc-BuOH v 2 ml DCM. Živica sa štyri razy premyla, vždy s 2 ml roztoku 20%-ného (objemovo) /PrOH v DCM, THF a 50%-ným (objemovo) roztokom THF vo vode; THF (štyri razy) a DCM (štyri razy).

Príprava 20 /V-Fmoc-2',3'-dimetoxyfenylglycín - zlúčenina (901)

-78CHO

OMe (901 A)

(9°^1B·) (901C)

FmocOSu vod. roztok Na₂CO₃

(901)

Do roztoku kyanidu draselného (1,465 g, 22,5 mmólu) a uhličitanu amónneho (5,045 g, 52,5 mmólu) vo vode (15 ml) sa pridal roztok 2,3-dimetoxybenzaldehydu (901 A) (2,5 g, 15 mmolov) v etanole (15 ml). Reakčná zmes sa 24 hodín zahrievala na 40 °C. Potom sa odparením pri zníženom tlaku zmenšil objem roztoku na 10 ml. Pridala sa koncentrovaná kyselina chlorovodíková (15 ml), čím sa vytvorila biela zrazenina zlúčeniny (901 B). Zlúčenina (901 B) sa izolovala odfiltrovaním (2,2 g, 9,3 mmólu). Zlúčenina (901 B) sa rozpustila v 10%-nom (hmotnostné) vodnom roztoku hydroxidu sodného (15 ml) a roztok sa 24 hodín zahrieval pri teplote varu pod spätným chladičom. Potom sa pridala koncentrovaná kyselina chlorovodíková a pH roztoku sa upravilo do neutrálnej reakcie (pH 7). Výsledný roztok obsahujúci zlúčeninu (901 C) sa odparil pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v 5%-nom vodnom roztoku hydrogenuhličitanu sodného (150 ml). Roztok sa ochladil na 0 °C v ľadovom kúpeli a pri tejto teplote sa postupne pridal 1,4-dioxán (30 ml) a roztok 9fluorenylmetyl sukcinimidylkarbonátu (2,7 g, 8 mmolov) v 1,4-dioxáne (30 ml). Reakčná zmes sa nechala zohriať na teplotu miestnosti a pri tejto teplote sa 24 hodín miešala. 1,4-Dioxán sa pri zníženom tlaku odparil. Vodný roztok sa premyl

-79dietyléterom. Pridala sa koncentrovaná kyselina chlorovodíková a pH sa upravilo do kyslej oblasti (pH 1). Pridal sa octan etylnatý, organická vrstva sa oddelila, premyla vodou a roztokom soli. Organická vrstva sa potom sušila nad bezvodým síranom sodným, rozpúšťadlo sa odparilo pri zníženom tlaku, čím sa získala zlúčenina (901) vo forme tuhej bielej peny (3,44 g, 7,9 mmólu). MS (LCMS-Elektrospray) 434,1 MH⁺.

Príprava 21

Zlúčenina (801)

(801D) (801)

Do roztoku /V-Fmoc-fenylalanínu (801 A) (5 g, 12,9 mmolov) v bezvodom DCM (22 ml), chladenom zmesou acetónu a suchého ľadu na -30 °C sa postupne pridali /V-metylpyrolidín (1,96 ml, 16,1 mmolov) a metylester kyseliny chlórmravčej (1,2 ml, 15,5 mmolov). Reakčná zmes sa hodinu miešala pri -30 °C a potom sa pridal roztok /V-O-dimetylhydroxylamínhydrochloridu (1,51 g, 15,5 mmolov) a Nmetylpyrolidínu (1,96 ml, 16,1 mmolov) v bezvodom DCM (8 ml). Reakčná zmes sa potom nachala zohriať na teplotu miestnosti a pri tejto teplote sa miešala cez noc. Potom sa pridal toluén, organická vrstva sa premyla zriedenou kyselinou chlorovodíkovou, vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a roztokom soli. Organická vrstva sa vysušila nad bezvodým síranom sodným. Rozpúšťadlo sa potom odparilo pri zníženom tlaku, čím sa získala zlúčenina (801 B) (4 g, 9,29 mmolov).

-80Do roztoku činidla Red-AI (6,28 ml, 21,4 mmolov) v bezvodom toluéne (8 ml), chladeného na -20 °C v kúpeli acetón-ľad sa pridal roztok zlúčeniny (801 B) (4 g, 9,29 mmolov) v bezvodom toluéne (12 ml). Reakčná zmes sa 1,5 hodiny miešala pri -20 °C. Organická vrstva sa premyla zriedenou kyselinou chlorovodíkovou, vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a roztokom soli, sušila nad bezvodým síranom sodným. Rozpúšťadlo sa odparilo pri zníženom tlaku a získal sa surový produkt (801 C), ktorý sa použil v nasledujúcom kroku bez ďalšieho čistenia.

Do roztoku zlúčeniny (801 C) (približne 9,29 mmolov) v hexáne (15 ml) sa postupne pridali roztok kyanidu draselného (24 mg, 0,37 mmôlu) a tetrabutylamóniumjodidu (34 mg, 0,092 mmolu) vo vode (4 ml) a acetónkyanhydrín (1,27 ml,

13,9 mmolu). Reakčná zmes sa 24 hodín miešala pri teplote miestnosti. Pridal sa octan etylnatý a organická vrstva sa premyla vodou a roztokom soli, sušila nad bezvodým síranom sodným. Rozpúšťadlo sa odparilo pri zníženom tlaku, čím sa získala zlúčenina (801 D) (2,4 g, 6,03 mmolu).

Do roztoku zlúčeniny (801 D) (2,4 g, 6,03 mmolu) v 1,4-dioxáne (11 ml) sa pridala koncentrovaná kyselina chlorovodíková (11 ml). Reakčná zmes sa 3 hodiny zahrievala na 80 °C. Potom sa pridal octan etylnatý (25 ml) a voda (25 ml). Organická vrstva sa premyla roztokom soli a sušila nad bezvodým síranom sodným. Pri zníženom tlaku sa potom rozpúšťadlo odparilo, čím sa získala zlúčenina (801) vo forme bielej tuhej peny (2 g, 4,8 mmolu). MS (LCMS-Elektrospray) 418,1 MH*.

Príklad 101J - zlúčenina (101 J)

101J

-81 Schéma 5

FmocHN-P (101A)

(101H)

(1O1J)

O

-82Postupom všeobecne uvedeným pre kopulačné reakcie v tuhej fáze sa pripravili živicou viazané zlúčeniny (101 B), (101 C), (101 D), (101 E), (101 F) a (101 G), pričom sa vychádzalo z 100 mg Fmoc-Sieberovej živice (0,035 mmolu). Živicou viazaná zlúčenina (101 G) sa oxidovala na živicou viazanú zlúčeninu (101 H) postupom všeobecne uvedeným pre Dess-Martinovu oxidáciu v tuhej fáze. Živicou viazaná zlúčenina (101 H) sa spracovala päťminútovým pôsobením 4 ml 2%-ného (objemovo) roztoku TFA v DCM. Filtrát sa pridal k 1 ml AcOH a roztok sa skoncentroval vákuovým odstreďovaním, čím sa získala zlúčenina (101 J) (0,011 g, 45 % teoretického výťažku). MS (LCMS-Elektrospray) 703,2 MH⁺.

S využitím hore uvedeného postupu techniky syntézy v tuhej fáze sa pripravili a použili ďalej uvedené štruktúrne zoskupenia nasledujúceho vzorca:

ΗΟ

ΝΟ₂ Ο

-85ΤΧΧΎΌ

Ο

-87-Ρ3:

*w*

*W*

ch₃

ry/V*

OH

*\ΛΛ

*W» *W*

*W* I H

-90Jeden z -P1 a a -P1 b je -H a druhý je vybraný z:

Hore opísanými spôsobmi sa pripravili zlúčeniny, ktorých účinnosti sa uvádzajú v priloženej Tab. 3.

Ďalej sa pripravili zlúčeniny, ktorých účinnosti sa uvádzajú v priloženej Tab.

4. Príprava týchto zlúčenín sa opisuje v nasledujúcom texte.

Všeobecné postupy prípravy zlúčenín z Tab. 4 na tuhom nosiči

Na prípravu malých množstiev niektorých zlúčenín podľa tohto vynálezu je vhodná syntéza v tuhej fáze. Podobne ako pri bežnej syntéze v tuhej fáze peptidov, reaktory na syntézu peptidylových ketoamidov v tuhej fáze pozostávajú z reakčnej nádoby s najmenej jednou plochou, priepustnou pre rozpúšťadlo a rozpustený reaktant, ale nepriepustnou pre častice syntéznej živice, použitej veľkosti. Reaktory zahŕňajú sklené reakčné nádoby so spekanou sklenou fritou, polypropylénové rúrky alebo kolóny s fritami, alebo Kansov™ reaktor, vyrábaný spoločnosťou Irori Inc., San Diego, CA USA. Typ vybraného reaktora závisí od objemu živice potrebnej na uskutočnenie reakcie v tuhej fáze, pričom v rôznych fázach syntézy možno použiť rôzne typy reaktorov. Postupy sa bližšie opisujú v nasledujúcich Príkladoch:

Postup A: Kopulačná reakcia

K živici suspendovanej v /V-metylpyrolidíne (NMP) (10 až 15 ml na gram živice) sa pridala A/-Fmoc- alebo A/-Boc- aminokyselina (2 ekvivalenty), HOAt (2 ekvivalenty), HATU (2 ekvivalenty) a diizopropyletylamín (4 ekvivalenty). Zmes sa nechala 4 až 48 hodín reagovať. Potom sa reaktanty odviedli a živica sa postupne premyla dimetylformamidom, dichlórmetánom, metanolom, dichlórmetánom a dietyl-93éterom (použilo sa vždy 10 až 15 ml rozpúšťadla na gram živice). Živica sa potom sušila vo vákuu.

Postup B: Odstránenie ochrannej skupiny Fmoc

Na živicu chránenú skupinou Fmoc sa 30 minút pôsobilo 20%-ným piperidínom v dimetylformamide (10 ml činidla na gram živice). Reaktanty sa potom odviedli z reakčnej nádoby a živica sa postupne premyla dimetylformamidom, dichlórmetánom, metanolom, dichlórmetánom a dietyléterom (vždy 10 ml rozpúšťadla na gram živice).

Postup C: Odstránenie ochrannej skupiny Boe

Na živicu chránenú skupinami Boe sa 20 až 60 minút pôsobilo zmesou dichlórmetánu a kyseliny trifluóroctovej (1:1) (10 ml rozpúšťadla na gram živice). Potom sa reaktanty odviedli a živica sa postupne premyla dichlórmetánom, dimetylformamidom, 5%-ným diizopropyletylamínom v dimetylformamide, dimetylformamidom, dichlórmetánom a dimetylformamidom (vždy po 10 ml rozpúšťadla na gram živice).

Postup D: Hydrolýza semikarbazónu

Živica sa na dve hodiny suspendovala v zmesi rozpúšťadiel (10 ml na gram živice); zmes rozpúšťadiel tvorili kyselina trifluóroctová:kyselina pyrohroznová:dichlórmetámvoda = 9:2:2:1. Potom sa reaktanty odviedli a postup sa ešte trikrát opakoval. Živica sa postupne premyla dichlórmetánom, vodou a dichlórmetánom, rozpúšťadlo sa odviedlo pomocou vákua.

Postup E: HF štiepenie

Suchá peptid-n-Val(CO)-G-O-PAM živica (50 mg) sa vložila do HF nádobky s malým tyčovým miešadíelkom. Ako zberač sa pridal anizol (10 % z celkového objemu). V prítomnosti kyseliny glutámovej a cysteínových aminokyselín sa pridali tiež tioanizol (10 %) a 1,2-etánditiol (0,2 %). HF nádobka sa potom zavesila do HF aparatúry (Imuno Dynamics) a systém sa 5 minút preplachoval dusíkom. Potom sa ochladil na -78 °C v kúpeli suchého ľadu a izopropanolu. Po 20 minútach sa k

-94zmesi nadestiloval vyžadovaný objem HF (10 ml HF na gram živice). Pri 0 °C sa potom nechala reakcia prebiehať 1,5 hodiny. Potom sa pomocou dusíka odstránila všetka HF. K živici sa pridal dichlórmetán a zmes sa 5 minút miešala. Pokračovalo sa pridaním 20%-ného roztoku kyseliny octovej vo vode (4 ml). Po 20 minútovom miešaní sa živica odfiltrovala s použitím lievika s fritou a dichlórmetán sa odstránil pri zníženom tlaku. Ostávajúci roztok sa premyl hexánom (3 x) na odstránenie zberača. Živica sa namočila v 1 ml metanolu. Vodná vrstva (20%-ná kyselina octová) sa pridala späť k živici a zmes sa 5 minút miešala a potom filtrovala. Metanol sa odstránil pri zníženom tlaku a vodná vrstva sa lyofilizovala. Peptid sa potom rozpustil v 10 až 25%-nom metanole (obsahujúcom 0,1 % kyseliny trifluóroctovej) a čistil HPLC s reverznou fázou.

II) Syntéza medziproduktov

Príklad 1

Syntéza Boc-3-alkylsulfinylalanínu

Do zmesi hydridu sodného (20 mmolov, 800 mg 60%-ného v oleji, premytého hexánom) v tetrahydrofuráne (30 ml) sa pri 0 °C v priebehu 10 minút za miešania pridával alkyltiol (chci = 1 mol.dm'³) 20 mmolov, R = Ph, R = 1-naftyl, R = 2-naftyl, R = PhCH₂CH₂ alebo R = Et). Chladiaci kúpeľ sa potom odložil a 10 minút sa pokračovalo v miešaní. Potom sa pridal Boc-2(S,)-aminopropionyllaktón (odkaz: Synthetic Communications 25(16), 2475 až 2482 (1995)) (3,74 g, 20 mmolov). Použil sa ľadový kúpeľ aby teplota neprekročila 30 °C, reakčná zmes sa potom 16 hodín miešala pri teplote miestnosti, skoncentrovala a zvyšok sa potom rozpustil v roztoku hydrogénsíranu draselného (ckhso4 = 1 mol.dm'³) (200 ml) a HCI (Chci = 1

-95mol.dm*³) (40 ml). Zmes sa extrahovala dichlórmetánom (2 x 200 ml). Spojené organické vrstvy sa sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali. Zvyšok sa rozpustil vo vode (200 ml) s metanolom (30 ml) a s uhličitanom draselným (40 mmolov), 5,5 g). Potom sa po častiach pridal pridával oxón (21 mmolov, 13,0 g) a reakčná zmes sa chladila aby sa teplota udržiavala na teplote miestnosti. Zmes sa potom 18 hodín miešala a potom skoncentrovala vo vákuu, aby sa odstránil metanol. Roztok sa okyslil roztokom hydrogensíranu draselného (ckhso4 = 2 mol.dm'³) (pH = 1) a extrahoval octanom etylnatým (2 x 100 ml). Spojené organické vrstvy sa sušili nad bezvodým síranom sodným, filtrovali a skoncentrovali. Surový produkt sa čistil HPLC s reverznou fázou. Po tomto čistení sa produkt ďalej čistil acidobázickou extrakciou na odstránenie de-bocylovaného materiálu a aby sa predišlo ďalšiemu rozkladu (úbytok skupiny Boe) produkt sa uchovával vo forme diizopropyletylamóniovej soli.

Príklad 2

Syntéza kyseliny 2-(1-etyletyl)-7-metyl-okt-4-énovej

OH

V nadpise uvedený medziprodukt sa pripravil syntézou, ktorú opísali Wuts (Wuts P. G. M., Ritter A. R., Pruitt L. E., J. Org. Chem. 57, 6696 až 6700 (1992)). Príklad 3

Syntéza Fmoc-nV-(dpsc)-Gly-OH (reakčné kroky 1 až 7)

Fmoc-HN

IH

NH-CH(Ph)2

-96Reakčný krok 1: Syntéza alylesteru kyseliny izokyanooctovej (reakčné kroky a a b) (a) Syntéza draselnej soli kyseliny izokyanooctovej

Do roztoku hydroxidu draselného (56,1 g, 1,0 molu) v etanole (1,5 litra) sa po kvapkách a za chladenia pridával etylester kyseliny izokyanooctovej (96,6 ml, 0,88 molu). Reakčná zmes sa zvoľna ohriala na teplotu miestnosti. Vylúčený produkt sa po dvoch hodinách oddelil filtráciou a premyl niekoľkými dávkami vychladeného etanolu. Získaná draselná soľ kyseliny izokyanooctovej sa sušila vo vákuu; produkt tvoril zlatohnedú tuhú látku (99,92 g, 91,8 % teoretického výťažku).

(b) Syntéza alylesteru kyseliny izokyanooctovej °N JY _K+ ----.

Do produktu z reakčného predchádzajúceho kroku (a) (99,92 g, 0,81 molu), rozpusteného v acetonitrile (810 ml) sa pridal alylbromid (92 ml, 1,05 molu). Reakčná zmes sa v tme zahrievala štyri hodiny na teplotu varu pod spätným chladičom a získal sa tmavohnedý roztok. Roztok sa skoncentroval a odparok sa rozpustil v éteri (1,5 litra); roztok sa premyl vodou (3 x 500 ml). Organická vrstva sa sušila, filtrovala a skoncentrovala až na tmavohnedý sirup. Surový produkt sa čistil vákuovou destiláciou pri 7 mm Hg (98 °C) na číry olej (78,92 g, 78 % teoretického výťažku). NMR ppm (CDCI₃): δ 5,9 (m, 1 H), 5,3 (m, 2H), 4,7 (d, 2H), 4,25 (s, 2H).

Reakčný krok 2: Syntéza 9-fluorenylmetoxykarbonyl-norvalinalu (reakčné kroky a až

(a) Syntéza metylesteru 9-fluorenylmetoxykarbonyl-L-norvalínu (Fmoc-nValOMe)

o o

Do chladeného roztoku komerčne dostupného Fmoc-L-norvalínu (25 g, 73,75 mmolu) v bezvodom metanole (469 ml) sa v priebehu hodiny pridával tionylchlorid (53,76 ml, 737,5 mmolov). Po ďalšej hodine sa kontrolovala úplnosť reakcie pomocou TCL s octanom etylnatým (Rf = 0,85). Reakčná zmes sa potom skoncentrovala a zvyšok sa rozpustil v octane etylnatom. Organická vrstva sa premyla nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (3 x 200 ml) a následne roztokom soli (200 ml). Organická vrstva sa sušila, filtrovala a skoncentrovala, čím sa získal Fmoc-norVal-OMe vo forme bielej tuhej látky (26,03 g, kvantitatívny výťažok). NMR ppm (CD₃OD): δ 7,7 (m, 2H), 7,6 (m, 2H), 7,4 (m, 2H), 7,3 (m, 2H),

4,3 (m, 2H), 4,1 (m, 2H), 3,7 (s, 3H), 1,7 (m, 1H), 1,6 (m, 1H), 1,4 (m, 2H), 0,95 (t, 3H).

(b) Syntéza 9-fluorenylmetoxykarbonyl-norvalínolu (Fmoc-nValinol)

Do roztoku Fmoc-nVal-OMe (26,03g, 73,75 mmolov) v tetrahydrofuráne (123 ml) a metanole (246 ml) sa pridal chlorid vápenatý (16,37 g, 147,49 mmolov). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a v niekoľkých dávkach sa pridal borhydrid sodný (11,16 g, 294,98 mmolov). Do vzniknutej hustej pasty sa pridalo 500 ml metanolu a reakčná zmes sa potom 90 minút miešala pri teplote miestnosti. Úplnosť reakcie sa potvrdila pomocou TLC s elučným činidlom octan etylnatý/hexán (2:3). Reakcia sa ukončila pomalým pridaním 100 ml vody. Pri zníženom tlaku sa odstránil metanol a ostávajúca vodná fáza sa zriedila octanom etylnatým. Organická vrstva sa premyla vodou (3 x 500 ml), nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (3

-98χ. 500 ml) a roztokom soli (500 ml), sušila nad bezvodým síranom sodným a skoncentrovala, čím sa získala biela tuhá látka (21,70 g, 90,5 % teoretického výťažku). NMR ppm (CD₃OD): δ 7,8 (m, 2H), 7,7 (m, 2H), 7,4 (m, 2H), 7,3 (m, 2H),

4,3 - 4,5 (m, 2H), 4,2 (m, 1 H), 3,6 (s, 1 H), 3,5 (s, 2H), 1,5 (m, 1 H), 1,3 -1,4 (m, 3H), 0,99 (m, 3H).

(c) Syntéza 9-fluorenylmetoxykarbonyl-norvalínalu (Fmoc-nVal-CHO)

Do roztoku Fmoc-nValinolu (21,70 g, 66,77 mmolov) v dichlórmetáne (668 ml) sa pridal trietylamín (37,23 ml, 267 mmolov) a roztok sa ochladil na 0 °C. Do chladeného roztoku sa pridala suspenzia komplexu pyridínu-oxidu sírového (42,51 g, 267 mmolov) v dimetylsulfoxide (96 ml). Úplnosť reakcia sa po hodine potvrdila pomocou.TLC s použitím octanu etylnatého/hexánu (2:3). Dichlórmetán sa odstránil pri zníženom tlaku a zvyšok sa rozpustil v octane etylnatom a premyl vodou (2 x 50 ml), nasýteným roztokom hydrogensíranu draselného (2 x 50 ml), nasýteným roztokom hydrogeňuhličitanu sodného (2 x 50 ml) a roztokom soli (50 ml). Organická vrstva sa skoncentrovala. Predpokladal sa teoretický výťažok (21,57 g) a použil sa v nasledujúcom kroku bez ďalšieho čistenia.

Reakčný krok 3: Syntéza trifluóroctanovej soli difenylmetylsemikarbazidu (dpsc), (reakčné kroky a a b) (a) Syntéza Boc-semikarbazid-4-yl difenylmetánu

Do roztoku karbonyldiimidazolu (16,2 g, 0,10 molu) v dimetylformamide (225 ml) sa po kvapkách v priebehu 30 minút pridal roztok terc-butylkarbazátu (13,2 g,

-990,100 molu) v dimetylformamide (225 ml). Do reakčnej zmesi sa potom v priebehu ďalšej polhodiny pridal difenylmetylamín (18,3 g, 0,10 molu). Reakčná zmes sa potom hodinu miešala pri teplote miestnosti. Pridala sa voda (10 ml) a zmes sa pri zníženom tlaku skoncentrovala na približne 50 ml. Tento roztok sa nalial do vody (500 ml) a extrahoval octanom etylnatým (400 ml). Fáza octanu etylnatého sa premyla zriedenou kyselinou chlorovodíkovou (chci = 1 mol.dm’³) (2 x 75 ml), vodou (2 x 75 ml), nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (2 x 75 ml) a roztokom chloridu sodného (2 x 75 ml) a sušila bezvodým síranom horečnatým. Zmes sa potom filtrovala a roztok sa skoncentroval, čim sa získalo 29,5 g (85 % teoretického výťažku) bielej peny. Tento materiál možno čistiť rekryštalizáciou z prostredia octanu etylnatého/hexánu, ale bol dostatočne čistý na priame použitie v nasledujúcom kroku; teplota topenia produktu bola 142 až 142 °G, ¹H NMR (CDCI₃): δ 1,45 (s, 9H), 6,10 (dd, 2H), 6,42 (s, 1H), 6,67 (bs, 1H), 7,21-7,31 (m, 1DH).

Vypočítané zloženie pre C19H23N3O3: 66,84 % C, 6,79 % H, 12,31 % N; stanovené: 66,46 % C, 6,75 % H, 12,90 % N.

(b) Syntéza trifluóroctanovej soli difenylmetylsemikarbazidu (dpsc)

H tfa-h₂n'^NY o

Pri teplote miestnosti sa do roztoku Boc-semikarbazid-4-yl difenylmetánu (3,43 g, 10 mmolov) v dichlórmetáne (12,5 ml) pridala kyselina trifluóroctová (12,5 ml) a roztok sa 30 minút miešal. Roztok sa potom po kvapkách pridával do 75 ml éteru a získaná tuhá látka (2,7 g, 80 % teoretického výťažku) sa oddelila odfiltrovaním. Teplota topenia produktu bola 182 až 184 °C.

¹H NMR (CD3OD): δ 6,05 (s, 1H), 7,21-7,35 (m, 10H); ¹³C NMR (CD₃OD): δ 57,6,

118,3 (q, CF₃), 126,7, 127,9,141,6, 156,9, 160,9 (q, CF3COOH).

-100-

Reakčný krok 4: Syntéza Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-Oalylu

Do roztoku Fmoc-nVal-CHO (z Príkladu 3, kroku 2c) (5,47 g, 16,90 mmolov) v dichlórmetáne (170 ml) sa pridal alylester kyseliny izokyanooctovej (z Príkladu 3, kroku 1b) (2,46 ml, 20,28 mmolov) a pyridín (5,47 ml, 67,61 mmolov). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a po kvapkách sa pridala kyselina trifluóroctová (3,38 ml, 33,80 mmolov). Reakčná zmes sa hodinu miešala pri 0 °C a potom 48 hodín pri teplote miestnosti. Úplnosť reakcie sa potvrdila pomocou TLC s použitím octanu etylnatého. Reakčná zmes sa skoncentrovala a čistila rýchlou chromatografiou s použitím 20 % až 70 % octanu etylnatého v hexáne. Podiely, ktoré obsahovali vyžadovaný produkt sa spojili a skoncentrovali, čím sa získala biela pena (6,88 g,

87,3 % teoretického výťažku). TLC s octanom etylnatým a hexánom (1:1) vykázala 1 škvrnu (R_f = 0,37). ¹H NMR (CD₃OD): δ 7,8 (m, 3H), 7,65 (m, 2H), 7,4 (m, 2H), 7,3 (m, 2H), 5,9 (m, 1H), 5,1 - 5,4 (m, 2H), 4,55 - 4,65 (m, 2H), 4,3 - 4,4 (m, 2H), 4,15 4,25 (m, 1 H), 4,01 (s, 1 H), 3,9 - 4,0 (m, 3H), 1,5-1,6 (m, 2H), 1,35 - 1,45 (m, 3H), 0,9 (m, 3H).

Reakčný krok 5: Syntéza Fmoc-nVal-(CO)-Gly-Oalylu

Do roztoku Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-Oalylu (z predchádzajúceho kroku 4) (5,01 g, 10,77 mmolov) v dimetylsulfoxide (100 ml) a toluéne (100 ml) sa pridal EDC (20,6 g, 107,7 mmolov). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a po kvapkách sa pridala kyselina dichlóroctová (4,44 ml, 53,83 mmolov). Reakčná zmes sa 15 minút miešala pri 0 °C a potom hodinu pri teplote miestnosti. Pri 0 °C sa pridala voda (70

- 101 ml) a toluén sa odstránil pri zníženom tlaku. Zvyšok sa zriedil octanom etylnatým a niekoľko razy sa premyl nasýteným roztokom hydrogénuhličitanu sodného, potom zriedeným roztokom hydrogensíranu sodného (CNaHS04 = 1 mol.dm’³) a roztokom soli. Organická vrstva sa sušila nad bezvodým síranom sodným, filtrovala a skoncentrovala. Predpokladal sa teoretický výťažok 4,99 g pričom produkt sa použil bez ďalšieho čistenia v nasledujúcom reakčnom kroku. Pri TLC s použitím octanu etylnatého/hexánu sa zistila jedna škvrna (Rf = 0,73).

Reakčný krok 6: Syntéza Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-Oalylu

Do roztoku Fmoc-nVal-(CO)-Gly-Oalylu (z predchádzajúceho kroku 5) (4,99 g, 10,75 mmolov) v etanole (130 ml) a vode (42 ml) sa pridala kyselina trifluóroctanová soľ difenylmetylsemikarbazidu (dpsc) (z Príkladu 3, kroku 3b) (7,6 g, 21,5 mmolov) a trihydrát octanu sodného (1,76 g, 12,9 mmolov). Reakčná zmes sa zahrievala 90 minút na teplotu varu pod spätným chladičom. Úplnosť reakcie sa potvrdila pomocou TLC s použitím octanu etylnatého/hexánu (1:1). Etanol sa odstránil pri zníženom tlaku a zvyšok sa rozpustil v octane etylnatom, premyl roztokom hydrogensíranu sodného (CNaHso4 = 1 mol.dm‘³) (2x10 ml), nasýteným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (2 x 10 ml) a roztokom soli (2 x 10 ml). Organická vrstva sa sušila, filtrovala a skoncentrovala. Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou v 20%-nom až 50%-nom octane etylnatom v hexáne, čím sa získala biela tuhá látka (5,76 g, 78 % teoretického výťažku). Pri TLC v octane etylnatom/hexáne (1:1) sa preukázali dve škvrny (c/s- a trans- izoméry) s Rf = 0,42 a 0,50.

Reakčný krok 7: Syntéza Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-OH

-102-

Do roztoku Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-Oalylu (z Príkladu 3, kroku 6) (4,53 g, 6,59 mmolov) v tetrahydrofuráne (300 ml) sa pridal dimedon (462 g, 32,97 mmolov) a následne tetrakis(trifenylfosfín)paládiový katalyzátor (0,76 g, 0,66 mmólu). Po 90 minútach sa pomocou TLC (9:1 dichlórmetán/etanol) potvrdilo, že reakcia bola skončená. Reakčná zmes sa skoncentrovala, zvyšok sa rozpustil v octane etylnatom, premyl roztokom hydrogenfosforečnanu didraselného (c«2hpo4 = 0,1 mol.dm'³) (3 x 50 ml). Organická vrstva sa potom zmiešala s 50 ml roztoku hydrogensiričitanu sodného a dvojfázový systém sa 15 minút miešal. Po oddelení fáz sa postup dva razy opakoval. Organická vrstva sa sušila, filtrovala a skoncentrovala. Potom sa čistila rýchlou stĺpcovou chromatografiou (20 % až 100 % octanu etylnatého v hexáne, potom 9:1 dichlórmetán/metanol), čím sa získala biela tuhá látka (3,99 g, 94 % teoretického výťažku). Pri TLC v dichlórmetáne/metanole (9:1) sa preukázali dve škvrny (c/s- a trans- izoméry).

¹H NMR (CD₃OD): δ 7,75 (m, 2H), 7,6 (m, 3H), 7,2 - 7,4 (m, 14H), 6,1 - 6,2 (m, 1H), 4,25 - 4,4 (m, 2H), 4,1 - 4,2 (m, 2H), 3,85 (s, 2H), 1,6-1,8 (m, 2H), 1,3-1,5 (m, 2H), 0,95 (t, 3H).

Príklad 4

Syntéza H-nVal-(dpsc)-Gly-Phg-MBHA živice (reakčné kroky 1 a 2)

-103ch₃

Reakčný krok 1: Syntéza H-Phg-MBHA živice ch₃ h₂n

Komerčne dostupná MBHA živica (2,6 g, 1,12 mmolu.g'¹, 2,91 mmolu) sa preniesla do 250 ml reakčnej nádoby s fritou na reakcie v tuhej fáze, vybavenej prívodom dusíka. Potom sa dôkladne postupne premyla vždy 30 ml dávkami dichlórmetánu, metanolu, dimetylformamidu a dichlórmetánu a kopulovala 18 hodín s komerčne dostupným Fmoc-Phg-OH (2,17 g, 5,82 mmolu) s 99,82%-nou účinnosťou spôsobom, aký sa opisuje v postupe A. Živica sa potom zbavila ochrannej skupiny Fmoc spôsobom uvedeným v postupe B. Kvalitatívna kontrola s ninhydrínovým činidlom v malej alikvotnej časti preukázala vznik tmavomodrého sfarbenia živice a roztoku, čo poukázalo na úspešné uskutočnenie reakcie.

Reakčný krok 2: Syntéza H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA živice

NH-CH(Ph)₂

NH-MBHA živica

Živica pripravená v predchádzajúcom reakčnom kroku 1 (2,6 g, 0,8 mmol.g*¹,

2,91 mmolu) reagovala s Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-OH (z Príkladu 3, kroku 7) (5,82 mmolov, 3,77 g) s použitím postupu A. Kvantitatívna kontrola s ninhydrínovým činidlom preukázala 99,91 %-účinnosť kopulácie. Živica sa potom zbavila ochrannej skupiny Fmoc spôsobom uvedeným v postupe B. Kvalitatívna kontrola s

- 104ninhydrínovým činidlom v malej alikvotnej časti preukázala vznik tmavomodrého sfarbenia živice a roztoku, čo poukázalo na úspešné uskutočnenie reakcie.

III) Zostavenie predstaviteľov cieľov hepatitídy C v tuhej fáze

Príklad 5

Syntéza 2,5-difluór-6-hydroxykarbonylfenylkarbonyl-G(Chx)-Leu-nVal-(CO)-GlyPhg-NH₂ (kroky 1 až 5) v tuhej fáze

Reakčný krok 1: Syntéza Fmoc-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA živice

NH-MBHA živica

-105 Zlúčenina H-nVal-(dpsc)-Gly-Phg-MBHA živice (Príklad 4, krok 2) (2,15 g, 1,12 mrnol.g'¹, 1,68 mmólu) sa v polypropylénovej trubičke s fritou kopulovala s NFmoc-Leu-OH (890 mg, 2,52 mmólu) spôsobom uvedeným v postupe A. Po 18 hodinách sa reakciou alikvotnej časti s ninhydrínom kvalitatívne dosiahol bezfarebný roztok aj bezfarebné perličky živice.

Reakčný krok 2: Syntéza Fmoc-G(Chx)-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA živice

Živica pripravená v Príklade 5, v kroku 1 (Fmoc-Leu-nVal(dpsc)-Gly-PhgMBHA živica, 1,68 mmólu) sa zbavila ochrannej skupiny Fmoc postupom, ktorý sa uvádza v postupe B. Potom sa postupom A kopuloval komerčne dostupný FmocG(Chx)-OH (0.956 g, 0,252 mmólu). Kvantitatívna kontrola s ninhydrínovým činidlom preukázala 98%-nú účinnosť kopulácie.

Reakčný krok 3: Syntéza 2,5-difluór-6-hydroxykarbonylfenylkarbonyl-G(Chx)-LeunVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA živice

-106 -

Živica pripravená v Príklade 5, v kroku 2 (Fmoc-G(Chx)-Ľeu-nVal(dpsc)-GlyPhg-MBHA živica) (200 mg) sa zbavila ochrannej skupiny Fmoc spôsobom, ktorý sa uvádza v postupe B. Pri reakcii s ninhydrínovým činidlom v malej alikvotnej časti reakčnej zmesi vznikla tmavomodrá živica a sfarbený roztok čo poukazuje na úspešné uskutočnenie reakcie. V 1 ml NMP sa suspendovala uvedená živica (150 mg, 0,168 mmólu) a do suspenzie sa pridal anhydrid kyseliny 3,6-difluórftalovej (91 mg, 0,42 mmólu) a následne diizopropyletylamín (0,146 ml, 0,84 mmólu) a reakčná zmes sa 18 hodín pretrepávala pri teplote miestnosti. Kvantitatívna ninhydrínová reakcia preukázala 97,8%-nú účinnosť kopulácie.

Reakčný krok 4: Syntéza 2,5-difluór-6-hydroxykarbonylfenylkarbonyl-G(Chx)-LeunVal(CO)-Gly-Phg-MBHA živice

- 107-

NH-MBHA živica

Semikarbazónovou hydrolýzou zlúčeniny pripravenej v Príklade 5, v kroku 3 (2,5-difluór-6-hydroxykarbonylfenylkarbonyl-G(Chx)-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA živica) sa postupom D pripravila v nadpise uvedená zlúčenina.

Reakčný krok 5: Syntéza 2,5-difluór-6-hydroxykarbonylfenylkarbonyl-G(Chx)-LeunVal-(CO)-Gly-Phg-NH₂

-108 -

Postupom E v podmienkach HF štiepenia sa štiepila živica z Príkladu 5, z kroku 4 (2,5-difluór-6-hydroxykarbonylfenylkarbonyl-G(Chx)-Leu-nVal(CO)-Gly-PhgMBHA živica) (100 mg); čím sa získal surový produkt Produkt sa čistil HPLC s použitím 2,2 x 25 cm kolóny s reverznou fázou, obsahujúcej C-18 živicu pozostávajúcu z 10 pm častíc gélu s 300 Ä pórmi; elúcia sa uskutočnila v gradiente s použitím 20 až 50%-ného acetonitrilu vo vode. Analytická HPLC sa robila na 4,6 x 250 mm kolóne s reverznou fázou, obsahujúcou C-18 živicu, pozostávajúcu z 5 pm častíc gélu s 300 Ä pórmi; elúcia sa uskutočnila v gradiente s použitím 10 až 60%ného acetonitrilu vo vode (obsahujúceho 0,1 % kyseliny trifluóroctovej); zaznamenal sa jeden pík v čase 17,2 minút. Nízkorozlišovacou hmotnostnou spektrometriou sa potvrdila očakávaná hmotnosť (MH⁺ 771,5).

Príklad 6

Syntéza iBoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal-(CO)-Gly-Phg-NH₂ v tuhej fáze (reakčné kroky 1 až 5)

O

-109Reakčný krok 1: Syntéza Boc-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA živice

NH-MBHA živica

Zlúčenina H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA živice (z Príkladu 4, kroku 2) (0,17 g, 0,8 mmol.g'¹, 0,19 mmolu) sa vložila do polypropylénovej trubice s fritou a kopulovala sa s Boc-Cys((O2)Et)-OH (Príklad 1) (160 mg, 0,38 mmolu) podľa postupu A. Kvantitatívna kontrola po 18 hodinách s ninhydrínovým činidlom preukázala 99,98%-nú účinnosť kopulačnej reakcie.

Reakčný krok 2: Syntéza Fmoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA živice

-110-

Živica pripravená v predchádzajúcom kroku (Príklad 6, krok 1) BocCys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA (0,19 mmólu) sa zbavila ochrannej skupiny Boe spôsobom, uvedenom v postupe C. Potom sa postupom A kopuloval FmocG(Chx)-OH (0,170 g, 0,45 mmólu). Kvantitatívna kontrola po 18 hodinách s ninhydrínovým činidlom preukázala 99,92%-nú účinnosť reakcie.

Reakčný krok 3: Syntéza živice iBoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA

NH-MBH A živica

NH-MBHA živica

NH-CH(Ph)₂

NH-CH(Ph)2

-111 Živica pripravená v predchádzajúcom kroku (Príklad 6, krok 2) (FmocG(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA) (0,19 mmólu) sa zbavila ochrannej skupiny Fmoc spôsobom, uvedenom v postupe B. Pri kvalitatívnej kontrole ninhydrínovou skúškou sa živica aj roztok sfarbili na tmavomodro, čo poukazuje na úspešné uskutočnenie reakcie. V 1 ml NMP sa suspendovala živica (170 mg, 0,19 mmólu) a do suspenzie sa pridal izobutylester kyseliny chlórmravčej (0,06 ml, 0,45 mmólu) a následne diizopropyletylamín (0,16 ml, 0,90 mmólu) a reakčná zmes sa 18 hodín pretrepávala pri teplote miestnosti. Kvantitatívna ninhydrínová reakcia preukázala 99,35%-nú účinnosť rakcie.

Reakčný krok 4: Syntéza iBoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA živice

Semikarbazónovou hydrolýzou zlúčeniny pripravenej v predchádzajúcom kroku (Príklad 6, krok 3) (iBoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA živica) (170 mg) sa spôsobom uvedenom v postupe D pripravila v nadpise uvedená zlúčenina.

-112Reakčný krok 5: Syntéza iBoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(CO)-Gly-Phg-NH₂

Živica z predchádzajúceho kroku (Príklad 6, reakčný krok 4) (iBoc-G(Chx)Cys((O2)Et)-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA živica) (170 mg) sa štiepila v podmienkach vhodných na HF štiepenia (postup E), čím sa získal vyžadovaný surový produkt.

Produkt sa čistil HPLC s použitím 2,2 x 25 cm kolóny s reverznou fázou, obsahujúcej C-18 živicu, pozostávajúcu z 10 pm častíc gélu s 300 Ä pórmi; elúcia sa uskutočnila v gradiente s použitím 20 až 50%-ného acetonitrilu vo vode. Analytická HPLC sa uskutočnila na 4,6 x 250 mm kolóne s reverznou fázou, obsahujúcou C-18 živicu, pozostávajúcu z 5 pm častíc gélu s 300 A pórmi; elúcia sa uskutočnila v gradiente s použitím 10 až 60%-ného acetonitrilu vo vode (obsahujúceho 0,1 % kyseliny trifluóroctovej); zaznamenal sa jeden pík v čase 16,94 minút. Nízkorozlišovacou hmotnostnou spektrometriou sa potvrdila očakávaná hmotnosť (MH⁺ 737,5).

Stanovenie HCV proteázovej inhibičnej aktivity

Spektrofotometrické stanovenie

Spektrofotometrické stanovenie HCV sérinovej proteázy v prítomnosti zlúčenín podľa tohto vynálezu sa uskutočnilo spôsobom, ktorý opísal Zhang R. a

-113ďalší, Analytical Biochemistry 270, 268 až 275 (1999); tento spôsob sa tu zahŕňa týmto odkazom. Analýza je založená na proteolýze chromogénnych esterových substrátov a je vhodná na monitorovanie HCV NS3 proteázovaj aktivity. Uvedené substráty sa odvodili od P-dielu spojovacej sekvencie NS5A-NS5B (AcDTEDWX(Nva), kde X = A alebo P), ktorej C-terminálové karboxylové skupiny boli esterifikované jedným zo štyroch rôznych chromofornych alkoholov (3- alebo 4nitrofenol, 7-hydroxy-4-metyl-kumarín, alebo 4-fenylazofenol). V ďalšom texte sa uvádza syntéza, vlastnosti a použitie týchto nových spektrofotometrických substrátov na vysoko výkonný skríning a podrobné kinetické hodnotenie HCV NS3 proteázových inhibitorov.

Materiály a postupy

Materiály: chemické činidlá na analytické účely, týkajúce sa tlmivých roztokov sa získali od spoločnosti Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri). Reakčné činidlá na syntézu peptidov boli od spoločnosti Aldrich Chemicals, Novabiochem (San Diego, Kalifornia), Applied Biosystems (Foster City, Kalifornia) a od Perseptive Biosystems (Framingham, Massachusetts). Peptidy sa syntetizovali ručne alebo na automatizovanom ABI modeli 431A Synthesizer (od Applied Biosystems). Použil sa spektrofotometer model Lambda 12 od firmy Perkin Elmer (Norwalk, Connecticut) a 96-jamkové plátne boli od firmy Corning (Corning, New York). Predhrievacie bloky boli od USA Scientific (Ocala, Florida) a miešacie zariadenie pre 96 jamkové platne od firmy Labline Instruments (Melrose Park, lllinois). Čítač mikrotitračných platní Spectramax Plus s monochromátorom sa získal od spoločnosti Molecular Devices (Sunnyvale, Kalifornia).

Príprava enzýmu

Rekombinantná heterodimérna HCV NS3/NS4A proteáza (kmeň 1a) sa pripravila s použitím už zverejnených postupov (Sali D. L., a ďalší, Biochemistry 37,

3392 až 3401 (1998)). Koncentrácie proteínov sa stanovovali farbením spôsobom

Biorad, pričom sa použili proteázové štandardy vopred kvantifikované analýzou aminokyselín. Pred začatím analýzy sa uchovávací enzýmový tlmivý roztok (50 mM fosforečnanu sodného pH 8,0, 300 mM NaCI, 10 % glycerolu, 0,05 % lauryl-114maltozidu a 10 mM DTT) vymenil za analytický tlmivý roztok (25 mM MOPS pH 6,5, 300 mM NaCI, 10 % glycerol, 0,05 % laurylmaltozid, 5 μΜ EDTA a 5 μΜ DTT); na uvedenú výmenu sa použila vopred plnená kolóna Biorad Bio-Spin P-6.

Syntéza substrátu a čistenie

Syntéza substrátov sa uskutočnila podľa návodu Zhanga R. a ďalších (citácia hore); syntéza sa začala kotvením Fmoc-Nva-OH na 2-chlorotritylchloridovú živicu s použitím bežného protokolu (Barlos K. a ďalší, Int. J. Pept. Proteín Res. 37, 513 až 520 (1991)). Peptidy sa budovali alebo manuálne alebo automatizovaným modelom peptidového syntetizátora ABI model 431 postupne s využitím chemických vlastností Fmoc. /V-acetylované a celkom chránené peptidové fragmenty sa z živice odštiepili tridsaťminútovým pôsobením 10%-néj kyseliny octovej alebo 10%-ného trifluóretanolu (TFE) v dichlórmetáne (DCM), alebo desaťminútovým pôsobením 2%-nej kyseliny trifluóroctovej (TFA) v DCM. Filtráty spojené s premývacím DCM sa azeotropicky odparili (alebo opakovane extrahovali vodným roztokom uhličitanu sodného) na odstránenie kyseliny, ktorá sa použila na štiepenie. DCM fáza sa sušila nad bezvodým síranom sodným a odparila.

Esterové substráty sa budovali s použitím známych a bežných postupov kyselino-alkoholovej väzby (Holmber K., Acta Chem. Scand. B33, 410 až 412 (1979)). Fragmenty peptidov sa rozpustili v bezvodom pyridíne (30 až 60 mg.ml'¹); do roztoku sa pridalo 10 molových ekvivalentov chromoforu a katalytické množstvo (0,1 ekvivalentu) kyseliny para-toluénsulfónovej (pTSA).

Na iniciáciu kopulačných reakcií sa pridával dicyklohexylkarbodiimid (DCC, 3 ekvivalenty). Vznik produktu sa monitoroval HPLC a zistilo sa, že pri teplote miestnosti bola reakcia skončená po 12 až 72 hodinách. Pyridínové rozpúšťadlo sa potom odparilo vo vákuu a ďalej sa jeho zvyšky odstránili azeotropickou destiláciou s toluénom. Peptidový ester sa zbavil ochranných skupín dvojhodinovým pôsobením 95%-ného TEA v DCM; nadbytok chromoforu sa odstránil trojnásobnou extrakciou bezvodým etyléterom. Substrát zbavený ochranných skupín sa čistil HPLC s reverznou fázou na C3 alebo C8 kolóne s gradientom 30%-ného až 60%ného acetonitrilu (použilo sa 6 objemov kolóny). Celkový výťažok po čistení HPLC bol približne 20 až 30 %. Molekulová hmotnosť sa potvrdila hmotnostnou

-115spektrometriou s elektrosprejovou ionizáciou. Substráty sa uchovávali v suchom prostredí vo forme suchého prášku nad vysušovadlom.

Spektrá substrátov a produktov

Spektrá substrátov a príslušných chromoforových produktov sa zaznamenávali v prostredí tlmivého roztoku (pH 6,5). Určovali sa extinkčné koeficienty pri optimálnej vlnovej dĺžke (340 nM pre 3-Np a HMC, 370 nm pre ΡΆΡ a 400 nm pre

4-Np); použili sa kyvety s hrúbkou vrstvy 1 cm a viacnásobné riedenia. Optimálna vlnová dĺžka je taká vlnová dĺžka, pri ktorej sa dosahuje najväčší pomerný rozdiel v absorbancii medzi substrátom a produktom [(produkt OD - substrát OD)/substrát OD].

Stanovenie proteáz

Stanovenie HCV proteázy sa uskutočnilo pri 30 °C v 200 μΙ objemoch reakčných zmesí v 96-jamkovej mikrotitračnej platni. Podmienky analytického tlmivého roztoku (25 mM -MOPS pH 6,5, 300 mM NaCI, 10 % glycerol, 0,05 % laurylmaltozid, 5 μΜ EDTA a 5 μΜ DTT) sa optimalizovali pre NS3/NS4A heterodimér (Salo D. L. a ďalší, citácia hore). Typicky sa do jamky vnieslo 150 μΙ zmesi tlmivého roztoku, substrátu a inhibítora (konečná koncentrácia DMSO 4 % objemové) a približne 3 minúty prebiehala predinkubácia pri 30 °C. Na iniciáciu reakcie sa potom pridalo 50 μΙ predhriatej proteázy (12 nM, 30 °C) v analytickom tlmivom roztoku (konečný objem vzorky bol 200 μΙ). Po celý čas analýzy (60 minút) sa platne monitorovali; zaznamenávala sa absorbancia pri príslušnej vlnovej dĺžke (340 nm pre 3-Np a HMC, 370 nm pre PAP a 400 nm pre 4-Np) pomocou čítača mikrotitračných platní Spectromax Plus, vybavenom monochromátorom (prijateľné výsledky možno dosiahnuť tiež s čítačom platní, ktorý využíva optické filtre s hranou priepustnosti). Proteolytické štiepenie esterovej väzby medzi Nva a chrornoforom sa monitorovalo pri príslušnej vlnovej dĺžke v porovnaní s bezenzýmovým slepým pokusom ako kontrolou pre nie enzýmovú hydrolýzu. Vyhodnotenie kinetických parametrov substrátov sa uskutočnilo v rozsahu 30 násobného koncentračného rozpätia substrátu (približne 6 až 200 μΜ). Počiatočné rýchlosti sa určili pomocou

-116lineárnej regresie; kinetické konštanty sa získali vyrovnaním dát pomocou Michaelisovej Mentenovej rovnice s použitím nelineárnej regresnej analýzy (Mac Curve Fit 1.1, K. Raner). Prevrátené číselné hodnoty (k_cat) sa počítali za predpokladu, že enzým bol plne aktívny.

Hodnotenie inhibítorov a inaktivátorov

Inhibičné konštanty (K,) pre porovnávacie inhibítory Ac-D-(D-Gla)-L-l-(Cha)C-OH (27), Ac-DTEDVVA(NVa)-OH a Ac-DTEDWP(NVa)-OH sa experimentálne stanovili pri rovnakých koncentráciách enzýmu a substrátu vynesením vo/Vj v závislosti od koncentrácie inhibítora ([l]o) podľa Michaelisovej - Mentenovej rovnice, upravenej na kompetitívnu inhibičnú kinetiku:

Vo/Vj = 1 + [i]o / (Ki(1+[S]o/K_m)) kde vo je počiatočná neinhibovaná rýchlosť, v, je počiatočná rýchlosť v prítomnosti inhibítora pri každej koncentrácii inhibítora ([l]₀) a [S]_o je koncentrácia použitého substrátu. Výsledné hodnoty sa vyrovnávali pomocou lineárnej regresie a na výpočet hodnoty K* sa použila výsledná smernica 1/(Kj(í+[S]o/K_m).

Stanovené hodnoty K* pre rôzne zlúčeniny podľa tohto vynálezu sú uvedené v tabuľkách, pričom zlúčeniny sú v tabuľkách usporiadané podľa poriadku hodnôt K*. Z výsledkov uvedenej skúšky je odborníkom zrejmá výnimočná použiteľnosť zlúčenín z tohto vynálezu ako inhibítorov NS3-serínovej proteázy.

Hoci bol vynález opísaný v spojení s jednotlivými hore uvedenými uskutočneniami, odborníkom v danej oblasti je zrejmé, že sú možné aj iné úpravy, ďalšie alternatívy a iné zmeny. Všetky také alternatívy, úpravy a zmeny sa považujú za zahrnuté v rámci a rozsahu tohto vynálezu.

-117Tabuľka 2

Zlúčenina č.	Štruktúrny vzorec	Vzorec	LR MS (FAB) M+H
1	—s-™.	C44H68N6O8	809,5
2	. Λ“’ <>- 8 Q ó 0 Ý	θ^ΗβοΝβΟβ	753,5
3	P £ n Ó ’ \°	C42H62N6O8	779,5
4	á “ ‘ó	C39H54N6O8	725,4
5	ch, CH, V f Λ· o o γ “Ά» Ύ “yY’^a^Y. ô 0 S; 0	C35H54N6O8	6.87,4

-118-

6	0 ’χχ	CagHsiBrNeOe	720,4
7	n>c ® δ ( 0 0 ¢3 γ 0	C38H47F5N6O8	811,3
8	ρ 0 0 ο γ	C41H53N7O10	804,4
9	0 K 0 f μ tb	C42H54N6O8	771,4
10	::b γΨΥ' F	C38H49F3N6O8	775,4
11	o>-o oQ ίΥΎΫ'Λγτ^Λ CH, 0 >v 0 \ 0 0 U	C35H53N5O9	688,4

-119-

12	H.c 0 ο / 0 0 •P	C39H51F3N6O8	789,4
13	ď °ó	C42H57N5O9	776,4
14	-.C—jA C N,	C34H49F3N6O8	727,4
- —15----	wp A> 0	C47H59N5O10	854,4
16	^0 \	C40H53N5O10	764,4
17	kJ <K	C48H51N5O10	868,4

-120-

18	ύ «Τ'04ο „Q LJ °·*>	C41H55N5O10	778,4
19	''Υ'ΛΧτ^ΧΑ'<γςΑ“ - >· °ό	C33H49N5O9S	692,3
20	’Γ W	C42H59N5O9	778,4
21	LAv	C38H50FN5O9	740,4
22	- ? Ä »9 °Ô ° V ’	C38H50CI N5O9	756,3
23	ί^γ,Α^<ί/γκΑ^γί °ô °v 0	C38H50FN5O9	740,4

-121 -

24	λ°ό 0 v 0	C45H61N5O10	832,4
25	04, Hŕ pSj VWÁvWÍ'“ Λ°ό ° \° 0	C38H57N5O10	744,4
26	‘^Ο O	C47H68N6O9	861,5
27	·β ·*^*·β H . *T > “,ς~ϊ7.	C43H68N6O9	813,5
28	\.o°'c«. .C—< ’£O H >C ’	C41H56N6O10	793,4
29	0 X 0 o >x Y*1 y HP «.	C37H57N5O9	716,4

-122-

30	w\y-° ό	C39H55N5O10	754,4
31		C46H59N5O10	842,4
32	- »K ,.9 ^<^V’^,órVVN^>íirGH °ô 4° °	C36H55N5O9	702,4
'33	. .y, .0 °ó 4° ooi	C40H63N5O9	758,5
34	“ď r °	C34H49N5O9	672,4
35	Ό r	C38H57N5O9	728,4

-123-

36	0 A. 0 ) 0 O CM, °φ	C56H71N5O9S	990,5
37		C44H55N6O9	798,4
38	»VÄW. ·5>· '0	C35H49N7O9	712,4
39	o, “p Q	C40H61N5O10S2	836,4
40	Ú oQ	C39H59N5O9S2	806,4
41	«>	C36H53N5O9S2	764,3

-124-

42		C40H61N5O9S2	820,4
43	k	C35H51N5O9S2	750,3
44	0 J' ’ o < o o A. „y·· ô	C40H64N6O11SÍ	805,5
45	>° °Ó	C34H52N6O9	689,4
47	cw^^M'/ZoV'« “V>° °ó	C37H46CI2N6O10	805,3
48	WK» 0 Vch, 0 °Λο Hp	C36H54FN5O9	720,4

- 125-

49	0 ycH,0 °hÄo H,C	C35H52FN6O9	706.4
50	v-íb - ° y- ° ° o	C49H62N6Ô11	911,5
51	ψθ Λ ’ír’ “ô	C41H56N6O10	793,4
52	0 yď’H χ· y-· ó	C42H56N6O12	837,4
53	ονΛο ψζΓ'- » oko o .r' O	C41H57N7O12S	872,4
54	QyCH> L o < o o ΪΓ ô	C36H54N6O10	731,4

-126-

55	í J ’ jCH> 0 '''g O y 0 0 v y* ó	θ4θΗ62ΝθΟιο	720,4
56	/o- L. 0 Ň 0 0 vk y-· o	C42H64N6O10	813,5
57	0yO Ih, 0 Ý=H. ° ° (A H,C	Ο^ΗθοΝθΟιο	785,4
58	O ’ 0 K o o JĽ CH* VeH· o H,C ks>	C38H57N7O11	788,4
59	r HO V CH| ' o L o o * t“ch> rj) MjC	C41H65N7O12S	880,4
60	u	C40H61N5O11	788,4

-127-

61		C39H59N5O9	742,4
62	cn	C35H51N5O9	686,4
63	«.ΧγΑ^«3γ·<Λ^ CMj	C41H56N5O9S2	826,4
64		C36H53N5O11	732,4
65		C39H59N5O11	774,4
66		C35H51N5O11	718,4

-128-

67	°Ô	C45H53N5O9	808,4
68	o Q o Λ 0 rMV'VhĺÝo4·’?· ‘0	C38H47N5O9	718,3
69	% 0 °Ó k	C39H61N5O9	744,5
70	'A, » y<H° »>s H.C	C37H50N6O8	707,4
71	\K G	C37H49N5O9	708,4
72	.Q . /. . L· 0 \ 0 0 k r04 H nc	C34H51N5O9	674,4

-129-

73	»λ CH, hŕ V	C36H56N6O10S	765,4
74	^*0 Hp	C36H48N6O10S	757,3
75	yť °ô	C37H47N5O10	722,3
76	V^X^nMzv’s^ch Mc 0 A° °A CH H,C YJ1	C37H45CI2 N5O10	790,3
77	fÓ . Λ . Y 0	C34H51N5O10S	722,3
78	^N^ÁtA/S^rf^Y^N^S^Oí a V,“ v° ba CH, Hŕ	C36H56N6O11S2	813,4

- 130-

79	0 ’4° °ô	C36H48N6O11S2	805,3
80	í? Uy»»vs° ·λ CH H,C	C37H47N5O11S	770,3
81	0 cAV 0 V° °ó OH HP	C37H45CI2N5O11S	838,2
82	Χ'Χυί/.-Α. »A CH V W	C39H49CI2N5O10	818,3
83	0 T £ý4AWA 4^ 4 ° ô	C37H57N5O8	700,4
84	yM4r4A o y*, CH, H,C	C38H60N6O10S	793,4

-131 -

85	-r T °ô	C38H52N6O10S	785,4
86	0 ľ órx °ó	C39H47F4N5O10	822,3
87	„ ,γ. .0 ηγ^υ\λμ\ϋυ^λΑ1Γ°H.cS 0 1 H>c °t>	C33H51N5O9S	694,3
88	, .Q 0 Y 0 <*>	C32H49N5O9S	680,3
89	οηΛ* 0 Y / CH y~° 0 ^-Oí,	C40H63N5O11S	822,4
90	° Ä'CH. ° S ° ° H,C 'sCH· 1 / CH, O	C39H55N5O9S	770,4

- 132-

91	.κ .Q w. 0 V < ch> Χο ° '-—CH,	C36H55N5O11S	766,4
92		C38H57N5O10	744,4
93	0 A 0 Lo 04 \Ζ 04,	C34H51N5O11	706,4
94	? Q °0 °V 004	C40H59N5O9S	754,4
95	ο A ο L ο ο 04,	C38H55N5O9	726,4
96		C30H51N5O9	698,4

-133-

97		0	C34H47N5O9	670,3
		Váv 0 CH X
98	Η,οΤΖος V Xxh CH 0 0 t	CH,	C42H57N5O10	792,4
99	?Η» **Α JL JL JL i! T ífT ·0-ΊΠ mx	s * © c*, P%|	2 C40H61N5O10	772,4
	V—c*, *A d Ä ° »/ «Η, Γ1	S. 0 0 CMa
100	xwt; Ό	o oQ V^-v .O 0 CH	C37H48FN5O8	710,4
101	αχ?Ύΐ	0	C36H49N5O8S	712,3
	u	1 OS
102		.0 v-r	C40H54CIN5O8	768,4

-134-

103	CH, 0 /Δ 0 oQ °0 °Á° 004	C39H57N5O9	740,4
104	/ 0 CH, 0 < 0 0 | Η<7^^Α/γ'γΙγ\Α/γ<:Η °0 °A° °	C35H49N5O9	984,4
105	0 zk 0 \ 0 °*Q^	C37H53N5O9	712,4
106	O4> 0 k._ 0 0 Ά V 0	C36H52N6O8	697,4
107	A ô	C48H66N8O10	915,5
108	0 A A k''zNy?\ o ( o o γ ’^γ^Αιι'νγΑ'Γγ0 °o 0 v “	C44H58N8O10	859,4

-135-

109	°o °v	C48H65N5O10	872,5
110	’O ’ V ”	C39H49N5O9	732,4
111		CaľHsaNsOg	712,4
112	° k ° s?	C33H45N5O9	656,3
113	Δ 0 O| 0 Z 0 0 y OJ ^y¥¥-U¥ “ó A’ 0	C38H56N5O9	741,4
114		C37H54N6O9	727,4

-136-

115		C41H61N5O9	768,5
116	Y/1 .	C37H53N5O9	712,4
117	/ 0 CK 0 f 0 0 Y <x awAAAA 0 A. CH, 0 k 0 0 U Y	C39H58N6O8	739,4
118	/ 0 CH, 0 ζ 0 0 y	C4oH6oN608	753,5
119		C39H58N6O9	755,4
120		C38H56N6O8	725,4

- 137-

121	v	C38H57N5O9	728,4
122	0 l 0 (. o 0 v	C34H49N5O9	672,4
123		C^HssNsOg	750,4
124	°0 °v °°*	C39H53N5O9	736,4
125		C39H53N5O9	736,4
126		C35H45N5O9	680,3

-138-

127		C36H47N5O9	694,3
128	Tj **£, CH, í? T f”» | Η/γ^<Α»Α|['Νγ P o 0 °ó	^β^θοΝθΟβ	729,5
129	° cAA/'.^y’y^o 0 °ô	c41h58n608	763,4
130	/ 0 °Φ 0 y	θ36Η54Ν8Ο8	699,4
131	0./. .0 ^WÄ-'VtVS OQ 0 y 0	C43H57N8O8	772,4
132	ô y Q WívWX” °Ó °V 0	C3gH49N5O8	716,4

- 139-

774,4

Tabuľka 3

Štruktúrny vzorec	Skupina podľa K*
	B
	B
>> H í r í “Τ’	B
M.	B
	B

-140-

-141 -

V	c
	B

Tabuľka 4

Štruktúrny vzorec	Názov	Rozmedzie K;*
γ·\'· '0	(2-CO2,3-Me)PhCO- G(Chx)-L-nV-(CO)-G- G(Ph)-Am	a
Xb/WA rr'f· Ό	(2,5-diF,6-CO2)PhCO- G(Chx)-L-nV-(CO)-G- G(Ph)-Am	a
X ° °(J	(2-CO2)BnCO-G(Chx)-LnV-(CO)-G-G(Ph)-Äm	c

-142-

Ι^Λ^,Ο 0 «γΟΐ 0 «ζΛ, ^'cH 04 k/	(2-SO3)PhCO-G(Chx)-LnV-(CO)-G-G(Ph)-Am	b
/AX^V^Vy<A* ΑΓ Τ’ Ό	(2-CO2)cyklopenta-noyl- G(Chx)-L-nV-(CO)-G- G(Ph)-Am	c
ΪΓ’ΊΓ °0	(2-CO2,3-OH)PhCO- G(Chx)-L-nV-(CO)-G- G(Ph)-Am	a
ΡγΨ^^^Η^ζΥΝ^Ν1 Α^ΟγΗ,Ο OÁ F 0 04 ks/	(2,3,4’,5-tetraF,6- C02)PhC0-G(Chx)-L-nV- (CO)-G-G(Ph)-Am	a
jíľ Q QyA/y’vV'yX'*’· A°ô ϊ 0 °	(2CO2)PhCO-G(Chx)- C((02)Et)-nV-(C0)-G- G(Ph)-Am	b
ΟγΥ,Ζ^ΧΎ^ xU 0 χ5^ Ο J 0 0 ° 0 k	(2CO2)PhCO-G(Chx)- C((02)Ph)-nV-(C0)-G- G(Ph)-Am	b

-143-

Ο	(2CO2)PhCO-G(Chx)- C((O2)EtPh)-nV-(CO)-G- G(Ph)-Am	b
;ô ϊ0. 0	iBoc-G(Chx)-C((O2)Et)nV-(CO)-G-G(Ph)-Am	b
„ .25. ο 0γ\^^γγ^><ΧΑΓ»4 A’Ô » 0	(2CO2)PhCO-G(Chx)- 0((02)-1 Np)-nV-(C0)-G- G(Ph)-Am	b
CV^JÉyjS^ Ó . ί “	(2-CO2)PhCO-G(Chx)C((O2)-2Np)-nV-(CO)-GG(Ph)-Am	b
ο hJ^^vUyýý^äX*’ °ô τ’ ’	iBoc-G(Chx)-C((O2)Ph)nV-(CO)-G-G(Ph)-Am	b
“Χ-γΥΑΥγΆ^ ,/ό.....r °	((3-tetrahydrofurán)- CH20)C0-G(Chx)-L-nV- (C0)-G-G(Ph)-Am	b

Claims (39)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Peptidové zlúčeniny, vrátane ich enantiomérov, stereoizomérov, rotamérov a tautomérov, vrátane ich farmaceutický prípustných solí alebo solvátov všeobecného vzorca I kde

   G, J a Y môžu byť rovnaké alebo rozdielne a sú vzájomne nezávisle od seba vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa: H, alkyl, alkyl-aryl, heteroalkyl, heteroaryl, arylheteroaryl, alkyl-heteroaryl, cykloalkyl, alkyloxy, alkyl-aryloxy, aryloxy, heteroaryloxy, heterocykloalkyloxy, cykloalkyloxy, alkylamino, arylamino, alkyl-arylamino, arylamino, heteroarylamino, cykloalkylamino alebo heterocykloalkylamino s podmienkou, že Y môže byť voliteľne substituované substituentami X¹¹ alebo X¹²;

   X¹¹ je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa alkyl, alkenyl, alkinyl, cykloalkyl, cykloalkylalkyl, heterocyklyl, heterocyklylalkyl, aryl, alkylaryl, arylalkyl, heteroaryl, alkylheteroaryl alebo heteroarylalkyl, s podmienkou že X¹¹ môže byť ďalej voliteľne substituované s X¹²;

   X¹² je hydroxy, alkoxy, aryloxy, tio, alkyltio, aryltio, amino, alkylamino, arylamino, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, alkylsulfónamido, arylsulfónamido, karboxy, karbalkoxy, karboxamido, alkoxykarbonylamino, alkoxykarbonyloxy, alkylureido, arylureido, halogén, kyano alebo nitro, s podmienkou, že uvedené alkylové skupiny, alkoxyskupiny a arylové skupiny môžu byť voliteľne ďalej substituované skupinami vybranými z X¹²;

   R¹ je COR⁵ alebo B(OR)2, pričom R⁵ je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa H, OH, OR⁸, NR⁹R¹⁰, CF_3i C₂F_5i C₃F₇, CF₂R⁶, R⁶ alebo COR⁷, pričom R⁷ je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa H, OH, OR⁸, CHR⁹R¹⁰ a NR⁹R¹⁰, kde R⁶, R⁸, R⁹ a R¹⁰ môžu byť rovnaké alebo rôzne a sú vzájomne nezávisle vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa

   H, alkyl, aryl, heteroalkyl, heteroaryl, cykloalkyl, arylalkyl, heteroarylalkyl,

   -146 CH(R¹ )COOR¹¹, CH(R¹')CONR¹²R¹³, CH(R¹')CONHCH(R²’)COOR¹¹, CH(R¹')CONHCH(R²')CONR¹²R¹³, CH(R¹ )CONHCH(R²)R', CH(R¹’)CONHCH(R²')CONHCH(R³')COOR¹¹, CH(R¹')CONHCH(R²')CONHCH(R³')CONR¹²R¹³, CH(R¹’)CONHCH(R²')CONHCH(R³')CONHCH(R⁴’)COOR¹¹, CH(R¹')CONHCH(R²')CONHCH(R³)CONHCH(R⁴')CONR¹²R¹³, CH(R¹')CONHCH(R²')CONHCH(R³')CONHCH(R⁴')CONHCH(R⁵‘)COOR¹¹ a CH(R¹ )CONHCH(R²)CONHCH(R³)CONHCH(R⁴)CONHCH(R⁵)CONR¹²R¹³, kde R¹’, R²', R³', R⁴', R⁵’, R¹¹, R¹², R¹³ a R' môžu byť rovnaké alebo rozdielne a sú vzájomne nezávisle vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa H, alkyl, aryl, heteroalkyl, heteroaryl, cykloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-heteroaryl, aryl-alkyl a heteroaralkyl;

   Z je vybrané z O, N alebo CH;

   W môže byť prítomné alebo neprítomné; ak je W prítomné, je vybrané z C=O, C=S alebo SO₂; a

   R, R', R², R³ a R⁴ sú vzájomne nezávisle vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa H, Cr Cio-alkyl, C₂-Cio-alkenyl, C3-C₈-cykloalkyl, Cs-Ce-heterocykloalkyl, alkoxy, aryloxy, alkyltio, aryltio, amino, amido, ester, karboxylovú kyselinu, karbamát, močovinu, ketón, aldehyd, kyano, nitro; atómy kyslíka, dusíka, síry a fosforu (pričom uvedené atómy kyslíka, dusíka, síry a fosforu sú v počte 0 až 6); (cykloalkyl)alkyl a (heterocykloalkyl)alkyl, pričom uvedený cykloalkyl je tvorený 3 až 8 atómami uhlíka a žiadnym alebo až šiestimi atómami kyslíka, dusíka, síry alebo fosforu a uvedený alkyl má jeden až šesť atómov uhlíka; aryl, heteroaryl; alkyl-aryl; a alkyl-heteroaryl; pričom uvedené skupiny alkyl, heteroalkyl, alkenyl, heteroalkényl, aryl, heteroaryl, cykloalkyl a heterocykloalkyl môžu byť voliteľne substituované, pričom výraz substituované sa týka voliteľnej a chemicky vhodnej substitúcie jednou alebo viacerými skupinami, vybranými zo skupiny, ktorá zahŕňa alkyl, alkenyl, alkinyl, aryl, aralkyl, cykloalkyl, heterocyklyl, halogén, hydroxy, tio, alkoxy, aryloxy, alkyltio, aryltio, amino, amido, ester, karboxyl, karbamát, močovinu, ketón, aldehyd, kyano, nitro, sulfónamid, sulfoxid, sulfón, sulfonylmočovinu, hydrazid a hydroxamát.
2. 2. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 1, kde R¹ je COR⁵ a R⁵ je H, OH,

   COOR⁸ alebo CONR⁹R¹⁰.

   -147 -
3. 3. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 2, kde R¹ je COCONR⁹R¹⁰, kde R⁹ je H a R¹⁰ je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa H, CH(R¹ )COOR¹¹, CH(R¹ )CONR¹²R¹³, CH(R¹')CONHCH(R²')COOR¹¹, CH(R¹')CONHCH(R²')CONR¹²R¹³ a CH(R¹)CONHCH(R²)(R').
4. 4. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 3, kde R¹⁰ je CH(R¹ )CONHCH(R²')COOR¹¹, CH(R¹')CONHCH(R²’)CONR¹²R¹³ alebo CH(R¹’)CONHCH(R²’)(R^,)_I kde R¹' je H alebo alkyl, heteroalkyl a R²' je fenyl, substituovaný fenyl, heteroatómom substituovaný fenyl, tiofenyl, cykloalkyl, piperidyl a pyridyl.
5. 5. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 4, kde R¹' je H.
6. 6. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 5, kde

   R¹¹ je H alebo ŕerc-butyl;

   R' je hydroxymetyl; a

   R^2, je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

   v ktorých:

   U¹ a U² môžu byť rovnaké alebo rozdielne a sú vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa H,

   F, CH₂COOH, CH₂COOMe, CH2CONH2, CH₂CONHMe, CH₂CONMe₂, azido, amino, hydroxy, substituovanú skupinu amino, substituovanú skupinu hydroxy;

   U³ a U⁴ môžu byť rovnaké alebo rôzne a sú O alebo S;

   U⁵ je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa alkylsulfonyl, aryl, sulfonyl, heteroalkylsulfonyl, heteroarylsulfonyl, alkylkarbonyl, arylkarbonyl, heteroalkylkarbonyl, hetero-148aľylkarbonyl, alkoxykarbonyl, aryloxykarbonyl, heteroaryloxykarbonyl, alkylaminokarbonyl, arylaminokarbonyl, heteroarylaminokarbonyl alebo ich kombinácie; a Nr12r13 j_{e V}yb_rané _zo skupiny, ktorá zahŕňa:

   NH₂, NHMe, N(Me)OMe, NMe₂,

   JĽ-Me

   HN u⁶

   O o o kde U⁶ je H, OH alebo CH₂OH.
7. 7. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 2, kde R² je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

   -149-
8. 8. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 7, kde R³ je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

   s

   COOH

   X 0 ch₃ ^chích?^H3 ^COOH

   -150- pričom R³¹ je OH alebo O-alkyl;

   Y¹⁹ je vybrané z nasledujúcich skupín:

   XÄ^cooh _vX__>c_8H6 a Y²⁰ je vybrané z nasledujúcich skupín:

   NHAc
9. 9. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 8, kde R³ je vybrané z nasledujúcich skupín:

   -151 -
10. 10. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 9, kde Z = N a R⁴ = H.
11. 11. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 10, kde W je C = O alebo SO2.
12. 12. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 11, kde Y je vybrané z nasledujúcich skupín:

    0-3 *

    0-3

    0-1

    -152- ^H00%ry

    COOH

    HOOC

    CH₃

    COOH

    -153-

    -154- kde

    Y¹¹ je vybrané z H, COOH, COOEt, OMe, Ph, OPh, NHMe, NHAc, NHPh, CH(Me)₂,

    1-triazolyl, 1-imidazolyl a NHCH₂COOH;

    -155 Y¹² je vybrané z H, COOH, COOMe, OMe, F, Cl alebo Br;

    Y¹³ je vybrané z nasledujúcich skupín:

    Me

    Me

    CbzHN

    M '0-1

    CO₂tBu uO₂H ‘CONH₂ a Y¹⁴ je vybrané zo skupín MeSO2, Ac, Boe, i-Boc, Cbz alebo Alloc;

    Y¹⁵ a Y¹⁶ môžu byť rovnaké alebo rozdielne a sú nezávisle od seba vybrané zo skupín alkyl, aryl, heteroalkyl alebo heteroaryl;

    Y¹⁷ je CF₃, NO_2i CONHz, OH, COOCH3, OCH₃, OCeHs, C₆H₅, COC₆H₅, NH₂ alebo COOH; a

    Y¹⁸ je COOCH3, NO₂, N(CH₃)_2i F, OCH3, CH₂COOH, COOH, SO₂NH₂ alebo NHCOCH3.
13. 13. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 12, kde Y je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

    'Mé

    Me'

    ΟΗ,ΟΗ; HaCOOC'^z·

    Ηοοσ

    HOOC

    Η kde:

    Y¹⁷ je CF₃, N0_2i CONH_2i OH, NH₂ alebo COOH;

    Y¹⁸ je F, COOH.
14. 14. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 13, kde J je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

    CH₃OOC^^V BnOOC^^V HOOC^^^V

    CH3
15. 15. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 14, kde J je H, CH₃ alebo Bn.

    -157-

    F₃ *\V<»

    - 158 -
16. 17. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 16, kde G je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa:

    ch₃ Ah₃ ^COOH ch_3xoh₃ Ν°^Η3 ŕ ŕ ^^H3 [-'CHa r* ch₃ Λ-3 p C₅Hn C4H9 J ch_3xxh₃ £ r sAAA* r ^COO^Bu cf₃ vWv £ «**SAr

    W*»%Ao

    -159-
17. 18. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako účinnú zložku terapeuticky účinné množstvo peptidovej zlúčeniny podľa nároku

    1.
18. 19. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 18 na použitie na liečenie porúch spojených s vírusom hepatitídy C.
19. 20. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 18, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje farmaceutický prípustný nosič.
20. 21. Použitie peptidovej zlúčeniny podľa nároku T na výrobu lieku na liečenie porúch spojených s proteázou HCV u pacienta, ktorý takúto liečbu potrebuje.
21. 22. Použitie podľa nároku 21, kde liek je vo forme na subkutánne podanie.
22. 23. Použitie peptidovej zlúčeniny podľa nároku 1 na výrobu lieku na liečenie porúch spojených s HCV proteázou.
23. 24. Spôsob prípravy farmaceutického prostriedku na liečenie porúch spojených s HCV proteázou, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa privedenie peptidovej zlúčeniny podľa nároku 1 do bezprostredného styku s farmaceutický prípustným nosičom.
24. 25. Peptidová zlúčenina podľa nároku 1, vrátane jej enantiomérov, stereoizomérov, rotamérov a tautomérov a jej farmaceutický prípustných solí a solvátov, ktorá má HCV proteázový inhibičný účinok, pričom uvedená zlúčenina je vybraná zo skupiny zlúčenín s nasledujúcimi štruktúrnymi vzorcami:

    Me

    -160-

    R = Me

    R = Benzyl

    -161 -

    X = O^lBu

    X = OH

    X = NH₂

    X = NMeOMe

    X = NMe₂

    X = O^lBu

    X = OH

    R = Propargyl; R = A lyl

    -162 -

    X = O^lButyl

    X = OH

    X = O^lButyl

    X = OH

    X = NMe₂

    X = O*Bu

    X = OH

    -163 -

    OH

    R=Me

    X = H, Y = COOH X = COOH, Y = H

    Me

    Me^O

    -164 -

    Me
25. 26. Farmaceutický prostriedok na liečenie porúch spojených s HCV proteázou, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo jednej alebo viac zlúčenín podľa nároku 25 a farmaceutický prípustný nosič.
26. 27. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 26, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje protivírusovú látku.
27. 28. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 26 alebo nároku 27, v y z n a čujúci sa tým, že obsahuje interferón.
28. 29. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 28, vyznačujúci sa t ý m, že protivírusovou látkou je ribavirín a interferónom je a-interferón.
29. 30. Peptidová zlúčenina podľa nároku 1, vybraná zo skupiny, ktorá zahŕňa:

    F O

    -165-

    -166 - alebo jej enantiomér, stereoizomér, rotamér alebo tautomér, alebo jej farmaceutický prípustná soľ alebo solvát, pričom uvedená zlúčenina má HCV inhibičný účinok.
30. 31. Farmaceutický prostriedok, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že obsahuje jednu alebo viac peptidových zlúčenín podľa nároku 30.
31. 32. Použitie jednej alebo viacerých peptidových zlúčenín podľa nároku 30 na výrobu lieku na liečenie porúch spojených s vírusom hepatitídy C.
32. 33. Použitie jednej alebo viacerých peptidových zlúčenín podľa nároku 30 na výrobu lieku na moduláciu aktivity proteázy vírusu hepatitídy C (HCV).
33. 34. Použitie jednej alebo viacerých peptidových zlúčenín na výrobu lieku na liečenie, prevenciu alebo zlepšenie jedného alebo viac symptómov hepatitídy C.
34. 35. Použitie podľa nároku 33, kde HCV proteázou je NS3/NS4a proteáza.
35. 36. Použitie podľa nároku 35, kde peptidová zlúčenina alebo zlúčeniny inhibujú HCV NS3/NS4a proteázu.

    -167 -
36. 37. Spôsob modulácie interakcie polypeptidu vírusu hepatitídy C (HCV), vyznačujúci sa tým, že zahŕňa privedenie prostriedku obsahujúceho HCV polypeptid do styku s jednou alebo viac zlúčeninami podľa nároku 30 v podmienkach, pri ktorých nastáva uvedená interakcia.
37. 38. Peptidová zlúčenina podľa nároku 7, kde R³ je cyklohexyl.
38. 39. Peptidová zlúčenina podľa nároku 11, kde Y je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa 2-karboxy-3-hydroxyfenyl, 3-tetrahydrofurylmetoxy a 2- sulfofenyl.
39. 40. Peptidová zlúčenina podľa nároku 15, kde G je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa etylsulfonylmetyl, fenylsulfonylmetyl, _2-fenyletylsulfonylmetyl a 1-naftylsulfonylmetyl.