KR20110019106A - 골 재생 촉진용 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 골 재생 촉진용 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 섬유아세포 성장인자-2 단백질의 카르복시 말단이 오스테오칼신 단백질의 아미노 말단과 펩타이드 결합된 골 재생 촉진용 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
상기 융합 단백질은 골의 주성분인 수산화인회석을 특이적으로 타겟팅하고, 상기 융합 단백질이 표면에 고정된 수산화인회석은 조골세포의 분화 및 증식을 증가시켜 골 재생을 촉진하므로 골 및 치주조직의 재생을 효과적으로 도모할 수 있다.
섬유아세포 성장인자-2, 오스테오칼신, 융합 단백질
Description
본 발명은 골 재생 촉진용 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 수산화인회석을 특이적으로 타겟팅하는 골 재생 촉진용 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
일반적으로 척추동물의 뼈 조직이 외상, 종양, 기형 등에 의해 손상되는 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 된다. 이에 손상된 부위에 골을 채워서 신생골을 생성시키는 치료법이 시행된다.
현재까지 알려진 치료방법으로 자신의 골을 이식하는 자가골 이식술, 다른 사람의 뼈를 이식하는 동종골 이식술, 동물의 뼈를 처리하여 이식하는 이종골 이식술 등이 있다.
상기 자가골 이식술은 환자의 정상부위에서 이미 생성되어 있는 뼈조직을 손상된 조직 부위에 이식하는 방법으로, 일부 환자에게서 성공을 거두었다. 그러나 정상 조직을 희생하는 셈이 되므로, 이러한 공여부에 새로운 통증이 생길 수 있는 등의 취약점이 있으며, 수술 후 통증, 골절, 출혈, 반흔을 비롯하여 재활이 더디게 이루어지는 등의 합병증이 발생할 수 있는 단점이 있다. 동종골 이식술은 면역 반응, 간염 등의 질환이 전염될 수 있는 위험이 있다. 한편, 이종골 이식술은 면역 반응과 광우병 등의 위험이 있는 단점이 있다. 이에 생체 적합성이 우수한 골이식재로서의 생체 인공재료의 개발이 요구되고 있다.
한편, 골 대사에 관여하는 많은 성장인자 중, 섬유아세포 성장인자- 2(fibroblast growth factor 2, FGF 2 또는 염기성 FGF)는 다양한 중간엽 세포에 대한 유력한 미토겐(mitogen)으로 알려져 있다(Rifkin, D.B. et al., J Cell Biol, 1989 , 109(1), 1-6). 연골 형성 부전증과 치사성 이형성증 유형 II(thanatophoric dyspalsia type II)와 같이 골과 연골 형성에 심각한 장애를 나타내는 몇몇 유전 질환은 섬유아세포 성장인자 수용체 변이가 그 원인인 것으로 최근 밝혀졌다(Rousseau, F. et al., Nature, 1994 , 371(6494), 252-4; Webster, M.K. et al., Mol Cell Biol, 1996 , 16(8), 4081-7)
골 조직에서 섬유아세포 성장인자-2는 조골세포 직계열(osteoblastic lineage)의 세포에 의해 생성되고, 골 매트릭스에 축적되며, 골 세포에 대한 자가분비(autocrine) 또는 측분비(paracrine)로 작용한다(Globus, R.K. et al., Endocrinology, 1989 , 124(3), 1539-47; Hurley, M.M. et al., J Biol Chem, 1994 , 269(12), 9392-6). 섬유아세포 성장인자-2를 외부에서 적용하는 경우 이의 약리 작용 처럼 골 형성에 자극 효과가 있다는 것이 보고된 바 있다(Park, J.M. et al., Int J Oral Maxillofac Implants, 2006 , 21(6), 859-66; Nakamura, T. et al., J Bone Miner Res, 1998 , 13(6), 942-9; Jang, J.H. et al., Biotechnol Lett, 2004 , 26(24), 1837-40).
오스테오칼신은 뼈 세포외 기질의 주요한 비콜라겐 단백질 성분이다(Hunter, G.K. et al., Biochem J, 1996 , 317 ( Pt 1)(59-64)). 골 성숙의 후기 단계에서 조골세포에 의해 생성되고 분비된다(Stein, G.S. et al., Physiol Rev, 1996 , 76(2), 593-629). 또한, 오스테오칼신은 수산화인회석에 대한 높은 친화도를 가지며, 미네랄화 조절에 중요한 역할을 한다(Delmas, P.D. et al., Biochemistry, 1984 , 23(20), 4720-5).
수산화인회석(hydroxyapatite)은 골이식재로 널리 사용되고 있는 물질 중 하나다. 생체 골의 무기질 성분과 유사한 화학적 조성으로 인해, 많은 실험 모델에서 우수한 골 형성능이 보고된 바 있다. 또한, 수산화인회석은 골조직 공학 분야에서 골-관련 세포 모집을 위한 스캐폴드 물질로 개발되어 왔다(Bae, C.J. et al., J Mater Sci Mater Med, 2006 , 17(6), 517-2). 생체내(in vivo) 치료효과 및 조직 공학을 위한 생체외(ex vivo) 세포 분화를 포함한 특정 생물학적 반응을 유도하기 위해, 성장인자와 같은 적절한 생활성 신호 분자를 수산화인회석 과립과 스캐폴드와 함께 조합하는 기술이 소개된 바 있다(Ono, I.et al., Biomaterials, 2004 , 25(19), 4709-18)
종래에 사용된 성장인자와 같은 단백질은 골 재생능력은 뛰어나지만, 골조직에 특이적이지 못하고 생체내에서 확산되어 그 효과를 장기간 지속할 수 없는 단점이 있었다.
이에 본 발명자들은 골의 주성분인 수산화인회석을 특이적으로 타겟팅하는 융합 단백질을 제조하였고, 이러한 융합 단백질이 수산화인회석에 대한 결합 친화도가 높을 뿐만 아니라 융합 단백질이 결합된 수산화인회석이 조골세포의 분화 및 증식을 효과적으로 향상시킴을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 골의 주성분인 수산화인회석을 특이적으로 타겟팅하고, 조골세포의 분화 및 증식을 하여 골 재생을 효과적으로 도모할 수 있는 골 재생 촉진용 융합 단백질 및 이의 용도을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
섬유아세포 성장인자-2 단백질의 카르복시 말단이 오스테오칼신 단백질의 아미노 말단과 펩타이드 결합된 골 재생 촉진용 융합 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 섬유아세포 성장인자-2 단백질을 코딩하는 cDNA의 3' 말단에 오스테오칼신 단백질을 코딩하는 cDNA가 결합되어 있고, 전술한 골 재생 촉진용 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한 본 발명은 상기한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기한 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.
또한 본 발명은 수산화인회석 표면에 상기한 융합 단백질이 고정된 골이식재를 제공한다.
아울러 본 발명은 수산화인회석 표면에 상기한 융합 단백질이 고정된 조직공학용 지지체를 제공한다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 수산화인회석에 대한 결합 친화도가 높아 골 의 주성분인 수산화인회석을 특이적으로 타겟팅한다. 또한, 표면에 본 발명의 융합 단백질이 고정된 수산화인회석은 조골세포의 분화 및 증식을 증가시켜 골 재생을 촉진하므로 골이식재 또는 골세포 지지체로 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 골 재생 촉진용 융합 단백질은 섬유아세포 성장인자-2 단백질의 카르복시 말단이 오스테오칼신 단백질의 아미노 말단과 펩타이드 결합되어 있다.
상기 섬유아세포 성장인자-2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 상기 오스테오칼신 단백질은 서열번호 2의 아미노선 서열로 표시된다.
본 발명의 융합 단백질은 섬유아세포 성장인자-2가 수산화인회석에 대한 높은 친화도를 갖는 오스테오칼신과 융합됨으로써, 섬유아세포 성장인자-2 자체 보다 수산화인회석에 대해 현저히 높은 결합 친화도를 나타낸다(실험예 2 및 도 3참조). 따라서, 상기 융합 단백질은 골의 주성분인 수산회인회석을 특이적으로 타겟팅하는 것이 가능하다.
상기 융합 단백질은 섬유아세포 성장인자-2 단백질 아미노 말단에 폴리히스티딘(poly-His) 영역이 결합될 수 있다. 상기 폴리히스티딘(poly-His) 영역은 표지 펩타이드 중 하나로, 히스티딘 결합 수지와 결합하여 본 발명의 융합 단백질을 분리 및 정제하는 데 사용할 수 있다. 바람직하기로 폴리히스티딘 영역으로 헥사히스티딘을 사용한다.
또한, 본 발명은 섬유아세포 성장인자-2 단백질을 코딩하는 cDNA의 3' 말단에 오스테오칼신 단백질을 코딩하는 cDNA가 결합되어 있고, 본 발명의 골 재생 촉진용 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
이러한 폴리뉴클레오티드는 섬유아세포 성장인자-2, 오스테오칼신을 코딩하는 공지의 핵산 서열로부터 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 상기 벡터는 클로닝 벡터로 사용가능한 것이라면 본 발명에서 특별히 한정하지는 않는다. 일예로, pET3, pET11, pBAD, pThioHis, pTrcHis 등이 가능하다. 상기 벡터로 폴리히스티딘(poly-His) 영역을 코딩하는 DNA가 삽입되어 있는 벡터를 사용할 수 있다.
이러한 벡터는 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 적절한 제한효소로 절단한 클로닝 벡터에 공지된 통상의 방법으로 삽입하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 미생물을 포함한다. 상기 미생물은 상기 융합 단백질이 효과적으로 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 가능하다. 대표적으로, E. Coli, 피키아 속(Pichia genus) 균주 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 섬유아세포 성장인자-2 단백질 을 코딩하는 cDNA의 3' 말단에 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 오스테오칼신 단백질을 코딩하는 cDNA가 결합되어 있고, 본 발명의 골 재생 촉진용 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 미생물을 형질전환하는 단계;
(b) 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 골 재생 촉진용 융합 단백질을 발현하는 단계; 및
(c) 발현된 골 재생 촉진용 융합 단백질을 정제하는 단계
상기 방법에 있어서, 상기 형질전환 단계는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 운반시켜 실시된다. 상기 형질전환 방법은 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, Hanahan 방법 및 전기 천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 봄바드먼트 등에 의해 발현 벡터를 숙주 세포인 미생물 내로 주입 할 수 있다. 미생물 내로 주입된 발현 벡터는 미생물 내에서 발현되어 목적의 융합 단백질을 얻게 된다.
발현된 융합 단백질은 변성상태 또는 자연상태에서, 당업계에 공지된 일반적인 정제 방법을 통해 정제될 수 있다. 정제방법은, 예컨대, 암모늄 설페이트에 의한 분획화 (fractionation), 크기 구별 여과 (한외여과) 및 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피를 포함한다.
본 발명은 또한, 수산화인회석 표면에 상기 융합 단백질이 고정된 골이식재 및 조직공학용 지지체를 포함한다.
상기 골이식재 및 조직공학용 지지체는 수산화인회석을 구성성분으로 함유하는 것이라면 종류 및 형태는 특별히 제한하지는 않는다. 일예로, 나노섬유, 차폐막, 미립구, 입자, 다공성 지지체, 블록 등이 가능하다.
본 발명의 융합 단백질은 수산화인회석에 대한 결합 친화도가 높기 때문에, 융합 단백질 고정을 위한 표면 개질 등의 추가적인 공정이 생략될 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 실험예 3에 따르면, 본 발명에 따른 융합 단백질로 고정된 수산화인회석 입자는 섬유아세포 성장인자-2로 고정된 수산화인회석 입자 보다 조골세포인 MC3T3-E1 세포의 증식을 월등히 자극하였다(도 3 참조).
또한, 본 발명의 실험예 4에 따르면, 본 발명에 따른 융합 단백질이 고정된 수산화인회석 입자과 함께 조골세포 배양한 경우, 섬유아세포 성장인자-2이 고정된 수산화인회석 입자와 함께 조골세포를 배양한 경우 보다, 알칼리 포스파타제의 활성이 훨씬 높았다(도 4 참조).
이와 같이, 융합 단백질이 표면에 고정된 수산화인회석은 조골세포의 분화 및 증식을 현저히 증가시켜 골 재생을 효과적으로 촉진하므로 골이식재 또는 골세포 지지체로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: FGF2-OC 융합 단백질 제조
섬유아세포 성장인자-2 단백질의 카르복시 말단이 오스테오칼신 단백질의 아미노 말단과 펩타이드 결합된 융합 단백질(이하, 'FGF2-OC')을 과다 발현시키기 위해 6개의 히스티딘, 서열번호 1로 표시되는 인간 섬유아세포 성장인자-2 및 서열번호 2로 표시되는 쥐 오스테오칼신 cDNA가 연속적으로 포함되어 있는 pBAD/HisA-FGF2-OC를 제조하였다.
FGF2를 인코딩하는 cDNA는 pBAD/HisA-OC 발현벡터에 클로닝되었다(Jang, J.H. et al., Biotechnol Lett, 2002 , 24(20), 1659-1663). 상기 발현벡터는 araBAD 프로모터 및 친화도를 이용한 정제에 사용하기 위한 아미노 말단의 폴리히스티딘 서열을 포함한다.
PCR 프라이머는 인간 FGF2를 인식하도록 다음과 같이 제작하였다;
FGF2의 NOOH-말단 앞에 BglII 제한부위를 도입하는 서열번호 3의 FGF2 상부 프라이머(5'- CAGATCTCGCTCTTAGCAGACATTG-3'), FGF2의 COOH-말단에 BglII 제한부위을 도입하는 서열번호 4의 FGF2 하부 프라이머(5'- CAGATCTCGCTCTTAGCAGACATTG -3')
중합효소 연쇄반응(PCR)은 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 100 ㎍/㎖ 젤라틴, 0.2 mM dNTPs, 1.25 units Taq 중합효소(iNtRON) 및 50 pmol 정방향, 역방향 프라이머를 포함하는 30 ㎕ 반응 혼합액에서 수행하였다. PCR 반응은 94 ℃에서 1분간 변성, 55 ℃에서 1분간 어닐링, 72 ℃에서 1분간 연장하는 방법으로 수행하였다.
30 사이클 후, 증폭된 PCR 산물은 BglII으로 절단하였다. 그후, PCR 산물은 pBAD/HisA-OC 벡터의 BglII 부위에 결찰하여 pBAD/HisA-FGF2-OC 벡터를 제조하였다(Kim, J.H. et al., Biotechnol Lett, 2007 , 29(11), 1631-5).
다음으로 재조합 FGF2-OC 융합 단백질 발현을 위해, 벡터를 형질전환용 세포(Escherichia coli TOP10)에 형질전환시켜 얻은 콜로니를 LB-Amp 배지에서 37 ℃에서 배양하였다. 배양액 내 박테리아 농도가 A600=0.6이 되었을 때, 0.02%(w/w) L-아라비노즈를 유도제로 사용하여 발현을 유도하였다. 3시간 후, 박테리아를 원심분리하여 침전시킨 후 용해하고 초음파처리하였다. 14,000×g로 30분 동안 원심분리하여 용해된 추출물을 수득하고, 상청액을 깨끗한 튜브로 옮겼다.
초음파 처리된 박테리아 상청액에 있는 조단백질을 융합 단백질의 아미노 말단에 위치하는 헥사히스티딘 태그와 니켈-니트릴로트리아세트산 레진 칼럼의 결합을 이용하여 정제하였다. 재조합 단백질의 정제 정도는 변정 조건 하에서 10% (v/v) SDS-PAGE의 쿠마스 블루 염색을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. L-아라비노즈의 유도를 통해 E. coli Top 10은 Mr = 250,000(SDS-PAGE로 평가)의 단백질을 생산하였으며, 이는 FGF2-OC와 아미노 말단에 His 태그로 구성된 융합 단백질에 대해 예상했던 크기였다.
실험예 2: 수산화인회석 결합 분석
FGF2-OC 융합 단백질의 수산화인회석 입자(제노스 社)에 대한 결합 정도를 수정된 단백질 부착 분석 방법을 통해 분석하였다(Ku, Y. et al., Biomaterials, 2005 , 26(25), 5153-7)
수산화인회석 입자를 6-웰 플레이트 배양 디쉬 바닥에 위치시킨 후 FGF2 또는 FGF2-OC 융합 단백질(0.5 μM)로 37 ℃에서 3시간 동안 고정하였다. 결합 후, 호스래디시 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase: HRP)와 결합된 His 항체(산타 크루즈 바이오테그날로지 社)에 37 ℃에서 1시간 동안 노출시켰다. HRP에 대한 비색 기질(colorimetric substrate)을 추가한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하면, FGF2-OC 융합 단백질은 FGF2(p < 0.05) 보다 월등히 수산화인회석에 결합하였다. 또한, FGF2-OC 융합 단백질(>70%)은 PBS에서 6일동안 배양한 후에도 수산화인회석와 계속 결합해 있었다(데이터 미도시). 이러한 결과는 FGF2-OC 융합 단백질이 FGF2 자체 보다 수산화인회석 결합능이 훨씬 우수함을 나타낸다.
실험예 3: 분열촉진성 분석(Mitogenic assay)
3-1. 세포 배양
MC3T3-E1 골모 세포주를 10% (v/v) 열로 불활성화된 우아혈청(heat-inactivated Fetal Calf Serum) (Invitrogen), 100 units mL-1 페니 실린 G 나트륨, 100 ㎍ mL-1 스트렙토마이신 설페이트와 0.25 ㎍ mL-1 아포테리신 B (Invitrogen)를 포함하는 α-MEM (Invitrogen) 배지에서 5% CO2, 37 ℃에서 배양하였다.
3-2. 분열촉진성 분석
세포 증식은 생존 가능한 세포 수를 측정하는 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 테트라졸리움 분석(Celltiter96TM AQ Non-radioactive Cell proliferation Assay, Promega, USA)으로 수행하였다.
상기 분석은 메틸 테트라졸 설페이트(MTS)가 490 nm에서 흡광하는 수용성 포르마잔 생성물로 변화하는 것을 측정하는 것이다. 40 ℃에서 MTS를 첨가한 후 2시간이 지나서 플레이트의 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
수산화인회석 표면에 고정된 FGF2-OC 융합 단백질의 기능적 활성을 확인하기 위해, 수산화인회석 표면에 고정된 FGF2-OC 융합 단백질의 미토겐 활성을 MTS로 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, FGF2-OC 융합 단백질이 고정된 수산화인회석 입자는 3일 동안의 배양기간 후 FGF2이 고정된 수산화인회석 입자 보다 MC3T3-E1 세포의 증식을 월등히 자극하였다(p < 0.05)
이러한 결과는 도 2에서 나타난 바와 같이, FGF2-OC 융합 단백질과 FGF2 두 단백질 사이에 수산화인회석에 대한 결합 친화도에 차이가 있기 때문인 것으로 판 단된다.
실험예 4: 알칼리 포스파타제(ALP) 활성
상기 실험예 3에서 14일의 배양기간이 끝났을 때, 세포를 PBS로 세척하고, 1 mM ZnCl2, 1mM MgCl2 및 1% Triton X-100을 함유하는 1.5 M Tris-HCl(pH 10.2) 4 ℃에서 10분 동안 용해하였다. 세포 용해질을 원심분리로 정화한 뒤, 알칼리 포스파타제 활성을 알칼리 포스파타제 키트(Procedure No. ALP-10, Sigma)로 37 ℃에서 60분 동안 측정하였다. 알칼리 포스파타제 존재시 노란색의 p-니트로페놀이 생성되고, 마이크로플레이트 판독기(Microplate reader)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. ALP 활성은 Quant-iTTM 단백질 분석 키트(Invitrogen)를 이용하여 각 샘플의 총 단백질 함량으로 표준화하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, FGF2-OC 융합 단백질이 고정된 수산화인회석 입자와 함께 배양된 MC3T3-El 조골세포의 ALP 활성은 FGF2이 고정된 수산화인회석 입자와 함께 배양된 MC3T3-El 조골세포 보다 훨씬 높았다(~25%). 이와 같이 상승된 ALP 활성은 골 세포 기능과 매트릭스생성/턴오버가 향상되었다는 지표이다.
이와 같은 결과는 표면 고정 시그널 단백질/펩타이드가 조골세포가 성숙 세포로 분화하는 것을 가속화하고 조기 세포 분화를 높이는 충분한 생체분자 신호를 제공하였기 때문이다(Cavalcanti-Adam, E.A. et al., J Bone Miner Res, 2002 , 17(12), 2130-40). 또한, 수산화인회석 입자 외부 표면에 고정된 FGF2-OC 융합 단백질이 조골세포의 기능을 강화하는 중요한 작용인자라는 것을 나타낸다. 게다가, FGF2-OC 융합 단백질은 시간에 따라 FGF2 자체가 점점 소실되는 환경에서 조골세포 기능 강화를 보존할 수 있다는 점에서 FGF2 보다 이점이 있다. 생물학적인 활성 인자를 생의학 기구 표면에 고정하는 것은 이식된 기구에 대한 치료 반응을 강화할 수 있다는 점에서 성과가 기대되는 방법으로 알려져 있다(Lutolf, M.P.et al., Nat Biotechnol, 2005, 23(1), 47-55)
본 발명자들은 수산화인회석 입자 표면에 고정된 FGF2-OC 융합 단백질이 조골세포 MC3T3-E1의 세포 증식과 분화를 도와주는 것을 확인하였다. 가용성 성장인자를 치료적 용도로 사용함에 있어 빠른 확산 현상과 생체내 짧은 반감기로 인해 많은 제한이 따른다는 점을 고려할 때, 이식재나 생의학 기구 표면에 성장인자를 고정하는 것은 치료학적 이점이 상당할 것으로 생각된다.
결론적으로, FGF2-OC 융합 단백질은 섬유아세포성장인자 2와 오스테오칼신의 성질을 모두 가지고 있고, FGF2 자체보다 수산화인회석 결합 친화도는 훨씬 높다. 또한, 수산화인회석 입자 표면에 고정된 상태의 FGF2-OC 융합 단백질은 MC3T3-E1 조골세포의 분열촉진 활성 및 세포 분화를 현저히 증가시켰다. 이러한 특성은 FGF2 자체에서는 나타나지 않는 것으로, FGF2의 골 재생에 있어 치료효과를 더욱 강화하는 새로운 방법으로 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 골 및 치주 조직의 재생을 위한 골이식재 또는 조직공학용 지지체로 응용되어 치과 및 정형외과 분야에 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1은 FGF2-OC 융합 단백질 및 FGF2를 10%(w/v) SDS-PAGE 겔을 통해 분석한 뒤 쿠마시 블루로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 2의 본 발명에 따른 융합 단백질과 FGF2의 수산화인회석에 대한 결합능을 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 FGF2-OC 융합 단백질로 처리된 수산화인회석 입자, FGF-2로 처리된 수산화인회석 입자를 각각 조골세포와 함께 배양시 분열촉진 활성을 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 FGF2-OC 융합 단백질로 처리된 수산화인회석 입자, FGF-2로 처리된 수산화인회석 입자를 각각 조골세포와 함께 배양시 ALP 활성을 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University
<120> FUSION PROTEIN FOR FACILITATING BONE REGENERATION AND USES
THEREOF
<130> DP090164
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 288
<212> PRT
<213> FGF2-human
<400> 1
Met Val Gly Val Gly Gly Gly Asp Val Glu Asp Val Thr Pro Arg Pro
1 5 10 15
Gly Gly Cys Gln Ile Ser Gly Arg Gly Ala Arg Gly Cys Asn Gly Ile
20 25 30
Pro Gly Ala Ala Ala Trp Glu Ala Ala Leu Pro Arg Arg Arg Pro Arg
35 40 45
Arg His Pro Ser Val Asn Pro Arg Ser Arg Ala Ala Gly Ser Pro Arg
50 55 60
Thr Arg Gly Arg Arg Thr Glu Glu Arg Pro Ser Gly Ser Arg Leu Gly
65 70 75 80
Asp Arg Gly Arg Gly Arg Ala Leu Pro Gly Gly Arg Leu Gly Gly Arg
85 90 95
Gly Arg Gly Arg Ala Pro Glu Arg Val Gly Gly Arg Gly Arg Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Ala Ala Pro Arg Ala Ala Pro Ala Ala Arg Gly Ser Arg Pro
115 120 125
Gly Pro Ala Gly Thr Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala
130 135 140
Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys
145 150 155 160
Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile
165 170 175
His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His
180 185 190
Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys
195 200 205
Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu
210 215 220
Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu
225 230 235 240
Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp
245 250 255
Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr
260 265 270
Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
275 280 285
<210> 2
<211> 75
<212> PRT
<213> Osteocalcin-mouse
<400> 2
Ser Asp Leu Thr Asp Ala Ala Lys Pro Ser Gly Pro Glu Ser Asp Lys
1 5 10 15
Ala Phe Met Ser Lys Gln Glu Gly Asn Lys Val Val Asn Arg Leu Gly
20 25 30
Ala Ser Val Pro Ser Pro Asp Pro Leu Glu Pro Thr Arg Glu Gln Cys
35 40 45
Glu Leu Asn Pro Ala Cys Asp Glu Leu Ser Asp Gln Tyr Gly Leu Lys
50 55 60
Thr Ala Tyr Lys Arg Ile Tyr Gly Ile Thr Ile
65 70 75
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF2 upstream Primer
<400> 3
cagatctcgc tcttagcaga cattg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF2 downstream primer
<400> 4
cagatctcgc tcttagcaga cattg 25
Claims (9)
- 섬유아세포 성장인자-2 단백질의 카르복시 말단이 오스테오칼신 단백질의 아미노 말단과 펩타이드 결합된 골 재생 촉진용 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 섬유아세포 성장인자-2는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 오스테오칼신은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 섬유아세포 성장인자-2 단백질 아미노 말단에 폴리히스티딘(poly-His) 영역이 결합된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 섬유아세포 성장인자-2 단백질을 코딩하는 cDNA의 3' 말단에 오스테오칼신 단백질을 코딩하는 cDNA가 결합되어 있고, 제1항의 골 재생 촉진용 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
- 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
- 제6항의 발현벡터로 형질전환된 미생물.
- 수산화인회석 표면에 제1항의 융합 단백질이 고정된 골이식재.
- 수산화인회석 표면에 제1항의 융합 단백질이 고정된 조직공학용 지지체.
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2009
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