WO2012070758A2 - 치아 및 뼈 재생을 위한 융합 단백질 - Google Patents
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Definitions
- the present invention is a fusion protein comprising a fibronectin domain and an osteocalcin domain comprising an Arg-Gly-Asp (RGD) sequence, a composition for bone or tooth regeneration comprising the protein and for preventing or treating bone diseases A composition, a method for regenerating bone or teeth using the protein, and a method for preventing or treating bone disease using the composition.
- RGD Arg-Gly-Asp
- ECM extracellular matrix
- Integrins Cell surface adhesion receptors, called integrins, play an important role in cell adhesion. Integrins interact with extracellular matrix to regulate cell growth, differentiation, killing, and development. One of the best known extracellular substrates that interact with integrins to regulate cell function is fibronectin. Fibronectin is a relatively large protein with a molecular weight of about 220 kDa that interacts with various integrins, including several motifs, including the RGD motif, to regulate cell function.
- Osteocalcin called bone ⁇ -carboxyglutamic acid (Gla) -protein (BGP), is a non-collagenic protein rich in extracellular matrix.
- the mature protein consists of 49 amino acid residues and has a molecular weight of 5,700 Da.
- the osteocalcin is produced and separated by osteoblasts in the later stages of bone maturation, and osteocalcin has a high affinity for hydroxyapatite, thus playing an important role in mineralization.
- Hydroxyapatite is one of the widely used bone replacement materials for bone graft or regeneration because of its chemical composition similar to that of natural bone or dental minerals.
- hydroxyapatite has been developed in the field of bone tissue engineering as a scaffold material for bone-related cell attraction.
- the conventional fibronectin protein has a difficulty in maintaining the concentration for the therapeutic application because of its nonspecificity to bone tissue, its diffusion in vivo and its long-lasting effects, and its short half-life. .
- the present inventors have prepared a fusion protein comprising a fibronectin domain and an osteocalcin domain comprising an RGD sequence, and the fusion protein not only has a high binding affinity for hydroxyapatite, but also promotes the attachment and maintenance of osteoblasts, and osteoblasts.
- the fusion protein By improving the differentiation of the bone and tooth regeneration composition, and further confirmed that it can be used as a composition for preventing or treating bone diseases to complete the present invention based on this.
- One object of the present invention is to provide a fusion protein comprising a fibronectin domain and an osteocalcin domain comprising an Arg-Gly-Asp (RGD) sequence.
- Another object of the present invention is to provide a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the protein.
- Still another object of the present invention is to provide a composition for bone or tooth regeneration and a composition for preventing or treating bone diseases including the protein.
- Still another object of the present invention is to coat the protein on a structure composed of hydroxyapatite; And it provides a bone or tooth regeneration method comprising the step of attaching osteoblasts to the coated structure.
- Still another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating a bone disease, comprising administering the composition to a subject.
- Still another object of the present invention is to provide a structure composed of hydroxyapatite, which is coated with the protein of any one of claims 1 to 5.
- the fusion protein of the present invention not only has a high binding affinity for hydroxyapatite, but also promotes the attachment and maintenance of osteoblasts, enhances the differentiation of osteoblasts, and thus, a composition for bone and tooth regeneration, and also for preventing or treating bone diseases.
- HA hydroxyapatite
- FIG. 1 is a photograph confirming the expression of recombinant FN RGD / OC fusion protein by SDS-PAGE.
- Recombinant FN RGD / OC was expressed in the form of histidine (His 6) tagged fusion protein and purified using Ni-NTA column. The eluted material was subjected to SDS-PAGE under reducing conditions and detected by Coomassie Blue staining. 5 ⁇ g of protein was subjected to 15% (w / v) SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Molecular weight (Mr) markers are expressed in kDa.
- FIG. 2 shows the result of the protein adhered to hydroxyapatite (HA).
- Figure 4 is a result confirming the extent of MC3T3-E1 osteoblasts attached on the FN RGD / OC-fixed hydroxyapatite (HA) disk.
- FIG. 5 is an electron micrograph of MC3T3-E1 cells cultured on FN RGD or FN RGD / OC-fixed hydroxyapatite (HA) disks after 1 hour of culture.
- MC3T3-E1 osteoblasts cultured on immobilized hydroxyapatite (HA) disks.
- HA hydroxyapatite
- the present invention provides a fusion protein comprising a fibronectin domain and an osteocalcin domain comprising an Arg-Gly-Asp (RGD) sequence.
- fibronectin is a protein having a molecular weight of about 230 to 250 kDa and comprising three types of modules (type I, type II, type III).
- the sequence of the fibronectin protein can be obtained from a known database (eg, GenBank, etc.) and in humans has the amino acid sequence of SEQ ID NO.
- the fibronectin contains several motifs, including RGD motifs, and interacts with various integrins to regulate cell function.
- the fibronectin has a variety of functional or protein-binding domains, which domains contain specific motifs.
- the fibronectin domain of the present invention comprises an Arg-Gly-Asp (RGD) sequence, and includes both fibronectin wild type and variants capable of cell adhesion as part of the fibronectin protein comprising the sequence. can do.
- RGD sequence is included, at least 50%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably 98% of the amino acid sequence of the wild type It may include an amino acid sequence having the above homology.
- This homology comparison can be performed by using a comparison program that is easy to see with the naked eye. Commercially available computer programs can calculate the percent homology between two or more sequences, and the percent homology can be calculated for adjacent sequences.
- the fibronectin domain of the present invention may preferably be a tenth type III unit of fibronectin, more preferably the fibronectin domain may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
- osteocalcin is a vitamin K-dependent calcium-binding non-collagenic protein containing 2-3 gamma-carboxylglutamate (Gla) residues and having a molecular weight of about 5,900 Da.
- Osteocalcin protein sequences can be obtained from known databases (eg, GenBank, etc.), and in musculus mice have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
- Osteocalcin in bone plays an important physiological role in bone metabolism, such as regulating local mineralization or controlling the movement of Ca 2+ between bone and body fluids. Osteocalcin is synthesized in osteoblasts and then gamma-carboxylated by vitamin K dependent carboxylase in the cells.
- Gamma-carboxylated osteocalcin binds to hydroxyapatite (HA) in bone and accumulates in the bone matrix to participate in bone formation, while gamma-carboxylated osteocalcin (Glu-OC) Affinity with the bone matrix is weak, released into the blood is an indicator of bone absorption.
- the osteocalcin has a high affinity for hydroxyapatite
- the osteocalcin domain of the present invention may preferably include a site that binds to hydroxyapatite (HA), as a partial sequence of the osteocalcin protein for hydroxyapatite It can include both osteocalcin wild type and variants with high affinity.
- an amino acid sequence having at least 50%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 98% homology with the wild-type amino acid sequence It may include.
- the site that binds the hydroxyapatite may be an 18-95 amino acid site of SEQ ID NO: 8, more preferably the osteocalcin domain may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
- It may also include a polypeptide having a sequence in which the amino acid sequence of the wild type of the domain differs from one or more amino acid residues.
- Amino acid exchanges in proteins and polypeptides that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art.
- the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly.
- the protein may include a protein having increased structural stability or increased protein activity against heat, pH, etc. of the protein by variation or modification on the amino acid sequence.
- the fibronectin domain or osteocalcin domain polypeptide may be prepared by a chemical peptide synthesis method known in the art, or the gene encoding the domain may be amplified by PCR (polymerase chain reaction) or synthesized by a known method and cloned into an expression vector. Can be expressed.
- the gene may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and 4, respectively.
- the gene sequence may be mutated by one or more bases substituted, deleted, inserted, or a combination thereof.
- synthesis methods well known in the art may be used, for example, those described in Engels and Uhlmann, Angew Chem Int Ed Eng., 37: 73-127, 1988. , Triester, phosphite, phosphoramidite and H-phosphate methods, PCR and other autoprimer methods, oligonucleotide synthesis on a solid support, and the like.
- a "fusion protein comprising a fibronectin domain and an osteocalcin domain” is a protein recombinant to include both a fibronectin domain and an osteocalcin domain.
- FN RGD / OC has the same meaning.
- the fusion protein of the present invention binds to hydroxyapatite (HA) to promote integrin mediated cell adhesion, more specifically to promote osteoblast adhesion and maintenance on tooth and bone mineral components, and to promote osteoblast differentiation. Promote.
- HA hydroxyapatite
- the fusion protein of the present invention may be a structure in which the osteocalcin domain is connected to the C terminus of the fibronectin domain or a structure in which the osteocalcin domain is connected to the N terminus of the fibronectin domain.
- it may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
- the fusion protein comprising the fibronectin domain and the osteocalcin domain may be prepared by a chemical peptide synthesis method known in the art, or the genes encoding the respective domains may be amplified by PCR (polymerase chain reaction) or synthesized by a known method.
- By linking in frame (in frame) it can be expressed by operably linked and cloned in the expression vector.
- a nucleic acid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 can be operably linked and expressed in an expression vector.
- "operably linked” refers to a functional linkage of a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA of interest to perform a general function.
- a promoter and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA may be operably linked to affect expression of the coding sequence.
- Operative linkage with expression vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation can employ enzymes commonly known in the art.
- an "expression vector” refers to a gene construct that is a recombinant vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell and includes essential regulatory elements operably linked to express a gene insert.
- Expression vectors of the present invention may include expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, polyadenylation signals, and enhancers as elements generally possessed by suitable expression vectors. Initiation and termination codons are generally considered to be part of a nucleotide sequence encoding an immunogenic target protein and must be functional in the subject and be in frame with the coding sequence when the gene construct is administered.
- the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
- the expression vector all conventional expression vectors can be used. Depending on the host cell, the expression level and expression of the protein are different. Therefore, the host cell may be selected and used according to the purpose.
- pBAC / His-FN RGD / OC was prepared as an expression vector comprising a gene encoding the fusion protein of the present invention.
- the fibronectin domain and the osteocalcin domain may be linked by a linker. That is, the linker peptide may be included between the fibronectin domain and the osteocalcin domain.
- the linker peptide may be a flexible linker peptide that is commonly used, and examples thereof include a linker peptide having a GGSGGT amino acid sequence, a GGGGS amino acid sequence, and a GGGGSGGGGS amino acid sequence, but is not limited thereto.
- the linker peptide may be expressed by linking the nucleic acid encoding the linker peptide in frame between the nucleic acid encoding each domain in an operably linked expression vector.
- the vector of the present invention may further comprise a protein tag, which can be optionally removed using endopeptidase, to facilitate detection of the fusion protein.
- tag refers to a molecule exhibiting quantifiable activity or properties, and refers to a polypeptide fluorescent substance such as a chemical fluorescent substance (fluoracer), a fluorescent protein (GFP) or a related protein such as fluorescein. It may be a fluorescent molecule included, or may be an epitope tag such as a Myc tag, a flag tag, a histidine tag, a leucine tag, an IgG tag, and a straptavidin tag. Suitable tag polypeptides generally have 6 or more amino acid residues and typically have about 8 to 50 amino acid residues, wherein 6 histidine tags were used in the present invention.
- Host cells that can be transformed with the expression vector according to the present invention include prokaryotic cells, and a host with high expression efficiency of introduced DNA and a high expression efficiency of introduced DNA is usually used.
- Bacteria for example, known prokaryotic hosts such as Escherichia, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, are examples of host cells that can be used.
- E. coli can be used.
- recombinantly produced peptides can be recovered from medium or cell lysate. If membrane bound, it may be liberated from the membrane using a suitable surfactant solution (eg Triton-X 100) or by enzymatic cleavage.
- a suitable surfactant solution eg Triton-X 100
- Cells used for peptide expression can be disrupted by various physical or chemical means, such as freeze-thaw repetition, sonication, mechanical disruption or cell digestion, and are isolated by conventional biochemical separation techniques.
- the present invention provides a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the fusion protein.
- the nucleic acid may be a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, more preferably, a nucleic acid having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
- the fusion protein is as described above.
- the nucleic acid of the present invention does not change the amino acid sequence of the fusion protein expressed from the coding region due to degeneracy of the codon or in consideration of the codons preferred in the organism to express the fusion protein.
- Various modifications may be made to the coding region, and various modifications or modifications may be made within a range that does not affect the expression of the gene even at portions other than the coding region, and those skilled in the art may well include such modified genes. I can understand. That is, as long as the nucleic acid of the present invention encodes a fusion protein having equivalent activity, one or more bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, which are also included in the scope of the present invention.
- the present invention provides a composition for bone or tooth regeneration and a composition for preventing or treating bone disease, comprising the fusion protein.
- the fusion protein binds to hydroxyapatite (HA), which is a mineral component of bone or tooth, promotes adhesion of osteoblasts to hydroxyapatite (HA), and alkaline phosphate hydrolysis of osteoblasts. It promotes osteoblast differentiation by enhancing the activity of alkaline phosphatase (ALP).
- HA hydroxyapatite
- ALP alkaline phosphatase
- alkaline phosphatase is present in a large number of osteoblasts (osteoblast), a cell that produces bone, and in all cases where the production of bone increases (for example, fracture, destruction of bone by tumors). Bone production increases for repair), osteoblast activity increases and the activity of alkaline phosphatase, an enzyme in osteoblasts, also increases.
- the composition for bone or tooth regeneration and the composition for preventing or treating bone diseases of the present invention increases the expression of alkaline phosphatase by osteoblasts and promotes bone production, and through this action, various bone diseases are prevented. Treat or prevent.
- the FN RGD / OC of the fusion protein of the present invention is immobilized on a fixed hydroxyapatite disk, it was confirmed that ALP activity was significantly increased compared to FN RGD , thereby regenerating bone or teeth. It was confirmed that the bone disease can be prevented or treated (FIG. 6).
- bone diseases that can be prevented or treated by the present invention include bone damage caused by bone metastasis of cancer cells, osteoporosis, osteomalacia, rickets, fibrous osteoarthritis, aplastic bone disease, metabolic bone disease, osteolysis, leukopenia , Bone malformations, hypercalcemia or neurocompression syndrome.
- the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
- Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It is not.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like, in addition to the above components.
- the present invention comprises the steps of coating the fusion protein in a structure consisting of hydroxyapatite; And it provides a bone or tooth regeneration method comprising the step of attaching osteoblasts to the coated structure.
- fusion protein and hydroxyapatite are the same as described above, and calcium phosphate-based minerals such as oxiapatite, tricalcium phosphate, monocalcium phosphate, tetracalcium phosphate and calcium metaphosphate may be used instead of the hydroxyapatite.
- calcium phosphate-based minerals such as oxiapatite, tricalcium phosphate, monocalcium phosphate, tetracalcium phosphate and calcium metaphosphate may be used instead of the hydroxyapatite.
- hydroxyapatite may be used, but is not limited thereto.
- the present invention provides a method for preventing or treating bone disease, comprising administering the composition for preventing or treating bone disease to an individual suspected of bone disease or an individual suffering from bone disease.
- compositions of the present invention may be administered orally or parenterally, and suitable dosages of the compositions may be formulated, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response of the patient. Various factors may be prescribed by such factors as sensitivity.
- compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient, according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. It can be prepared by incorporation into a multi-dose container.
- the formulations can then be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants or stabilizers.
- the present invention provides a structure consisting of a hydroxyapatite, characterized in that the coated with the protein.
- the construct can be used as a scaffold for attracting bone-related cells for bone or tooth regeneration.
- the fusion protein of the present invention not only has a high binding affinity for hydroxyapatite but also promotes adhesion and maintenance of osteoblasts, thereby improving osteoblast differentiation.
- MC3T3-E1 preosteoblastic cells contained 10% heat-inactivated fetal calf serum (Invitrogen), penicillin G (100 units / mL), streptomycin sulfate (100 ⁇ g / s). The cells were incubated at 37% in 5% CO 2 in ⁇ -MEM medium (Invitrogen) containing mL, and 0.25 ⁇ g / mL of amphotericin B.
- Hydroxyapatite (Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 Alfa Aesar Co., Ward Hill, MA, USA) powder was compressed in a metal mold with a diameter of 2.5 cm and cold-isostatically press at 150 MPa ) Hydroxyapatite (HA) disks were sintered at 1250 ° C. for 2 hours. The disk specimens were 1 mm high and 20 mm diameter. For cell culture, all samples were immersed in 100% ethanol for 24 hours and completely dried.
- Total RNA of MC3T3-E1 cells was prepared using an easy-spin Total RNA Extraction Kit (iNtRON) according to the manufacturer's protocol. And 2 ⁇ g RNA samples were used for cDNA synthesis. The first strand cDNA was synthesized using primer oligo (dT) and Super Script TM III First-Strand Kit (Invitrogen) and further processed according to the manufacturer's protocol.
- a vector comprising a tenth type III domain (FN RGD ) of human fibronectin (FN) comprising a specific cell binding sequence RGD (Arg-Gly-Asp) was prepared.
- FN RGD tenth type III domain
- FN human fibronectin
- RGD Arg-Gly-Asp
- a forward primer SEQ ID NO: 9 introduced a SacI restriction enzyme site before the N-terminus
- 5'-CTCGAGCAACAATCAACAGTTTC-3 'and a reverse primer SEQ ID NO: 5'-CTCGAGTGGTTTGTCAATTTC-3'
- PCR polymerase chain reaction
- PCR was performed in a 30 ⁇ l reaction solution containing 50 pmol of primer each, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl 2 , 100 ⁇ g / ml gelatin, 0.2 mM dNTPs, 1.25 units of taq polymerase (iNtRON) It was.
- PCR was performed by annealing at 55 ° C. for 1 minute, extending at 72 ° C. for 1 minute, and denaturing at 94 ° C. for 1 minute. After 30 repetitions, the amplified PCR product was digested with restriction enzyme SacI .
- the cleaved PCR product was linked to the Sac I position of the pBAD / His-OC vector (see Biotechnol Lett. 2007 Nov; 29 (11): 1631-5) to generate construct pBAD / His-FN RGD / OC.
- Osteocalcin (OC) contains a conserved major domain (18-95 aa) for binding to hydroxyapatite (HA), a mineral component of bone.
- the vector contained the araBAD promoter for highly regulated expression and the amino-terminal polyhistidine sequence for affinity purification.
- E. coli TOP 10 cells a type of Escherichia coli, were seeded in LB-Epicillin medium and incubated overnight at 37 ° C. When reaching an OD 600 of 0.6, induction of transcription was initiated with 0.02% (w / v) transcription inducer L-arabinose. After 3 hours, the bacteria were pelleted by centrifugation, lysed and sonicated. The dissolved extracts were prepared by centrifugation in a refrigerated centrifuge at 14,000 ⁇ g for 30 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube.
- the hexahistidine tag was combined to purify crude protein isolated from bacterial supernatants sonicated with a nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) resin column (Invitrogen). The degree of purification of the recombinant protein was confirmed by Coomassie bule staining of 10% (v / v) SDS-PAGE under denaturation conditions.
- FN RGD / OC protein The ability of FN RGD / OC protein to bind to hydroxyapatite (HA) was determined by a modification of protein adhesion assay (Ku et al, Biomaterials, 26 (25): 5153-7, 2005).
- the hydroxyapatite (HA) disk prepared in Example 1 was placed on the bottom of a 6 well culture dish, and osteocalcin (OC, used as a control), fibronectin RGD (FN RGD ) or fibronectin RGD / osteocalcin (FN RGD / OC)
- the fusion protein was allowed to adhere at 37 ° C. for 3 hours.
- HRP horseradish peroxidase
- fusion proteins of the present invention have higher adhesion to hydroxyapatite than conventional fibronectin and osteocalcin, respectively.
- MC3T3-E1 cells were collected with 1 mM EDTA containing 0.02% (w / v) trypsin and resuspended in ⁇ -MEM.
- Cells were washed three times with ⁇ -MEM with 100 mg / ml soybean trypsin inhibitor and 1% (w / v) BSA, followed by seeding 5 ⁇ 10 4 cells per well in ⁇ -MEM.
- the 24-well plate was coated with the fusion protein by reacting with the fusion protein and the FN RGD protein prepared in Example 2 overnight at 4 ° C., and incubated with PBS containing 0.5% BSA for 1 hour at 37 ° C. for nonspecific adhesion. Blocked.
- MC3T3-E1 cells were resuspended in serum-free medium and plated on hydroxyapatite (HA) discs immobilized with recombinant FN RGD or FN RGD / OC for 1 hour incubation. Afterwards, the number of cells in each hydroxyapatite (HA) disk was counted. The maximum increase in cell adhesion was at 0.5 ⁇ M so a protein of 0.5 ⁇ M concentration was used for the experiment.
- HA hydroxyapatite
- the number of attached cells was higher in the FN RGD / OC fusion protein than that observed in the FN RGD protein coated plate as shown in FIG. 4 ( p ⁇ 0.05).
- ALP has been thought to be a bone formation marker in osteoblast differentiation. Therefore, the effects of FN RGD / OC on bone formation can be predicted through the effect of FN RGD / OC on ALP activity.
- ALP activity was normalized to the total protein content of each sample using the BCA Protein Assay Kit (Sigma). Standard curves were prepared with p-nitrophenol (sigma). Each value was normalized to the protein content of the cell lysate measured by the BCA Protein Assay Protocol (Pierce).
- ALP was expressed at low levels in cells on FN RGD -fixed hydroxyapatite (HA) disks, but after FN RGD / OC was fixed to hydroxyapatite (HA) disks.
- a significant increase in ALP activity was observed.
- the results indicate that FN RGD / OC immobilized on hydroxyapatite (HA) disk stimulates the expression of ALP activity of MC3TC-E1 cells on hydroxyapatite (HA) disk, and thus the ALP activity is hydroxyapatite (HA) To FN RGD / OC immobilized at. Therefore, these results confirm that FN RGD / OC can be useful for regenerating bone and preventing and treating bone disease by enhancing the activity of ALP, a bone formation marker.
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Abstract
본 발명은 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 포함하는 피브로넥틴(fibronectin) 도메인 및 오스테오칼신(osteocalcin) 도메인을 포함하는 융합 단백질, 상기 단백질을 포함하는 뼈 또는 치아 재생용 조성물 및 뼈 질환 예방 또는 치료용 조성물, 상기 단백질을 이용한 뼈 또는 치아 재생 방법 및 상기 조성물을 이용한 뼈 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질은 히드록시아파타이트에 대한 결합 친화도가 높을 뿐만 아니라 조골세포의 부착 및 유지를 촉진시키고, 조골세포의 분화를 향상시켜 뼈 및 치아 재생용 조성물, 나아가 뼈 질환 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있다. 또한, 상기 단백질을 히드록시아파타이트(HA) 등으로 구성된 구조물에 코팅함으로써, 뼈 조직 공학 및 생의학에 적용할 수 있다.
Description
본 발명은 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 포함하는 피브로넥틴(fibronectin) 도메인 및 오스테오칼신(osteocalcin) 도메인을 포함하는 융합 단백질, 상기 단백질을 포함하는 뼈 또는 치아 재생용 조성물 및 뼈 질환 예방 또는 치료용 조성물, 상기 단백질을 이용한 뼈 또는 치아 재생 방법 및 상기 조성물을 이용한 뼈 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
조직의 발생, 조직화 그리고 유지를 포함한 다양한 생리적 기능을 수행하기 위해서는 세포가 미세환경의 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 단백질에 특이적으로 부착되는 것이 필요하다. 따라서, ECM 리간드에 세포가 부착되는 것이 생체적합물질, 인공장기, 조직공학, 시험관내 세포 배양을 위한 지지체 등 생명공학적 응용에 필수적이다.
세포의 부착에는 인테그린(integrin)이라 불리는 세포 표면 부착 수용체가 중요한 역할을 하는데, 인테그린과 세포외 기질과의 상호작용을 통해 세포의 성장, 분화, 사멸 및 발생과정이 조절된다. 인테그린과 작용하여 세포의 기능을 조절하는 중요한 세포외 기질 중 가장 잘 알려진 것 중 하나가 피브로넥틴(fibronectin)이다. 피브로넥틴은 분자량이 약 220 kDa의 비교적 큰 단백질로서 RGD 모티프를 비롯한 몇 개의 모티프들을 포함하여 다양한 인테그린과 작용하여 세포의 기능을 조절한다.
뼈 γ-카르복시글루탐산(Gla)-단백질(BGP)로 불리우는 오스테오칼신 (Osteocalcin) 은 세포외 기질에 풍부한 비콜라겐성 단백질이다. 성숙된 단백질은 49 개의 아미노산 잔기로 구성되어 있고 5,700 Da의 분자량을 가진다. 상기 오스테오칼신은 뼈 성숙의 후기 단계에서 조골세포에 의해 생성되고 분리되며, 오스테오칼신은 히드록시아파타이트에 대한 높은 친화도를 가져, 무기질화에 중요한 역할을 한다.
히드록시아파타이트(hydroxyapatite, HA)는 천연 뼈 또는 치아 무기질 부분과 유사한 화학적 구성 때문에, 뼈 이식이나 재생의 뼈 대체 물질로 널리 사용되는 것 중에 하나이다. 또한, 히드록시아파타이트는 뼈 조직공학 분야에서 뼈-관련 세포 유인을 위한 스캐폴드 물질로 개발되어 왔다.
한편, 종래의 피브로넥틴 단백질은 뼈 조직에 특이적이지 못한 점, 생체 내에서 확산되어 그 효과를 장기간 지속할 수 없다는 점, 및 반감기가 짧은 점 때문에 치료로 응용하기 위해서는 농도를 유지하는데 그 어려움이 있었다.
본 발명자들은 RGD 서열을 포함하는 피브로넥틴 도메인 및 오스테오칼신 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제조하였고, 이러한 융합 단백질이 히드록시아파타이트에 대한 결합 친화도가 높을 뿐만 아니라 조골세포의 부착 및 유지를 촉진시키고, 조골세포의 분화를 향상시켜 뼈 및 치아 재생용 조성물, 나아가 뼈 질환 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있다는 것을 확인하여 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 포함하는 피브로넥틴(fibronectin) 도메인 및 오스테오칼신(osteocalcin) 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 포함하는 뼈 또는 치아 재생용 조성물 및 뼈 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 히드록시아파타이트(hydroxy apatite)로 구성된 구조물에 코팅하는 단계; 및 상기 코팅된 구조물에 조골세포를 부착시키는 단계를 포함하는 뼈 또는 치아 재생 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 뼈 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 히드록시아파타이트로 구성된 구조물로서, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 단백질로 코팅된 것을 특징으로 하는 구조물을 제공하는 것이다.
본 발명의 융합 단백질은 히드록시아파타이트에 대한 결합 친화도가 높을 뿐만 아니라 조골세포의 부착 및 유지를 촉진시키고, 조골세포의 분화를 향상시켜 뼈 및 치아 재생용 조성물, 나아가 뼈 질환 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있다. 또한, 상기 단백질을 히드록시아파타이트(HA) 등으로 구성된 구조물에 코팅함으로써, 뼈 조직 공학 및 생의학에 적용할 수 있다.
도 1은 재조합 FNRGD/OC 융합 단백질의 발현을 SDS-PAGE로 확인한 사진이다. 재조합 FNRGD/OC은 히스티딘(His 6) 태깅된 융합 단백질 형태로 발현되었고, Ni-NTA컬럼을 이용하여 정제하였다. 용출된 물질을 환원 조건하에 SDS-PAGE을 실행하였고 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색하여 검출하였다. 5μg의 단백질을 15%(w/v) SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 적용하였다. 분자량(Mr) 마커는 kDa으로 나타내었다.
도 2는 히드록시아파타이트(HA)에 단백질이 접착된 결과를 나타낸다. 히드록시아파타이트(HA) 디스크는 24 웰 접시 바닥에 놓고, FNRGD 또는 FNRGD/OC 단백질(0.5μM)로 2시간 동안 37℃ 에서 고정하였다. BSA를 대조군으로 사용하였다. 결과는 O.D.값과 평균±표준표차(n=3)로 나타내었다.
도 3은 7일까지 동안 세포가 없는 배양 배지에서 인큐베이션하는 동안 히드록시아파타이트(HA)디스크로부터 FNRGD/OC 가 분리되는 프로파일을 Hig-tag 프루브로 평가한 것이다. 처음 고정된 FNRGD/OC의 대략 70%가 적어도 인큐베이션 7일 동안 남아있었다. 히드록시아파타이트(HA)디스크에 처음 고정된 FNRGD/OC단백질의 양을 100%로 정의한다. 각 데이터 점은 평균±표준표차(n=3)을 나타낸다.
도 4는 FNRGD/OC-고정된 히드록시아파타이트(HA)디스크 상에 MC3T3-E1 조골세포가 부착되는 정도를 확인한 결과이다. MC3T3-E1 세포를 FNRGD 또는 FNRGD/OC 단백질(0.5μM)로 고정된 히드록시아파타이트(HA) 디스크 상에 시딩하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 결과는 크리스탈 바이올렛으로 염색된 세포의 값으로 표시하였고, 평균±표준표차(n=3)로 나타내었다.
도 5는 배양 1시간 후, FNRGD 또는 FNRGD/OC-고정된 히드록시아파타이트(HA) 디스크 상에서 배양된 MC3T3-E1 세포의 전자 현미경 사진이다.
도 6은 14일째에 FNRGD 또는 FNRGD/OC-고정된 히드록시아파타이트(HA) 디스크 상에서 배양된 MC3T3-E1 조골세포의 상대적 ALP 활성을 나타낸다. 알칼리성 인산가수분해효소의 촉매능을 결정하기 위해, MC3T3-E1 조골세포을 히드록시아파타이트(HA) 디스크 상에 2주 동안 배양하였다. 처리되지 않은 히드록시아파타이트(HA) 디스크가 대조군으로 사용되었다. * p < 0.05 (n=3).
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 포함하는 피브로넥틴 도메인 및 오스테오칼신 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명에서 "피브로넥틴(fibronectin)"은 분자량이 약 230 내지 250 kDa의 단백질로서 3개 타입(타입 Ⅰ, 타입 Ⅱ, 타입 Ⅲ)의 단위(module)를 포함하는 단백질이다. 피브로넥틴 단백질의 서열은 공지의 데이터베이스(예, GenBank 등)에서 얻을 수 있으며, 인간에서는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가진다. 상기 피브로넥틴은 RGD 모티프를 비롯한 몇 개의 모티프들을 포함하며 다양한 인테그린과 작용하여 세포의 기능을 조절한다. 상기 피브로넥틴은 다양한 기능적인 또는 단백질-결합 도메인을 가지고 있으며, 상기 도메인들은 특이적인 모티프를 포함하고 있다. 그 중 세포 표면 부착 수용체인 인테그린과 작용하는 피브로넥틴의 여러 가지 모티프 중 Arg-Gly-Asp(RGD)는 세포 부착 모티프로서 10번째 타입 Ⅲ 단위에 존재한다. 따라서, 본 발명의 피브로넥틴 도메인은 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 포함하며, 상기 서열을 포함하는 피브로넥틴 단백질의 일부서열로서 세포부착기능을 할 수 있는 피브로넥틴 야생형(wild type) 및 변이체를 모두 포함할 수 있다. 또한, 상기 RGD 서열을 포함하는 한, 상기 야생형의 아미노산 서열과 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
본 발명의 상기 피브로넥틴 도메인은 바람직하게는 피브로넥틴의 10번째 타입 Ⅲ 단위일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 피브로넥틴 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 "오스테오칼신(osteocalcin)"은 감마-카르복실글루타민산(γ-carboxylglutamate: Gla) 잔기를 2-3 개 포함하며 분자량 약 5,900 Da의 비타민 K 의존성 칼슘 결합 비콜라겐성 단백질이다. 오스테오칼신 단백질 서열은 공지의 데이터베이스(예, GenBank 등)에서 얻을 수 있으며, 생쥐(Mus musculus)에서는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가진다. 뼈 속의 오스테오칼신은 국소 무기질화 조절을 하거나 뼈와 체액간의 Ca2+의 움직임을 제어하는 등 뼈의 대사에 있어서 중요한 생리적 역할을 한다. 오스테오칼신은 조골세포에서 합성된 후 세포 내에서 비타민 K 의존성 탈탄산효소(carboxylase)에 의해 감마-카르복실화된다. 감마-카르복실화된 오스테오칼신(Gla-OC)은 뼈 속의 히드록시아파타이트(hydroxyapatite,HA)와 결합하여 뼈 기질에 축적되어 뼈 형성에 관여하고 감마-카르복실화되지 않은 오스테오칼신(Glu-OC)은 뼈 기질과의 친화성이 약하여 혈액으로 방출되어 뼈흡수의 지표가 된다. 상기 오스테오칼신은 히드록시아파타이트에 대한 높은 친화도를 가지며, 본 발명의 오스테오칼신 도메인은 바람직하게는 히드록시아파타이트(HA)에 결합하는 부위를 포함할 수 있으며, 오스테오칼신 단백질의 일부서열로서 히드록시아파타이트에 대한 높은 친화도를 가지는 오스테오칼신 야생형 및 변이체를 모두 포함할 수 있다. 또한, 상기 야생형의 아미노산 서열과 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 히드록시아파타이트에 결합하는 부위는 서열번호 8의 18-95 아미노산 부위일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 오스테오칼신 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.
상기 피브로넥틴 도메인 또는 오스테오칼신 도메인 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 도메인을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시킬 수 있다. 상기 유전자는 각각 서열번호 3 및 4의 염기서열을 가지는 것일 수 있다. 상기 유전자 서열은 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.
본 발명에서 "피브로넥틴 도메인 및 오스테오칼신 도메인을 포함하는 융합 단백질"은 피브로넥틴 도메인 및 오스테오칼신 도메인을 모두 포함하도록 재조합한 단백질로서, 본 발명에서 "FNRGD/OC"도 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 융합 단백질은 히드록시아파타이트(HA)에 결합하여 인테그린 매개 세포 부착을 촉진하는 기능을 하고, 더욱 상세하게는 치아 및 뼈 무기질 성분에 조골세포 부착 및 유지를 촉진시키고, 조골세포의 분화를 증진시킨다. 본 발명의 구체예에서는 본 발명의 융합 단백질인 FNRGD/OC는 FNRGD에 비하여 히드록시아파타이트에 현저히 더 많이 결합하였음을 확인하였으며(도 2), 세포 부착을 보다 증진시킴을 확인하였다(도 4). 본 발명의 융합 단백질은 피브로넥틴 도메인의 C 말단에 오스테오칼신 도메인이 연결된 구조 또는 피브로넥틴 도메인의 N 말단에 오스테오칼신 도메인이 연결된 구조일 수 있다. 바람직하게는, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 피브로넥틴 도메인 및 오스테오칼신 도메인을 포함하는 융합 단백질은 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 각 도메인을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 인프레임(in frame)으로 연결하여 발현벡터 내에 작동 가능하게 연결하여 클로닝하여 발현시킬 수 있다. 구체적으로는 서열번호 6의 염기서열을 가지는 핵산을 발현벡터 내에 작동 가능하게 연결하여 발현시킬 수 있다. 본 발명에서 "작동가능하게 연결(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명의 발현벡터는 적합한 발현벡터가 일반적으로 가지고 있는 요소로서 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인헨서 같은 발현 조절 요소들을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오 타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
발현벡터는 통상의 모든 발현 벡터를 모두 사용할 수 있다. 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 본 발명의 구체예에서, 본 발명의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 포함한 발현 벡터로서 pBAC/His-FNRGD/OC를 제조하였다.
본 발명의 융합 단백질에서, 피브로넥틴 도메인 및 오스테오칼신 도메인은 링커로 연결된 것일 수 있다. 즉, 피브로넥틴 도메인과 오스테오칼신 도메인 사이에 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 링커 펩타이드로는 통상적으로 사용되는 잘 구부러지는(flexible) 링커 펩타이드를 사용할 수 있고, 그 예로 GGSGGT 아미노산 서열, GGGGS 아미노산 서열, GGGGSGGGGS 아미노산 서열을 가지는 링커 펩타이드를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 링커 펩타이드는 상기 링커 펩타이드를 코딩하는 핵산을 각 도메인을 코딩하는 핵산 사이에 인프레임(in frame)으로 연결하여 발현벡터 내에 작동 가능하게 연결하여 발현시킬 수 있다.
본 발명의 벡터는 융합단백질의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티다아제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "태그(tag)"란 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 말하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수 있고, Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그 및 스트랩타비딘 태그 등 에피톱 태그일 수도 있다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상적으로 약 8개 내지 50개의 아미노산 잔기를 가지는데, 본 발명에서는 6개의 히스티딘 태그를 사용하였다.
상기 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양하면 유용한 단백질을 대량으로 제조, 분리 가능하다. 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절하여야 한다. 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주 세포는 원핵 세포를 포함하며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 세균, 예를 들어 에스케리치아, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스와 같은 주지의 원핵 숙주들이 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 바람직하게는 대장균이 사용될 수 있다. 펩티드의 발현은 유도인자 IPTG를 사용하여 발현을 유도할 수 있고, 유도시간은 단백질의 양을 최대화되게 조절할 수 있다. 본 발명에서, 재조합적으로 생산된 펩티드는 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있다. 막 결합형인 경우, 적합한 계면활성제 용액(예, 트리톤-X 100)을 사용하거나 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 유리될 수 있다. 펩티드 발현에 사용된 세포는 동결-해동 반복, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리. 정제 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990). 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교화크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 제공한다. 상기 핵산은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산일 수 있다. 상기 융합 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 상기 핵산은 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 융합 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 융합 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 핵산은 이와 동등한 활성을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 포함하는 뼈 또는 치아 재생용 조성물 및 뼈 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 융합 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 뼈 또는 치아의 무기질 성분인 히드록시아파타이트(HA)에 결합하여 히드록시아파타이트(HA)에 조골세포의 부착을 증진시키며, 조골세포의 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase; ALP) 활성을 증진시켜 조골세포의 분화를 촉진시킨다.
본 발명에서 "알칼리성 인산가수분해효소(ALP)"는 뼈를 생성하는 세포인 조골세포(osteoblast)에 많이 존재하며, 뼈의 생성이 많아지는 모든 경우(예를 들면 골절, 종양에 의한 뼈의 파괴시 복구를 위해서 뼈의 생성이 증가한다), 조골세포의 활동이 증가하고 조골세포의 효소인 알칼리성 인산가수분해효소의 활성도 역시 증가한다.
본 발명의 뼈 또는 치아 재생용 조성물 및 뼈 질환 예방 또는 치료용 조성물은, 조골세포에 의한 알칼리성 인산가수분해효소의 발현을 증가시켜 뼈 생성을 촉진하는 작용을 하며, 이러한 작용을 통하여 다양한 뼈 질환을 치료 또는 예방한다. 본 발명의 구체예에서는 본 발명의 융합 단백질인 FNRGD/OC가 고정된 히드록시아파타이트 디스크에 고정된 경우 FNRGD에 비하여 ALP 활성이 현저히 증가하였음을 확인하였하였으며, 그에 따라 뼈 또는 치아를 재생할 수 있으며, 뼈 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다(도 6).
본 발명에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 뼈 질환의 예는 암세포의 뼈전이에 의해 초래되는 뼈의 손상, 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성 골질환, 골용해, 백혈구 감소증, 뼈의 기형, 고칼슘혈증 또는 신경압박 증후군을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 히드록시아파타이트로 구성된 구조물에 코팅하는 단계; 및 상기 코팅된 구조물에 조골세포를 부착시키는 단계를 포함하는 뼈 또는 치아 재생 방법을 제공한다.
상기 융합 단백질 및 히드록시아파타이트에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 상기 히드록시아파타이트 대신 옥시아파타이트, 트리칼슘포스페이트, 모노칼슘포스페이트, 육인산사칼슘, 칼슘메타포스페이트 등의 인산칼슘계 무기질을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 히드록시아파타이트를 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 뼈 질환 예방 또는 치료용 조성물을 뼈 질환 의심 개체 또는 뼈 질환에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 뼈 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 뼈 질환 예방 또는 치료용 조성물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 조성물은 경구 또는 비 경구 투여할 수 있으며, 상기 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 히드록시아파타이트로 구성된 구조물로서, 상기 단백질로 코팅된 것을 특징으로 하는 구조물을 제공한다.
상기 구조물은 뼈 또는 치아 재생을 위하여 뼈 관련 세포 유인을 위한 스캐폴드로 사용될 수 있다. 기존의 피브로넥틴에 비하여 본 발명의 융합 단백질은 히드록시아파타이트에 대한 결합 친화도가 높을 뿐만 아니라 조골세포의 부착 및 유지를 촉진시키므로, 조골세포의 분화를 향상시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 세포 배양, 히드록시아파타이트(hydroxyapatite, HA) 제조, RNA 준비 및 cDNA 합성
MC3T3-E1 전조골세포(preosteoblastic cell)는 10% 열-불활성화된 우태아혈청(fetal calf serum, Invitrogen), 페니실린 G(penicillin G) 100유닛/mL, 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate) 100㎍/mL, 및 암포테리신 B(amphotericin B) 0.25㎍/mL를 포함하는 α-MEM 배지(Invitrogen)에서 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다.
히드록시아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2, Alfa Aesar Co., Ward Hill, MA, USA) 분말은 직경 2.5cm의 금속 몰드에서 압축하였고, 150MPa에서 냉등압프레스(cold-isostatically press)하였다. 히드록시아파타이트(HA) 디스크를 2시간동안 1250℃에서 소결하였다. 상기 디스크 표본은 1mm 높이, 20mm 직경을 가졌다. 세포 배양을 위하여, 모든 표본은 24시간동안 100% 에탄올에 침지시키고 완전히 건조 처리하였다.
MC3T3-E1 세포의 총 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 easy-spin Total RNA Extraction Kit(iNtRON)를 이용하여 준비하였다. 그리고 2㎍ RNA 샘플을 cDNA합성에 사용하였다. 첫 번째 가닥 cDNA는 프라이머 올리고(dT)와 Super ScriptTMⅢ First-Strand Kit(Invitrogen)을 이용하여 합성하였고, 제조사의 프로토콜에 따라 추가 처리되었다.
실시예 2: 융합단백질 발현 벡터의 제작 및 정제
특정 세포 바인딩 서열인 RGD(Arg-Gly-Asp)를 포함하는 인간 피브로넥틴(FN)의 10번째 타입Ⅲ 도메인(FNRGD)을 포함하는 벡터를 제조하였다. 구체적으로 FNRGD를 증폭하기 위해 5'-CTCGAGCAACAATCAACAGTTTC-3'로 기재되는 정방향 프라이머(서열번호 9, N-말단 앞에 SacⅠ제한효소 사이트 도입)와 5'- CTCGAGTGGTTTGTCAATTTC-3'로 기재되는 역방향 프라이머(서열번호 10, COOH-말단에 SacⅠ제한효소 사이트 포함)를 사용하여 PCR(polymerase Chain Reaction)을 수행하였다. PCR은 프라이머 각 50pmol, 50mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH 8.3), 1.5mM MgCl2, 100㎍/ml 젤라틴, 0.2mM dNTPs, 1.25 유닛의 taq polymerase(iNtRON)를 포함하는 30㎕ 반응 용액에서 수행하였다. PCR은 55℃에서 1분 동안 어닐링, 72℃에서 1분 동안 연장, 94℃에서 1분 동안 변성으로 수행하였다. 30회 반복수행 후, 상기 증폭된 PCR 산물을 제한효소 SacⅠ로 절단하였다. 절단된 PCR 산물을 pBAD/His-OC 벡터(Biotechnol Lett. 2007 Nov;29(11):1631-5 참고)의 SacⅠ 위치에 연결하여, 구조물 pBAD/His-FNRGD/OC을 생성하였다. 오스테오칼신(OC)은 뼈의 광물 구성성분인 히드록시아파타이트(HA)에 결합하기 위한 보존된 주요 도메인(18-95 a.a.)을 포함한다. 상기 벡터는 매우 조절된 발현을 위해 araBAD 프로모터를 포함하고, 친화성 정제를 위해 아미노-말단 폴리히스티딘 염기서열을 포함하였다.
재조합 FNRGD/OC의 발현을 위해, 대장균의 일종인 E.coli TOP 10 세포를 LB-엠피실린 배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 0.6의 OD600에 도달했을 때, 0.02%(w/v)의 전사 유도물질 L-아라비노스로 전사 유도를 개시하였다. 3시간 후에, 원심분리기로 박테리아를 펠렛화하였고, 용해분리하고 초음파 처리하였다. 14,000 × g에서 30분간 냉장 원심분리기에서 원심분리하여 용해된 추출물을 준비하고, 상등액은 새로운 튜브에 옮겼다.
헥사히스티딘 태그를 결합하여, 니켈-나이트릴로트라이아세트산(Ni-NTA) 레진 컬럼(Invitrogen)으로 초음파처리된 박테리아 상등액으로부터 분리된 조단백질을 정제하였다. 재조합 단백질의 정제 정도는 변성조건하에 10%(v/v) SDS-PAGE의 쿠마시 블루염색(Coomassie bule staining)으로 확인하였다.
L- 아라비노스로 유도한 결과, E.Coli TOP 10은 Mr=300,000의 단백질을 생성하였다(SDS-PAGE로 추정). 상기 크기의 단백질은 FNRGD/OC과 아미노 말단에 His-Tag로 구성된 융합단백질로 추정된다(도 1).
실시예 3: His-tag 프로브를 이용한 히드록시아파타이트(HA) 부착 분석
히드록시아파타이트(HA)에 FNRGD/OC 단백질이 결합하는 능력은 단백질 부착 분석(Ku et al, Biomaterials, 26(25):5153-7, 2005)의 변형방법으로 측정하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 히드록시아파타이트(HA) 디스크를 6 웰 배양 접시의 바닥에 놓고, 오스테오칼신(OC, 대조군으로 사용), 피브로넥틴RGD(FNRGD) 또는 피브로넥틴RGD/오스테오칼신(FNRGD/OC) 융합 단백질과 37℃에서 3시간 동안 부착하게 하였다. 결합 후, 디스크를 37℃에서 1시간 동안 홀스래디시퍼옥시다제(HRP)-접합된 히스티딘 항체(horseradish peroxidase (HRP)-conjugated His antibody, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 에 노출하였다. HRP에 대한 비색기질(Pierce)을 첨가하고, 흡광도 450㎚에서 측정하였다.
FN과 FNRGD/OC의 히드록시아파타이트(HA)에의 부착 특성을 정량적으로 비교한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 FNRGD/OC 단백질은 FNRGD보다 히드록시아파타이트(HA)에 현저히 더 많이 결합하였다. 또한, 도 3에 나타난 바와 같이 히드록시아파타이트(HA)에서 FNRGD/OC가 분리되는 프로파일은 고정된 FNRGD/OC의 단백질이 배양 배지에서 7일 동안 처음 양의 70%을 유지함을 확인하였다.
이와 같은 결과는 본 발명의 융합 단백질의 히드록시아파타이트와의 부착능이 기존의 피브로넥틴 및 오스테오칼신 각각보다 더 높다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 4: 세포 부착 분석
히드록시아파타이트(HA)에 부착된 FNRGD/OC의 생물학적 활성을 측정하기 위하여, FNRGD/OC 단백질이 세포 부착을 증진시키는 능력을 측정하였다.
24시간 동안 혈청 기아 상태인 MC3T3-E1 세포를 0.02%(w/v) 트립신이 들어있는 1mM EDTA로 세포를 수집하고, α-MEM에 재현탁하였다. 세포를 100㎎/㎖ 대두(soybean) 트립신 저해제와 1%(w/v) BSA이 첨가된 α-MEM로 3차례 세척한 후, α-MEM 중 웰당 5 x 104개의 세포를 시딩하였다. 24 웰 플레이트를 4℃에서 하룻밤 동안 상기 실시예 2에서 제작한 융합 단백질 및 FNRGD 단백질과 반응시켜 융합 단백질로 코팅하였고, 37℃에서 1시간 동안 0.5% BSA가 포함된 PBS와 인큐베이션 하여 비특이적 부착을 차단하였다. 부착된 세포는 PBS로 2차례 세척하고, 3% (w/v) 파라포름알데하이드(Sigma)로 고정하고, 2% 에탄올/물(v/v)에 들어있는 0.25% (w/v) 크리스탈 바이올렛(Crystal violet, Sigma)용액으로 염색하였다. 멸균수로 플레이트 전체를 세척한 후 건조하였다. 570nm에서 흡광도를 측정하였고, 흡광도 결과는 부착된 세포의 수와의 관계를 나타낸다.
단백질의 세포 부착 최대 증가 농도를 결정하기 위하여, MC3T3-E1 세포를 무혈청 배지에 재 현탁하고, 재조합 FNRGD 또는 FNRGD/OC가 고정화된 히드록시아파타이트(HA) 디스크 상에 도말하여 1시간 인큐베이션 한 후, 각 히드록시아파타이트(HA) 디스크 내 세포 개수를 계수하였다. 세포부착의 최대 증가는 0.5μM에서 있었으므로 0.5μM 농도의 단백질을 실험에 사용하였다.
부착 실험 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 부착된 세포의 수는 FNRGD 단백질 코팅된 플레이트에서 관찰된 것보다 FNRGD/OC 융합 단백질에서 더 높았다(p<0.05). 이러한 결과는, FNRGD/OC 융합 단백질이 뼈 무기물 히드록시아파타이트(HA)에 높은 친화성을 갖는 오스테오칼신(OC)의 특성을 유지하면서, 동시에 세포 부착도 증진시킨다는 것을 의미한다.
실시예 5: 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase, ALP)의 활성 측정
ALP는 조골세포의 분화에서 뼈 형성 마커로 생각되어 왔다. 따라서 ALP 활성에 대한 FNRGD/OC의 효과를 통하여 뼈 형성에 대한 FNRGD/OC의 효과를 예측할 수 있을 것이다.
ALP의 활성을 측정하기 위해, MC3T3 세포를 4일 동안 배양하고, 인산완충용액(PBS)으로 세척하였다. 그리고 1mM ZnCl2, 1mM MgCl2 과 1% 트립톤 X-100 을 포함하는 1.5M Tris-HCl(pH=10.2)로 4℃에서 10분간 용해하였다. 이어서 원심분리하고, 세포 용해물에 대하여 제조사의 방법에 따라 알칼리 인산 분석 키트(Alkaline Phosphate Assay Kit, Sigma Dignostics)로 ALP의 활성을 분석하였다. 알칼리성 인산가수분해효소가 존재하면 황색의 p-니트로페놀(p-Nitrophenol)을 생성하였고, 마이크로플레이트 판독기(BioRad Laboratories)를 이용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. ALP 활성을 BCA 단백질 분석 키트(BCA protein Assay Kit, Sigma)를 이용하여 각 표본의 총 단백질 함량으로 표준화하였다. p-니트로페놀(sigma)로 표준곡선을 작성하였다. BCA 단백질 분석 프로토콜(Pierce)로 측정된 세포 용해물의 단백질 함량으로 각 값을 표준화하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 FNRGD-고정된 히드록시아파타이트(HA) 디스크 상에 있는 세포에서는 ALP가 낮은 수준으로 발현되었으나, FNRGD/OC가 히드록시아파타이트(HA) 디스크에 고정된 후에는 ALP 활성의 현저한 증가가 관찰되었다. 상기 결과는 히드록시아파타이트(HA) 디스크에 고정된 FNRGD/OC은 히드록시아파타이트(HA)디스크 상의 MC3TC-E1 세포의 ALP 활성의 발현을 자극하고, 따라서 상기 ALP 활성은 히드록시아파타이트(HA)에 고정된 FNRGD/OC로 증진된다는 것을 나타낸다. 따라서, 이러한 결과를 통하여 FNRGD/OC가 뼈형성 마커인 ALP의 활성을 증진시킴으로써, 뼈를 재생하고 뼈 질환을 예방 및 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
Claims (15)
- Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 포함하는 피브로넥틴(fibronectin) 도메인 및 오스테오칼신(osteocalcin) 도메인을 포함하는 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 히드록시아파타이트(hydroxy apatite)에 결합하고 인테그린 매개 세포 부착을 촉진하는 것인 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 피브로넥틴 도메인은 피브로넥틴의 10번째 타입 Ⅲ 단위(module)인 것인 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 피브로넥틴 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것인 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 오스테오칼신 도메인은 히드록시아파타이트에 결합하는 부위를 포함하는 것인 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 오스테오칼신 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것인 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 피브로넥틴 도메인 및 오스테오칼신 도메인은 링커로 연결된 것인 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산.
- 제9항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것인 핵산.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 뼈 또는 치아 재생용 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 뼈 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 히드록시아파타이트(hydroxy apatite)로 구성된 구조물에 코팅하는 단계; 및 상기 코팅된 구조물에 조골세포를 부착시키는 단계를 포함하는 뼈 또는 치아 재생 방법.
- 제12항의 조성물을 뼈 질환 의심 개체 또는 뼈 질환에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 뼈 질환의 예방 또는 치료 방법.
- 히드록시아파타이트로 구성된 구조물로서, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 융합 단백질로 코팅된 것을 특징으로 하는 구조물.
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